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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
EFEITO DO LEVAMISOL SOBRE LEUCÓCITOS
PERIFÉRICOS DE CÃES COM ERLIQUIOSE
Dhagma Renata Denis de Souza
Cuiabá – MT
Março/2010
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
EFEITO DO LEVAMISOL SOBRE LEUCÓCITOS
PERIFÉRICOS DE CÃES COM ERLIQUIOSE
Autor: Dhagma Renata Denis de Souza
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Deijanira Alves de Albuquerque
Co-Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Sanidade Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Cuiabá – MT
Março/2010
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FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome da autora: SOUZA, Dhagma Renata Denis de
Título: Efeito do levamisol sobre leucócitos periféricos de cães com erliquiose.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Veterinárias, área de
concentração: Sanidade Animal, da Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade
Federal de Mato Grosso para a obtenção do título
de Mestre em Ciências Veterinárias.
Data: 22/03/2010
Banca Examinadora Prof.(a) Dr. (a) Deijanira Alves de Albuquerque Instituição: UFMT/Cuiabá
Assinatura: ___________________________ Julgamento: ___________________
Prof. Dr. Cor Jesus Fernandes Fontes Instituição: UFMT/Cuiabá
Assinatura: ___________________________ Julgamento: ___________________
Prof.(a) Dr. (a) Ana Helena Benetti Gomes Instituição: UNIC/Cuiabá
Assinatura: ___________________________ Julgamento: ___________________
4
DEDICATÓRIA
Dedico a todos que contribuíram direta
ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por me
proporcionarem esta realização, pois sem os mesmos, sei que nada disso seria
possível.
Aos meus pais que tanto amo (Claudemiro Assis de Souza e Leonarda Denis
de Souza) e à minha irmã (Déborah Claúdia Denis de Souza), que sempre estiveram
ao meu lado incentivando.
Ao meu namorado Bernardo Batista Minetto, juntamente com seus pais, por
toda força, carinho e atenção.
A todos meus professores, mestres e doutores, que me guiaram pelos
caminhos do conhecimento.
Agradeço à Professora Dra. Deijanira Alves de Albuquerque pela confiança,
ensinamento, paciência e carinho com que me orientou.
Agradeço ao Professor Dr. Daniel Moura de Aguiar e à sua orientada, Andréia
Mello, pelo auxílio no desenvolvimento das provas moleculares.
Agradeço a todos do Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá - UNIC
pela oportunidade de desenvolver toda pesquisa neste estabelecimento de ensino.
Agradecimento especial à Lívia Saab Muraro e às técnicas do Laboratório de
Análises Clínicas - UNIC, que contribuíram em muito para que esse projeto se
consolidasse.
Agradeço à coordenadora do programa Professora Dra. Rosa Helena e ao
Técnico Administrativo Jean Carlos Gonçalves da Silva pelo apoio e carinho.
6
Agradeço a todos meus colegas de mestrado que de alguma forma
contribuíram para a realização deste sonho.
Agradeço à Fundação de Amparo e Pesquisa de Mato Grosso – FAPEMAT e
à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES pela
concessão da bolsa de mestrado.
7
RESUMO
EFEITO DO LEVAMISOL SOBRE LEUCÓCITOS PERIFÉRICOS DE CÃES COM
ERLIQUIOSE
A erliquiose canina é uma enfermidade endêmica causada, principalmente, pela
Ehrlichia canis. Sua ocorrência está diretamente relacionada à abundância e à
distribuição do vetor, o carrapato Rhipicephalus sanguíneos. Como a erliquiose
frequentemente causa leucopenia e outras anormalidades na resposta imune, mais
recentemente, tem sido utilizados imunoestimulantes associados a antibióticos para
o seu tratamento. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a ação
imunoestimulante do levamisol sobre os leucócitos de cães infectados por Ehrlichia.
