Upload
fadly-boiz
View
1.026
Download
86
Embed Size (px)
Citation preview
LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKULER
EKSTRAKSI DNA, REAKSI BERANTAI POLIMERASE (PCR)
DAN ELEKTROFORESIS
Oleh :
Ahmad Fadli
2011 38 001
POGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI PAPUA
MANOKWARI
2013
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan. DNA adalah
molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu
gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk
nukleotida (Maulana dkk, 2010).
DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan
penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein
dan proses metabolisme lain. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan
kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linier dan
berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan
kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain
itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan
sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA nukleus memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA
eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Maulana dkk, 2010).
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-
langkah kerja analisis DNA sequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan
panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh
karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA.
Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki
tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis
jaringan (termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan
bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak (Sutomo, 2002).
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan amplifikasi
DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan oleh Karry Mullis
pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen
2
DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Dengan
diketemukannya teknik PCR di samping juga teknik-teknik lain seperti
sekuensing DNA, telah merevolusi bidang sains dan teknologi khususnya di
bidang diagnosa penyakit genetik, kedokteran forensik dan evolusi molekular
(Handoyo dan Ari, 2000).
Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering
dipakai dalam bidang Biokimia dan Biologi Molekular. Secara prinsip, teknik ini
mirip dengan kromatografi, memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan
perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap
campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip
dalam elektroforesis) (Jusuf, 2001).
Berdasarkan latar belakang tersebut, praktikum ini penting dilakukan oleh
mahasiswa untuk mempelajari metode-metode dalam ekstraksi DNA, PCR dan
elektroforesis yang biasa dilakukan dalam analisis DNA dalam bidang Biologi
Molekuler.
1.2 Tujuan
Tujuan dilakukanya praktikum ini adalah :
1. Mempelajari bagaimana mengekstraksi DNA.
2. Mempelajari bagaimana proses ekstraksi DNA.
3. Mempelajari bagaimana mengamplifikasi fragmen DNA.
4. Mempelajari bagaimana kerja PCR.
5. Mempelajari bagaimana melakukan analisis dengan gel agarosa dan
poliakrilamida
6. Mempelajari bagaimana kerja elektorofresis gel agarosa dan bagaimana
menentukan ukuran fragmen DNA.
7. Mempelajari bagaimana elektroforesis gel poliakrilamida bekerja.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ekstraksi DNA
Komponen utama kromosom pada eukariota adalah molekul DNA dan
protein histon. Protein histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat
asam dari DNA. Pada dasarnya sel mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan
DNA. DNA yang dijumpai di nukleus disebut DNA kromosomal, DNA lain yang
terdapat dalam sel di luar nukleus yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA
plasmid, ketiganya disebut DNA ekstrakromosomal (Fatchiyah dkk., 2012).
Ekstraksi DNA adalah prosedur umum memisahkan dan mengumpulkan
DNA untuk analisis rekayasa genetika, forensik, bioinformatika, komputasi,
analisis asal-usul dan antropologi. Ada beberapa teknik ekstraksi yang umum
digunakan dalam teknologi DNA termasuk teknik Chelex. Teknik ini
dikembangkan tahun 1991 dan hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR.
Meskipun memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan
efektif untuk ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA
karena tidak membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan
menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks
PCR. Metode ini menjamin untuk menghasilkan sampel kecil sehingga disarankan
untuk semua sampel yang diuji dengan berbagai ukuran dan volume sampel
(Walsh and Higuchi, 1991).
2.1.1 Prinsip Dasar Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA berarti mengeluarkan DNA dari sel. Teknik Chelex
umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan prosedur
penambahan suspensi "resin-chelat" secara langsung untuk spesimen (darah,
noda darah, semen sebagai contoh) kemudian melalui resin penukar ion yang
mengikat ion metal polivalen, magnesium. Dalam tahap terakhir, logam
membawa materi lain dengannya. Ada beberapa tahap dasar dalam ekstraksi
DNA, yang rinciannya dapat berbeda tergantung jenis sampel dan senyawa yang
mempengaruhi ekstraksi dan analisis lanjut (Walsh and Higuchi, 1991).
4
• Memecahkan sel (lisis) melalui sonikasi, dan menghancurkan lipid
membran dengan penambahan detergen seperti SDS. Melakukan vorteks
dengan fenol (kadang-kadang dipanaskan) sering efektif untuk memecahkan
protein dinding sel.
• Mengeluarkan sel dan protein histon yang terikat dengan DNA melalui
penambahan protease dalam presipitasi dengan garam atau asetat
ammonium, atau dengan menggunakan ekstrasi fenol-kloroform.
• Presipitasi DNA dalam etanol atau isopropanol dingin, DNA dapat larut di
dalam alkohol dan berikatan bersama, tahap ini juga melepaskan garam.
• Cuci pelet DNA dengan alkohol lagi dan sentrifugasi untuk mendapatkan
kembeli peletnya.
• Melarutkan DNA dalam buffer alkalin
Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memanaskan sejumlah
jaringan dalam larutan Chelex. Pemanasan tersebut membantu memecahkan sel
dan mendenaturasi protein. Chelex melindungi sampel dari DNAse dan mencegah
sampel dari kontaminan (Walsh and Higuchi, 1991).
