Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Ekstrakcija flavonoida iz biljne vrste Anethum graveolens

L. Uticaj različitih parametara procesa, kinetika i

termodinamika

Master rad

Mentor

Prof. dr Milan Mitić

Kandidat

Miloš Nikolić 155

Niš, 2019. god

Прилог 4/1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Милош Николић

Ментор, МН: др Милан Митић

Наслов рада, НР:

Екстракција флавоноида из биљне врсте Anethum

graveolens L. Утицај различитих параметара процеса,

кинетика и термодинамика

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Српски

Земља публиковања, ЗП: Србија

Уже географско подручје, УГП: Србија

Година, ГО: 2019

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33

Физички опис рада, ФО: 6 поглавља/ 55 стране/ 53 цитата/ 13 табела/ 19

слика/графика/ 0 прилога

Научна област, НО: Хемија

Научна дисциплина, НД: Аналитичка и физичка хемија

Предметна одредница/

Кључне речи, ПО:

Кинетика; Термодинамика; Флавоноиди;

Екстракција;

УДК [66.061.3+547.972]:582.794.1

582.794.1:544.3/.4

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ:

Hlorogenska i ferulna kiselina su ekstrahovane iz mirođije postupkom

maceracije. Kao rastvarač korišćen je vodeni rastvor etanola koncentracije 50%,

pri hidromodulu od 20 ml/g. Ekstrakcija je izvedena na 30, 40 i 50oC. Za

modelovanje kinetike ekstrakcije fenolnih kiselina iz mirođije 50% etanolom

korišćena su dva modela: model zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije kroz

biljni materijal i empirijski model Ponomarjeva. Vrednosti ΔHo, ΔSo i ΔGo

ukazuju da je proces ekstrakcije hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije

spontan, nepovratan i endoterman.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови

комисије,

КО:

Председник:

Члан:

Члан, ментор: др Милан Митић

Образац Q4.09.13 – Издање 1

Прилог 4/2

ПРИРОДНО – МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: Monographic

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: University Master’s degree thesis

Author, AU: Miloš Nikolić

Mentor, MN: dr Milan Mitić

Title, TI:

Extraction of flavonoids from the plant species Anethum

graveolens L. Influnce of various process parameters,

kinetics and thermodynamics

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2019

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33

Physical description, PD: 6 chapters / 55 pages / 53 ref / 13 tables / 19 figures /

graphics / 0 appendices

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: Analytical and physical chemistry

Subject/Key words, S/KW: Kinetics; Thermodynamics; Flavonoids; Еxtraction;

UC [66.061.3+547.972]:582.794.1

582.794.1:544.3/.4

Holding data, HD: Library

Note, N:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Abstract,

AB:

Chlorogenic and ferulic acid were extracted from the dill using a maceration

process. Aqueous solutions of 50% ethanol were used as a solvent at a

hydromodule of 20 ml/g. The extraction was performed at 30, 40 and 50 0C.

Two kinetic models were used to describe extraction of phenolic acids from

extracts: a model based on the theory of non-stationary diffusion through plant

material and model based on Ponomaryov’s equation. The values of ΔHo, ΔSo

and ΔGo indicate that the process of extraction of chlorogenic and ferulic acid

from dill is spontaneous, irreversible and endothermic.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended

Board, DB:

President:

Member:

Member, Mentor: Dr Milan Mitić

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u laboratorijama Katedre za

analitičku i fizičku hemiju, Departmana za hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta,

Univerziteta u Nišu.

Ovom prilikom bih želeo da se zahvalim svom mentoru, dr Milanu Mitiću, vanrednom

profesoru na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu na pomoći oko izbora teme,

definisanju njenih okvira, na ukazanom poverenju i na savetima tokom izrade

eksperimentalnog dela i pisanja master rada. Takođe bih se zahvalio i Sonji Janković na

pomoći i podršci tokom izrade ovog master rada.

Posebnu i veliku zahvalnost dugujem svojoj porodici i prijateljima jedom rečju svima

koji su bili uvek tu za mene, dali podršku, imali strpljenja i razumevanja za mene. Posebno

bih se zahvalio mom deki Petroniju koji mi je bio podrska tokom celog zivota.

Hvala vam.

Sadržaj 1. UVOD ............................................................................................................... 9

2. TEORIJSKI DEO ............................................................................................ 12

2.1. Mirođija (Anethum graveolens L.) ............................................................ 13

2.1.1. Sistematika biljne vrste Anethum graveolens .................................... 13

2.2. Hemijski sastav ......................................................................................... 15

2.2.1. Fenolna jedinjenja ............................................................................... 15

2.2.2. Flavonoidi ........................................................................................... 16

2.2.3. Fenolne kiseline .................................................................................. 20

2.3. EKSTRAKCIJA ........................................................................................ 21

2.3.1. Ekstrakcija čvrsto-tečno ..................................................................... 21

2.3.2. Faktori koji utiču na prenos mase ....................................................... 22

2.3.3 Matematičko modelovanje .................................................................. 23

2.3.4. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji u biljnoj sirovini ............ 24

2.3.5. Empirijska jednačina Ponomarjeva .................................................... 26

2.4. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) ................................. 27

3. EKSPERIMENTALNI DEO .......................................................................... 30

3.1. Biljna sirovina ........................................................................................... 31

3.2. Reagensi .................................................................................................... 31

3.3. Ekstrakcija iz biljne sirovine .................................................................... 31

3.4. Inicijalni sadržaj fenolnih kiselina u mirođiji (qo) ................................... 31

3.5. Aparati ....................................................................................................... 32

3.6. HPLC analiza etanolnih ekstrakata mirođije ............................................ 33

3.7. Statistička obrada podataka ...................................................................... 34

4. REZULTATI I DISKUSIJA ........................................................................... 35

4.1. Modelovanje kinetika ekstrakcije hlorogenske i ferulne kiseline iz

mirođije ............................................................................................................ 36

4.1.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal ....... 39

4.1.2. Model Ponomarjeva ............................................................................ 41

4.2. Kinetički parametri ................................................................................... 44

4.2.1. Poređenje modela................................................................................ 45

4.3. Termodinamički parametri ....................................................................... 46

5. ZAKLJUČAK ................................................................................................. 49

6. LITERATURA ................................................................................................ 51

9

1. UVOD

10

Upotreba aromatičnih i začinskih biljaka kao prirodnih konzervanasa datira još iz

preantičkih i antičkih vremena. Naime, još su stari narodi zapazili da dodavanje začina ne

samo da poboljšava ukus i miris hrane već i sprečava njeno kvarenje i produžava održivost

namirnica. Kasnija istraživanja dokazala su da začinske biljke sadrže supstance sa izraženim

baktericidnim i fungicidnim delovanjem (etarska ulja) kao i supstance sa snažnim

antioksidantnim delovanjem, koje se najčešće pripisuje jedinjenjima fenolne strukture

(Mimica-Dukić, 2003).

Primena lekovitih i aromatičnih biljaka u prehrambenoj industriji doživela je

ekspanziju u poslednjih desetak godina, posebno od kada je kao svetski trend u ishrani

uvršćena tkz. “funkcionalna hrana“, koja pored nutritivnih, poseduje i lekovita svojstva.

Moderne prehrambene tehnologije već koriste začinske i lekovite biljke u proizvodnji mesa i

mesnih prerađevina, mlečnih i pekarskih proizvoda.

Mirođija (Anethum graveolens L.) pripada rodu Anethum L., familiji Apiaceae

(Umbelliferae) (Tucakov, 1997; Stanojević i sar. 2014). U narodu je poznata kao: anita, dil,

kopar, koper, kopra, kopr, mirođija, mirudija, sladki janež (Tucakov, 1997).

Mirođija se tradicionalno koristi za ublažavanje umora pri poremećaju sna,

sprečavanje i lečenje raznih bolesti: za prevenciju i lečenje bolesti i poremećaja funkcije

gastrointestinalnog trakta, bubrega i mokraćnih puteva, nesanice i grčeva. To je dobro

poznata kultivisana začinska aromatična biljka, koja se i sama razmnožava po vrtovima.

Zahvaljujući naučnim saznanjima, danas je poznato da je medicinski značaj lekovitog

bilja u uskoj vezi sa sadržajem sekundarnih biomolekula, od kojih neki ispoljavaju izrazito

snažne farmakološke efekte.

Iako je do danas izolovano više od 1500 sekundarnih biomolekula iz biljaka, smatra se

da je to manje od 10% hemijskih supstanci biljnog sveta.

Fenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu heterogenu grupu

sekundarnih biljnih metabolita i jednu od najvažnijih klasa prirodnih antioksidanasa. To su

supstance koje u strukturi imaju jedan ili više aromatičnih prstenova sa jednom ili više

hidroksilnih grupa i obično se dele na fenolne kiseline, flavonoide, stilbene, kumarine i

tanine. Ove supstance se mogu naći u slobodnom obliku ili češće u obliku

glikozida sa različitim šećernim ostacima ili u obliku kompleksa sa organskim kiselinama,

aminima, lipidima, ugljenim hidratima i drugim polifenolnim jedinjenjima.

Fenolna jedinjenja u biljkama nisu ravnomerno raspoređena na nivou tkiva, ćelijskom

i subćelijskom nivou. Nerastvorni fenoli su sastavni deo ćelijskog zida, dok se rastvorni

fenoli nalaze unutar ćelijskih vakuola. Na nivou tkiva, površinski slojevi sadrže veći nivo

fenola od onih koji se nalaze u njihovim središnjim delovima. Fenoli ćelijskog zida, kao što

su lignini i hidroksicimetna kiselina, povezani su različitim ćelijskim komponentama. Ova

jedinjenja doprinose mehaničkoj otpornosti ćelijskog zida, imaju regulatornu ulogu u rastu i

11

morfogenezi biljke, kao i u reakciji na stres i patogene (Naczk, 2004). Akumulacija

polifenolnih jedinjenja varira i u zavisnosti od fiziološkog stanja biljke, kao rezultat ravnoteže

između biosinteze i daljeg metabolizma (Harborne, 1994).

Ekstrakcija čvrsto-tečno je operacija prenosa mase kojom se jedan ili više sastojaka

izdvaja iz čvrstog materijala pomoću pogodnog rastvarača. Jedan deo čvrstog materijala, koji,

po pravilu, sadrži željenu supstancu, rastvara se u rastvaraču, a zatim se rastvor odvaja od

iscrpljenog, nerastvornog dela čvrstog materijala. Čvrst materijal je najčešće biljna ili

mineralna sirovina, dok se kao rastvarač koristi: voda, organski rastvarači i rastvori kiselina,

baza ili soli. Deo čvrstog materijala koji se rastvara predstavlja ekstraktivne supstance, dok se

dobijeni rastvor naziva ekstrakt ili lug.

Danas se koristi veliki broj ekstrakcionih tehnika i rastvarača za izolaciju različitih

klasa biološki aktivnih jedinjenja iz biljnog materijala (terpeni, vitamini, karotenoidi, masne

kiseline i dr.) (Wang i Weller, 2006). Kod izbora odgovarajuće tehnike ekstrakcije treba

voditi računa o toksičnosti rastvarača, selektivnosti procesa u odnosu na željenu grupu

jedinjenja, kao i na mogućnost razgradnje aktivnih komponenata u ekstraktu. Pri

projektovanju procesa za izolaciju bioaktivnih ekstrakata odlučujući su sledeći faktori: (a)

biljna sirovina, (b) totalni prinos koji se ostvaruje datim postupkom, (c) produktivnost, (d)

selektivnost i (e) regeneracija iskorišćenog rastvarača. Prva tri faktora su direktno povezana

sa ekonomskom održivošću datog procesa, četvrti sa kvalitetom i čistoćom finalnog

proizvoda, dok je poslednji u vezi ne samo sa ekonomikom procesa već i sa očuvanjem

životne sredine.

U ovom radu je ispitavana kinetika i efikasnost ekstrakcije hlorogenske i ferulne

kiseline postupkom maceracije iz mirođije pri različitim operativnim uslovima (vreme

ekstrakcije i temperatura ekstrakcije). Kao rastvarač, korišćen je vodeni rastvor etanola

koncentracije 50 % (v/v), pri hidromodulu 1:20 (g/ml). Za modelovanje kinetike ekstrakcije

čvrsto-tečno korišćeni su sledeći modeli: model zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije

kroz čvrst materijal i empirijski model Ponomarjeva.

12

2. TEORIJSKI DEO

13

2.1. Mirođija (Anethum graveolens L.)

2.1.1. Sistematika biljne vrste Anethum graveolens

Mirođija ili kopar (lat. Anethum graveolens L.) (slika 1), pripada rodu Anethum L. i

familiji Apiaceae (Umbelliferae) (Tucakov, 1997; Leung i sar., 2003) (Tabela 1). Ova

jednogodišnja začinska biljka raste oko metar visine. Karakteriše je razgranata i rascepkana,

igličasta lisna ploča, mali žuti cvetići kao i jajoliki plodovi (slika 1). Zbog brze vegetacije

može se saditi više puta godišnje (Leung i sar., 2003). Poreklo vodi iz Južne Evrope, i

pogoduju joj sunčani predeli. Raste u skoro svim predelima. Za ishranu je najbolje upotrebiti

sveže lišće mirođije.

Slika 1. Mirođija (Kišgeci, 2002)

14

Lekovite i aromatične supstance se u najvećoj koncentraciji mogu naći u plodovima,

zatim listovima i cvetu. Zbog toga se kao lek najviše upotrebljava plod. Ova biljka je bogata

polifenolnim jedinjenjima poput derivata hidroksicimetne kiseline, kumarina i flavonoida, od

kojih najviše ima kvercetina i rutina (Ortan i sar., 2009).

Tabela 1. Taksonomske kategorije mirođije

Taksonomske kategorije Taksoni

Regnum – Carstvo Plantae

Ordo – Red Apiales

Familia – Familija Apiaceae

Genus – Rod Anethum

Mirođija ima prijatan miris i karakterističan ukus. Kao začin se koristi cela biljka sa

plodovima. Primena mirođije u medicinske svrhe datira još iz drevne prošlosti i ta primena je

dobro opisana u istoriji staroga Egipta. U svetu je medicinska primena veoma široko

rasprostranjena, a najčešće se upotrebljava kao diuretik, antipiretik, analgetik, stimulator

apetita, itd (WHO, 2006).

Iako je farmaceutska industrija jedna od najmoćnijih industrija, ljudi se u mnogim

slučajevima okreću narodnoj medicini, odnosno fitoterapiji koja je zasnovana na upotrebi

lekovitog bilja, jer nema neželjenih efekata, za razliku od sintetičkih lekova (Milić i sar.,

2014). Prednost upotrebe prirodnih lekova je u tome što se terapija može primenjivati i

nezavisno od primene drugih preparata. Primena lekovitog bilja u medicini utiče na

proučavanje bilja, i sve intenzivnije izolovanje lekovitih supstanci iz tog bilja, odnosno utiče

na povećanje primene biljnih droga i lekovitih biljnih proizvoda, koji nalaze primenu u

sprečavanju i lečenju mnogih bolesti i simptoma. Samim tim raste interesovanje farmaceutske

industrije, usled primene biljaka kao sirovine za proizvodnju farmaceutskih preparata.

Plod mirođije se takođe upotrebljava u lečenju dispepsije, dok se biljka upotrebljava

za prevenciju i lečenje bolesti digestivnog sistema, bubrega i poremećaja sna.

Preporučuje se dnevni unos 3 g ploda ili 0,1-0,3 ml etarskog ulja, ili propisana

količina preparata (Blumenthal i Busse, 1998). U Ruskoj farmakopeji najveću primenu imaju

plodovi mirođije (Shikov i sar., 2014), dok je u Britanskoj farmakopeji veću primenu našlo

etarsko ulje plodova mirođije (British Pharmacopoeia, 2004).

Takođe, u mnogim farmakopejama primenjuju se i etarsko ulje i plodovi indijske

mirođije (A. graveolens subsp. sowa) (The Ayurvedic pharmacopoeia of India, 1999). Prema

Jugoslovenskoj farmakopeji (Jugoslovenska farmakopeja, 2001), mirođija nije uvršćena kao

droga, ali bez obzira na to ona ima primenu u narodnoj medicini.

15

2.2. Hemijski sastav

Karakterističan miris mirođije potiče od etarskog ulja, koga ima u mirođiji od 3 do 4

%. U etarskom ulju dobijenog iz lista mirođije u najvećem procentu se nalaze dil-etar i α-

felandren od kojih potiče njen specifičan miris. U etarskom ulju plodova preovladava

limonen, karvon i miristicin. Pored ovih komponenti, izolovani su i kumarini, fenolne

kiseline, flavonoidi i steroidi (Aćimovic i sar., 2014).

Od mirođije se koristi nadzemni deo, cvet (Anethi herba), plod (Anethi fructus) i

etarsko ulje (Anethi aetheroleum). Nadzemni organi mirođije sadrže etarsko ulje. U

plodovima ima do 4% etarskog ulja, u svežoj herbi oko 0,5%, a u suvoj do 2%. Etarsko ulje

je bezbojna ili žućkasta, providna tečnost prijatnog i oštrog mirisa. Najviše sadrži alfa-

karvona (do 70%), beta-limonena, felandrena i dr. U mladim razvojnim stadijumima u ulju

preovladava felandren, dok je karvon slabo zastupljen. Daljim razvojem opada sadržaj

felandrena a sadržaj karvona raste. Pri toplom sunčanom vremenu u etarskom ulju ima uvek

više karvona, dok pri hladnom i kišnom njegov sadržaj opada. U plodovima se nalazi do 18%

masnog ulja i do 16% belančevina.

Pored minerala (kalcijum, mangan i gvožđe), mirođija je bogata i mnogim

vitaminima neophodnim za dobro zdravlje kao što su folna kiselina, niacin, riboflavin,

vitamin A, vitamin C i drugi.

2.2.1. Fenolna jedinjenja

Fenolna jedinjenja su supstance koje sadrže aromatični prsten za koji je vezana jedna

ili više hidroksilnih grupa. Velika je raznovrsnost fenola prisutnih u biljkama, a mogu se

klasifikovati prema hemijskoj strukturi, biološkoj funkciji i biosintetskom poreklu ovih

jedinjenja. Fenoli se prema strukturi osnovnog skeleta mogu podeliti: C6 (jednostavni fenoli,

benzohinoni), C6-C1 (fenolne kiseline), C6-C2 (fenilsirćetne kiseline), C6-C3 (hidroksicimetne

kiseline, kumarini, fenilpropani, hormoni), C6-C4 (naftohinoni), C6-C1-C6 (ksantoni), C6-C2-

C6 (stilbeni, antrahinoni) C6-C3-C6 (flavonoidi, isoflavonoidi, neoflavonoidi), (C6-C3-C6)2,3

(bi-, triflavonoidi), (C6-C3)2 (lignani), (C6)n (katehol melanini) i (C6-C3-C6)n (kondenzovani

tanini) (Lattanzio 2013).

Kao prirodni izvori polifenolnih jedinjenja u literaturi se najčešće spominju začinsko i

lekovito bilje, ali to mogu biti i voće, povrće, žitarice, brojni životinjski i mikrobiološki

proizvodi. (Naczk i Shahidi, 2006).

16

2.2.2. Flavonoidi

Flavonoidi pripradaju grupi polifenolnih jedinjenja, odnosno fenola. Aglikonska

komponenta flavonoidnih heterozida je flavonoid. Osnovu aglikona čine γ-piron, benzo-γ-

piron i flavon (slika 2). Flavonoidi su sekundarni metaboliti i nalaze se uglavnom u biljkama.

U životinjskom svetu se mogu naći u morskom koralu i u nekim mikroorganizmima a mogu

se naći i u krilima plavog leptira. Nekada su se flavonoidi nazivali vitaminom P usled

njihovog uticaja na permeabilnost vaskularnih kapilara, dok se danas ovaj termin ne

upotrebljava.

Slika 2. Sleva nadesno γ-piron (piranon-4), benzo-γ-piron (hromon) i 2-fenil-benzo-γ-piron

(flavon)

Ugljenični skelet flavonoida sastoji se iz dva benzenova prstena (A i B) koji su

međusobno povezani tročlanim ugljeničnim nizom, i koji sa kiseonikovim atomom formiraju

heteročiklični prsten C (slika 3) (Lea i Leegood, 1999).

Slika 3. Ugljenični skelet flavonoida

Osnovnu strukturu flavonoida čine: flavon koji nastaje iz hromona i flavan koji

nastaje iz hromana (slika 4).

17

Slika 4. Strukturne jedinice flavonoida

Na strukturnu raznolikost flavonoida utiču brojne modifikacije strukture, a koje su

posledica uticaja reakcija hidrogenizacije, O-metilacije hidroksilnih grupa, hidroksilacije,

dimerizacije, glikolizacija hridroksilnih grupa čime nastaju O-glikozidi, zatim glikolizacija

flavonoidnog jezgra koje dovode do C-glikozida i vezivanje neorganskog sulfata (slika 5)

(Mimica-Đukić, 1992).

Metabolizam sinteze sekundarnih metabolita je veoma složen. Od velike važnosti za

istraživanja, a posebno za farmaceutsku i prehrambenu industriju, jesu produkti sekundarnog

metabolizma biljaka (Zhang i Demain, 2005).

18

Slika 5. Šema biosinteze flavonoida u biljkama (Mišan, 2009)

19

Kako su jako rasprostranjeni u prirodi, odnosno biljnom svetu, flavonoidi su za sada

najproučavaniji sekundarni metaboliti biljaka (slika 6). U fotosintezi biljke koriste ugljenik,

od tog ugljenika oko 2% učestvuje u proizvodnji flavonoida i njihovih derivata. Oko 40-50%

mahovina i lišajeva vrši sintezu flavonoida, ali ipak najviše flavonoida proizvode biljke koje

su mlađe od 450 miliona godina. Proizvodnja biosintezom flavonoida raste sa porastom

evolutivnog stadijuma biljke (Mimica-Đukić, 1992).

Slika 6. Neki od flavanoida prisutni u biljakama

20

2.2.3. Fenolne kiseline

Fenolne kiseline su sekundarni metaboliti rasprostranjeni isključivo u biljnom svetu.

Ova jedinjenja su zaslužna za jedinstven ukus i aromu povrća i voća.

Fenolne kiseline mogu se podeliti u dve grupe: derivati hidroksibenzoeve kiseline

(hidroksibenzoeva, galna, vanilinska i elaginska kiselina) i derivati hidroksicimetne kiseline

(p-kumarinska, kafeinska, ferulna, hlorgena i hidroksicimetna kiselina). Osnovna strukture

ovih grupacija prikazane su na slici 7 i 8 (Hidalgo i Almajno, 2017).

Benoeva kiselina 4-hidroksibenzoeva

kiselina

Protokatehinska kiselina Galna kiselina

2,5-dihidroksibenzoeva

kiselina

Siringinska kiselina Salicilna kiselina Vanilinska kiselina

Slika 7: Benzoeva kiselina i njeni derivati

Fenolne kiseline se u biljnom materijalu nalaze uglavnom u vezanoj formi u obliku

estara ili glikozida (Jimenez-Garcia et al., 2012). Supstituenti na aromatičnom jezgru utiču na

stabilizaciju pa samim tim i na antioksidativne osobine fenolnih kiselina. Zahvaljujući svom

prisustvu u hrani biljnog porekla ljudi svakodnevno konzumiraju izvesnu količinu ovih

vrednih bioaktivnih jedinjenja (od 25mg do 1g na dnevnoj bazi) u zavisnosti od zastupljenosti

voća, povrća, žitarica, čaja, kafe i začinau ishrani (Clifford, 1999).

21

Cimetna kiselina p-Kumarna kiselina Kafena kiselina

Ferulna kiselina Sinapinska kiselina

Slika 8. Cimetna kiselina i njeni derivati

2.3. EKSTRAKCIJA

2.3.1. Ekstrakcija čvrsto-tečno

Čvrsto-tečna ekstrakcija je proces ekstrakcije jedinjenja iz čvrstog uzorka i izvodi se

tako što se dovedu u kontakt čvrst material i tečni rastvarač, pri čemu rastvarač prodire u pore

čvrstog materijala. Čvrst materijal je najčešće biljna ili mineralna sirovina, dok se kao

rastvarač koristi: voda, organski rastvarači i rastvori kiselina, baza ili soli. Deo čvrstog

materijala koji se rastvara predstavlja ekstraktivne supstance, dok se dobijeni rastvor naziva

ekstrakt.

Ekstrakcija čvrsto-tečno se najčešće izvodi kao maceracija ili perkolacija. Maceracija

se izvodi u suspenziji, kao šaržna operacija, tako što se čvrst materijal potapa u rastvarač, a

perkolacija polušaržno, tako što kroz nepokretan sloj čvrstog materijala kontinualno protiče

rastvarač.

Celokupan proces najjednostavnije se može opisati kroz dve faze: ispiranje ili brza

ekstrakcija odnosno rastvaranje ekstraktivnih supstanci sa površine čvrstog materijala i spora

ekstrakcija odnosno difuzija ekstraktivnih supstanci iz unutrašnjisti ka spoljašnjoj površini

čvrstog materijala i njhov transfer u okolni rastvor (tečni ekstrakt) (Milenović, 2002). Na

kraju sledi separacija dobijenog ekstrakta od nerastvornog ostatka čvrstog materijala,

odnosno iscrpljenog materijala (ceđenjem ili presovanjem). Ekstrakcija čvrsto-tečno određena

22

je osobinama polazne sirovine, fizičko-hemijskom kompatibilnošću rastvarača i bioaktivnih

jedinjenja koja se ekstrahuju i opštim zakonima prenosa mase (Pekić i Miljković, 1980)

Ovaj proces definišu opšti zakoni prenosa mase, zatim fizičko-hemijska sličnost

rastvarača i ekstraktivnih supstanci, kao i osobine polaznog materijala.

Prenos mase u najvećoj meri je posledica postojanja koncentracionog gradijenta

rastvorenih supstanci u fazama koje ostvaruju međusobni kontakt. Molekuli supstance koja

difunduje haotično se kreću iz dela sistema sa većom u deo sistema sa manjom

koncentracijom što je uzrokovano težnjom sistema za uspostavljanjem termodinamičke

ravnoteže. Brzina difuzije raste usled povećanja brzine kretanja molekula odnosno povećanja

njihove kinetičke energije kao posledice povećanja temperature sistema. Debljina sloja kroz

koji se vrši difuzija, veličina dodirne površine faza kao i molekulska masa supstance koja

difunduje su takođe faktori koji utiču na brzinu difuzije (Tolić, 1996).

Brzina ekstrakcije čvrsto-tečno je obično limitirana difuzijom ekstraktivnih materija

kroz unutrašnjost čestica biljnog materijala (čvrsta faza), dok je rastvaranje ekstraktivnih

materija u rastvaraču brz proces, koji ne utiče na brzinu ukupnog procesa. Ako je pak,

difuzija ekstraktivnih materija sa površine čestice ka masi rastvora limitirajući faktor, onda je

potrebno obezbediti dovoljno intenzivno mešanje suspenzije.

Ishod ekstrakcije uslovljen je sledećim grupama faktora: faktori koji su determinisani

tehnološkim svojstvima biljnog materijala kao sirovine (sadržaj vlage, sadržaj bioaktivnih

jedinjenja, stepen usitnjenosti, bubrenje i adsorpciona sposobnost, relativna gustina i

zapreminska masa, mehaničke osobine) i faktori koji ispoljavaju uticaj na transfer mase

unutar čestica biljnog materijala i u rastvoru (hidrodinamički uslovi, uloga rastvarača, način

dovođenja rastvarača, uticaj temperature, vreme trajanja ekstrakcije) (Ponomarev, 1976).

2.3.2. Faktori koji utiču na prenos mase

Hidrodinamički uslovi ispoljavaju uticaj na transfer mase kroz difuzioni granični sloj

i kroz masu rastvora, a poboljšavaju se mešanjem, cirkulacijom ili vibracijom, jer povećanje

brzine strujanja rastvora u okolini čestica biljnog materijala utiče na smanjenje debljine

difuzionog graničnog sloja (Ponomarev, 1976).

Izbor rastvarača. Fizička i hemijska svojstva rastvarača imaju vrlo bitan uticaj na

ishod procesa ekstrakcije. Izbor rastvarača se vrši tako da omogućava što kvantitativnije

iscrpljenje biljnog materijala, odnosno ostvarenje visokog prinosa ekstrakcije. Takođe,

neophodno je voditi računa o selektivnosti ekstrakcije, odnosno dobijanje ekstrakata sa

minimalnim sadržajem primesa, a maksimalnim sadržajem željenih ekstraktivnih supstanci.

Rastvorljivost i brzina difuzije supstanci iz biljnog materijala uslovljeni su

vrednostima dielektrične konstantante, viskoznosti (čijim se povećanjem srazmerno smanjuje

23

koeficijent difuzije) i površinskog napona rastvarača čijim se smanjenjem povećava brzina

ekstrakcije (što se može postići dodatkom izvesnih površinski aktivnih supstranci).

Od polarnih rastvarača najčešće se koriste voda, etanol, metanol i glicerol, a od

nepolarnih n-heksan, aceton, petroletar, acetiletar i dr. Pri ekstrakciji fenolnih jedinjenja

smeše alkohola i vode su efikasnije od odgovarajućih monokomponentnih sistema rastvarača.

Vodeno-etanolne smeše su među najkorišćenijim ekstragensima ne samo zbog

ekonomske pristupačnosti, već i zbog mogućnosti dobijanja etanola iz obnovljivih izvora (na

primer iz šećerne trske) kao i njegove male što je u skladu sa trendom koncepta “zelene

hemije” (Rodrigues i sar., 2015).

Uticaj odnosa biljni materijal-rastvarač. Povećanjem odnosa biljni materijal-

rastvarač smanjuje se utrošak rastvarača potrebnog za ekstrakciju uzorka čime se povećava

koncentracija antioksidativnih jedinjenja u dobijenom ekstraktu. Međutim neophodna je

ravnoteža između oba elementa ovog odnosa jer će prenos mase biti ometen ukoliko postoji

nedostatak rastvarača (Hidalgo i Almajano, 2017).

Uticaj temperature i vremena ekstrakcije. Zagrevanjem rastvarača smanjuje se vreme

penetracije rastvarača u biljne ćelije i vreme bubrenja, smanjuje se viskoznost rastvarača,

ubrzava se difuzija bioaktivnih jedinjenja kroz rastvarač jer se povećanjem temperature

postižu i bolji hidrodinamički uslovi (Ponomarev, 1976). Temperatura i ekstrakciono vreme

su međusobno povezani jer povećanjem vremena trajanja ekstrakcije smanjuje se vrednost

neophodne temperature, dok povećanje temperature smanjuje vreme potrebno za uspešnu

ekstrakciju.

2.3.3 Matematičko modelovanje

Matematički modeli se primenjuju u cilju kvantitativnog opisa kinetike različitih

ekstrakcionih procesa. Matematički opis procesa čvrsto-tečne ekstrakcije je veoma složen

zbog složenosti samog procesa prenosa mase iz unutrašnjosti čestica biljnog materijala u

masu rastvora. Matematički opis i analiza čvrsto-tečne ekstrakcije se značajno

pojednostavljuje primenom uprošćenih modela, koji su bazirani na uprošćenim opisima

difuzije ekstraktivnih supstanci iz biljnog materijala u rastvor. Matematičko modelovanje ima

važnu ulogu s obzirom na to da omogućava relativno brzo procenjivanje uticaja različitih

procesnih faktora na izlazne parametere procesa uz smanjenje broja potrebnih

eksperimentalnih podataka.

Ni jedan od matematičkih modela koji postoji u literaturi u potpunosti ne zadovoljava

krajnje zahtevne potrebe jednog univerzalnog matematičkog modela kojim bi se opisao

proces ekstrakcije. Razlog za to je izuzetno velika šarolikost ekstrakcionih procesa koji

obuhvataju mnogo različitih prirodnih sirovina i hemijskih jedninjenja koja se tom prilikom

izdvajaju. Zato su raspoloživi matematički modeli najčešće primenjivi samo za određene

sisteme, ili imaju neko drugo ograničenje u primeni (Nikolovski, 2009, Hortaçsu, 2000).

24

U većini slučajeva, pri ekstrakciji prirodnih materijala, gotovo se nikad ne ekstrahuje

samo jedno jedinjenje u toku procesa, već se dobijaju višekomponentni ekstrakti.

Matematički modeli koji se najčešće koriste za opisivanje procesa ekstrakcije

ekstraktinih, među njima i fenolnih, jedinjenja su:

- model zasnovan na nestacionarnoj difuziji u biljnom materijalu i

- empirijska jednačina Ponomarjeva (Ponomarev, 1976).

2.3.4. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji u biljnoj sirovini

Prenos mase kroz čvrst materijal pri ekstrakciji čvrsto-tečno odigrava se difuzijom.

Iako mehanizam difuzije nije tako jednostavan kao u slučaju gasova i tečnosti, obično se

brzina prenos mase ekstraktivnih supstanci (rastvorak) kroz čvrsti materijal može opisati

Fikovim zakonima.

Uslovi difuzije pri ekstrakciji čvrsto-tečno su, po pravilu, nestacionarni. Promene

koncentracije ekstraktivnih supstanci pri nestacionarnoj difuziji, pod uslovom da se ne

odigrava hemijska reakcija, opisuju se jednačinom II Fikovog zakona. Kada se prenos mase

odigrava u jednom pravcu, diferencijalni oblik ove jednačine je (Treybal, 1985):

𝜕𝑐

𝜕𝑡= 𝐷 ∙

𝜕2𝑐

𝜕𝑥2 (1)

Analitičko rešavanje jednačine (1) zahteva složen matematički aparat, pa se ona može

koristiti za rešavanje problema nestacionarne difuzije pri ekstrakciji čvrsto-tečno u slučaju

prostijih geometrijskih oblika čvrstih čestica (ravna ploča, cilindar i sfera), integrisanjem uz

primenu odgovarajućih početnih i graničnih uslova (Veljković i Milenović, 2002).

U cilju analitičkog rešavanja jednačine (1) uvode se sledeće pretpostavke:

- čestice biljnog materijala su izotropne i jednake po veličini,

- koeficijent difuzije ekstraktivnih supstanci kroz česticu je konstantan,

- na početku (za t = 0), koncentracija ekstraktivnih supstanci u čestici je ravnomerna i iznosi

co,

- koncentracija ekstraktivnih supstanci na spoljašnjoj površini čestice je stalna i iznosi , c

25

- u svakom trenutku unutar čestice postoji raspodela koncentracije ekstraktivnih supstanci

txcc )(= , tako da je srednja koncentracija u čestici =

pV

p

cdVV

c0

1, gde je Vp - zapremina

čestice,

- u svakom trenutku u osi čestice je ,

- difuzija se odigrava samo u jednom pravcu i

- mešanje je intenzivno, tako da se isključuje uticaj prenosa mase od spoljašnje površine

čestica u glavninu rastvora i prenosa mase u rastvoru.

Kao rezultat rešavanja jednačine (1) pri graničnim uslovima, dobija se jednačina koja

opisuje primenu sadržaja ekstraktivnih supstanci u biljnoj sirovini sa vremenom:

𝑞

𝑞𝑜= (1 − 𝑏) ∙ 𝑒−𝑘𝑡 (2)

gde je:

- 𝑞𝑜 sadržaj ekstraktivnih supstanci u biljnoj sirovini na početku ekstrakcije

- 𝑞 sadržaj ekstraktivnih supstanci u biljnoj sirovini posle određenog vremena

ekstrakcije.

Za izračunavanje parametara jednačine (2) koristi se njen linearizovan oblik:

𝑙𝑛𝑞

𝑞𝑜= ln(1 − 𝑏) − 𝑘𝑡 (3)

gde je 𝑏 koeficijent ispiranja, a 𝑘 koeficijent spore ekstrakcije (Ponomarev, 1976).

Kinetički parametri jednačine (3) mogu se izračunati grafoanalitički (Ponomarev,

1976) ili analitički. Grafoanalitički postupak je ilustrovan na slici 9. Na grafiku su naznačena

dva perioda ekstrakcije: ispiranje (I) i spora ekstrakcija (II) (Veljković i Milenović, 2002). U

periodu spore ekstrakcije zavisnost o

i

q

qlog od vremena je linearna. Koeficijent ispiranja se

izračunava iz odsečka pravolinijskog dela zavisnosti na ordinati za t = 0, dok se koeficijent

spore ekstrakcije izračunava iz nagiba zavisnosti. Po analitičkom postupku, odsečak i nagib

pravolinijske zavisnosti se izračunavaju metodom najmanjih kvadrata.

00

=

=xx

c

26

Slika 9. Grafoanalitički proračun koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore ekstrakcije

Parametri jednačine mogu se izračunati i analitički, pri čemu se odsečak i nagib

pravolinijske zavisnosti izračunavaju metodom najmanjeg kvadrata. Ovaj model korišćen je

za određivanje i koeficijenta ispiranjai i koeficijenta spore ekstrakcije (Veličković i sar.,

2006; Veličković i sar., 2008)

2.3.5. Empirijska jednačina Ponomarjeva

U ovom slučaju, pretpostavlja se da u periodu spore ekstrakcije važi linearna

zavisnost između 𝑞𝑜−𝑞

𝑞𝑜 i vremena (Ponomarev, 1976), tako da je:

𝑞𝑜−𝑞

𝑞𝑜= 𝑏 + 𝑘𝑡 (4)

gde je: b - koeficijent ispiranja, a k - koeficijent pravca linerne zavisnosti. Koeficijent

ispiranja je mera mase ekstraktivnih supstanci koja se rastvori pošto se biljni materijal potopi

u rastvarač, tj.

𝑏 = (1 −𝑞

𝑞𝑜)𝑡=0

Parametar k je, u stvari, brzina rastvaranja ekstraktivnih supstanci u odnosu na

njihovu početnu masu u periodu spore ekstrakcije, pa se može smatrati specifičnom brzinom

spore ekstrakcije, tj.

𝑘 = (1

𝑞𝑜

𝑞𝑜 − 𝑞

𝑡)𝐼𝐼

indeks II označava da se radi o periodu spore ekstrakcije. Izračunavanje parametara b” i k”

postiže se grafoanalitičkim postupkom (Ponomarev, 1976), a može se primeniti i metoda

najmanjih kvadrata (Pekić i sar., 1988).

27

2.4. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC)

U današnje vreme jedna od najmoćnijih i najprimenjivanih tehnika u analitičkoj

hemiji. Daje informacije o identifikaciji, mogućnosti razdvajanja i kvantitativnog određivanja

jedinjenja, prisutnih u uzorku u tečnom stanju. Uz pomoć HPLC- tehnike može se vršiti

identifikacija jedinjenja, koja su prisutna u uzorku u koncentraciji koja je reda veličine ppt

(part per trillion).

HPLC - (high-performance liquid chromatograpfy) ili tečna hromatografija pod

visokim pritiskom je tehnika koja se koristi za razdvajanje, identifikaciju i kvantifikaciju

komponenata u smeši. Tehnika se bazira na tome da svaka od komponenata u uzorku reaguje

na određeni način sa adsorbensom, a kao posledica njihove reaktivnosti javljaju se različite

brzine protoka za svaku od komponenata smeše, što dovodi do njihovog odvajanja u odnosu

na vreme zadržavanja na koloni. Razlika između HPLC hromatografije i tečne hromatografije

niskog pritiska je u tome što se kod HPLC koriste znatno viši pritisci (50-350 bar), dok kod

obične, tečne hromatografije na efikasnost utiče gravitaciona sila. Takođe, kod HPLC, kolone

se prave sa veoma sitnim česticama adsorbenta, što utiče pozitivno na razdvajanje

komponenata smeše. Potrebna je veoma mala zapremina uzorka i komponente se kreću

različitim brzinama kroz kolonu. Brzina svake od komponenata zavisi od njene hemijske

prirode, kao i prirode stacionarne faze i sastava mobilne faze (Calvin, 1968; Karger, 1997).

Osnovni delovi HPLC sistema su prikazani na slici 10.

Slika 10. Šematski prikaz uređaja za HPLC

28

U rezervoaru se nalazi rastvarač, tj. mobilna faza. Mobilna faza za HPLC analizu

treba da se bira tako da pre svega dobro rastvara sve komponente ispitivane smeše. Drugim

rečima, ako se analiziraju nepolarna jedinjenja, tada biramo nepolarne rastvarače, i obrnuto -

pri analizi polarnih jedinjenja kao mobilna faza se biraju polarni rastvarači. Polarnost

mobilne faze može da se varira od puferovanih vodenih rastvora do ugljovodonika.

Rastvarači koji se koriste kao mobilna faza moraju biti odgovarajuće čistoće, bez stranih

primesa organskog I neorganskog porekla. HPLC rastvarači su komercijalno dostupni i treba

ih uvek koristiti. Takođe, mobilna faza mora biti oslobođena mehurića gasova. Zbog toga se

pre upotrebe mobilna faza filtrira i degazira.

Pumpa za proizvodnju visokog pritiska se koristi za generisanje i održavanje

specifičnog protoka mobilne faze, koji je obično reda veličine mililitar po minuti. Pumpe koje

se koriste za HPLC sisteme moraju biti izrađene od materijala koji je

otporan na rastvarče koji se koriste kao mobilna faza.

Injektor služi za uvođenje, tj. injektovanje (engl. inject) uzorka u kontinualni tok

mobilne faze koja ga nosi u HPLC kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne

faze i na osnovu specifičnih hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja

komponenata smeše na koloni. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se

analizira, stacionarne faze i sastava mobilne faze. Korišćenje visokog pritiska povećava

linearnu brzinu i daje jedinjenjima manje vremena za zadržavanje na koloni, što poboljšava

rezoluciju hromatograma.

Kolona je smeštena u termostatu koji održava temperaturu kolone konstantnom u toku

analize, što je veoma značajno jer promena temperature utiče na raspodelu ispitivanog

jedinjenja između stacionarne i mobilne faze, kao i na njegovu rastvorljivost i viskoznost

mobilne faze. Stacionarna faza tj. kolona predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto

svih hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika

ili stakla i njihov izbor zavisi od prirode supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti

različite dužine, najčešće od 2,5 do 25 cm (i više), sa različitim unutrašnjim prečnikom

(najčešće 2,0-4,6 mm) i različitim dijametrom čestica (od 2 do 50 µm). Uobičajeni

materijali za pakovanje HPLC kolona su sledeći: silika-gel, kopolimeri na bazi stirena i

divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje (Antić i Antić, 2014).

Detektor beleži i obrađuje električni signal potreban za generisanje hromatograma na

ekranu. Hromatogram omogućava identifikaciju i kvantitativno određivanje koncentracije

pojedinačnih jedinjenja u analiziranoj smeši. Mobilna faza zatim napušta detektor i može biti

poslata u otpad, ili po želji prečišćavana. Detektor je uglavnom najsofisticiraniji i

najskuplji deo HPLC opreme. Kako karakteristike jedinjenja prisutnih u uzorku mogu

biti veoma različite, razvijeno je nekoliko tipova detektora. Postoje selektivni detektori,

koji daju različite odgovore u zavisnosti od strukture analiziranog uzorka, i tzv.

univerzalniji detektori, kod kojih je odgovor sličan za većinu jedinjenja. Na primer, ako

jedinjenje apsorbuje ultraljubičastu ili vidljivu svetlost, koristi se UV-Vis apsorbujući

detektor (engl. ultraviolet-visible detector). Ako jedinjenje ima sposobnost fluorescencije,

29

koristi se fluorescentni detektor. Oba tipa detektora su selektivni detektori. Ako analizirano

jedinjenje nema ni jednu od pomenutih karakteristika, koristi se univerzalniji tip detektora,

kao što je RI detektor, tj. detektor koji radi na principu prelamanja svetlosti (engl. refractive

index detector), ili ELSD detector, tj. detektor koji radi na principu isparavanja i rasipanja

svetlosti

Cevi i ostali delovi opreme koja se koristi za povezivanje pumpe, injektora, kolone i

detektora, da bi se omogućio nesmetani protok mobilne faze i uzorka, izrađeni su od

materijala koji može da podnese visok pritisak (Mitić, 2017).

30

3. EKSPERIMENTALNI DEO

31

3.1. Biljna sirovina

Mirođija, kupljena u marketu zdrave hrane, sušena je na sobnoj temperaturi i

neposredno pre eksperimenta samlevena blenderom.

3.2. Reagensi

U radu su korišćeni sledeći reagensi: ferulna kiselina proizvođača Sigma-Aldrich

(Steinheim, Germany) i hlorogenska kiselina proizvođača Merck (Darmstadt, Germany). Sve

hemikalije i rastvarači koji su korišćeni bili su p.a. i HPLC čistoće.

Sudovi koji su korišćeni prani su etanolnim rastvorom KOH, zatim rastvorom HCl

(1:1), isprani česmenskom, destilovanom i dejonizovanom vodom. Vodeni rastvori su

pripremani dejonizovanom vodom specifične provodljivosti 0,05 μS/cm.

3.3. Ekstrakcija iz biljne sirovine

Ekstrakcija iz biljne sirovine je vršena rastvorima etanola koncentracije 50%(v/v), pri

solvomodulu 1:20 (g/V), na temperaturama od 30, 40 i 50oC i različitim vremenima

maceracije 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60 i 80 min. Biljna sirovina (2,5 g) je prelivena sa 50 ml

rastvarača i ostavljena na konstantnoj temperaturi. Posle određenog vremena, ekstrakt je

odvojen od ostatka biljne sirovine vakuum filtracijom.

3.4. Inicijalni sadržaj fenolnih kiselina u mirođiji (qo)

Biljni materijal (2,5 g) se u erlenmajeru od 250 ml prelije sa 100 ml ekstrakcionog

rastvarača (50 % etanol). Ekstrakcija je vršena postupkom maceracije u toku 120 minuta.

Ekstrakti su odvojeni od ostatka filtriranjem kroz Whatman No. 1 filter papir. Nakon

filtriranja, iscrpljena biljna sirovina se prelije sa istom zapreminom istog rastvarača, i

macerira još 30 minuta, a zatim se filtrira i ispire sa 20 ml rastvarača. Ekstrakti se spoje i

uparavaju, a zatim i suše pod vakumom na 45 °C do konstantne mase. Osušeni, suvi i

koncentrovani ekstrakti su rastvoreni u ekstrakcionom rastavaraču neposredno pre analize.

Osušeni ekstrakti su pripremljeni tri puta, a rezultat je izražen kao srednja vrednost.

32

3.5. Aparati

Za određivanje sadržaja hlorogenske i ferulne kiseline u mirođiji korišćena je sledeća

aparatura:

- Analitička vaga Mettler Toledo AB-204-S za odmeravanjeuzoraka i čvrstih supstanci;

- MicroMed high purity water system, TKAWasseraufbereitungsszsteGmbH za

dobijanje demineralizovane vode

- HPLC sistem Agilent Technologies 1200 Series (Agilent Tecnologies, USA) koji se

sastoji od kvaternarne pumpe G1354A, automatskog injektora G1329A,

termostatiranog kolonskog dela G1316A, UV/Vis detektora G1315D, fluorescentnog

detektora G1321A kontrolisanog sa HP Chemstation softverom, za određivanje

sadržaja fenolnih jedinjenja (slika 8);

- Termostat Julabo MP 5A Open Bath Circulations (JULABO, USA) za termostatiranje

rastvora;

- Varijabilne automatske pipete Lab Mate+ za pipetiranje rastvora;

- Električni blender za homogenizovanje uzoraka.

Slika 11. Tečni hromatograf visokih performansi (HPLC) (laboratorija Katedre za analitičku

i fizičku hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu).

33

3.6. HPLC analiza etanolnih ekstrakata mirođije

Kao mobilna faza korišćen je sistem rastvarača: A – (H2O + 5% HCOOH) i B – (80%

HCN + 5% HCOOH + H2O). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom sledećeg

linearnog gradijenta: 0-28 min, 0% B; 28-35 min, 25% B; 35-40 min, 50% B; 40-45 min,

80% B, i na kraju poslednjih 10 min ponovo 0% B. Protok mobilne faze je iznosio 0,8

ml/min. Injektovano je 5 μL rastvora uzorka, automatski, korišćenjem autosampler-a. Kolona

je termostatirana na temperaturi od 30 ºC. Fenolne kiseline prisutne u ekstraktima su

identifikovane poređenjem retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i

spektrom standarda (slika 12) za određenu kiselinu.

Kvantifikacija fenolnih kiselina je izvršena metodom spoljašnjeg standarda.

Pripremljen je osnovni rastvor standarda masene koncentracije 1,0 mg/ml, rastvaranjem u

metanolu. Od ovog rastvora je pripremljena serija razblaženih rastvora standarda

odgovarajućih masenih koncentracija. Konstruisana je kalibraciona kriva na osnovu dobijenih

površina pikova u zavisnosti od masene koncentracije standarda. Iz dobijene jednačine

linearne zavisnosti izračunate su masene koncentracije komponenti u ekstraktima.

Slika 12. UV-VIS spektar hlorogenske kiseline

34

Slika 13. UV-VIS spektar ferulne kiseline

3.7. Statistička obrada podataka

Prihvatljivost modela se može proceniti na osnovu korelacionog koeficijenta (R2) i

korena srednjeg kvatrata (Root Mean Square (RMS) (Kitanović i sar., 2008), koji se

izračunava na osnovu jednačine:

𝑅𝑀𝑆 = √1

𝑁∑ (

�̅�𝑒𝑥𝑝−�̅�𝑐𝑎𝑙

�̅�𝑒𝑥𝑝)2

𝑁𝑖=1 (5)

Što je veća vrednost za R2 i manja vrednost za RMS to model bolje opisuje

eksperimentalne podatke (Kitanović i sar., 2008).

35

4. REZULTATI I DISKUSIJA

36

4.1. Modelovanje kinetika ekstrakcije hlorogenske i ferulne

kiseline iz mirođije

Za modelovanje kinetike ekstrakcije hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije 50 %

(v/v) etanolom, primenjena su dva kinetička modela: model zasnovan na nestacionarnoj

difuziji kroz biljni material i empirijski model Ponomarjeva. U tabeli 2 dat je prikaz

korišćenih kinetičkih modela ekstrakcije.

Tabela 2. Kinetički modeli ekstrakcije ekstraktivnih materija iz biljnog materijala

Kinetička jednačina Linearna transformacija

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji

𝑞

𝑞𝑜= (1 − 𝑏) ∙ 𝑒−𝑘𝑡 𝑙𝑛

𝑞

𝑞𝑜= 𝑙𝑛(1 − 𝑏) − 𝑘𝑡

Empirijski model

Ponomarjeva

𝑞0 − 𝑞

𝑞0= 𝑏′′ + 𝑘′′𝑡

Promene sadržaja hlorogenske i ferulne kiseline izražene u μg/g suvog biljnog

materijala u toku ekstrakcije 50% etanolom pri solvomodulu 20 ml/g na temperaturama od

30, 40 i 50oC sa vremenom ekstrakcije, prikazane su u Tabelama 3 i 4 i na slikama 14 i 15.

Tabela 3. Promena sadržaja hlorogenske kiseline sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz mirođije (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: 30±0.1 °C; 40±0.1 °C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (30°C) μg/g (40°C) μg/g (50°C)

5 45,18 49,80 50,90

10 69,96 71,22 73,46

15 70,43 73,20 75,02

20 72,34 75,16 77,44

30 75,43 77,54 82,29

40 78,40 81,25 85,79

60 83,83 87,94 94,51

80 92,08 97,43 103,75

37

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

40

50

60

70

80

90

100

110

c (

mg

10

-3/g

)

t (min)

Slika 14. Promena sadržaja hlorogenske kiseline sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz mirođije (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: (●) 30±0.1 °C; (■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

Tabela 4. Promena sadržaja ferulne kiseline sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz mirođije (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: 30±0.1 °C; 40±0.1 °C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (30°C) μg/g (40°C) μg/g (50°C)

5 2,20 2,46 2,64

10 2,89 3,14 3,56

15 3,06 3,28 3,67

20 3,20 3,56 3,82

30 3,31 3,71 4,27

40 3,67 4,06 4,64

60 4,20 4,69 5,41

80 4,62 5,19 6,05

38

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

c (

mg 1

0-3/g

)

t (min)

Slika 15. Promena sadržaja ferulne kiseline sa vremenom ekstrakcije pri optimalnim

uslovima ekstrakcije iz mirođije (koncentracija etanola: 50 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: (●) 30±0.1 °C; (■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

Ekstrakcija hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije maceracijom odvija se u dve

faze. Na početku, ekstraktivne supstance koje se nalaze na površini čestica biljne sirovine

rastvaraju se u kratkom vremenskom periodu. U ovoj fazi, poznatoj kao ispiranje ili brza

ekstrakcija, rastvara se veći deo ekstraktivih supstanci. Trajanje ove faze zavisi od vrste

biljnog materijala, vrste rastvarača kao i raspoložive količine rastvarača. Brza faza ekstrakcije

(ispiranje) pri ekstrakciji hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije maceracijom traje 10-tak

minuta.

Nakon završetka faze ispiranja, nastupa spora faza procesa ekstrakcije u kojoj prinos

ekstraktivnih materija, odnosno hlorogenske i ferulne kiseline, više ili manje blago raste sa

vremenom na račun difuzije ekstraktivnih materija iz unutrašnjosti nerazorenih ćelija biljnog

materijala do i kroz njihovu spoljnu površinu u masu rastvora. Produžetkom ove faze

postigao bi se veći stepen ekstrakcije ali na račun smanjenja ekonomičnosti celog procesa

(Karabegović, 2011).

U periodu brze ekstrakcije se, spiranjem i rastvaranjem ekstraktivnih materija sa

površine razorenih ćelija biljnog materijala ekstrahuje se od 54,43 do 57,16,10 %

hlorogenske kiseline, odnosno od 36,49 do 44,95 % ferulne kiseline. To pokazuje da je

usitnjenost biljnog materijala korišćenog za ispitivanja zadovoljavajuća.

39

4.1.1. Model zasnovan na nestacionarnoj difuziji kroz biljni materijal

Za izračunavanje parametara modela zasnovanog na nestacionarnoj difuziji kroz čvrst

materijal korišćeni su samo podaci iz perioda spore ekstrakcije od 10-tog minuta ekatrakcije,

a izračunavanje je vršeno pomoću metode linearne regresije (slika 16 i 17).

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

-0.95

-0.90

-0.85

-0.80

-0.75

-0.70

-0.65

-0.60

-0.55

-0.50

c (

mg

10

-3/g

)

t (min)

Slika 16. Linearizovan oblik kinetičke jednačine modela zasnovanog na nestacionarnoj

difuziji kroz biljni material pri ekstrakciji hlorogenske kiseline iz mirođije na temperaturama:

(●) 30±0.1 °C; (■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

40

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

c (

mg

10

-3/g

)

t (min)

Slika 17. Linearizovan oblik kinetičke jednačine modela zasnovanog na nestacionarnoj

difuziji kroz biljni material pri ekstrakciji ferulne kiseline iz mirođije na temperaturama: (●)

30±0.1 °C; (■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

Prediktivne vrednosti sadržaja hlorogenske i ferulne kiseline u ekstraktima mirođije

izračunate po modelu nestacionarne difuzije kroz biljni material date su u Tabelama 5 i 6.

Tabela 5. Prediktivne vrednosti promena sadržaja hlorogenske kiseline sa vremenom

ekstrakcije pri optimalnim uslovima ekstrakcije iz mirođije izračunate na osnovu modela

zasnovanog na nestacionarnoj difuziji (koncentracija etanola: 40 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: 30±0.1 °C; 40±0.1 °C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (30°C) μg/g (40°C) μg/g (50°C)

10 68,87 71,41 73,70

15 70,37 72,97 75,55

20 71,89 74,57 77,44

30 75,04 77,87 81,37

40 78,32 81,32 85,50

60 85,32 88,67 94,40

80 92,95 96,69 104,22

41

Uporedimo li podatke za sadržaj hlorogenske kiseline dobijenih eksperimentalno

(Tabela 3) i izračunatih po modelu zasnovanom na nestacionarnoj difuziji kroz biljni material

(Tabela 5) možemo uočiti njihovo dobro slaganje.

Tabela 6. Prediktivne vrednosti promena sadržaja ferule kiseline sa vremenom ekstrakcije pri

optimalnim uslovima ekstrakcije iz mirođije izračunate na osnovu modela zasnovanog na

nestacionarnoj difuziji (koncentracija etanola: 40 %; solvmodul: V/m=20) na

temperaturama: 30±0.1 °C; 40±0.1 °C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (25°C) μg/g (35°C) μg/g (45°C)

10 2,95 3,22 3,58

15 3,05 3,34 3,72

20 3,15 3,46 3,87

30 3,37 3,71 4,18

40 3,60 3,99 4,53

60 4,12 4,60 5,30

80 4,71 5,30 6,20

I u ovom slučaju (Tabela 4 i Tabela 6) uočeno je dobro slaganje prediktivnih vrednosti

izračunatih po modelu nestacionarne difuzije sa eksperimentalno dobijenih vrednosti za

sadržaj ferulne kiseline u ekstraktima mirođije.

Vrednosti kinetičkih parametara su izračunate primenom metode najmanjih kvadrata i

date u Tabeli 9 i 10. Pri datim uslovima ekstrakcije na temperature od 50oC postižu se

najveće vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore ekstrakcije.

4.1.2. Model Ponomarjeva

Za izračunavanje parametara modela zasnovanog na Ponomarjevoj jednačini korišćeni

su samo podaci iz perioda spore ekstrakcije od 10-tog minuta ekatrakcije, a izračunavanje je

vršeno pomoću metode linearne regresije (slike 18 i 19).

42

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

c (

mg

10

-3/g

)

t (min)

Slika 18. Linearizovan oblik kinetičke jednačine modela zasnovanog na modelu

Ponomarjeva pri ekstrakciji hlorogenske kiseline iz mirođije na temperaturama: (●) 30±0.1

°C; (■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

c (

mg

10

-3/g

)

t (min)

Slika 19. Linearizovan oblik kinetičke jednačine modela zasnovanog na modelu

Ponomarjeva pri ekstrakciji ferulne kiseline iz mirođije na temperaturama: (●) 30±0.1 °C;

(■) 40±0.1 °C i (▲) 50±0.1 °C

43

Prediktivne vrednosti sadržaja hlorogenske i ferulne kiseline u ekstraktima mirođije

izračunate po modelu Ponomarjeva date su u Tabelama 7 i 8.

Tabela 7. Prediktivne vrednosti promena sadržaja hlorogenske kiseline sa vremenom

ekstrakcije pri optimalnim uslovima ekstrakcije iz mirođije izračunate na osnovu modela

Ponomarjeva (koncentracija etanola: 40 %; solvmodul: V/m=20) na temperaturama: 30±0.1

°C; 40±0.1 °C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (30°C) μg/g (40°C) μg/g (50°C)

10 69,19 70.96 73,20

15 70,76 72,96 75,36

20 72,33 74,57 77,52

30 75,47 78,18 81,84

40 78,60 81,79 86,16

60 84,87 89,01 94,80

80 91,15 96,24 103,43

Tabela 8. Prediktivne vrednosti promena sadržaja ferule kiseline sa vremenom ekstrakcije pri

optimalnim uslovima ekstrakcije iz mirođije izračunate na osnovu modela Ponomarjeva

(koncentracija etanola: 40 %; solvmodul: V/m=20) na temperaturama: 30±0.1 °C; 40±0.1

°C i 50±0.1 °C

t (min) μg/g (30°C) μg/g (40°C) μg/g (50°C)

10 2,91 3,15 3,51

15 3,03 3,30 3,70

20 3,15 3,45 3,88

30 3,40 3,75 4,25

40 3,65 4,05 4,62

60 4,14 4,65 5,35

80 4,64 5,25 6,09

I u ovom slučaju uočeno je dobro slaganje prediktivnih vrednosti izračunatih po modelu

Ponomarjeva sa eksperimentalno dobijenih.

44

Vrednosti kinetičkih parametara su izračunate primenom metode najmanjih kvadrata i

date u Tabeli 9 i 10. Pri datim uslovima ekstrakcije na temperature od 50oC postižu se

najveće vrednosti koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore ekstrakcije izračunatih po modelu

Ponomarjeva.

4.2. Kinetički parametri

U tabeli 8 i Tabeli 10 su prikazane vrednosti koeficijenata ispiranja i koeficijenata spore

ekstrakcije na različitim temperaturama, koje su određene korišćenjem različitih modela.

Tabela 9. Vrednosti koeficijenata ispiranja i koeficijenata spore ekstrakcije za process

ekstrakcije hlorogenske kiseline is mirođije

Temperature, K

Koeficijent

ispiranja (b)

(min-1)

Koeficijent

spore

ekstrakcije (k)

(min-1)

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji kroz

biljni materijal

303

313

323

0.805

0,812

0,816

1,86·10-3

1,88·10-3

2,15·10-3

Model Ponomarjeva

303

313

323

0,514

0,524

0,536

2,44·10-3

2,81·10-3

3,36·10-3

Tabela 10. Vrednosti koeficijenata ispiranja i koeficijenata spore ekstrakcije za process

ekstrakcije ferulne kiseline is mirođije

Temperature, K

Koeficijent

ispiranja (b)

(min-1)

Koeficijent

spore

ekstrakcije (k)

(min-1)

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji

kroz biljni materijal

303

313

323

0.713

0,736

0,761

2,91·10-3

3,10·10-3

3,41·10-3

Model Ponomarjeva

303

313

323

0,336

0,360

0,397

3,12·10-3

3,79·10-3

4,65·10-3

45

Kao što se može videte koeficijenti ispiranja (b) prema modelu Ponomarjeva imaju,

generalno, manju vrednost od koeficijenata ispiranja izračunatih prema modelu zasnovanom

na teoriji nestacionarne difuzije kroz biljni material, dok koeficijenti spore ekstrakcije (k)

izračunati prema modelu Ponomarjeva imaju veće vrednosti od koeficijenata spore

ekstrakcije izračunatih prema modelu zasnovanom na teoriji nestacionarne difuzije kroz biljni

material. Takođe se može videti da se vrednosti i koeficijenta ispiranja i koeficijenta spore

ekstrakcije povećavaju sa porastom temperature.

Koristeći iste modele Stanojević i sar. (2014) su za vodene ekstrake ploda mirođije na

25oC postupkom maceracije odredili vrednosti koeficijenta ispiranja (b=0.532, model

nestacionarne difuzije; b=0,533, model Ponomarjeva) i koeficijenta spore ekstrakcije

(k=1,10·10-3, model nestacionarne difuzije; k=0,43·10-3, model Ponomarjeva). Paunović i sar.

(2015) su za ekstrakciju fenolnih komponenti iz hmelja na temperaturama od 25, 35 i 45oC

dobili da se b i k kreću u intervalima od 0,791-0,830 i od 1,62·10-3- 1,88·10-3 po modelu

nestacionarne difuzije, odnosno u intervalima od 0,475-0,598 i 2,71·10-3- 3,02·10-3.

4.2.1. Poređenje modela

Prihvatljivost kinetičkog modela je ocenjena na osnovu slaganja kinetičkih jednačina

sa eksperimentalnim podacima, odnosno na osnovu vrednosti koeficijenata linearne

korelacije (R2) i na osnovu vrednosti korena kvadratnog srednjeg odstupanja (RMS)

izračunatih od eksperimentalnih vrednosti koncentracija hlorogenske i ferulne kiseline.

Usvojeno je da je model prihvatljiv ukoliko je srednja vrednost odstupanja izračunatih od

eksperimentalnih vrednosti sadržaja ekstraktivnih supstanci manja od ±10%. Izračunate

vrednosti za R2 i RMS na tri temperature i za svaki primenjen model prikazane su u Tabeli 11

i Tabeli 12.

Tabela 11. Vrednosti RMS i R2 za različite modele na temperaturama 30, 40 i 50oC za

ekstrakciju hlorogenske kiseline iz mirođije

Temperatura (K) RMS (%) R2(%)

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji

kroz biljni materijal

303

313

323

0,206

0,154

0,177

99,806

99,845

99,896

Model Ponomarjeva

303

313

323

0,241

0,259

0,115

99,665

99,605

99,948

46

Tabela 12. Vrednosti RMS i R2 za različite modele na temperaturama 30, 40 i 50oC za

ekstrakciju ferulne kiseline iz mirođije

Temperatura (K) RMS (%) R2(%)

Model zasnovan na

nestacionarnoj difuziji

kroz biljni materijal

303

313

323

0,550

0,647

0,622

99,441

99,271

99,506

Model Ponomarjeva

303

313

323

0,444

0,430

0,511

99,692

99,739

99,884

Na osnovu podataka u Tabelama 11 i 12 očigledno je bez obzira na primenjeni model i

temperaturu ekstrakcije, vrednosti RMS bile su manje od 1%. Dakle, na osnovu niskih

vrednosti za RMS, svaki od primenjenih modela može uspešno opisati kinetiku ekstrakcije

hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije. Pri tome, vrednosti koeficijenata linearne

korelacije (R2) bile su jako visoke i kretale su se od 99,271 do 99,948 %.

4.3. Termodinamički parametri

Vrednosti koeficijenara spore ekstrakcije na različitim temperaturama, dobijenih po

modelu Ponomarjeva, poslužili su nam da odredimo energiju aktivacije.

Uticaj temperature na konstantu brzine ekstrakcije definisan je Arrhenius-om

jednačinom:

𝑘 = 𝐴 ∙ 𝑒−𝐸𝑎 𝑅∙𝑇⁄

Za izračunavanje energije aktivacije koristi se njen linearizovan oblik:

𝑙𝑛𝑘 = 𝑙𝑛𝐴 −𝐸𝑎𝑅∙1

𝑇

gde 𝑘 predstavlja konstantu brzine ekstrakcije, 𝐴 je predeksponencijalni factor, 𝑅 univerzalna

gasna konstanta (8,314 J/mol K) i 𝑇 (K) apsolutna temperature. Energija aktivacije se može

izračunati iz nagiba zavisnosti 𝑙𝑛𝑘 u funkciji 1/T.

Na osnovu zavisnosti logaritma koeficijenta spore ekstrakcije hlorogenske i ferulne

47

kiseline iz mirođije u funkciji recipročne vrednosti apsolutne temperature, dobijena je prava

iz čijeg nagiba je izračunata energija aktivacije i ona iznosi 5,37 KJ/mol za hlorogensku

kiselinu i 4,25 KJ/mol za ferulnu kiselinu. Dobivene vrednosti su u skladu sa rezultatima

drugih autora za ekstrakciju fenolnih jedinjenja iz biljnog materijala (Bucić-Kojić i sar.,

2007; Sant' Anna i sar., 2012; Paunović i sar., 2015).

Termodinamički parametri (ΔGo, ΔHo, ΔSo) izračunati su na osnovu jednačina:

∆𝐺𝑜 = −𝑅𝑇𝑙𝑛𝐾𝑒 (6)

𝑙𝑛𝐾𝑒 = −∆𝐺𝑜

𝑅𝑇= −

∆𝐻𝑜

𝑅𝑇+

∆𝑆𝑜

𝑅 (7)

𝐾𝑒 =𝑞

𝑞 (8)

gde je:

- 𝐾𝑒 ravnotežna konstanta,

- 𝑞 koncentracija kiseline u ekstraktu a

- 𝑞 početna količina kiseline u čvrstom biljnom materijalu.

Izračunati termodinamički parametri dati su u Tabeli 13.

Tabela 13. Konstanta ravnoteže i termodinamički parametri procesa ekstrakcije hlorogenske

i ferulne kiseline iz mirođije

Jedinjenje T (K) K ΔH0 (kJ/mol) ΔS0 (JK-

1mol-1)

ΔG0

Hlorogenska 303

313

323

2,53

3,13

4,19

3,33 22,69 -3,55

-3,78

-4,01

Ferulna 303

313

323

1,40

1,90

3,23

1,98 25,23 -5,67

-5,92

-6,17

Vrednosti entalpije su 3,33 i 1,98 kJ/mol. Pozitivne vrednosti entalpije ukazuju na

endotermnu prirodu procesa ekstrakcije hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije, pa se

shodno tome potreban spoljni izvor energije, što je potvrđeno činjenicom da se sadržaj ovih

kiselina u ekstraktu povećava sa povećanjem temperature ekstrakcije (Suleiman i sar., 2013;

Menkiti i sar., 2015).

48

Pozitivna vrednost entropije ukazuje na ireverzibilnost procesa. Slični podaci su

dobiveni za ekstrakciju mnogih jedinjenja iz biljnog materijala (Krishnan i Rajan, 2017;

Amin i sar., 2010; Meziane i Kadi, 2008; Topolar i Gecgel, 2000)

Promena standardne Gibbs-ove energije se kreće u granicama od -3,55 do -4,01

kJ/mol za hlorogensku i u granicama od -5,67 do 6,17 kJ/mol. Negativne vrednosti potvrđuju

spontanost procesa ekstrakcije (Krishnan i Rajan, 2017).

49

5. ZAKLJUČAK

50

Hlorogenska i ferulna kiselina su ekstrahovane iz mirođije postupkom

maceracije. Kao rastvarač korišćen je vodeni rastvor etanola koncentracije 50% (v/v),

pri hidromodulu 20 ml/g. Ekstrakcija je izvedena na 30, 40 i 50oC.

Utvrđeno je da se proces ekstrakcije hlorogenske i ferulne kiseline iz mirođije

postupkom maceracije odvija u dve faze: faza brze ekstrakcije (ispiranje) (prvih 10-

tak minuta) i faza spore ekstrakcije (difuzija).

Za modelovanje kinetike ekstrakcije fenolnih kiselina iz mirođije 50%

etanolom korišćena su dva modela: model zasnovan na teoriji nestacionarne difuzije

kroz biljni materijal i empirijski model Ponomarjeva.

Oba korišćena matematička modela su dvoparametrijska. Vrednosti kinetičkih

parametara, koeficijenti ispiranja (b) i koeficijenti spore ekstrakcije (k) zavise od

primenjenog modela kinetike i od temperature. Koeficijenti ispiranja (b) prema

modelu zasnovanom na teoriji nestacionarne difuzije kroz biljni materijal imaju veću

vrednost od koeficijenata ispiranja prema modelu zasnovanom na modelu

Ponomarjeva. Koeficijenti spore ekstrakcije (k) prema modelu zasnovanom na teoriji

nestacionarne difuzije imaju manju vrednost od koeficijenata spore ekstrakcije prema

modelu Ponomarjeva.

Vrednosti ΔHo, ΔSo i ΔGo ukazuju da je process ekstrakcije hlorogenske i

ferulne kiseline iz mirođije spontan, nepovratan i endoterman.

51

6. LITERATURA

52

Aćimović M., Stanković J., Cvetković M., Jaćimović G., Dojčinović N. (2014). Ispitivanje

morfoloških karakteristika mirođije i kvaliteta etarskog ulja ploda, Letopis naučnih radova,

Poljoprivredni fakultet u Novom Sadu, 38(1): 69-79

Amin, S., Hawash, G., El Diwani, El Rafei, S. (2010). Kinetics and thermodynamic of oil

extraction from jatropha curcas in aqueous acidic hexane solutions, Journal of American

Science, 6, 8.

Antić, V.V., Antić, M.P. (2014). Hromatografija u analizi hrane, Univeritet u Beogradu,

Poljoprivredni fakultet.

Blumenthal M., Busse W.R. (1998). The complete German Commission E monographs:

therapeutic guide to herbal medicines, American Botanical Council, Austin, Texas

Bucić-Kojić, A., Planinić, M., Tomos, S., Bilić, M., Velić, D. (2007). Study of solid-liquid

extraction kinetics of total polyphenols from grape seeds, Journal of Food Engineering 81,

236-242.

British Pharmacopoeia Commission (2004). BP, Volume IV, A 248-250

Calvin G.J. (1968). Dynamics of Chromatography, Part I. Principles and Theory. Marcel

Dekker, Inc., New York.

Clifford, M.N. (1999). Chlorogenic acids and other cinnamates –Nature, occurrence, and

dietary burden, Journal of Science and Food Agriculture, 79, 362–372.

Harborne, J.B. (1994). The Flavonoids: Advances in Research Since 1986. Chapman & Hall,

Cambridge, United Kingdom.

Hidalgo, G-I., Almajano, M. P. (2017). Red Fruits: Extraction of Antioxidants, Phenolic

Content, and Radical Scavenging Determination: A Review, Antioxidants, 6, 7, 1-27.

Hortaçsu, Ö. (2000). Modeling of natural materials extraction „Supercritical Fluids:

Fundamentals and Application“. Kiran, E. Debenedetti, P.G., and Peters, C.J., Eds.,

Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, pp. 499-516.

Jimenez-Garcia, S.N., Guevara-Gonzalez, R.G. Miranda-Lopez, R., Feregrino-Perez, A.A.,

Torres-Pacheco, I., Vazquez-Cruz, A.M. (2013). Functional properties and quality

characteristics of bioactive compounds in berries: Biochemistry, biotechnology, and

genomics, Food Research International, 54(1), 1195-1207.

Jugoslovenska farmakopeja (2001). Savezni zavod za zaštitu i unapredjenje zdravlja,

Beograd.

53

J. Tucakov (1997). Lečenje biljem, RAD-Beograd, Beograd, 483-484.

Karabegović, I. (2011). Kinetika mikrotalasne ekstrakcije i karakterizacija bioaktivnih

komponenti iz lovor višnje (Prunus laurocerasus L.), Doktorska disertacija, Tehnološki

fakultet u Leskovcu, Univerzitet u Nišu.

Karger, B.L. (1997). HPLC: Early and Recent Perspectives, Journal of Chemical

Education, 74(1): 45-85.

Kitanović, S., Milenović, D., Veljković, V. (2008). empirical kinetic models for the resionid

extraction from aerial parts of St. John's wort (Hypericum Perforatum L.), Biochemical

Engineering Journal, 41, 1-11.

Kišgeci J. (2002). Lekovito bilje, Partenon, Beograd

Krishnan, R.Y., Rajan, K.S. (2017). Influence of microwave irradiation on kinetics and

thermodynamics of extraction of flavonoids from Phyllanthus emblica, Brazilian Journal of

Chemical Engineering, 34, 885-899.

Lattanzio, V. (2013). Phenolic compounds: introduction. U: K.G. Ramawat, J.M. Mérillon,.

Natural Products. Springer Berlin Heidelberg, 1543-1580.

Leung, A.Y., Foster, S. (2003). Encyclopedia of common natural ingredients (used in

food, drugs, and cosmetics), Second Edition, A John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New

Jersey. 649 p.

Menkiti, C., Davis, J., Semertzidou, K., Abbireddy C.O.R., Hight, W., Williams, J.D., Black,

M. (2015). The geology and geotechnical properties of the thanet sand formation - an update

from the crossrail project. ICE Publishing.

Meziane, S., Kadi, H. (2008). Kinetics and thermodynamics of oil extraction from olive cake,

J. Am. Oil Chem. Soc., 85, 391-396.

Milenović, D. (2002). Analiza procesa ekstrakcije čvrsto-tečno, Magistarski rad, Tehnološko

fakultet Leskovac.

Milić N., Milošević N., Goločorbin K.S., Božić T., Abenavoli L., Borrelli F. (2014). Warfarin

interactions with medicinal herbs, Natural Product Communications, 9(8): 1211-1216.

Mimica-Đukić N. (1992). Ispitivanje sekundarnih biomolekula u nekim vrstama roda

Mentha, Doktorska disertacija, Prirodno-matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Mimica-Dukić N. (2003). Aromatic plants as dietery supplements in human health. La

Phytotherapie Europeenne, 14, 13-18.

54

Mitić, M. (2017) Hromatografske metode, Univerzitet u Nišu, Prirodno-matematički fakultet

u Nišu.

Mišan A. (2009). Antioksidativna svojstva lekovitog bilja u hrani, Doktorska disertacija,

Prirodno matematički fakultet, Univerzitet u Novom Sadu.

Naczk, M., Shadidi, F. (2004). Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of

Chromatography A, 1054, 95-111.

Naczk, M., Shahidi, F. (2006). Phenolics in cereals, fruits and vegetables: ccurrence,

extraction and analysis. J. Pharmaceut. Biomed., 41, 1523-1542.

Nikolovski, B. (2009). Kinetika i modelovanje ekstrakcije ulja iz bobica kleke (Juniperus

communis) i semenki tikve (Cucurbita pepo) natkritičnim ugljendioksidom. Doktorska

disertacija. Tehnološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu, Novi Sad.

Ortan A., Popescu M. L., Gaita A. L., Dinu-Pirvu C. (2009). Contributions to the

Pharmacognostical Study on Anethum graveolens, Dill (Apiaceae), Romanian

Biotehnological Letters, 14: 4342-4348.

Paunović, D.Đ., Mitić, S.S., Stojanović, G.S., Mitić, M.N., Stojanović, B.T., Stojković. M.B.

(2015). Kinetics of the Solid-Liquid Extraction Process of Phenolic Antioxidants and

Antioxidant Capacity from Hop (Humulus lupulus L.), Separation Science and Thechnology,

50, 1658-1664.

Pekić, B., Miljković, D. (1980). Hemija i tehnologija kardiotoničnih glikozida, Univerzitet u

Novom Sadu, Tehnološki fakultet, Novi Sad.

Pekić B., Stojanović D., Lepojević Ž., Tolić A. (1988). Investigation of extraction kinetics of

glycosides from leaves of Digitalis lanata. Ehrh., Pharm. Ind. 50(8), 984-6.

Ponomarev V. D. (1976). Ekstragirovanje lekarstvennogo syr’ya. Medicina. Moscow.

Rodrigues, S., Fernandes, F.A.N., de Brito, E.S., Sousa, A.D., Narain, N. (2015). Ultrasound

extraction of phenolics and anthocyanins from jabuticaba peel, Industrial Crops Products, 69,

400–407.

Sant'Anna, V., Brandelli, A., Marczak, L.D.F., Ressaro, I.C. (2012). Kinetic modeling of total

polyphenol extraction from grape marc and characteritation of the rxtracts, Separation and

Purification Thechnology, 100, 82-87.

Shikov A.N., Pozharitskaya O.N., Makarov V.G., Wagner H., Verpoorte R., Heinrich M.

(2014). Medicinal plants of the Russian Pharmacopoeia; their history and applications.

Journal of Ethnopharmacology, 154: 481-536

55

Stanojević Lj., Stanković, B., Cakić, M., Nikolić, V, Ilić D., Perić, M. (2014). Uticaj tehnike

ekstrakcije na prinos, kinetiku I sastav vodenih ekstrakata ploda mirođije (Anethi fructus),

Savremene tehnologije, 3, 23-29.

Suleiman, R., Rosentrater, K., Bern, C. (2013). Effects of deterioration parameters on storage

of maize: A review. Journal of Natural Sciences Research 3(9): 147-165.

The Ayurvedic pharmacopoeia of India (1999). Part I. Vol. II. New Delhi, Ministry of Health

and Family Welfare, Department of Indian System of Medicine and Homeopathy.

Tolić, A. (1996). Operacija ekstrakcije tečno-tečno, Tehnološki fakultet, Novi Sad.

Topolar, H., Gecgel, U. (2000). kinetics and thermodynamics of oil extraction from

sunflower seeds in the presence of aqueous acidic hexane solutions. Turk. J. Chem., 24, 247-

253.

Treybal R. E. (1985). Mass transfer operations, 3th ed., McGraw-Hill, Singapore.

Veljković, V.B., Milenović, D.M. (2002). Analiza ekstrakcije rezinoida kantariona

(Hzpericum perforatum L.) II. Poređenje modela kinetike ekstrakcije, He. Ind. 56, 60-67

Veličković, D.T., Milenović, D.M., Ristić, M.S., Veljković, V.B. (2006). Kinetics of

ultrasonic extraction of extractive substances from garden (Salvia officinalis L.) and glutinous

(Salvia glutinosa L.) sage, Ultrasonic Sonochemistry, 13, 159-156

Veličković, D.T., Milenović, D.M., Ristić, M.S., Veljković, V.B. (2008). Ultrasonic

extraction of waste solid residues from the Salvia sp. Essential oil hydrodestillation,

Biochemical Engineering Journal, 42, 97-104

Lea P.J., Leegood R.C. (1999). Plant Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley &

Sons, Chichester.

Zhang L., Demain A.L. (2005). Natural Products: Drug Discovery and Therapeutic

Medicine, Humana Press Inc., Totowa, New York.

Wang, L., Weller, C. L. (2006). Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants,

Trends in Food Science & Technology, 17, 300-312.

World Health Organization (2006) WHO Monographs on selected medicinal plants, Volume

3. WHO, Geneva.