Foram estudados 21 cães com erliquiose atendidos no Hospital Veterinário (HOVET)
da Universidade de Cuiabá (UNIC). Durante os cinco dias do experimento, os cães
permaneceram internados por no HOVET/UNIC e foram avaliados clinicamente Os
animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: o grupo controle (GC),
composto por 10 animais, foi tratado com reposição hidroeletrolítica (NaCl 0,9%),
cimetidina (5 mg/kg IV, BID) e doxiciclina (10 mg/kg, VO, SID); e o grupo
experimental (GE), composto por 11 cães que receberam o mesmo tratamento do
GC mais o levamisol (1 mg/kg, SC, dose única). Amostras sanguíneas foram
coletadas de cada cão antes do tratamento e após cinco dias para avaliações
hematológicas. O diagnóstico da infecção foi feito através da amplificação parcial do
gene Dsb de Ehrlichia pela reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando os
iniciadores Dsb-330 (5’- GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT -3’) e Dsb-
728 (CTG CTC GTC TAT TTT ACT TCT TAA AGT -3’). Os dados obtidos a partir das
avaliações hematológicas foram tratados pela análise de variância (ANOVA) seguida
do teste Tukey. Os valores dos leucócitos totais, linfócitos e monócitos obtidos a
partir do leucograma do GE foram significantemente superiores aos observados para
o GC. Conclui-se que o levamisol associado à antibioticoterapia aumenta
significativamente o número global e específico dos leucócitos.
Palavras-Chave: Ehrlichia canis, leucócitos, levamisol, imunoestimulante
8
ABSTRACT
EFFECT OF LEVAMISOL ON THE PERIPHERAL LEUKOCYTES OF DOGS WITH
EHRLICHIOSIS
The canine ehrlichiosis is an endemic disease whose agent is Ehrlichia canis. Its
occurrence is directly related to the abundance and to the distribution of the
biological vector, the tick Rhipicephalus sanguineus. Since ehrlichiosis often causes
leukopenia and other abnormalities in the immune response, for its treatment some
immunostimulating drugs have been associated with antibiotics. This study aimed to
evaluate the immunostimulating action of levamisole on the leukocytes of dogs
infected with E. canis. We studied 21 dogs suffering of ehrlichiosis and maintained at
the Veterinary Hospital (HOVET) of the University of Cuiabá (UNIC) for five days.
The animals were randomly divided into two groups: the control group (CG) was
composed of 10 animals which were treated with fluid replacement (0.9% NaCl),
cimetidine (5 mg/kg IV BID) and doxycycline (10 mg/kg, PO, SID). The group treated
with levamisole (GE) was composed of 11 dogs which received the same treatment
as the CG plus levamisole (1 mg/kg, SC, single dose). Blood samples in EDTA
solution were obtained from each dog before treatment and after five days for
hematologic evaluations. The diagnosis of the infection was performed by
amplification of the dsb gene by chain reaction polymerase (PCR), using primers
Dsb-330 (5'-GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT -3 ') and Dsb-728 (CTG
CTC GTC TAT TTT ACT TCT TAA AGT -3 '). The hematological data were treated
by the analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey test. The values of total
leukocytes, lymphocytes and monocytes obtained from the GE were significantly
higher than those of the GC. According to the results, one could conclude that the
use of levamisole associated with antibiotic significantly increased the overall number
of leukocytes, lymphocytes and monocytes. In addition, animals that received
levamisole showed clinical improvement superior to that of the control dogs.
Key-words: Ehrlichia canis, leukocytes, levamisole, immunostimulant
9
LISTA DE ABREVIATURAS
ATP: adenosina tri-fosfato
ELISA: ensaio imunoenzimático
GC: grupo controle
GE: grupo experimental
IFN: interferon
IgG: imunoglobulina G
IgM: imunoglobulina M
IL: interleucina
MHC: complexo de histocompatibilidade maior
NK: “natural killer”
PCR: reação em cadeia pela polimerase
TNF: fator de necrose tumoral
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................12
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................14
2.1 A erliquiose canina no Brasil ...........................................................................14
2.2 Classificação taxonômica .................................................................................14
2.2.1 Ehrlichia canis ..................................................................................................15
2.3 Mecanismos imunes na patogênese da erliquiose ......................................16
2.4 Manifestações clínicas ......................................................................................20
2.4.1 FASE AGUDA ..................................................................................................20
2.4.2 FASE SUBCLÍNICA ..........................................................................................21
2.4.3 FASE CRÔNICA ...............................................................................................21
2.5 Diagnóstico ........................................................................................................22
2.5.1 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO .......................................................................24
2.5.1.1 Imunofluorescência indireta ...........................................................................24
2.5.1.2 Ensaio imunoenzimático.................................................................................24
2.6 Tratamento .........................................................................................................25
2.7 Imunomoduladores ...........................................................................................25
2.7.1 LEVAMISOL .....................................................................................................26
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................27
3.1 Seleção dos animais .........................................................................................27
3.2 Avaliação clínica ................................................................................................27
3.3 Procedimento das coletas de sangue .............................................................28
3.4 Tratamento .........................................................................................................28
3.5 Avaliações hematológicas ................................................................................28
3.6 Extração de material genômico (DNA) ............................................................29
3.7 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) ......................................................29
3.8 Análise estatística .............................................................................................30
4 RESULTADOS .......................................................................................................31
4.1 Efeito do levamisol sobre parâmetros clínicos de cães com erliquiose .....31
4.2 Avaliação do efeito do levamisol sobre o número de leucócitos no sangue
periférico ..................................................................................................................32
4.3 Avaliação do número de neutrófilos ...............................................................32
11
4.4 Efeito do levamisol sobre o número de linfócitos .........................................34
4.5 Verificação do número de monócitos .............................................................35
4.6 Avaliação do número de eosinófilos ...............................................................36
4.7 Avaliação do efeito do levamisol sobre hemácias e plaquetas ....................37
4.7.1 ERITRÓCITOS E HEMATÓCRITO ..................................................................37
4.7.2 PLAQUETAS ....................................................................................................38
5 DISCUSSÃO ..........................................................................................................40
6 CONCLUSÕES ......................................................................................................44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................45
ANEXO I – Parecer do Comitê de Ética .................................................................55
APÊNDICE I – Termo de Consentimento ...............................................................57
12
1 INTRODUÇÃO
Os cães de companhia apresentam hoje uma inserção muito grande na
sociedade, o que gera preocupação em relação à sanidade desses animais. Nesse
contexto, atenção deve ser dada à erliquiose canina, doença infecciosa que acarreta
imunossupressão podendo levar o animal ao óbito.
Com a evolução de pesquisas científicas demonstrando o amplo potencial do
uso de imunomoduladores em diversas atividades terapêuticas, abriram-se
possibilidades para o uso de imunoestimulantes seguros e eficazes, os quais
futuramente poderão vir a ser utilizados como parte do tratamento, barateando
assim, os custos para a sociedade.
Vários estudos tem considerado os imunoestimulantes como recursos
promissores em novos protocolos terapêuticos de doenças relacionadas ao sistema
imune.
O levamisol tem efeito marcante na imunossupressão, sendo, portanto
indicado em todas as doenças que se caracterizam por este quadro. Como a
erliquiose é uma patologia que, na maioria das vezes, causa leucopenia, o uso do
levamisol associado ao tratamento padrão, apresentará melhores resultados.
Sua principal vantagem em relação aos demais imunoestimulantes é o custo
mais acessível, o que viabiliza seu uso concomitante com os demais medicamentos
para o tratamento da doença, obtendo assim uma resposta melhor.
Apesar das atividades terapêuticas comprovadas, a ação do levamisol como
imunoestimulante em animais naturalmente infectados com E. canis é pouco
conhecida. Faz-se necessário, portanto, pesquisas que comprovem cientificamente
se sua ação imunoestimuladora interfere ou não sobre o sistema imunológico,
inclusive sobre o número de leucócitos periféricos. Tendo como base esses
conhecimentos, é que se tornará possível a indicação ou a contra-indicação do uso
do levamisol, de acordo com os resultados apresentados pelos pacientes.
O presente trabalho tem por finalidade avaliar a ação imunoestimuladora do
levamisol sobre os leucócitos de cães naturalmente infectados por E. canis.