2.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi
nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi
bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah
diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi
dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui
replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau
ragi). Karena PCR merupakan teknik in vitro, teknik ini dapat digunakan tanpa
memotong DNA, dan dapat dimodifikasi secara ekstensif untuk mengikuti aturan
luas manipulasi genetik (Fatchiyah dkk., 2012).
PCR ditemukan oleh Kary Mullis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum
yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai
keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan, identifikasi
sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas), deteksi
5
dan diagnosis penyakit infeksi, dan pembentukan organisme transgenik. PCR juga
digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi, ekologi,
biologi perkembangan, dan genetika (Binur, 2013).
Keuntungan menggunakan PCR adalah:
1. Deteksi dan identifikasi mikroorganisme secara cepat pada frekuensi yang
sangat rendah, mikroorganisme simbiotik, dan individu ikan dan larva
avertebrata;
2. Analisis cepat genom individu untuk mempelajari populasi;
3. Deteksi dan analisis "kejadian langka" yang terjadi pada fraksi sel kecil
dalam sampel jaringan atau kolesi lapangan; dan
4. Menduga kuaiitas air melalui deteksi virus, bakteri, dan/atau parasit
pathogen. Keuntungan lain PCR adalah mengurangi keperluan kultur yang
sering ditemukan untuk spesies atau jenis mikroba yang tidak dapat dikultur
untuk kepentingan ekologi atau biogeokimia.
Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan
kali dari jumlah semula, sekitar 106 - 10
7 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus PCR akan
diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR
adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target
dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah dkk., 2012).
Tabel 1. Amplifikasi Geometrik (X=2n)
Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
10 1.024
20 1.048.576
30 1.073.741.824
Sumber : Fatchiyah dkk., 2012
2.2.1 Prinsip Dasar PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara
6
mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA
target tersebut melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam
suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan
nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum
daerah target disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut
reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru
dikenal sebagai enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut
dalam teknik PCR diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis
Adenin), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine) (Muladno,
2010).
PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen tunggal, bagian gen, atau urutan
non-kode DNA. PCR akan membuat sekitar 40 milyar salinan dari DNA
cetakan. Kebanyakan metode PCR dapat mengamplifikasi fragmen DNA sampai
10 kilo pasang basa (kb), meskipun beberapa teknik dapat mengamplifikasi
fragmen berukuran sampai 40 kb (Binur, 2013).
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,
annealing dan ekstensi (pemanjangan) oleh enzim DNA polimerase. Taq DNA
polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada
tahun 1988. Enzim ini tahan sampai temperature mendidih 100° C, dan aktifitas
maksimal pada temperatur 70o - 72° C. Sepasang primer oligonukleotida yang
spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’
untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan (Fatchiyah
dkk., 2012).
PCR biasanya terdiri atas 20 sampai 35 siklus. Kebanyakan PCR dilakukan
dalam tiga tahap, yang didahului satu suhu tetap untuk awal dan diikuti satu
suhu lagi untuk akhir (Binur, 2013).
1. Tahap Inisiasi/Denaturasi. Sebelum tahap inisiasi reaksi PCR sering
dipanaskan pada suhu 94° - 96° C (atau 98° C jika menggunakan
polimerase termostabil), selama 1 - 9 menit. Ini berguna untuk menjamin
banyak cetakan DNA dan primer terdenaturasi yaitu putusnya ikatan
hidrogen basa-basa komplemen rantai DNA untuk menghasilkan rantai
tunggal DNA. Beberapa polimerase PCR juga membutukan kondisi tahap
7
ini untuk aktivasi (PCR awal-panas). Setelah itu, mulai siklus dengan
tahap satu pada 94° - 98° C selama 20 - 30 detik (tahap denaturasi).
2. Tahap annealing/Penempelan. Dalam tahap ini suhu reaksi diturunkan
sehingga primer dapat menempel pada cetakan DNA rantai tunggal.
Gerakan Brownian menyebabkan primer bergerak di sekitar ikatan
hidrogen DNA-DNA yang secara konstan dibentuk dan diputuskan antara
primer dan cetakan. Ikatan stabil hanya terbentuk bila urutan primer sangat
sesuai dengan urutan cetakan. Bagian pendek DNA rantai ganda ini
dikatalisis oleh polimerase untuk memulai sintesis DNA. Suhu pada tahap
ini bergantung pada suhu leleh primer dan biasanya antara 50° - 64° C
selama 20 - 40 detik.
3. Tahap Ekstensi/Pemanjangan yaitu DNA polimerase memperpanjang
rantai DNA primer yang komplemen dengan rantai cetakan DNA. Suhu
pada tahap ini bergantung pada enzim DNA polimerase yang digunakan.
Polimerase Taq mempunyai suhu optimum 70° - 74° C. Umumnya reaksi
tahap ini menggunakan suhu 72° C. DNA polimerase melakukan
kondensasi gugus 5-fosfat dNTP dengan gugus 3'-hidroksil pada ujung
awal rantai DNA yang komplemen dengan cetakan dalam arah 5' ke 3'.
Waktu pemanjangan bergantung pada DNA polimerase dan panjang
bagian DNA yang akan diampiifikasi. Tahap elongasi (peanjangan) akhir
selama 5 - 15 menit (tergantung panjang cetakan DNA) setelah siklus
terakhir dapat digunakan untuk menjamin DNA rantai tunggal sisa
diperpanjang seluruhnya. Akhirnya jaga suhu 4° - 15°C selama waktu
terbatas untuk penyimpanan singkat selama reaksi misalnya jika reaksi
dikerjakan semalam.
Secara ringkas, prinsip pelipatgandaan jumlah molekul DNA pada target
yang diinginkan melalui teknik PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu
95o
C, molekul DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai
ganda menjadi untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50o
C sampai 60o
C,
primer, forward yang runutan nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu
untai tunggal akan menempel pada posisi komplemennya. Demikian juga primer
reversenya akan menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua primer
8
tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai
mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing-masing
primer pada suhu 72o
C. Proses ini disebut ekstensi. Dengan demikian, satu
molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul DNA.
Setelah itu diulangi proses denatuasi, penempelan (annealing), ekstensi
(pemanjangan) yang disebut sebagai satu siklus. Proses PCR biasanya
berlangsung 35 - 40 siklus (Muladno, 2010).
Gambar 1. Siklus dasar PCR. A. Sistem tiga temperatur yang berbeda. B.
Kenaikan hasil amplifikasi menunjukkan pertumbuhan sigmoid
(Fatchiyah dkk., 2012).
9
2.2.2 Prosedur (Untuk Awal - Panas, Amplifikasi Rantai Ganda)
Reaksi PCR dilakukan dalam tabung reaksi kecil (volume 0.2 - 0.5 ml) yang
mengandung volume reaksi antara 15 - 100 µl, yang dimasukkan di dalam mesin
thermal cycler. Mesin memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi sesuai
dengan suhu yang diinginkan untuk setiap tahap reaksi. Kebanyakan mesin
memiliki penutup panas untuk mencegah kondensasi bagian dalam tutup tabung
reaksi. Kalau tidak, lapisan minyak dapat ditempatkan pada campuran reaksi
untuk mencegah evaporasi (Binur, 2013).
Menurut Binur (2013) PCR membutuhkan beberapa komponen dasar
seperti:
• DNA cetakan yang mengandung daerah bagian DNA yang akan
diamplifikasi.
• Satu atau lebih primer yang komplemen dengan bagian DNA pada ujung 5'
dan ujung 3' bagian DNA yang akan diamplifikasi.
• DNA polimerase (misalnya polimerase Taq atau DNA polimerase lain
dengan suhu optimum sekitar 70° C) digunakan untuk sintesis salinan DNA
bagian yang akan diamplifikasi.
• Deoksinukleotida trifosfat (dNTP) yang digunakan DNA polimerase untuk
membentuk DNA baru.
• Larutan buffer, yang memberikan lingkungan kimia yang sesuai untuk
aktifitas dan kestabilan optimum DNA polimerase.
• Kation Divalen, ion magnesium atau mangan; umumnya menggunakan
Mg2+
, meskipun demikian Mn2+
dapat digunakan untuk mutagenesis DNA
PCR-mediated. Konsentrasi Mn2+
sangat tinggi dapat meningkatkan
kesalahan selama sintesis DNA.
• Kation Monovalen ion potassium.
2.3 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya
pengaruh medan listrik. Molekul DNA termasuk senyawa bermuatan negatif. Sifat
ini menjadikan molekul DNA yang ditempatkan pada medan listrik akan
bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul DNA tergantung
10
pada konsentrasi gel yang digunakan, ukuran molekul yang dianalisis, serta
tegangan listrik yang diberikan. Salah satu gel yang dapat digunakan pada
elektroforesis adalah gel agarosa. Agarosa digunakan untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen-fragmen DNA (Sambrook et al.,
1989).
Mobilitas fragmen DNA pada gel elektroforesis sangat dipengaruhi oleh
komposisi dan kelarutan ion buffer elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion sangat
sedikit maka konduktifitas listrik sangat kecil dan migrasi DNA menjadi lambat.
Konsentrasi ion yang berlebih akan mengakibatkan gel mencair dan DNA
terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis, teknik elektroforesis DNA juga
memerlukan loading buffer. Buffer ini berfungsi meningkatkan densitas sampel
sehingga fragmen tersebut berada di dasar well dan tidak menyebar. Fungsi
lainnya adalah memberi warna pada fragmen DNA sehingga mempermudah
pengamatan proses elektroforesis. Buffer ini dapat juga membantu pergerakan
sampel ke anoda. Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan dengan endonuklease
restriksi dapat ditentukan dengan memakai penanda DNA (marker). Penanda
DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui ukurannya (Sambrook et
al.,1989).
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat
bermigrasinya molekul biologi dan untuk mencegah terjadinya difusi karena
timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Media penyangganya
bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media
penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas,
selulosa asetat dan gel. Gel yang dipakai dapat berupa pati, agarose ataupun
poliakrilamid. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Dalam perangkat
elektroforesis, gel diletakkan diantara dua buffer chamber sebagai sarana untuk
menghubungkan kutub negatif dan kutub positif. Orientasi posisi gel dapat secara
vertikal dan horisontal atau disebut sebagai submarine (Fatchiyah dkk., 2012).
2.3.1 Prinsip Dasar Elektroforesis
11
Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda
negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel tergantung
pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh
pula protein bergerak dengan kata lain mobilitisnya tinggi. Sebaliknya, protein
dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek
dengan kata lain mobilitisnya rendah. Berbagai jenis protein pada suatu sampel
akan terseparasi (terpisah-pisah) pada gel tergantung pada mobilitasnya. Protein
dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian yang lebih bawah
gel, sedangkan protein dengan mobilitas rendah cenderung berhenti bergerak
pada bagian atas gel. Dengan demikian, pada jalur pergerakan protein akan
didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah
terseparasi berdasarkan berat molekulnya. Dalam satu sampel protein bisa lebih
dari satu bahkan puluhan band dalam gel poliakrilamida. Dalam kondisi tidak
diwarnai, protein tersebut tidak terlihat karena memang protein dalam sampel
tidak berwarna. Setelah diwarna dengan staining solution yang mengandung
Coomassie brilliant blue R-250, protein yang tidak berwarna tersebut menjadi
berwarna biru karena mengikat Coomassie blue. Dalam kondisi ini kita bisa
mengetahui keberadaan dan mengukur mobilitas protein untuk kemudian
ditentukan berat molekulnya (Fatchiyah dkk., 2012).
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada
pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada
dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan
bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. pH bufer elektroforesis berkisar
8 - 9 yang akan menyebabkan sebagian besar protein bermuatan negatif yang
akan bergerak ke anoda. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk
memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya (Fatchiyah dkk., 2012).
Elekroforesis gel DNA yang berukuran besar biasanya menggunakan
elektroforesis gel agarosa. Hasilnya dapat dianalisis secara kuantitatif melalui
visualisasi gel dengan cahaya ultra violet dan peralatan gambamya. Gambar
direkam dengan kamera yang dioperasikan dengan computer dan intensitas pita
diukur dan dibandingkan dengan DNA baku atau penanda yang dimasukkan
12
pada gel yang sama. Pengukuran dan analisis kebanyakan dilakukan dengan
perangkat lunak khusus (Binur, 2013).
Perbedaan nyata antara pita dipengaruhi oleh persentase agarosa, waktu
elekroforesis, konsentrasi Etidium Bromide, derajat superkoil dan ukuran serta
kompleksitas DNA. Peningkatan konsentrasi agarosa gel mengurangi kecepatan
migrasi dan kemampuan memisahkan molekul DNA lebih kecil. Lebih tinggi
voltase, lebih cepat migrasi DNA. Tetapi volstase dibatasi oleh panas dan
akhirnya dapat menyebabkan gel meleleh. Voltase tinggi juga mengurangi
resolusinya (di atas 5 sampai 8 V/cm). Molekul lebih pendek bergerak lebih
cepat daripada molekul lebih panjang (Binur, 2013).
Pada elektroforesis dalam matriks gel poliakrilamid, protein terseparasi
ketika protein bergerak melalui matriks tiga dimensi dalam medan listrik.
Matriks poliakrilamid berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran
dan menstabilkan pH bufer agar muatan protein tidak berubah. Poliakrilamid
dapat memisahkan protein dengan kisaran berat molekul 500 - 250.000 atau
polinukleotida dengan kisaran 5 - 2000 pasang basa. Pori matriks ini terbentuk
dari ikatan silang antara akrilamid dan bisakrilamid. Ukuran pori pada gel
poliakrilamid dapat dikecilkan dengan cara meningkatkan persentase total
akrilamidatau dengan meningkatkan banyaknya ikatan silang dengan
bisakrilamid (Fatchiyah dkk., 2012).
13
BAB III
METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada tanggal 3 – 6 Desember 2013 yang
bertempat di Laboratorium Bioteknologi Universitas Negeri Papua. Ekstraksi
DNA dilakukan pada tanggal 3 Desember 2013 pukul 10.20 - 12.30 WIT, PCR
dilakukan pada tanggal 5 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT dan
Elektroforesis dilakukan pada tanggal 6 Desember 2013 pukul 08.00 - 10.30 WIT.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Ekstraksi DNA
No. Alat Bahan
1 Vorteks Sampel (Kaki Renang Udang Galah)
2 Mikrosentrifuge Larutan ekstraksi Chelex 10%
3 Alkohol burner Sarung tangan
4 Heating block Alkohol
5 Timer Tisu
6 Spiner
7 Pinset
8 Gelas piala
9 Pulpen waterproff
10 Lembar kerja Chelex
11 Microtube
3.2.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
No. Alat Bahan
1 Mesin PCR (Thermal cycler) DNA template (Sampel hasil ekstraksi)
2 Micropipet eppendrof Kontrol positif dan kontrol negatif
3 Tip pipet ddH2O
4 Tube PCR + Rak 10 x PCR Buffer (PE-II)
5 Kalkulator dNTPs (8 µM)
6 Alat tulis MgCl2 (25 mM)
7 Lembar kerja PCR Primer 1 foward (10 mM)
8 Kotak sampah Primer 2 reverse (10 mM)
9 Pulpen waterproff PE Amplitaq (5 units/µL)
10 Mikrosentrifuge/Spiner
11 Sarung tangan
14
3.2.3 Elektroforesis
No. Alat Bahan
1 UV transluminator Agarose
2 Micropipet eppendrof TAE Buffer
3 Tip pipet EtBr (Ethidium Bromida)
4 Neraca digital ddH2O
5 Tabung Erlenmeyer Produk smapel PCR
6 Mikrowave Parafilm
7 Spatula Loading dye
8 Kamera digiatl DNA ladder
9 Sarung tangan putih + biru
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Ekstraksi DNA
1. Menggunakan sarung tangan dan mengambil sejumlah sampel udang galah
yang akan diekstraksi.
2. Mengambil microtube yang berisi 0,65 mL Chelex dari lemari pendingin
sebanyak jumlah sampel yang akan diekstraksi.
3. Mengisi lembar kerja Chelex dengan jenis Sampel, Tanggal, Metode
Ekstraksi, Kode Sampel, dan Lokasi pengambilan sampel, kemudian
menandai tabung (microtube) Chelex sesuai dengan daftar sampel dalam
lembar kerja Chelex dengan menuliskan kode sampel pada tutup tabung
dan tanggal ekstraksi di samping tabung.
4. Menghidupkan heating bock dan mengaturnya hingga suhu 95o
C.
5. Menuangkan alkohol 96% ke dalam gelas piala untuk mencuci penjepit
(pinset).
6. Memasukkan pinset dalam alkohol lalu memanaskan dengan alkohol
burner dan mengulaginya sebanyak 3 kali.
7. Menggunakan penjepit steril, mengambil potongan kecil dari jaringan
sampel, membuka tutup tabung Chelex, memasukkan potongan sampel
sebesar titik (.) ke dalam tabung Chelex yang sudah ditandai, lalu tabung
ditutup kembali.
8. Mengulangi langkah 6 - 7 di atas untuk setiap sampel dengan tabung
chelex baru, memastikan penjepit tetap steril dengan tiga kali pemanasan
dengan dicelupkan terlebih dahulu kedalam alkohol antara sampel-sampel.
9. Setelah selesai, sampel-sampel dalam Chelex diaduk secukupnya selama
15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20 detik dengan
kecepatan tinggi dalam microsentrifuge.
10. Sampel diinkubasi selama 30 menit pada suhu 95o
C dalam heating block.
11. Setelah selesai, sampel-sampel tersebut diaduk atau digoyang getar lagi
secukupnya selama 15 detik dan sampel-sampel dispin (diputar) selama 20
detik dengan kecepatan tinggi dalam microsentrifuge.
15
12. Sampel siap digunakan untuk Reaksi PCR dan lebih baik jika disimpan
dulu selama semalam dalam freezer.
3.3.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
1. Keluarkan reagen: ddH2O, dNTPs, buffer PCR, MgCI2, Primer 1, dan
Primer 2 dari freezer untuk mencairkan.
2. Mengisi formulir Hotstart PCR (24 µL) dengan mengisi tanggal, locus,
primer, Nama, dan Spesies sampel.
3. Menghitung dan menggandakan volume dari protokol baku dalam formulir
Hotstart PCR untuk membuat Master Mix (MM1 dan MM2) sebanyak jumlah
sampel yang digunakan ditambah dengan dua buah kontrol dan dilebihkan satu
untuk menghindari kekurangan pada saat digunakan.
4. Menandai dan menomori tabung PCR dalam rack, mengatur sampel
sehingga berada dalam pola yang berhubungan dengan tabung PCR yang
ditandai, serta mengatur tabung ekstra untuk kontrol.
5. Membuat campuran Master Mix (MM1) gunakan pipet NO DNA,
tambahkan bahan sesuai dengan volume yang telah dihitung dalam daftar
di lembar PCR di tabung 1.5 mL. Menggunakan tip berbeda untuk setiap
penambahan reagen. Pipet naik dan turun untuk mencampur reagen
sepenuhnya.
6. Menggunakan pipet NO DNA untuk membagi 14 µL MM1 ke dalam
setiap tabung PCR dan menambahkan 1 µL DNA template (hasil
ekstraksi) untuk setiap tabung. Sampel-sampel ini termasuk DNA ekstrak,
control positif PCR dan control negative Chelex. Ambil dari atas setiap
ekstrak Chelex karena tambahan butiran Chelex akan menghambat PCR.
Selau mengganti tip baru untuk setiap sampel.
7. Mengambil Taq dari freezer. Mengunakan pipetteman Enzim, mengambil
Taq sesuai dengan jumlah yang diinginkan dari bagian paling atas cairan.
Mengembalikan Taq ke freezer. Dengan hati-hati menambahkan Taq ke
MM2. Pipet naik turun untuk mencampur. mengamati hilangnya gliserol
dalam larutan.
8. Memilih dan memulai program hot-star PCR. Membiarkan penutup panas
dan menahan sebentar bila suhu mencapai 80° C.
9. Menempatkan strip tabung ke dalam mesin PCR (memastikan semua
tertutup untuk mencegah penguapan reaksi PCR).
10. Dengan pipet DNA rendah, mengatur 10 µL pipetman, pipet naik turun
MM2 untuk mencampur campuran master. Kemudian, dalam satu waktu,
membuka tutup tabung, menambahkan MM2, pipet naik turun, dan
menutup kembali. Mengulangi untuk setiap tabung dan mengganti tip
untuk setiap sampel.
16
11. Memeriksa kembali untuk memastikan semuanya telah tertutup. Unpause
program dan lihat layar mesin PCR untuk menjamin bahwa mesin PCR
sedang bekerja.
12. Membersihkan tempat kerja, meletakkan reagen ke dalam freezer dan
ekstrak DNA ke dalam lemari pendingin.
3.3.3 Elektroforesis
1. Membuat gel agarosa 2% dengan cara menyiapkan erlenmeyer,
menimbang 0,8 gram agarosa dan memasukkan ke dalam erlenmeyer,
kemudian menambahkan 40 ml TAE Buffer.
2. Memanaskan dalam microwave dan mengecek setiap menit serta
mengaduk-aduk (dengan menggoyang-goyang erlenmeyer) hingga jernih.
3. Mengambil dan mengaduk lagi, kemudian menyiapkan cetakan agarosa
dan sisir pembuat sumur.
4. Menuangkan gel agarosa ke dalam cetakan, dan meratakan serta
memastikan tidak ada gelembung dan kotoran di dalam gel. Mendiamkan
selama kurang lebih 30 menit sampat memadat.
5. Setelah dingin dan padat, melepar sisir dan memasukkan gel yang telah
jadi beserta cetakanya ke dalam tangki elektroforesis yang telah bereisi
buffer.
6. Mengambil parafilm, kemudian meneteskan loading dye di atas parafilm,
kira-kira volumenya 1 µL.
7. Mengambil 4 µL DNA PCR produk, kemudian mencampurkan dengan
loading dye, dan mengambil menggunakan pipet serta memasukkan ke
dalam sumur gel nomor dua yang berada dalam tangki elektroforesis.
8. Setelah semua sampel selesai, memasukkan DNA ladder atau penanda
pada sumur nomer 1 masing-masing baris, lalu tutup tangki tersebut.
9. Mensetting mesin pada voltase 200 V dan arus 72 mA dan waktu 15
menit, kemudian jalankan mesin.
10. Setelah selesai, ambil jel dan rendam selama 15 menit dalam larutan EtBr
lalu cuci dengan ddH2O. Selalu menggunakan sarung tangan berwarna
biru dalam melakukan langkah ini.
11. Setelah selesai, mengambil jel dan meletakkan di atas box UV
transluminator, kemudian tutup box kaca UV, dan nayalakan lampu UV.
12. Melihat adanya pita terang pada sampel yang positif mengandung DNA
dan berhasil diamplifikasi dengan PCR.
13. Mengambil kamera dan memfoto gel, setelah itu membuang gel ke dalam
box tempat pembuangan gel.
14. Membersihkan semua lokasi yang digunakan untuk bekerja.
17
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum
4.1.1 Ekstraksi DNA
Tabel 2. DNA Extraction Data Sheet
Samples : Udang Galah Date : 03 Desember 2013
Extraction Mthod : Chelex
Tube
Type
Number Locality PCR Col
Seq
Other
UGMK02 Merauke
UGMK03 Merauke
UGMK06 Merauke
UGMK07 Merauke
UGMK08 Merauke
UGMK11 Merauke
UGMK13 Merauke
UGMK14 Merauke
UGMK15 Merauke
UGMK16 Merauke
UGJA03 Jayapura
Supernatan/DNA template
Chelex
(a) (b)
Gambar 2. a. Sampel udang galah; b. Hasil ekstraksi DNA
4.1.2 Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Tabel 3. Perhitungan penggandaan Master Mix untuk: 7 tubes (Bidik Misi)
STANDART PROTOCOL
( 1 µL of Template DNA) Total MM1 MM2 ACTUALPROTOCOL
( 1 µL of Template DNA) MM1 MM2
ddH2O 14,5 5,5 9 ddH2O 38,5 63 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 1,5 1 10 x PCR Buffer (PE-II) 10,5 7 dNTPs (8 µM) 2,5 2,5 -- dNTPs (8 µM) 17,5 -- MgCl2 (25 mM) 2,0 2,0 -- MgCl2 (25 mM) 14 -- Primer 1 foward (10 mM) 1,25 1,25 -- Primer 1 foward (10 mM) 8,75 --
18
Primer 2 reverse (10 mM) 1,25 1,25 -- Primer 2 reverse (10 mM) 8,75 -- PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 -- 0,125 PE Amplitaq (5 units/µL) -- 0,875 Total 24 14 10,125 Total 98 70,875
Gambar 3. Setingan Siklus Reaksi Polimerasi dalam Thelmal Cycler
Gambar 4. Hasil PCR
4.1.3 Elektroforesis
(a) (b)
Gambar 5. Hasil elektroforesis produk PCR pada gel agarosa
dilihat dengan sinar UV
4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini kami telah melakukan analisis DNA dari udang galah
sebanyak 11 sampel, yang dibagi menjadi 7 sampel kelompok Bidik Misi dan 4
sampel kelompok umum. Rangkaian kegiatan dalam praktikum ini dimulai dari
Ekstraksi DNA, Reaksi Berantai Polimerase (PCR) dan diakhiri dengan
Elektroforesis.
DNA
Ladder
19
Ekstraksi DNA
Teknik ekstraksi yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah teknik
Chelex. Teknik ini hanya dapat digunakan untuk persiapan PCR. Meskipun
memiiiki keterbatasan, teknik ini unggul dalam hal cepat, murah dan efektif untuk
ekstraksi DNA. Metode chelex disarankan untuk preparasi DNA karena tidak
membutuhkan tabung-tabung untuk transfer. Metode ini cepat dan menghasilkan
kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji kompleks PCR.
Teknik Chelex umumnya mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan
prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen,
kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,
magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya.
Tahap pertama prosedur ekstraksi DNA adalah memasukkan potongan
jaringan sampel dengan ukuran seperti sebuah titik (.) ke dalam larutan Chelex.
Pemotongan yang terlalu besar dapat menghambat reaksi. Setelah itu larutan
dispin (diputar) dan dipanaskan dengan suhu 95oC selama 30 menit. Pemanasan
tersebut membantu memecahkan sel dan mendenaturasi protein. Seluruh kegiatan
ekstraksi dilakukan dalam kondisi steril untuk menghindari kontaminasi. Selain
itu, Chelex juga dapat melindungi sampel dari DNAse dan mencegah sampel dari
kontaminan. Setelah pemanasan selesai, larutan dispin kembali dan akan
menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan
supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex.
Supernatan tersebut merupakan bagian yang akan digunakan dalam reaksi PCR.
Reaksi Polimerase Berantai (PCR)
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction
(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi
nukleotida secara in vitro. PCR adalah teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi
bagian DNA spesifik yang terletak di antara dua bagian DNA yang telah
diketahui. PCR merupakan teknik biokimia dan biologi molekuler untuk isolasi
dan amplifikasi secara eksponensial fragmen atau urutan sasaran DNA melalui
replikasi enzimatik, atau tanpa menggunakan mahluk hidup (seperti E. coli atau
ragi).
20
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis
molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut
melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo
Cycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida
yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target
disebut forward dan yang berada setelah daerah target disebut reverse. Enzim
yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai
enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR
diperlukan dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida berbasis Adenin), dCTP
(Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Thymine).
Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen, yaitu
DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran 24 µL,
sehingga dalam satu tube volume total yang dibutuhkan adalah 25 µL.
Komponen-komponen campuran tersebut antara lain ddH2O 14,4 µL, 10 x PCR
Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL, MgCl2 (25 mM) 2 µL, Primer
forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10 mM), dan PE Amplitaq (5
units/µL) 0,125 µL. Komponen ddH2O merupakan air steril atau air yang bebas
molekul. Dalam reaksi PCR, dibutuhkan buffer sebagai penyangga reaksi.
Deoxyribonukleat Tri Phospat (dNTPs) merupakan komponen yang penting
dalam berjalannya reaksi PCR. Kedua primer digunakan untuk menginisiasi reaksi
PCR dari ujung 3’ ke 5’ dan sebaliknya. Yang paling penting dalam reaksi PCR
adalah enzim polymerase, contohnya PE Amplitaq.
Dalam mengerjakan reaksi PCR, selain sampel juga dibutuhkan suatu DNA
control positif dan DNA control negatif. DNA control positif merupakan suatu
DNA template yang sebelumnya telah berhasil dikerjakan dalam reaksi PCR,
sedangkan DNA control negatif merupakan hasil ekstraksi yang tidak
mengandung sampel yang digunakan untuk mengetahui adanya kontaminan antar
sampel. Selain itu komponen-komponen PCR harus dipisahkan dalam bentuk 2
buah Master Mix, yaitu MM1 dan MM2 untuk memudahkan langkah pengerjaan
PCR. Pemisahan ini harus dihitung dengan mengalikan jumlah tube yang
21
diinginkan dengan faktor perkalian yang telah ditentukan pada MM1 dan MM2.
Hal ini tergantung metode PCR yang digunakan.
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,
annealing dan ekstensi (pemanjangan). Sesuai profil yang digunakan seperti
dalam gambar 3, proses berjalanya siklus PCR dalam Thermal Cycler dapat
dijelaskan sebagai berikut. Langkah awal proses didahului dengan tahap
pradenaturasi yaitu pemanasan sampai suhu 80o C. Pada suhu 94
o C, molekul
DNA mengalami denaturasi sehingga struktur berubah dari untai ganda menjadi
untai tunggal. Pada suhu berkisar antara 50o C, primer forward yang runtutan
nukleotidanya berkomplemen dengan salah satu untai tunggal akan menempel
pada posisi komplemennya. Demikian juga primer reversenya akan menempel
pada untai tunggal lainnya. Proses ini disebut annealing. Setelah kedua primer
tersebut menempel pada posisinya masing-masing enzim polymerase mulai
mensintesis molekul DNA baru yang dimulai dari ujung 3’ nya masing-masing
primer pada suhu 72o C. Proses ini disebut ekstensi/pemanjangan. Dengan
demikian, satu molekul DNA ganda akan berlipat jumlahnya menjadi dua molekul
DNA. Setelah itu proses denatuasi, penempelan (annealing), ekstensi
(pemanjangan) tersebut diulangi sebagai suatu siklus. Dalam proses PCR yang
telah kami lakukan, siklus tersebut diulang sebanyak 38 siklus. Hasil PCR
tersebut kemudian diverifikasi keberhasilannya menggunakan elektroforesis.
Elektroforesis
Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose, karena dengan
menggunakan gel agarose teknik yang digunakan cukup sederhana, dan mudah
penanganannya. Selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan
dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000
pb. Penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari
DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Ethidium
Bromida (EtBr) sebagai pewarna. EtBr nantinya akan berinteraksi dengan basa
dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu
UV. Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita
DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.
22
Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari molekul
DNA/RNA. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel
DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA ladder) yang telah diketahui
ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum
dipaparkan di atas sinar ultraviolet.
Dalam proses elektroforesis yang telah dilakukan, sampel molekul DNA yang
telah dicampur dengan larutan loading dye ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik
dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel
tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai
dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju
elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat
yang dimilikinya. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses
pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi.
Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat
pewarnanya.
Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet, apabila proses PCR berhasil maka
akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel. Satu
lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Penanda (marker) atau
DNA ladder yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda
dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan
mengelektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel.
Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk
menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul.
23
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Ekstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-
langkah kerja analisis DNA. Teknik Chelex adalah metode ekstraksi yang cepat
dan efektif menghasilkan kualitas DNA baku yang dapat digunakan dalam uji
kompleks PCR. Teknik Chelex mengeluarkan DNA untai tunggal menggunakan
prosedur penambahan suspensi resin-chelat secara langsung untuk spesimen,
kemudian melalui resin penukar ion yang mengikat ion metal polivalen,
magnesium. Dalam tahap terakhir, logam membawa materi lain dengannya yang
menghasilkan larutan dalam dua fraksi, yaitu fraksi bagian atas merupakan
supernatan yang mengandung DNA dan fraksi bawah merupakan endapan Chelex.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu reaksi in vitro untuk
menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis
molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut
melalui bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu Thermo
Cycler. Dalam satu tube reaksi PCR harus mengandung beberapa komponen,
yaitu DNA template (sampel hasil ekstraksi) 1 µL dan komponen campuran antara
lain ddH2O 14,4 µL, 10 x PCR Buffer (PE-II) 2,5 µL, dNTPs (8 µM) 2,5 µL,
MgCl2 (25 mM) 2 µL, Primer forward (10 mM) 1,25 µL, Primer reverse (10
mM), dan PE Amplitaq (5 units/µL) 0,125 µL. Proses PCR merupakan proses
siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing dan ekstensi/pemanjangan
dengan pengulangan sebanyak kurang lebih 38 siklus.
Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk
mengidentifikasi atau memverifikasi keberhasilan reaksi PCR molekul DNA.
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Molekul
DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui
matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin
rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan
dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen
24
molekul DNA standar (DNA ladder) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi
DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih
dahulu direndam di dalam larutan EtBr sebelum dipaparkan di atas sinar
ultraviolet.
5.2 Saran
1. Sebaiknya langkah-langkah kegiatan praktikum harus dilakukan dengan
tepat dan sangat hati-hati karena kesalahan yang terjadi dapat
mengakibatkan pengaruh yang kurang baik terhadap hasil. Hal ini
terutama dalam penggunaan bahan harus sesuai dengan aturan yang telah
ditentukan dalam petunjuk kegiatan praktikum.
2. Seluruh kegiatan analisis DNA harus dilakukan secara aseptis dan steril
agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat mempengaruhi hasil reaksi.
3. Praktikan harus berhati-hati saat melakukan perendaman dalam EtBr dan
visualisasi dengan sinar UV, karena kedua hal tersebut sangat berbahaya
bagi kesehatan apabila dilakukan dengan ceroboh.
25
DAFTAR PUSTAKA
Anam K. 2010. Isolasi dan Pemetaan DNA Plasmid. Bogor : Bioteknologi
Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Binur, Robi. 2013. Panduan Praktikum Biologi Molekuler. Manokwari: Jurusan
Biologi FMIPA UNIPA
Fatchiyah dkk. 2012. Buku Praktikum Teknik Analisis Biologi Molekuler. Malang:
Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler FMIPA Universitas
Brawijaya.
Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan
Polymerase Chain Reaction. Surabaya: Pusat Studi Bioteknologi.
Universitas Surabaya.
Jusuf, Muhammad. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Bandung: ITB.
Juwita dan Sinaga, Rika Nailuvar. 2012. Laporan Praktikum Isolasi DNA dan
Teknik PCR. Medan : USU Resepstory.
Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Geneitika. Bogor : IPB Press
Maulana, Ridwan. dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA. Jakarta:
Jurusan Pendidikan Biologi FMIPA UPI
Prasetyoputri, Anggia. 2005. Bengkel Ilmu Genetik. Jakarta: Erlangga.
Sutomo, Juanda. 2002. Genetika Lanjutan Universitas. Jakarta: Erlangga.
Walsh, PS, Mezger, D.A., Higuchi, R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple
extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.
Biotechniques.