L’effetto ossigenoin

radiobiologia Università Cattolica del Sacro CuoreScuola di specializzazione in Fisica Sanitaria2003-2004

Claudia Dell’Omo

Fattori fisici

Fattori biologici

Fattori chimici

FATTORI CHE INFLUENZANO L’EFFETTO DELLE RADIAZIONI

• alta o bassa intensità• la dose può essere somministrata come dose singola o frazionata• alto o basso trasferimento lineare di energia (LET)

Fattori fisici:

Curve di sopravvivenza di cellule dopo irradiazioni con dose di raggi x e neutroni.

basso LET

alto LET

• fasi del ciclo cellulare in rapporto all’efficacia delle radiazioni nel provocare la morte cellulare

• recupero del danno• radiosensibilità e radioresistenza dei tessuti in riferimento alla loro attività proliferativa e al grado di differenziazione

Fattori biologici:

Sopravvivenza della capacità riproduttiva di cellule HeLa irradiate con raggi x in quattro differenti momenti del ciclo cellulare:

M, G1, G2 e fase S del DNA.

Esistono differenze di un fattore o due

nella dose richiesta per un determinato livello

di morte cellulare tra le diverse fasi del ciclo.

• protettori: agenti che riducono l’effetto di una determinata dose di radiazione• sensibilizzanti: agenti che aumentano l’efficacia di una determinata dose di radiazione, l’ossigeno è un potente “sensibilizzante”.

Fattori chimici:

In presenza di O2 tutti i sistemi biologici sono molto più sensibili alla radiazione

Il grado di sensibilizzazione è espresso in termini di “Oxygen Enhancement Ratio”:

per produrre lo stesso effetto biologico.

dose in condizioni di ipossia

dose in condizioni aerobicheOER

Oxygen Enhancement Ratio – x rays

OER ha valori tipici di 2,5 – 3 per raggi x e

• curva A: cellule ben ossigenate• curva B: cellule poco ossigenate

Per un livello di effetto E, la dose in condizioni di ossigenazione (4 Gy) è 2,5 volte inferiore alla dose richiesta in condizioni di ipossia (10 Gy).

O2 è perciò un agente dose-modifyingper radiazioni a basso LET.

Curve di sopravvivenza per cellule esposte a raggi x in condizioni ipossiche e non.

Oxygen Enhancement Ratio –altre radiationi

OER ha valori tipici < 2 per radiazioni densamente ionizzanti

Curve di sopravvivenza per cellule esposte a radiazioni adroniche in condizioni ipossiche e non.

Per radiazioni ad alto LET, si nota una diminuzione dell’OER al crescere del LET.

Ad esempio, per particelle (la curva di sopravvivenza non ha la spalla cioè è una funzione esponenziale della dose), le cellule ipossiche ed ossigenate vengono uccise con uguale facilità, ciò vuol dire OER = 1.

Efficacia dell’O2 come agente modificante per le radiazioni ad elevato e basso LET

Coppie di curve di sopravvivanza

per cellule sottoposte ad irradiazione

a LET elevato e basso in condizioni

di ossigenazione e di ipossia.

Nel primo caso l’OER 1

l’O2 non modifica l’effetto

della radiazione ad alto LET.

Perché c’è riduzione dell’effetto O2 all’aumentare del LET?

Spiegazione più probabile:

nei densi percorsi di ionizzazione delle radiazioni ad elevato LET c’è produzione di O2 , questo ossigena e così sensibilizza le cellule al momento dell’irradiazione.

Relazione tra LET, EBR ed OER

Tempi di azione

Affinchè si osservi l’effetto ossigeno, è necessario che l’ossigeno sia presente:

- durante l’esposizione alla radiazione Wright, Howard-Flanders, Acta Radiol 48, 1957Howard-Flanders P., Moore D., Radiat Res 9, 1958

- entro pochi millisecondi dopo l’irradiazioneMichael BD et al., Radiat Res 54, 1973

L’idea di questo ultimo esperimento è che l’ossigeno, contenuto in una camera ad alta pressione, venga fatto esplodere su uno strato singolo di batteri in vari tempi: prima, durante e dopo l’irradiazione con un impulso di elettroni di 2 sec dato da un acceleratore lineare.Il risultato è che l’ossigeno agisce come sensibilizzante se esso viene aggiunto non più tardi di 5 msec dopo l’irradiazione.