• Determinar as subpopulações de leucócitos sobre as quais o levamisol
atua;
13
• Verificar se o efeito imunoestimulante do levamisol é mensurável
laboratorialmente 5 dias após a primeira dose;
• Comparar a resposta do grupo controle X grupo experimental;
• Avaliar as alterações hematológicas dos animais tratados e não tratados
com levamisol.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A erliquiose canina no Brasil
No Brasil, o primeiro relato de erliquiose canina ocorreu em Belo Horizonte-
MG, por Costa et al., em 1973, e o segundo relato em Jaboticabal-SP, por Maregati,
em 1978. Relatos de casos de “Pancitopenia Tropical Canina” vem sendo feitos em
várias regiões do Brasil (YAMAMURA; VIDOTTO, 1982; SILVEIRA et al., 1984;
NASCIMENTO et al., 1984; ALMOSNY et al., 1985; KAVINSKI et al., 1988; SEIBERT
et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2000; RIBEIRO et al., 2000; SZABÓ et al., 2001;
BULLA et al. 2002; MOREIRA et al., 2003; DAGNONE et al., 2002; DAGNONE et al.,
2003, MUNHOZ et al., 2003; VILAR et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005). A
erliquiose canina vem sendo detectada com frequência em cães atendidos em
hospitais e clínicas veterinárias em vários estados do Sudeste, Sul, Centro-Oeste e
Nordeste do Brasil (LABARTHE et al., 2003).
2.2 Classificação taxonômica
As espécies do gênero Ehrlichia foram divididas em formas monocíticas (E.
canis, E. risticii), formas granulocíticas (E. ewingii e E. equi) e formas trombocíticas
(Anaplasma platys), embora essa divisão demonstre limitações, pois a infecção por
uma espécie pode ocorrer em mais de um tipo celular (COHN, 2003). Uma
classificação mais objetiva tem utilizado a sequência homóloga do RNA ribossomal
(rRNA), em genes, para determinar o parentesco genético de vários organismos.
Muitos organismos anteriormente incluídos no gênero Ehrlichia foram reclassificados
e dirigidos para outros grupos genéricos e distribuídos dentro das famílias
Anaplasmataceae e Rickettsiaceae (DUMLER et al., 2001). A família
Anaplasmataceae possui quatro gêneros: Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia e
Wolbachia. Conforme a reclassificação realizada, o genogrupo 1 mantém o nome
genérico Ehrlichia, enquanto membros do genogrupo 2 mudaram de Ehrlichia para
15
Anaplasma, e membros do genogrupo 3 tornaram-se Neorickettsia (DUMLER et al.,
2001).
2.2.1 Ehrlichia canis
A erliquiose é causada por um grupo de bactérias gram negativos,
intracelulares obrigatórios e pleomórficos, com parede celular de estrutura não
protéica, com perda de lipopolissacarídeo e peptideoglicano, e incorporação de
colesterol de membrana, o que pode facilitar sua adaptação às células, tanto do
hospedeiro vertebrado como do carrapato vetor. As erlíquias parasitam leucócitos
circulantes de várias espécies de animais domésticos e silvestres, inclusive o
homem (HUXSOLL, 1970; RIKIHISA, 1991; 2006; COHN, 2003).
Dentre os agentes etiológicos da erliquiose, a Ehrlichia canis é a mais
patogênica e a causa mais frequente de doença clínica em cães. Atualmente, a
erliquiose apresenta uma distribuição cosmopolita e é transmitida principalmente
pela saliva contaminada do carrapato da espécie Rhipicephalus sanguineus. A
presença desse vetor no animal caracteriza importante fator de risco para ocorrência
da doença (HARRUS et al., 1997a; LABRUNA e PEREIRA, 2001; DAGNONE et al.,
2003).
A E. canis pode ser transmitida pela ninfa e adulto do carrapato vermelho do
cão (Rhipicephalus sanguineus). Nos carrapatos infectados, a E. canis multiplica-se
nos hemócitos e células da glândula salivar, eventualmente entram no trato digestivo
e se desenvolvem no epitélio do intestino médio. Os carrapatos transmitem a doença
transestadialmente, mas não por via transovariana. Carrapatos adultos podem
sobreviver por mais de 568 dias e quando infectados com E. canis podem continuar
a transmitir o patógeno por pelo menos 155 dias após ter abandonado o cão (NEER;
HARRUS, 2006). No momento do repasto sanguíneo, o carrapato inocula secreção
da glândula salivar com E. canis (RIKIHISA, 1991).
Nyindo et al. (1971) observaram que E. canis apresenta três estágios de
desenvolvimento: corpúsculos elementares, corpúsculos iniciais e mórulas.
Os corpúsculos elementares, formas individuais de Ehrlichia, entram nos
monócitos por fagocitose. Medem cerca de 0,5 µm de diâmetro, tornando difícil a
16
visualização à microscopia óptica. Crescem e se dividem dentro do fagossomo por
fissão binária, entretanto não há fusão fago lisossomal nas células hospedeiras
infectadas. Em três a cinco dias após a infecção é observado um pequeno número
de estruturas compactadas, medindo de 1,0 a 2,5 µm de diâmetro chamados de
corpúsculos iniciais. Durante os próximos nove a dez dias ocorrem crescimento e
replicação, originando as mórulas, que se rompem liberando os corpúsculos
elementares que irão infectar novas células, repetindo o ciclo (McDADE, 1990).
A atividade metabólica de espécies de Ehrlichia tem sido investigada. Os
membros deste gênero parecem efetuar catabolismo aeróbico e assacarolítico, isto
é, não utilizam glicose-6-fosfato ou glicose para produção de ATP. Utilizam
aminoácidos como a glutamina ou glutamato como fonte de energia, porém preferem
a glutamina por penetrar melhor no fagossomo que o glutamato (RIKIHISA, 1991).
Infecção concomitante com outros patógenos transmitidos por carrapatos tem
sido bem documentada por vários pesquisadores (KORDICK et al., 1999; HUA et al.,
2000; BREITSCHWERALT et al., 1998).
No Brasil, a única espécie descrita até o momento é E. canis, responsável
pela erliquiose canina, doença considerada endêmica principalmente nas áreas
urbanas, onde abundam populações do carrapato vetor (LABRUNA & PEREIRA,
2001).
2.3 Mecanismos imunes na patogênese da erliquiose
Esses microorganismos tem a habilidade de inibir a fusão fagolisossomal nas
células infectadas, permitindo a sobrevivência intracelular dentro dos fagossomos
(ZHANG et al., 2004; RIKIHISA, 2006). Essa inibição ocorre devido à: (i) supressão
de proteínas que formam um complexo que justapõe as membranas vesiculares,
dificultando a fusão (ZHANG et al., 2004); (ii) redução dos níveis de interferon-gama
(IFN- � ), que é importante na ativação de macrófagos para eliminação de
microrganismos intracelulares (ISMALL et al., 2005). Também, durante essa fase da
infecção, a imunossupressão induzida pela saliva do carrapato (WINSLOW, 2000),
pode facilitar a instalação do agente infeccioso, visto que a saliva de R. sanguineus
inibe a proliferação de células T, interfere na função de macrófagos e promove um
17
desequilíbrio na produção de citocinas, aumentando os níveis de IL-4, IL-10 e TGF-� , e reduzindo IL-2, IL12 e IFN- � (FERREIRA; SILVA, 1999).
A liberação de TNF- � pelas células infectadas pode ser um dos mecanismos
implicados na aparente supressão da medula óssea (HUA et al., 2000), o que
justificaria as alterações hematológicas. A elevação desta citocina também poderia
justificar a alteração as enzimas hepáticas devido à sua hepatotoxicidade
(BRADHAM et al., 1998).
O prognóstico da erliquiose canina pode ser dependente da capacidade do
sistema imune em controlar a infecção (ISMAIL; WALKER, 2005), estando mais
relacionada à resposta imune celular, embora a participação da imunidade humoral
também tenha importância (WINSLOW et al., 2000; GANTA et al., 2004). Na
erliquiose canina, a persistência do agente concomitante aos altos títulos de
anticorpos evidencia que, para a adequada eliminação do microrganismo, há
necessidade da interação entre a resposta humoral e a resposta celular do
hospedeiro (WEISER et al., 1991; KAKOMA et al., 2000).
A manutenção de altos títulos de anticorpos circulantes no hospedeiro
infectado por E. canis, pode indicar um estímulo antigênico persistente e/ou
periódico (PERILLE; MATUS, 1991; HARRUS et al., 1998). Outra característica da
resposta humoral nas infecções erliquiais é a plasmocitose evidente, na maioria dos
órgãos afetados, inclusive na medula óssea (GREENE; HARVEY, 1984; CASTRO,
2004; MYLONAKIS et al., 2004). Além dos mecanismos humorais, alterações na
resposta imune mediada por células, descrito em infecções por diferentes espécies
de erlíquias, tem sido amplamente estudado recentemente. Patógenos como as
erliquias, que tem como alvo células da defesa imune inata, ativam a produção de
IL-12 por células apresentadoras de antígenos, induzindo o desenvolvimento da
resposta Th1 e secreção de IFN- � , pelas células T CD4+, o que determina a
resistência do hospedeiro à infecção. Porém, a avaliação imunohistoquímica de
órgãos linfóides como o baço e linfonodos de cães experimentalmente infectados
com E. canis revelou uma redução significativa na expressão de moléculas do
complexo de histocompatibilidade principal de classe II (MHC II) (CASTRO, 2004). A
expressão de uma quantidade adequada dessas moléculas MHC II é necessária,
inclusive para a maturação de precursores de células T em linfócitos T CD4+
(GRUSBY et al., 1991), que possuem um importante papel na elaboração resposta
imune celular e na potencialização da resposta imune humoral. Nas infecções
18
causadas por erliquias, ocorre uma inversão da relação de linfócitos T CD4+:CD8+
no sangue periférico (FRANK; BREITSCHWERDT, 1999; HEEB et al., 2003;
HASEGAWA, 2005), algumas vezes demonstrando, mais especificamente, uma
redução dos níveis de células CD4+ (HASEGAWA, 2005), em experimentos de
inoculação parenteral com E. canis. Os linfócitos T CD4+ são responsáveis pela
produção de IFN- � , o qual estimula a atividade microbicida de macrófagos
(BITSAKTSIS; HUNTINGTON; WINSLOW, 2004); portanto, são essenciais no
mecanismo de proteção e eliminação da infecção causada por erlíquias
(BITSAKTSIS; HUNTINGTON; WINSLOW, 2004). Na infecção de camundongos por
E. chaffeensis, demonstrou-se que a presença de células T CD4+ funcionalmente
aptas é essencial para a produção de IFN-� e uma resposta celular do tipo Th1
(GANTA et al., 2002). A infecção por erlíquias monocitotrópicas restringe a produção
de IL-12 e reprime a produção de IL-15 e IL-18 por células mononucleares, que tem
papel fundamental no estímulo de células NK (“natural killer”) e Th1 para a produção
de IFN- � , e também interferindo na eliminação do agente em células infectadas
(BITSAKTSIS; HUNTINGTON; WINSLOW, 2004; ZHANG et al., 2004). Essas
alterações nos mecanismos imunes podem representar uma forma de evasão do
parasito.
Outros estudos da patogênese da infecção, utilizando cepas pouco virulentas
comparativamente a uma amostra altamente virulenta para modelos experimentais
de erliquiose monocitotrópica, demonstraram um desequilíbrio de citocinas, com
evidente redução de IFN- � , além de uma elevação significativa de TNF- � (ISMAIL et
al., 2005), evidenciando-se assim a importância de mecanismos imunopatogênicos
no desenvolvimento da doença. A expressão de mRNA de TNF- � , IL-1 � , IL-2, IL-4,
IFN- � e IL-6 foram examinados por métodos moleculares, em cães
experimentalmente infectados pela via parenteral, com E. canis, demonstrando
expressão persistente de mRNA de TNF- � e IFN- � e baixos níveis de IL-1 � , IL-2, IL-
4 e IL-6 até 56 dias após a infecção (TAJIMA; RIKIHISA, 2005). Porém, esses
resultados foram observados na erliquiose moderada, contrastando com a
persistente elevação de IL-1 � e IL-8 e reduzidos níveis de TNF- � e IFN- � em cães
com erliquiose aguda severa (RIKIHISA, 2006). Esses resultados indicam que uma
resposta Th1 representada por IFN- � , pode estar associada à doença moderada e
não à doença severa como evidenciado pela infecção de camundongos com uma
amostra patogênica de erliquia monocitotrópica identificada em Ixodes ovatus
19
(ISMAIL et al., 2005). Portanto, os fatores considerados mais críticos na
determinação de uma erliquiose severa e até fatal, por esses estudos, são: (i) a
marcada redução da resposta de células T CD4+ e diminuição do número de células
Th1 produtoras de IFN- � , com deficiente produção de IL-2; e (ii) a superprodução de
TNF- � com consequente elevação dos seus níveis séricos (ISMAIL et al., 2005).
Os efeitos do desequilíbrio dessas citocinas foram evidenciados em diversos
estudos. A produção aumentada de TNF- � pode resultar em hepatotoxicidade
(BRADHAM et al., 1998), que pode estar correlacionada à elevação das enzimas
hepáticas observada em cães infectados por E. canis, durante a fase aguda da
doença. A elevação dessa citocita pode estar relacionada também à supressão da
atividade medular, levando à redução do número de células sanguíneas (HUA et al.,
2000), podendo estar relacionada à pancitopenia observada em cães com erliquiose.
Os efeitos sistêmicos de elevados níveis de TNF- � e ou IL-1 estão associados
à febre, perda de peso, redução do apetite e prostração (ABBAS; LICHTMAN;
POBER, 2000), sinais esses observados tanto na fase aguda como na fase crônica
da erliquiose canina, e que poderia ser um indício do desequilíbrio de interleucinas
nos animais infectados. A formação de complexos antígeno-anticorpo nas infecções
induziu uma potente expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-
� , IL-1 � e IL-6, indicando que na presença desses anticorpos o efeito do agente no
hospedeiro pode ser tão prejudicial quanto o choque endotóxico (LEE; RIKIHISA,
1997). Visto que as espécies de erliquia monocitotrópica induzem uma forte resposta
humoral, a produção de elevados níveis de citocinas pró-inflamatórias por período
prolongado poderia justificar as alterações clínicas e laboratoriais observadas.
Portanto, pode-se sugerir que um desequilíbrio de citocinas com elvação de IL-4 e
IL-10 e redução de IL-2, IL-12 e IFN- � (predominantemente do tipo Th2), inicialmente
induzido pela picada do carrapato vetor, pode favorecer a instalação da infecção
pela Ehrlichia. Posteriormente, durante a infecção esses microrganismos podem
manter reduzidos os níveis de algumas citocinas importantes na coordenação de
uma resposta efetiva contra as erliquias (IFN-� , IL-2, IL-12, IL-15 e IL-18) e elevação
de outras citocinas (TNF- � , IL-1 � e IL-6) que podem determinar alterações clínicas
fatais (RIKIHISA, 2006).
20
2.4 Manifestações clínicas
Em cães, geralmente suspeita-se de erliquiose quando o animal apresenta
histórico de infestações por carrapatos associadas a manifestações clínicas
inespecíficas como febre, anorexia, depressão, letargia e perda de peso (COHN,
2003; NEER; HARRUS, 2006).
O curso da doença, classicamente, pode ser dividido em três fases: aguda,
subclínica/assintomática e crônica.
Clinicamente é difícil, se não impossível determinar a fase da infecção em que
o animal se encontra (WANER et al., 2001).
2.4.1 FASE AGUDA
Depois de um período de incubação de oito a vinte dias, o cão infectado com
E. canis começa a apresentar diversos sinais clínicos iniciando a fase aguda da
doença, que dura de duas a quatro semanas. Nessa fase, as erlíquias se multiplicam
dentro das células mononucleares circulantes e nos fagócitos mononucleares do
fígado, baço e linfonodos, induzindo a linfoadenomegalia e hiperplasia linforreticular
do fígado e do baço. As células infectadas atingem outros órgãos através da
corrente sanguínea, principalmente pulmões, rins e meninges, e aderem ao
endotélio vascular, levando à vasculite e à infecção tecidual subendotelial
(BREITSCHWERDT, 2004).
Os sinais clínicos na fase aguda podem ser suaves e inespecíficos, porém
alguns casos podem apresentar com ameaça à vida. Os sinais incluem depressão,
letargia, anorexia, pirexia, linfoadenomegalia, esplenomegalia e perda suave de
peso. Os cães podem apresentar tendências a sangramento, principalmente
petéquias e equimoses na pele e mucosas, e epistaxe ocasional. Os sinais oculares
não são incomuns e incluem uveíte anterior e opacidade corneana por edema e/ou
deposição de precipitados celulares, hifema, vasos retinianos tortuosos e lesões
focais da coriorretina consistindo em pontos pigmentados centrais com áreas
circunvizinhas hiperreflexivas (ORIÁ, 2001). A hemorragia retiniana resulta em
21
deslocamento e consequente cegueira. Outros sinais clínicos podem incluir vômito,
descarga ocular e descarga nasal serosa ou purulenta, claudicação, ataxia e
dispnéia (WANER e HARRUS, 2000). