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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LAB. CITOPATOLOGÍA AMBIENTAL
Eficiencia de la Terapia Fotodinámica utilizando nanopartículas en la eliminación de células cancerosas
Clave: 20070480 Ene-Dic, 2007
Directora del proyecto:
DRA. EVA RAMON GALLEGOS.
Investigadores participantes: JIMENEZ PEREZ JOSE LUIS (IPN)
TANORI CORDOVA JUDITH (UNIV. SONORA) VEGA BARRITA MARIA LUISA (IPN)
CRUZ OREA ALFREDO (CINVESTAV-IPN)
Alumnos participantes: MALDONADO ALVARADO ELIZABETH
RODOLFO GARCIA CHACON ANA MARIA JIMENEZ BETANZOS JUAREZ PALAFOX SHARLLY RUBI
LUCRECIA ROSAS FLORES DIAZ ROSAS GUADALUPE
México, D.F. 4 de Feb. de 2008.
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Resumen El uso de las nanoparticulas de oro (nP-Au), en la eliminación del cáncer, ha mostrado ser altamente efectivo, debido a que las células cancerosas las acumulan 600% más que las no cancerosas, además tienen una alta capacidad de absorción y dispersión de luz1, con base en esto creemos que pueden mejorarse los resultados de la terapia fotodinámica (PDT) al acoplar nanoparticulas y los fotosensibilizadores (Ps), enfatizando que la PDT es un método altamente efectivo para el diagnóstico y tratamiento de procesos pre-malignos y malignos y que su principio se basa en la excitación de un fotosensibilizador mediante la luz y la generación de radicales libres para las eliminación de las células cancerosas. El objetivo del proyecto fue determinar in vitro la eficiencia de la terapia fotodinámica utilizando nanopartículas de oro (nP-Au) combinadas con ALA y PpIX en la eliminación de células de carcinoma cervicouterino. Se estandarizaron las condiciones de síntesis de nP-Au hidrosolubles, y caracterizaron por microscopia electrónica de transmisión (TEM) y por espectroscopia UV-VIS. Se expusieron células cancerosas (HeLa y C-33A) a diferentes dosis de nP-Au, se determinó su toxicidad per se y en presencia de PpIX y ácido �-aminolevulínico. Se realizó una cinética por TEM para determinar el tiempo de incorporación de las nP-Au a las células. Posterior a esto, se aplicó la PDT utilizando diferentes dosis de nP-Au y fotosensibilizadores, y se determinó la efectividad de la PDT por el método de MTT. Se determinó la difusividad térmica mediante espectroscopia de lente térmica de las nP-Au y el tiempo de relajación de la protoporfirina IX en combinación de las mismas mediante espectroscopia fotoacustica. Se encontró que el tiempo que requieren las células para incorporar la máxima concentración de las np-Au es de 16h. Por otro se determinó que la difusividad térmica de la PpIX aumenta conforme aumenta la concentración de nanoparticulas. Las nanoparticulas en combinación con la PpIX exógena tienen mayor efecto sobre las células C33 que sobre las células HeLa. Se logró hacer más eficiente la PDT utilizando que np-Au combinadas con la PpIX que con el ALA. La eficiencia de la PDT utilizando PpIX y np-Au combinadas se puede atribuir al fenómeno de difusividad térmica que tiene la PpIX.
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1. INTRODUCCIÓN 1.1 CARCINOMA CERVICOUTERINO
El Carcinoma del cuello uterino (CaCU) comienza en la unión entre el
epitelio escamoso y el cilíndrico del exocérvix. En su comienzo no es posible
apreciar a simple vista alteraciones. Algunas de estas lesiones in situ
indudablemente experimentan regresión, pero la mayor parte avanza a
cánceres invasores.
El CaCu suele crecer lentamente por un período de tiempo. Antes de
que se encuentren células cancerosas en el cuello uterino, aparecen una serie
de alteraciones celulares en el epitelio cervical denominadas neoplasia
intraepitelial cervical (NIC). El CaCu histológicamente se va desarrollando a
través de un proceso progresivo de alteraciones que van desde un carcinoma
in situ hasta llegar a un carcinoma invasor (Rock y cols. 2000).
Los tumores se clasifican de acuerdo con el grado de invasión tisular,
conforme a la Federación Internacional de Gineco Obstetricia (FIGO), que
distingue cinco estadios, de 0 a 4 (Benedit y cols. 1992).
Etapa 0 o carcinoma in situ: El carcinoma in situ es un cáncer en su
etapa inicial. Las células anormales se encuentran sólo en la primera
capa del epitelio que recubren el cuello uterino y no invaden la
membrana basal.
Etapa I: El cáncer afecta el cuello uterino, pero no se ha diseminado a
los alrededores.
Etapa IA: Una cantidad muy pequeña de células cancerosas que sólo es
visible a través del microscopio se encuentran en el tejido más profundo
del cuello uterino.
Etapa IB: Una cantidad mayor de células cancerosas se encuentran en
el tejido del cuello uterino.
Etapa II: El cáncer se ha diseminado a regiones cercanas, pero aún se
encuentra en la región pélvica.
Etapa IIA: El cáncer se ha diseminado fuera del cuello uterino a los dos
tercios superiores de la vagina.
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Etapa IIB: El cáncer se ha diseminado al tejido alrededor del cuello
uterino.
Etapa III: El cáncer se ha diseminado a toda la región pélvica. Las
células cancerosas pueden haberse diseminado a la parte inferior de la
vagina. Las células también pueden haberse diseminado para bloquear
los uréteres.
Etapa IV: El cáncer se ha diseminado a vejiga, recto y en ocasiones a
órganos dístales como los pulmones.
Etapa IVA: El cáncer se ha diseminado a la vejiga o al recto.
Etapa IVB: El cáncer se ha diseminado a órganos dístales como los
pulmones (Benedit y cols. 1992).
La frecuencia del CaCu se ha relacionado con los siguientes factores:
1. Es más frecuente entre grupos de ingresos bajos
2. Matrimonio temprano
3. Comienzo de relaciones sexuales a temprana edad
4. Virus del papiloma humano
5. Uso de anticonceptivos
6. Múltiples compañeros sexuales
7. Compañeros sexuales de “alto riesgo”
De todos los factores mencionados, actualmente se sabe que el virus del
papiloma humano (VPH) es el principal agente etiológico infeccioso asociado al
CaCu. Una fracción considerable de las infecciones por VPH es subclínica.
Tanto la mujer como el hombre pueden ser portadores y vehículos de la
infección, y socialmente pueden identificarse grupos de alta prevalencia en la
población que ejerce prostitución y en los grupos infectados por el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH). La diseminación se produce principalmente
por contacto sexual; el cérvix uterino en la zona de transformación y la línea
pectínea del canal anal son los sitios más susceptibles de infección con
potencial para iniciar una transformación neoplásica (Lörincz, 1999).
Con el tiempo, todos los carcinomas cervicales infiltran el cuello uterino
subyacente, cierran el orificio externo, crecen ascendiendo en el conducto
endocervical y el segmento uterino inferior y por último, se extienden a la pared
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del fondo del útero. Las lesiones avanzadas infiltran los órganos adyacentes
(Robbins y Cols. 1999)
La histología del 95% de los carcinomas del cuello uterino consiste en
cáncer epidermoide o de células escamosas típicas, que varían en
diferenciación y rapidez de crecimiento (Robbins y Cols., 1999).
El CaCu se desarrolla lentamente en término de años. Mucho antes de
que ocurra la lesión in situ comienzan cambios celulares, durante este tiempo,
las anomalías citológicas no producen manifestaciones clínicas. El diagnóstico
puede sospecharse al efectuar la citología de Papanicolaou (Robbins y Cols.
1999).
1.2 TERAPIAS CONVENCIONALES PARA TRATAR EL CARCINOMA CERVICOUTERINO
Existen diversas terapias que se utilizan para tratar el CaCu. La
gravedad de la enfermedad, el estado integral de la paciente, así como su edad
entre otros factores, influyen en la elección del tratamiento, en la mayoría de
las veces es necesario combinar dichos tratamientos para asegurar la
eliminación absoluta del tumor.
A continuación se describen brevemente las terapias tradicionales
comúnmente usadas en México para combatir el CaCu.
1.2.1 Histerectomía
Es una cirugía en la cual se extirpa el útero. Esta cirugía se puede
realizar de las siguientes formas: abdominal, vaginal o laparoscópica (Johnson
y Cols., 2005).
Hay diferentes tipos de histerectomía:
a. Total o completa: En la cual se extirpa el útero y el cuello del útero.
b. Histerectomía parcial: Se extirpa sólo la parte superior del útero.
c. Histerectomía radical: Se extirpa el útero, el cuello del útero, los
ovarios, las trompas de Falopio
Los efectos secundarios son iguales a los de cualquier otro tipo de
operación, algunos otros efectos incluyen los de la anestesia, infecciones,
sangrados, y lesiones de órganos cercanos (Publicación No. 98-0016 de la
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AHCPR). Una consecuencia muy importante sobre todo para mujeres que
desean embarazarse es que este procedimiento puede impedir embarazos
exitosos (Allison y Cols., 2005).
1.2.2 Radioterapia El agente terapéutico de la radioterapia es la energía física de las
radiaciones ionizantes absorbidas en los tejidos patológicos neoplásicos,
causando la detención de su crecimiento seguida de su involución y
eliminación. La absorción de esta energía en los tejidos sanos es causa de
lesiones, complicaciones y secuelas (García, 2003).
Las fuentes de energía son los isótopos radiactivos naturales o artificiales
(fotónicas) y los haces de radiación generados por aceleradores de partículas
subatómicas (Corpusculares) (García, 2003). Puede emplearse como
tratamiento complementario a la cirugía, para aplicarlo previamente a ésta, y
disminuir así el tamaño del tumor y que sea más fácil su extirpación.
El efecto biológico de las radiaciones ionizantes es el resultado final de
una serie de fenómenos de diversa naturaleza. La interacción entre radiaciones
y materia viva se realiza a través de tres fases sucesivas:
a. Fase física: Corresponde esencialmente a fenómenos de ionización y
excitación de los átomos, la formación de iones y rotura de enlaces
químicos.
b. Fase química: Consiste en la cesión de energía a moléculas o
macromoléculas de elevada significación funcional, así como la
activación de átomos o moléculas (radicales libres) muy reactivos que
interaccionan con las moléculas y macromoléculas orgánicas.
c. Fase biológica: Se desarrolla preferentemente a nivel del núcleo,
mediante alteraciones de los ácidos nucleicos y de las enzimas vitales
(Cortes, 1983).
1.2.3 Quimioterapia Es la administración del conjunto de medicamentos con capacidad
citotóxica que se utilizan en el tratamiento del cáncer. De manera general
podemos dividir la quimioterapia en dos modalidades (Zinder, 2003):
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a. Monoquimioterapia: Que consiste fundamentalmente en la juiciosa
rotación de los fármacos disponibles, administrando un medicamento
hasta que aparece la evidencia clínica de su ineficacia. En la mayor
parte de los casos, los alquilantes han representado los fármacos de
primera elección.
b. Poliquimioterapia: Es la asociación de varios fármacos antineoplásicos
para aumentar el sinergismo terapéutico, retrasar la aparición de los
fenómenos de resistencia celular, aumentar la tolerancia del paciente a
la acción tóxica de los fármacos, así como inducir una regresión
completa sin producir simultáneamente una elevada toxicidad (Cortes,
2003).
1.2.4 Criocirugía cervical Esté es un procedimiento que usa temperaturas de congelación (por
medio de nitrógeno líquido u óxido nítrico) para destruir el tejido (Popkin y cols.,
1978). La sonda de criocirugía se inserta en la vagina y el óxido nitroso enfría
extremadamente la punta. La punta toca áreas anormales del cuello del útero y
permanece de 3 a 5 minutos. Luego, la punta se retira, permitiendo que los
tejidos regresen a su temperatura normal. El ciclo de
congelamiento/descongelamiento se repite una vez más (Fernández y cols.,
2001).
1.2.5 Electrocirugía Se realiza mediante la utilización de corriente eléctrica alterna de alta
frecuencia para eliminar la zona de transformación y lesión con una
profundidad no menos a 5 mm.
Se requiere de generadores electroquirúrgicos modernos y un adecuado
entrenamiento del personal médico y auxiliar. Las máquinas electroquirúrgicas
deben disponer de circuitos aislados y monitor de electrodo de retorno. La
corriente se aplica mediante un electrodo en la zona de la lesión. El
procedimiento debe realizarse muy cuidadosamente debido a que pueden
ocasionarse lesiones térmicas colaterales a medida que se aumenta el voltaje
(Partington y cols., 1989).
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1.3 TERAPIAS INNOVADORAS Con base en las evidencias observadas en diversos estudios clínicos en
CaCu, es claro que la paciente con esta neoplasia debe recibir quimioterapia
concomitante con la radioterapia. Este padecimiento incluye tres componentes
fundamentales: el dolor y sufrimiento de las pacientes y sus familiares, los
efectos secundarios al tratamiento y el costo del mismo (Mohar, 2003). Debido
a esto se hacen grandes esfuerzos para encontrar nuevas terapias
innovadoras, así como incrementar su eficacia en el tratamiento contra el
CaCu. Un ejemplo es la Terapia Fotodinámica que se describe a continuación.
1.3.1 Terapia Fotodinámica La Terapia Fotodinámica (PDT) se considera un método altamente
efectivo para el diagnóstico y tratamiento de una amplia variedad de procesos
pre-malignos y malignos. Se caracteriza por la eliminación de células
cancerosas, que acumulan un fotosensibilizador y generan radicales libres al
ser expuestas a luz de una determinada longitud de onda.
Nuestro grupo de trabajo ha realizado proyectos enfocados a la
aplicación de la PDT para tratar el (CaCu), problema de salud pública en
México que es la principal causa de muerte en la mujer Mexicana. Nuestra
línea de investigación inicio en 1997. El primer trabajo publicado por el grupo
fue la determinación de la acumulación de la protoporfirina IX en células de
CaCu, se determinó que las células acumulaban de 5 a 8 veces más PpIX que
las células normales de cervix (Ramón y Cols., 1999). Con base en estos
resultados se plantearon varios proyectos que generaron valiosos resultados,
como el tiempo de fotoblanqueamiento de la PpIX en la piel de ratones y la
determinación del tiempo de decaimiento de la PpIX (Ramón y Cols., 2001). En
el 2002 se estudió el efecto de la PDT in vitro en las células de CaCu
infectadas con el VPH. Se observó que la terapia produjo un 100% de
mortalidad en dichas células. Por otro lado se determinó la efectividad de la
PDT utilizando luz continua y luz pulsada. Finalmente se desarrolló un modelo
de CaCu en ratones NU/NU y se le aplicó la PDT. Se encontró que los tumores
disminuyeron hasta un 53% de su volumen inicial además de presentar más del
90% de muerte celular vía apoptosis (Márquez y Cols., 2005).
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De lo anterior se concluye que la PDT muestra gran potencial para ser
utilizada, a mediano plazo, en la eliminación del cáncer cervicouterino en
mujeres mexicanas.
1.3.1.1 Fundamento La PDT se basa en la activación de un agente químico externo llamado
fotosensibilizador, por la irradiación con luz de una longitud de onda específica,
la cual puede ser absorbida por éste. El fotosensibilizador absorbe esta luz,
produciendo especies reactivas del oxígeno las cuales pueden destruir las
células tumorales (Prasad, 2003).
Cuando el fotosensibilizador es administrado, tanto las células
normales como las malignas absorben la droga, sin embargo, las células
tumorales tienen una mayor afinidad por esta. La concentración del
fotosensibilizador en las células normales se reduce significativamente, en
contraste, las células malignas retienen la droga produciendo una localización
selectiva del fotosensibilizador en el tejido maligno. Cuando se irradia con luz a
una longitud de onda apropiada, se activa la droga PDT, la cual destruye
selectivamente el tejido maligno por un mecanismo fotoquímico. En el caso de
cáncer en órganos internos como el pulmón, la luz es administrada usando
sistemas endoscópicos (Prasad 2003).
1.3.1.2 Fotosensibilizadores Las propiedades fisicoquímicas son muy importantes para la eficacia de
la fotosensibilización. Pureza química, capacidad para localizarse
específicamente en tejidos neoplásicos, un intervalo corto entre la
administración de la droga y la acumulación en tejidos cancerosos, activación a
una longitud de onda con una óptima penetración tisular, formación del
singulete de oxígeno y poca o nula sensibilidad son características deseables
de un fotosensibilizador ideal. El prerrequisito fundamental para una óptima
fotosensibilización es una suficiente acumulación de la droga localizada en los
tejidos blanco (Luksiene 2003).
Los fotosensibilizadores están constituidos por un anillo con dobles enlaces
conjugados. En el cuadro 1 se muestran los fotosensibilizadores y precursores
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más frecuentemente utilizados (Luksiene 2003). El proceso de transferencia de
energía resulta en la transformación de oxígeno molecular a un estado activado
llamado oxígeno singulete (Kessel, 1997).
.3.1.3 ÁCIDO δ-AMINOLEVULÍNICO
El ácido δ-aminolevulínico (ALA) es un precursor en la síntesis de
porfirinas. El ALA exógeno induce una selectiva acumulación del otro precursor
del grupo hemo, como lo es la Protoporfirina IX en células neoplásicas (Grieb
2004). Esto se debe a que en las células cancerosas, la enzima que convierte
la protoporfirina IX al grupo hemo, ferroquelatasa, se encuentra disminuída, y le
enzima porfobilinógeno desaminasa está aumentada (Van-Hillegersberg y
cols., 1994).
El ALA puede ser endógenamente generado por la condensación de la
glicina y la succinil CoA. Las ventanas que ofrece el ALA como inductor de la
protoporfirina IX son las siguientes:
a. Capacidad de alcanzar una óptima proporción terapéutica en 4-6 horas.
b. Rápido y sistemático blanqueamiento del ALA en 24 horas, gracias a
esto no hay una fotosensibilidad prolongada en piel.
1.3.1.4 Porfirinas Las porfirinas son compuestos cíclicos formados por la unión de 4 anillos
pirrólicos enlazados por puentes metileno. Una propiedad característica de las
porfirinas es la de formar complejos con los iones metálicos unidos a los
átomos de nitrógeno de los anillos pirrólicos (Martin, 1982).
De gran valor en el estudio de las porfirinas o de los derivados de las
porfirinas es el característico espectro de absorción que exhiben estos
compuestos. La porfirina disuelta en ácido clorhídrico al 5% muestra una
estrecha banda de absorción cerca de los 400 nm. Esto es un rasgo distintivo
del anillo porfírinico y es característico de todas las porfirinas sin importar las
cadenas laterales que existan. Esta banda se ha llamado la Banda de Soret
en honor a su descubridor (Martin, 1982).
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1.3.1.5 Fuentes de luz La luz consiste en radiación no ionizante en la región visible o visible
cercano (ultravioleta o infrarrojo) del espectro óptico (Dalla y Col. 2001).
Inicialmente, la fotosensibilización se había llevado a cabo con
lámparas de descarga de gas. La introducción de láseres equipados con fibras
ópticas revolucionó
la fotosensibilización y expandió su aplicación en medicina, permitiendo la
irradiación endoscópica en varios sitios del cuerpo humano (Luksiene 2003).
El láser utilizado para la PDT es un dye láser el cual genera una luz de
onda continua. Los dos tipos de láseres pueden ser:
1 Argon-dye (coheren) ó
2 KTP/YAG-dye (lasercope).
El dye puede emitir un espectro de longitud de onda que puede ser
modificado; este láser produce una luz roja que es transmitida por una fibra
óptica de cuarzo flexible e ideal para uso endoscópico. La longitud de onda
usada para PDT es de 630 nm porque da una óptima penetración en el tejido
tumoral con activación del agente fotosensible. La fibra óptica por la cual se
transmite el láser termina en punta cilíndrica la cual libera luz en forma
circunferencial (Alcocer y Col., 2000).
La PDT requiere suficiente luz para producir una fotosensibilización
efectiva. La energía y la longitud de onda utilizadas son establecidas por las
propiedades fotoquímicas del fotosensibilizador, las propiedades físicas y
biológicas del tumor y la vía de entrega de la luz utilizada (Delaney, 1989).
La cantidad de energía de luz que llega a una lesión en particular es
generalmente expresada en términos de la densidad de energía en J/cm2.
De estudios hechos por Ramón y colaboradores se sabe que la PDT es
más efectiva para eliminar las células de carcinoma cervicouterino in vitro,
utilizando un láser de argón que uno de diodo rojo (López, 2005).
1.3.1.6 Oxígeno El oxígeno es un elemento indispensable en la terapia fotodinámica. Han
sido propuestos dos mecanismos que pueden producir especies reactivas del
oxígeno provocando citotoxicidad al reaccionar con componentes celulares.
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Se propone que la eficacia de la PDT está directamente relacionada con
la formación del oxígeno singulete (proceso tipo II), y que este depende de la
concentración de oxígeno en el tejido (Dougherty y Cols., 1998), debido a esto
las células hipóxicas son muy resistentes a la fotosensibilización. Los niveles
de oxígeno en el tejido canceroso pueden disminuir durante la
fotosensibilización por los siguientes mecanismos:
a. El consumo de oxígeno durante la fotosensibilización (Luksiene, 2003).
b. Daño vascular debido a la acción fotodinámica, lo cual provoca hipoxia
en el tejido canceroso (Prasad, 2003. Dougherty y Cols., 1998. Luksiene,
2003).
El proceso tipo I involucra la formación de radicales libres, peróxidos y
superóxidos por una transferencia de un átomo de hidrógeno, o un electrón. En
el proceso tipo II el fotosensibilizador en estado triplete reacciona con el
oxígeno presente en el tejido que pasa de estado triplete, que es su estado
basal, a oxígeno singulete, provocando citotoxicidad (Prasad, 2003).
1.3.2 Aplicaciones clínicas de la Terapia Fotodinámica El desarrollo de la terapia fotodinámica nos permite aplicar un nuevo
método para tratamiento local en cáncer esofágico, pulmonar y otras
malignidades en la piel, cabeza y cuello (Alcocer y Col., 2000). A continuación
se describen las principales aplicaciones clínicas de la terapia Fotodinámica:
1.3.2.1 Diagnóstico Se utiliza principalmente el ALA como fotosensibilizador debido a que se
incorpora selectivamente por tejido displásico o maligno.
Para aplicar la PDT como diagnóstico se usa luz de una corta longitud
de onda, al irradiar el tejido maligno, el fotosensibilizador se excita y se
detectan áreas anormales mediante la fluorescencia que se produce cuando el
fotosensibilizador regresa a su estado basal. La PDT ha sido aplicada en el
diagnóstico de carcinoma in situ de vejiga y estadios tempranos de cáncer de
pulmón (Shackley y Cols., 1999).
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1.3.2.2 Tratamiento en lesiones superficiales de piel y mucosas Generalmente el fotosensibilizador de elección es el ALA ya que puede
administrarse tópicamente sobre la lesión. La PDT es una atractiva opción para
el tratamiento de estas lesiones debido a que no genera efectos secundarios
como los que se derivan de tratamientos como la radioterapia y la cirugía
convencional, entre los cuales tenemos molestas contracciones en la piel y
ulceración. La PDT puede aplicarse para combatir el carcinoma basocelular y
tiene aplicaciones potenciales en enfermedades uroteliales, así como en
neoplasias cervical y vaginal (Shackley y Cols., 1999).
1.3.2.3 Tratamiento contra el cáncer en órganos sólidos Se requieren fotosensibilizadores sistémicos. Se ha usado en cáncer de
próstata, y en cáncer de páncreas cuando es inoperable.
Estudios clínicos preliminares sobre el tratamiento de tumores sólidos en
el ojo utilizando la PDT han mostrado éxito. Esta lesión es idónea para ser
tratada con la PDT debido a que las propiedades ópticas del ojo evitan la
necesidad de utilizar un láser con fibras ópticas (Shackley y Cols., 1999).
1.3.2.4 Tratamiento contra lesiones benignas El tratamiento aceptado para combatir la degeneración macular senil es
la fotocoagulación, pero esta terapia causa daños a la retina. La PDT utilizando
derivados de la Benzoporfirina (Verteporfin) ofrece selectividad desde el
momento en que la iluminación del fotosensibilizador es predominantemente
dentro de la neovasculatura.
La Psoriasis es comúnmente tratada con luz UV después de administrar
soralen, una alternativa a este padecimiento podría ser la PDT utilizando un
fotosensibilizador tópico.
Aún se evalúa la efectividad de la PDT como tratamiento de la
menorragia.
1.3.2.5 Tratamiento en enfermedades ginecológicas Diagnóstico y procedimientos para enfermedades ginecológicas han
evolucionado en afán de preservar las funciones sexuales, reproductivas y de
los órganos afectados (Allison y Cols., 2005).
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La PDT y el fotodiagnóstico han sido empleados para detectar y
combatir lesiones premalignas y lesiones malignas de cervix, endometrio,
lesiones de vulva y vagina, así como en el cáncer de ovario (Allison y Cols.,
2005).
1.4 NANOPARTICULAS Nanotecnologia es la creación y utilización de materiales y sistemas cuyas
dimensiones se encuentran dentro de la escala de nanómetros (Priya y Cols.,
2007). Avances recientes en nanotecnología han aportado una variedad de
materiales nanoestructurados con propiedades altamente controladas. Estos
materiales poseen nuevas y únicas capacidades para ser aplicados en
biomedicina, particularmente en el diagnóstico y el desarrollo de nuevas
terapias. En particular, la nanotecnología podría tener un gran impacto en la
biofotónica (West y Cols., 2003).
1.4.1 Fundamento
Las nanopartículas son partículas obtenidas por algún proceso químico o
físico cuyo diámetro es menor a 100 nanómetros y sus propiedades físicas son
específicas y controladas (Maureen y cols., 2006). El término de nanopartícula
es muy general y describe dendrímeros, nanocristales, esferas y nanotubos
(Holister y Cols., 2003).
Las nanopartículas son de 102 a 104 más pequeñas que las células
humanas, pero son similares en tamaño a biomoléculas como enzimas y
receptores celulares (Priya y Cols., 2007).
1.4.2 Síntesis Existe una amplia variedad de técnicas para obtener nanopartículas.
Estas recaen principalmente en 3 categorías:
a. Condensación de vapor
b. Procesos en fase sólida
c. Síntesis química
1.4.2.1 Condensación de vapor
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Involucra la evaporación de un metal sólido seguida de una rápida
condensación originando nanoagrupaciones que se asientan en forma de
polvo. Se usan gases inertes para evitar la oxidación cuando se crean
nanopartículas de metal. La principal ventaja de este método es que se
obtienen nanopartículas con bajos niveles de contaminación. El tamaño final se
puede controlar variando factores como la temperatura, el gas inerte en el cual
se realiza la reacción y la velocidad de evaporación (Holister y Cols., 1993).
1.4.2.2 Procesos en fase sólida La trituración o pulverización puede ser usada para la síntesis de
nanopartículas. El material a pulverizar, la temperatura y la atmósfera en la que
se haga la trituración afectan las propiedades del producto resultante. Se usa
esta técnica cuando se pretende sintetizar nanopartículas a partir de materiales
que no pueden ser tratados mediante las otras dos técnicas. Es común obtener
nanopartículas contaminadas con los materiales de los cuales se partió para su
realización (Holister y Cols., 1993).
1.4.2.3 Síntesis química
La técnica mas comúnmente usada consiste esencialmente en la
formación de nanopartículas en medio líquido compuesto por varios reactivos.
Esta técnica permite un mejor control sobre las características finales de las
nanopartículas como es el tamaño y la forma. El tamaño final dependerá de
detener la reacción cuando las nanopartículas hayan alcanzado el tamaño
deseado. Mediante esta síntesis se obtienen grandes cantidades de producto a
un bajo costo. La desventaja es que la contaminación por los reactivos
utilizados es muy frecuente (Holister y Cols., 1993).
1.4.2.3.1 Sistema de microemulsiones Para obtener nanopartículas mediante este sistema se requiere un
surfactante, y agua desionizada para formar una microemulsión, el resultado de
mezclar estos dos reactivos es la formación de micelas inversas, el
clorurotetraaurico (HAuCl4), al igual que la hidracina, se van al interior de las
micelas debido a su carácter polar, al aplicar agitación se provoca que las
micelas choquen entre sí y se fusionen, dentro de ellas se lleva a cabo la
16
reacción de reducción del oro, y por lo tanto la formación de nanopartículas de
oro.
1.4.2.3.2 Modelo de formación de coloides monodispersos
La síntesis se da mediante la formación de coloides monodispersos por
precipitación de una solución homogénea al ser reducida. El modelo está
basado en una pequeña nucleación (primera etapa), seguida de un crecimiento
difusional de las finas partículas formadas de la primera etapa (Park y Cols.,
2001).
1.4.3 Usos clínicos o en investigación de nanopartículas en estudios piloto Debido a que el desarrollo de la nanotecnología es relativamente
reciente aún no hay aplicaciones clínicas de nanomateriales, sin embargo en
los últimos años se han realizado estudios piloto en los cuales se pretende
acoplar esta tecnología de vanguardia a terapias innovadoras como lo es la
PDT.
En el 2005 Vargas y Colaboradores evaluaron la eficiencia de la
actividad fotodinámica in vivo de las porfirinas encapsuladas en nanopartículas
biodegradables utilizando embriones de pollo. Los resultados mostraron que el
fotosensibilizador permanecía por más tiempo en el compartimiento vascular de
la membrana corioalantoidea cuando se administraba encapsulado en
nanopartículas y que el efecto del fotosensibilizador se potenciaba con el uso
de estas.
Pegas y colaboradores realizaron un estudio en el año de 2005 de
intercomparación preclínica utilizando diferentes fotosensibilizadores con la
finalidad de optimizar la PDT para el tratamiento de extravasación coroidal,
asociada a degeneración macular, encapsulando los fotosensibilizadores en
nanopartículas biodegradables. Observaron que usando nanopartículas
conjugadas con un fotosensibilizador lipofílico se potenciaba el daño vascular.
Dicho estudio se evaluó en embriones de pollo, específicamente en la
membrana corioalantoidea del embrión.
17
2. JUSTIFICACIÓN En México los tratamientos que se utilizan para tratar el cáncer
cervicouterino son: la criocirugía, electrocirugía, histerectomía, quimioterapia y
radioterapia, los cuales son parcialmente efectivos y en ocasiones sus efectos
secundarios conducen a la muerte de la paciente. Por tanto, es importante
buscar terapias dirigidas y no invasivas para asegurar la completa eliminación
de las células cancerosas sin dañar las normales. Dado que en México el
cáncer cervicouterino es un problema de salud pública (principal causa de
muerte en mujeres), en este proyecto se pretende aplicar la terapia
fotodinámica en un ensayo in vitro utilizando dos líneas celulares cancerosas
de CaCu: HeLa (VPH 18 +) y C-33A (VPH -). Esta terapia a diferencia de los
tratamientos tradicionales elimina selectivamente a las células cancerosas sin
afectar a las células sanas. Por otro lado, el uso de nanopartículas de oro (np-
Au) en la eliminación del cáncer ha mostrado ser altamente efectivo debido a
que las células cancerosas las acumulan 600% más que las no cancerosas,
además tienen una alta capacidad de absorción y dispersión de la luz. Con
base en lo anterior se cree que pueden mejorarse los resultados de la PDT
utilizando nanopartículas.
Así la hipótesis de nuestro trabajo fue que el uso de un fotosensibilizador
(protoporfirina IX) y np-Au permite obtener una mayor eficiencia en la
eliminación de las células cancerosas mediante la PDT que la obtenida
únicamente con el fotosensibilizador.
18
3. Objetivo general Determinar in vitro la eficiencia de la terapia fotodinámica utilizando
nanopartículas de oro combinadas con ALA y PpIX en la eliminación de células
de carcinoma cervicouterino.
4. Metas cumplidas
• Estandarización de la técnica empleada para la síntesis de nanopartículas
de oro (np-Au).
• Caracterización de las nanopartículas de oro por microscopia de
transmisión (TEM) y por espectroscopia UV-VIS.
• Descongelar, mantener, propagar y congelar las líneas celulares HeLa y
C33A.
• Exponer las líneas celulares HeLa y C-33A a diferentes concentraciones de
nanopartículas de oro y determinar la dosis a la cual las nanopartículas no
provocan muerte celular.
• Determinar mediante microscopia electrónica de barrido (SEM) y de
transmisión (TEM) el tiempo de incorporación de las np-Au a la célula en
ausencia del fotosensibilizador (protoporfirina IX) y en presencia del
fotosensibilizador como sal disódica e inducido por exposición al ácido δ-
aminolevulínico.
NOTA: La microscopia electrónica de barrido (SEM) no fue necesaria
hacerla ya que con TEM se pudo corroborar nuestra hipotesis.
• Determinar la efectividad de la PDT utilizando nanopartículas de oro y
combinadas con el fotosensibilizador por cuantificación de la mortalidad
mediante el método de MTT.
• Determinar para la discusión de los resultados la difusividad térmica
mediante espectroscopia de lente térmica de las nanoparticulas y el tiempo
de relajación de la protoporifirina IX en combinación de las mismas
mediante espectroscopia fotoacústica.
19
5. Métodos y materiales 5.1 Síntesis química de np-Au 5.1.1 Síntesis química de np-Au mediante el sistema de microemulsiones. Para obtener un volumen de reacción de 9mL, se agregaron 8.83 mL de
Docusato de sodio en isooctano, a una concentración de 0.1M, 142.38 μL de
agua destilada y se agita para formar las micelas inversas. Posteriormente se
agregan 18μL de HAuCl4 al 0.2M solubilizado en agua y finalmente se agregan
1.62 μL de N2H2 al 11M. Para detener la reacción se agregan 8 μL de
Dodecanotiol. Se hace un lavado con acetona a un volumen 1:1, centrifugando
a 5000 rpm/20 min.
5.1.2 Síntesis química de np-Au mediante el método de coloides monodispersos (Wagner y cols., 2005)
Para obtener np-Au en solución acuosa se adicionaron 15 μL de HAuCl4
al 0.2M a una solución al 0.025% de PVP a temperatura ambiente,
posteriormente se agregaron 10.56 mg de ácido ascórbico. Se dejó reposar
durante 5 minutos para obtener una solución coloidal de nanopartículas de oro.
5.2 Caracterización de las nanopartículas de oro mediante microscopía electrónica de Transmisión y espectroscopia UV-VIS.
Se colocaron aproximadamente 0.1 mL de la muestra de np-Au sobre
rejillas TEM. Se dejó adsorber 24 horas, posteriormente se colocó en el
microscopio electrónico de transmisión para determinar el diámetro de las
nanopartículas de oro (np–Au). Se determinó la longitud de onda de máxima
absorción realizando un barrido de 400 a 600 nm en un espectrofotómetro de
UV-VIS-NIR.
5.3 Esterilización de np-Au Se realizaron alícuotas en viales de la suspensión de np-Au. Una parte
del lote se esterilizó mediante filtración, para lo cual se hizo pasar la
suspensión de np-Au a través de un filtro cuyo poro de membrana posee un
diámetro de 0.22 μm. Se determinó la absorbencia de la suspensión de np-Au
20
sin filtrar y filtrada para determinar el porcentaje de np-Au que se perdieron
durante la esterilización.
Otra parte del lote se esterilizó mediante radiación ionizante en el
utilizando un irradiador de 60Co a una dosis de 25 kGy a temperatura ambiente.
Se tomó una muestra de ambos lotes, tanto el esterilizado por filtración como
por radiación ionizante para montar pruebas de esterilidad en el medio de
cultivo utilizado para la propagación y mantenimiento de las líneas celulares.
5.4 Preparación de las placas para determinar la dosis segura de np-Au Se utilizaron placas de 96 pozos. Cada pozo se sembró con 2 x 104 y 3 x
104 células HeLa y C33-A respectivamente, se incubó a 37°C. Se utilizó el
medio mínimo esencial de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM/F12)
complementado con L-glutamina, bicarbonato de sodio, 10% de suero fetal de
bovino y 1% de antibótico.
5.5 Selección de la dosis a la cual las np-Au no provocan muerte celular per se.
Las células sembradas en las placas se expusieron a concentraciones de
60%, 30%, 15%, 7.5%, 3.7% y 1.5% a partir solución madre de nP–Au.
Posteriormente se determinó la viabilidad a las 24 horas mediante el método de
azul de tetrazolio (MTT). Se hizo un ensayo utilizando células expuestas a np-
Au, células y np-Au con Pp IX en forma de sal disódica a una concentración de
40 y 20 μg/mL, y un tercer ensayo exponiendo las células a np-Au con ALA a
una concentración de 40 μg/mL.
5.6 Preparación de las placas para determinar el tiempo de incorporación de np-Au a las células. Se utilizarán placas de 6 pozos. Cada pozo se sembró con 2 mL de una
suspensión celular que contenía 1 x 106 células, incubando a una temperatura
de 37°C. Se utilizará el medio mínimo esencial de Eagle modificado por
Dulbeco (DMEM) IX complementado con L-glutamina, bicarbonato de sodio,
10% de suero fetal de bovino y antibióticos. Se realiza este procedimiento para
las dos líneas celulares.
21
5.7 Determinación del tiempo de incorporación de np-Au a las células mediante TEM
Una vez obtenidas las microplacas se expusieron la celulas HeLa a np-
Au a una concentración de np-Au obtenida en el punto 5.2.5. La monocapa de
un pozo no se expusó a np-Au, dicho pozo se tomó como testigo; se tomó una
muestra inicial y a los tiempos de 4, 8, 16 y 24 horas. Las observaciones se
realizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
5.8 Procesamiento de las muestras para determinar el tiempo de incorporación de np-Au a las células mediante TEM. 5.8.1 Obtención del paquete celular Una vez que pasó el tiempo de exposición dispuesto para cada pozo se
desprendió la monocapa celular utilizando tripsina – verseno, posteriormente se
centrifugó en viales a 1500 rpm durante 1 minuto y se recuperó el paquete
celular.
5.8.2 Fijación de la muestra Al paquete celular se trató con glutaldehido al 2% en regulador PBS
durante 2 horas, posteriormente se hicieron 3 lavados de 10 minutos con un
Buffer de lavado.
5.8.3 Post fijación de la muestra El proceso de post fijación se realizó con Osmio al 1% durante dos
horas, una vez transcurrido este tiempo se llevaron a cabo 3 lavados de 10
minutos con un Buffer de lavado.
5.8.4 Deshidratación
Se sometieron las muestras a un tren de deshidratación a
concentraciones de etanol de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%,
sometiéndolas 10 minutos a cada concentración y 20 minutos en etanol
absoluto, este último paso se realizó 3 veces.
22
5.8.5 Preinclusión Posteriormente se retiró el etanol absoluto y la muestra se sometió al
protocolo que se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Protocolo para preparar las muestras antes de su inclusión en resina.
Proporción de reactivos
Etanol
absoluto
Óxido de propileno
2 : 1 20 minutos 1 : 1 20 minutos 1 : 2 20 minutos
Óxido de propileno absoluto 20 minutos
5.8.6 Inclusión en resina Epon Para incluir las muestras fue necesario transferir los paquetes celulares
de los viales en donde se realizó la deshidratación a cápsulas de Been y se
siguió el protocolo que se muestra en la tabla 2.
Tabla 2. Protocolo de inclusión en resina Epon
Proporción de reactivos Óxido de
propileno Resina Epon
2 : 1 20 minutos 1 : 1 20 minutos 1 : 2 20 minutos Resina Epon pura 60 minutos
La polimerización se realizó a 60°C durante 24 horas en un horno,
poniendo especial cuidado en mantener la temperatura constante.
5.8.7 Obtención de los cortes para TEM Los cortes se obtuvieron luego de cortar las muestras con un
ultramicrotomo utilizando una cuchilla de diamante. Se obtuvieron cortes de
300 nanómetros de espesor para observarlos al microscopio óptico y ver la
calidad de la inclusión. Después de comprobar que el tratamiento de la muestra
23
fue adecuado, se realizaron cortes de 150 nm. de espesor y se colocaron en
rejillas TEM.
5.8.8 Contrastado de cortes para TEM Los cortes se trataron con una solución etanóica de acetato de uranilo al
4% durante 10 minutos, posteriormente se pasaron las muestras a una solución
acuosa de acetato de uranilo al 4%, por último los cortes se trataron con citrato
de plomo al 1%, entre cada paso se realizaron lavados con agua bidestilada.
5.9 Aplicación de la Terapia Fotodinámica Después de encontrar el tiempo de incorporación de las np-Au para cada
una de las líneas celulares, se utilizaron microplacas de 96 pozos, en la cuales
se sembraron 10000 células por pozo, se trabajarán 4 réplicas por ensayo. Se
aplicó la PDT utilizando np-Au sin agregar el fotosensibilizador. El segundo
ensayo se realizó aplicando la PDT con np-Au y el fotosensibilizador en forma
de sal disódica (PpIX) a la concentración segura. En el tercer ensayo se aplicó
la PDT con np-Au y el fotosensibilizador se inducirá por la exposición al ALA a
una concentración de 40μg/mL.
El tiempo de exposición al fotosensibilizador fue de 4 horas en el caso
de ALA, y 24 horas para la PpIX. Se irradió con un láser de Argón a 488 nm a
una dosis de luz de 64.23 J/cm2. Se utilizó de un grupo de 4 pozos por línea
celular que funcionó como testigo, al cual no se le agregó el fotosensibilizador
ni las np-Au, y ni se irradió. Se consideró también un testigo de irradiación, al
cual no se le agregó fotosensibilizador ni np-Au pero si se irradió.
5.2.10 Determinación de la efectividad mediante cuantificación de la
mortalidad por el método del MTT
Pasadas 24 horas de la irradiación se adicionó el MTT a una
concentración de 25 μg/mL. Se incubaron las microplacas en la oscuridad por 4
horas y se removió el medio y el MTT, los cristales de MTT insolubles en agua
se disolverieron en isopropanol ácido (pH 4). Se leyó a 570 nm inmediatamente
porque el producto es inestable. El número de células sobrevivientes fue
determinado de manera indirecta por la reducción del MTT.
24
5,2,11 Determinación de la difusividad térmica mediante espectroscopia de lente térmica de las nP-Au y el tiempo de relajación de la protoporfirina IX en combinación de las mismas mediante espectroscopia fotoacústica. Se utilizaron 3 diluciones de la sal disodica de sodio en HCl al 25%, y estas
fueron mezcladas a temperatura ambiente con las np-Au a concentraciones
finales de 1, 2.5 y 5 mL, todas las diluciones quedaron en un volumen final de
10 ml. Las soluciones se colocaron en una celda de cuarzo de 1 cm2 especial
para medidas térmicas y ópticas.
Se midieron los espectros de absorción. Para la medición se realizaron con una
lente térmica.
25
6. RESULTADOS 6.1 Síntesis química de np-Au mediante el sistema de microemulsiones
Como resultado de la reducción del clorurotetraaurico por acción de la
hidracina, se obtiene el ión Au (III), mediante un sistema de autoensamble se
forman las np-Au. Para retirar la contaminación por reactivos se hace un lavado
con acetona volumen I:I, y se centrifuga a 5000rpm/20min, se decantó y se
resuspendió en 3 mL de isooctano, para su posterior caracterización.
6.2 Síntesis química de np-Au mediante el método de coloides monodispersos.
Se ensayó un volumen de reacción de 3 mL, el agente reductor es el
ácido ascórbico, que reduce la sal de oro para formar el ión Au(III). Una vez
terminada la reacción de reducción se lavó con agua destilada, y se centrifugó
a 5000 rpm/20 min., se decantó el sobrenadante y se resuspendió en 5 mL de
agua desionizada para caracterizarlas posteriormente.
6.3 Caracterización TEM y espectroscopía UV-VIS.
Se colocaron aproximadamente 0.1mL de muestra de np-Au sobre
rejillas TEM. Se analizaron las muestras obtenidas por los métodos
mencionados anteriormente. Se observó que las np-Au obtenidas mediante el
método de microemulsiones tienen un diámetro aproximado de 5 – 10 nm,
mientras que las obtenidas por el sistema de coloides monodispersos se
observaban con precipitado de sales y formaban agregados, estos agregados
estaban constituidos de partículas de 10 nm aproximadamente (figura 1).
26
a b Figura 1. a) np-Au obtenidas mediante el método de microemulsiones 10 000X λmax = 531 nm. b) np-Au obtenidas mediante el método de coloides monodispersos. 100 000 X λmax = 560.
Para la caracterización por espectroscopía UV-VIS se realizó un barrido
de 400 – 700 nm para ambas muestras (Figura 2).
Figura 2. np-Au obtenidas mediante el sistema de microemulsiones. Se
observa que presentan su máxima absorción a 531 nm.
Se hicieron lavados con Na2CO3 a diferentes concentraciones (Tabla 3,
figura 3) para eliminar impurezas e interferencias.
27
Figura 3. Obtenidas mediante el sistema de coloides monodispersos. Se
observa que tienen un máximo de absorción a 691 nm.
Como se puede observar en la tabla 3, cuando se lava con Na2CO3 al 2.1% se
obtienen unas nanopartículas más limpias, sin interferencias y el pico de
máxima absorción se acerca más a 520 nm como se observa en la figura 4.
Tabla 3. Resultado de la variación de la concentración de Na2CO3 sobre la longitud de onda de máxima absorción de las np-Au.
Na2CO3 λmax (nm) Na2CO3 λmax (nm)
0.25 619 2 549 1 590 2.1 548
1.25 565 2.5 564 1.9 585 3 576
Para tratar de acercar más el pico de máximo absorción a 520 nm (figura 4) se
realizó la síntesis sin agitación, como resultado se obtuvieron las np-Au que se
muestran en la figura 5.
28
Figura 4. np-Au obtenidas mediante el método de coloides monodispersos. Barrido de 400 – 700 nm. Máximo de absorción a 548 nm.
Figura 5. np-Au. Método de síntesis: Coloides monodispersos.
100,000X
29
Figura 6. np-Au, lavadas con 2.1% de Na2CO3 al 2.1 % sin agitación. Método de coloides monodispersos. Barrido de 400-700. Máximo de absorción a 543
nm.
6.3 Resultados de la selección de la dosis a la cual las np-Au no provocan muerte celular
La dosis segura de np-Au son concentraciones menores al 30 % (figura
7).
Figura 7. Porcentaje de viabilidad de células HeLa y C-33 expuestas a np-Au.
30
La concentración de 20 mg/mL de PpIX son seguras de usarse ya que no
provocan mortalidad en presencia de las np-Au. Este experimento se realizó en
condiciones de oscuridad.
De las concentraciones de ALA, todas fueron seguras para las células C33 y
para las células HeLa sólo la combinada con 1.7% de np-Au.
6.4 Determinación del tiempo de incorporación de np-Au a las células HeLa mediante TEM.
Se encontró que ambos tipos de células incorporan la máxima concentración
de np-Au a las 16 h, observe en la figura 10b la alta densidad de las
nanoparticulas.
Nota: no se incluyen las imágenes por el tamaño en Bytes de cada una de ellas, ya que adjuntándolas se rebasa el tamaño máximo permitido para el archivo que es de 700 KB 6.5 Determinación de la efectividad mediante la cuantificación de la
mortalidad por el método de Azul Alamar. No hubo diferencia entre las células HeLa y C33 tratadas con ALA e irradiadas
y las tratadas con ALA mas np-Au e irradiadas, por lo que podemos decir que
no aumentó la eficiencia de la PDT utilizando ALA para ambos tipos de células.
Sin embargo se observa diferencia entre las células tratadas con PpIX sola y
combinada con las np-Au, lo cual si muestra diferencia significativa, indicando
que en este caso si se optimizó la terapia fotodinámica.
31
Figura 13. Viabilidad a las 24 h de células C33-A expuestas a la PDT utilizando
como fotosensibilizador ALA.
Figura 14. Viabilidad a las 24 h de células C33-A expuestas a la PDT
utilizando como fotosensibilizador PpIX.
32
6.6. Determinación de la difusividad térmica mediante espectroscopia de lente térmica de las nP-Au y el tiempo de relajación de la protoporfirina IX en combinación de las mismas mediante espectroscopia fotoacustica. Se encontró que la difusividad térmica de la PpIX aumenta conforme aumenta la concentración de nanoparticulas. Nota: no se muestran gráficas por el tamaño del archivo ya que el tamaño máximo permitido para el archivo presente es de 700 KB. Estos datos están publicados en el articulo: Termal Diffusitivity ...Int. J. Thermophys.28:1048-1055. 2007. 7. Conclusiones
• Se establecieron las condiciones de síntesis de np-Au en agua. • Se determinó que el tiempo que requieren las células para incorporar la
máxima concentración de las np-Au es de 16h. • Se logró determinar que la difusividad térmica de la PpIX aumenta
conforme aumenta la concentración de nanoparticulas. • Las nanoparticulas en combinación con la PpIX exógena tienen mayor
efecto sobre las células C33 que sobre las células HeLa. • Se logró hacer más eficiente la PDT utilizando que np-Au combinadas
con la PpIX que con el ALA. • La eficiencia de la PDT utilizando PpIX y np-Au combinadas se puede
atribuir al fenómeno de difusividad térmica que tiene la PpIX. 8. Impacto • Este proyecto generó conocimientos originales en el área de
nanotecnología. • Permitió la formación de estudiantes a los tres niveles (Lic, M en C y D en
C). • Generó 2 artículos internacionales (uno publicado y otro en vías de
publicación). • Este proyecto es el primer paso para llevar a la terapia fotodinamica y el uso
de nanoparticulas combinadas al tratamiento de personas con cáncer.
33
9. Bibliografia Ramón-Gallegos E., Deleón-Rodríguez I., Martínez-Guzmán L.A., Pérez-Zapata A.J. 1999. In vitro
study of biosynthesis of protoporfirin IX induced by �-aminolevulinic acid in normal and cancerous cells of the human cervix. Arch. Med. Research. 30:163-170.
Ramón-Gallegos E., S. Stolik, Ponce-Parra C., López-Bueno G., Pérez-Zapata A.J., Calderón A., Muñoz-Hernández R.A., Cruz-Orea A., Sánchez-Sinencio F. 2001. Photoacoutic spectroscopy applied to the study of protoporphirin IX induced in mice. Analytical Sciences. 17 Special Issue s361-s364.
Marquez-Lemus V.A., Noguez-Juarez B.M., Solano-Rodriguez L., Perez-Zapata A.J., Schneider-Ehrenberg O.P., Graue-Wiechers F., Ramón-Gallegos E. 2005. In Vivo Study Of Biological Effects Of Therapy Photodynamic On Cervical Cancer. Physica Scripta. 18: 215-218.
Rock C., Michael C.W., Reynolds R.K., Ruffin M.T., 2000. Prevention of cericx cancer. Crit Rev Oncol Hematol. 33:169-185.
Benedit J.L., Millar D.M., Mickerson K.G. 1992. Results of conservative management of cervical intraepithelial neoplasia. Obstetrics & Gynecology. 79:105-110.
Lörincz A.T. Los virus del papiloma humano de tipo oncogénico causan cáncer En: Curso internacional cáncer cervicouterino y mamario en el próximo milenio. E. Cpesar Santiago Pineda. INCan, biomédicas UNAM. México 1999.
Robbins S.L., Cotran R.S., Kumar V., Patología Humana. Sexta edición. McGraw-Hill Interamericana. 1999. pp: 656 – 659
Johnson N, Barlow D, Lethaby A, Tavender E, Curr L, Garry R., et al. 2005. Methods of hysterectomy: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMG. 330 (7506): 1478.
Publicación No. 98-0016 de la AHCPR, enfermedades comunes del útero: opciones para su tratamiento. Agency for Health Care Policy and Research, Rockville, MD. Abril 1998.
Allison R.R., Cuenca R., Downie G.H., Randall M.E., Bagnato V.S., Sibata C.H. 2005. PD/PDT for gynecological disease: A clinical review. Elsevier. 2: 51-63
García Sainz M. 2003. La radioterapia en el cáncer. Pérez Tamayo R. El cáncer en México. Primera edición. El Colegio Nacional. pp: 341-357.
Cortes Funes H. Oncología Médica. Masson S.A. 1983. pp: 215 – 218, 250 – 252, 647 – 650. Zinder J.W. 2003 La quimioterapia y cáncer. Pérez Tamayo R. El cáncer en México. Primera Edición.
El colegio Nacional. pp: 325 – 339. Popkin D.R., Scali V., Ahmed N.M. 1978. Cryosurgery for the treatment of cervical intraepithelial
neoplasia. Am J Obstet Gynecol. 130:551 – 554 Fernández M., Soto J. Todo sobre el virus del Papiloma. Editorial Ginita Linda. San José, 2001. Partington C.K., Turner M.J., Soutter W.P., Griffiths m., Krausz T. 1989. Laser vaporization versus
laser excision conization in the treatment of cervical intraepithelial neoplasia. Obstet Gynecol. 73: 775 – 778.
Mohar A. 2003. Prevención del cáncer cervical: el caso de los países en desarrollo. Salud Pública de México. 45 (3): 5302 – 5303.
Prasad P.N. Introduction to Biophotonics. Jonh Wyley & Sons. New Jersey 2003. pp: 433 – 461. Luksiene Z. 2003. Photodynamic Therapy: mechanism of action and ways to improve the efficiency or
treatment. Medicina (Kaunas). 39 (12): 1137 – 50. Kessel D. 1998. Photodynamic Therapy. Science & Medicine. Van-Hillegersberg V.F., Kort W.J., Wilson J.H. 1994. Current status of photodynamic therapy in
oncology. Drug. 48: 510 – 527 Oleinick N. 1998. Photodynamic therapy (PDT) eliminates tumour by a complex interplay or
mechanisms. Photochem Photobiol. 68(6): 841 – 845. Grieb P. 2004. 5-Aminolevulinic acid (ALA) and its applications in neurosurgery. Neurol Neurochir Pol.
38(3): 201 – 7. Martin D.W. Bioquímica de Harper. El manual Moderno. México. 1982. pp: 306 – 313. Dalla Via L., Marciani Magno S. 2001. Photochemotherapy in the treatment of cancer. Current
Medicinal Chemistry. 8: 1405 – 1418 Alcocer Macías J., Cogordán Colo J. 2000. Terapia fotodinámica, una nueva modalidad de
tratamiento oncológico. Neumología y cirugía de torax. 59(3): 88-91. Delaney T.F. Photocynamic therapy. Section E/Other Therapeutic Approaches. 2d Edición. Ed.
A.R.Mossa. Comprensive textbook of Oncology. 1989. pp 675-685. López Cárdenas T. Efectos de la Terapia fotodinámica sobre el virus del papiloma humano en
diferentes líneas celulares de carcinoma cercicouterino. 2005. Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias en biomedicina y biotecnología molecular.
Thomas J. Dougherty, Charles J. Gomer, Barbara W. Henderson, Giulio Jori, David Kessel, Mladen Korbelik, Johan Moan, Qian Peng et al. 1998. Photodynamic therapy: Review. Journal of the National Cancer Institute. 9(12):889-905
Sibata CH, Colussi VC, Oleinick NL, Kinsella TJ. 2001. Photodynamic therapy in oncology. Expert Opin Pharmacother.2 :1-11.
Shackley D.C., Whitehurst C., Clarke N.W., Betts C., Moore J.V. 1999. Photodynamic Therapy. Journal of the royal society of medicine. 92: 562-525.
West J. L., Halas N.J. 2003. Engineered nanomaterials for biophotonics aplications: Improving sensin, imaging and therapeutics. Annu Rev Biomed Eng. 3(5): 285 – 292.
34
Nehl C.L., Liao H., Hafner J.H. 2004. Optical propierties of star-shaped gold nanoparticles. Nano Lett. 6(4): 683 – 388.
Holister P., Weener J.W., Román Vas C., Harper T. 2003. Nanoparticles. Cientifica. 3: 1-11. Vargas A, Pegaz B, Debefve E, Konan-Kouakou Y, Lange N, Ballini JP, van den Bergh H, Gurny R,
Delie F. et al. 2004. Improved photodynamic activity of porphyrin loaded into nanoparticles: an in vivo evaluation using chick embryos. Int J Pharm. 286(1-2): 131 – 145.
Pegaz B, Debefve E, Borle F, Ballini JP, van den Bergh H, Kouakou-Konan YN. 2005. Encapsulation of porphyrins and chlorins in biodegradable nanoparticles: the effect of dye lipophilicity on the extravasation and the photothrombic activity. A comparative study. J. Photochem Photobiol B. 80(1):19 – 27
Wagneg J.,Köhler J.M., Continuous Synthesis of Gold Nanoparticles in a Microreactor. 2005. Nanoletters. 5:4. 685-691.
Privman V., Goia D.V., Park J., Jatijevic. Mechanism of Formation of Monodispersed colloids by Aggegation of Nanosize Precursors. 1999. Journal or colloid and Interface Science. 213: 36 – 45.
Ma H., Huang S., Feng X., Zhang X, Tian F., Yong F., Pan W., Wang Y., Chen S. Electrochemical Synthesis and Fabrication of Gold Nanostructures Based on Poly(N-vinylpyrrolidone). 2006. ChemPhysChem. 7: 333-335.
Kuo Chun-Hong and Huang Michael H. Synthesis of Branched Gold Nanocrystals by a Seeding Growth Approach. 2005. Lngmuir 21:2012 - 2016