Concentrazione richiesta di ossigeno

Dipendenza della radiosensibilità dalla concentrazionedi ossigeno.

Assegnando 1 alla radiosensibilità in condizioni anossiche, si trova sperimentalmente che essa diventa 3 in condizioni di ossigenazione.

La variazione di sensibilità si realizzasoprattutto quando la concentrazione di ossigeno passa da 0 a 30 mm Hg.Dopo, si realizza un plateau.

Il meccanismo dell’effetto ossigeno (1)

Catena di eventi

Interazioni inizialiRadiazioni indirettamente ionizzanti (X, , n) 10-24 – 10-14 sRadiazioni direttamente ionizzanti (e-, p) 10-16 – 10-14 s

Stadio fisico-chimicoDeposito di energia come ionizzazioni delle strutturemolecolari lungo il percorso 10-12 – 10-8 s

Danno chimicoRadicali liberi 10-7 s - ore

Danno biomolecolare Proteine, acidi nucleici ms - ore

Effetti biologici precociMorte cellulare, morte animale ore - settimane

Effetti biologici tardiviInduzione di neoplasie, effetti genetici anni - secoli

Limiti di tempo

Radiochimica dell’acqua; ipotesi della fissazione del danno

H2O H2O+ + e- e- + H2O H2O-

H2O+, H2O- sono instabili:

H2O+ H + + OH° H2O- H ° + OH -

radiation

RH + OH° R° + H2O RH + H° R° + H2

H°, OH° sono radicali liberi, cioè atomi o molecole elettricamente neutri aventi un elettrone spaiato rispettoallo spin nell’orbita esterna. Sono molto reattivi, con una grande tendenza ad accoppiare l’elettrone spaiato (ossidante)oppure a eliminare l’elettrone spaiato (riducente). Ad es., possono estrarre idrogeno da molecole organiche RH:

R° sono radicali liberi secondari che possono interagire con molecole biologicamente importanti e provocare danni azione indiretta delle radiazioni ionizzanti

In presenza di O2:

R° + O2 RO2°Formazione del radicale organico perossido, che può attivare una reazione a catena che coinvolge più RH

RO2° + RH RO2H + R° Fissazione del danno biologico, cioè cambiamento stabile della composizione chimica del target

potenziamento dell’efficacia delle radiazioni

Il meccanismo dell’effetto ossigeno (2)

Effetto ossigeno e radioterapia

Thomlinson & Gray (1955) key paper

Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano.

Conclusioni schematizzate del lavorodi Thomlinson e Gray:

-ogni centro tumorale con raggio maggiore di 200 m presenta un centro necrotico

-nessuna necrosi è presente in tumori con raggio minore di 160 m

-Comunque grande sia il raggio del centro necrotico, lo spessore esternocomposto di cellule tumorali attivenon è mai maggiore di 180 m ed è sempre compreso tra 100 m e 180 m. L’area delle cellule tumorali attive appare, in sezione,

come un anello

Effetto ossigeno e radioterapia

Conclusioni del lavoro di Thomlinson e Gray:

•Le cellule tumorali proliferano e crescono attivamente soltanto se sonoin prossimità di una sorgente diossigeno o nutrienti (stroma).Fino a 150 m dal capillare le cellule sono ossigenate; a distanze maggiori l’ossigeno è consumato e le cellule diventano necrotiche.

•Le cellule ipossiche formano uno strato (di una o due cellule) nel quale la concentrazione di ossigeno è alta abbastanza da permettere la loro attività e bassa abbastanza da renderle relativamente protette dagli effetti dei raggi x.

Diffusione dell’O2 da un capillare

150 m

Conclusioni ottenute da Thomlinson e Gray dallo studio di sezioni istologiche di carcinoma bronchiale umano.

Effetto ossigeno e radioterapiaPowers & Tolmach, 1973

Prima evidenza di cellule ipossiche in tumore - La curva ha due distinte componenti, di

due diverse pendenze (bifasica). Ciò suggerisce che il tumore consiste di due gruppi separati di cellule, uno ossigenato e l’altro ipossico.

-Estrapolando dalla regione di alte dosiall’asse di sopravvivenza si ottiene la frazione di cellule ipossiche al tempo di irradiazione:

livello di sopravivvenza = 1 %

Circa 1 % delle cellule clonogeniche nel tumore hanno una curva di sopravivvenzatipica di cellule ipossiche.

Risposta alla radiazione di un linfosarcoma subcutaneo solido nel topo

A basse dosi (< 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ossigenate.

Ad alte dosi (> 900 rad) la risposta è dominata dal killing delle cellule ipossiche.

Prima evidenza inequivocabile che un tumore solidocontiene una percentuale di cellule clonogeniche sufficientemente ipossiche da essere radioresisrtenti

Effetto ossigeno e radioterapia

Determinazione pratica della frazione di cellule ipossiche

Mouse tumour curva aerobica

– Animale respira aria– Mistura di cellule ipossiche e aerate

curva ipossica– Animale asfissiato mediante

respirazione di N2

curva ossica – Cellule in vitro in O2

La frazione ipossica è 20 %:

(la distanza verticale tra la curva ipossicae quella in aria sull’asse della frazione

di sopravvivenza va da 1.0 a 0,2)

Effetto ossigeno e radioterapia

Introduzione alla reossigenazione

Sperimentalmente è stato dimostrato chela proporzione di cellule ipossiche nel tumore è circa costante,

cioè la stessa sia nel tumore non trattato che dopo il trattamento frazionato.

Spiegazione: durante il trattamento, le cellule si muovono dal compartimento ipossico a quello

ossigenato. Se così non fosse la proporzione di cellule ipossiche dovrebbe aumentare durante il trattamento perché la radiazione dovrebbe spopolare più il

compartimento delle cellule aerate che quello delle cellule ipossiche

REOSSIGENAZIONE

Effetto ossigeno e radioterapiaIl meccanismo della reossigenazione

I tumori umani si reossigenano rapidamente ed efficientemente, come la maggior parte di quelli animali, tra due frazioni di dose.

Ogni frazione di dose uccide una proporzione molto più grande di cellule ossigenate che di cellule ipossiche.

Il processo di riossigenazione ristabilisce la proporzione di cellule ipossiche (ad es. all’ 1 %) prima che venga irradiata la prossima frazione di dose, quindi il compartimento di cellule ipossiche non diventa mai dominante.

Mentre il numero di cellule ossigenate diventa sempre più piccolo, sempre più cellule ipossiche si muovono nel compartimento ossigenato per mantenere la proporzione di cellule ipossiche all’ 1 %.

La morte delle cellule che erano ipossiche all’inizio del trattamento è perciò un risultato della loro irradiazione quando sono diventate ossigenate.

La presenza di un piccolo numero di cellule ipossiche (radioresistenti) può spiegare la differenza tra il successo e l’insuccesso nella terapia di un tumore.Esse rappresentano un focus per la ricrescita

del tumore.

Effetto ossigeno e radioterapia

Dose di radiazioni necessaria per uccidere tutte le cellule nei volumi indicati.

Si ipotizza che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente

ed efficientemente.

conclusione

Effetto ossigeno e radioterapia

Tumori (animali) includono • Cellule aerate • Cellule ipossiche

L’ipossia conferisce protezione da • Raggi x• Agenti Chemioterapici

La presenza of O2 aumenta il “cell killing”

La reossigenazione delle cellule ipossiche può migliorare il trattamento contro il tumore mediante “radiation therapy”.

conclusioni

E’ una ipotesi plausibile che i tumori che non rispondono bene alla radioterapia sono quelli che non si reossigenano velocemente ed

efficientemente.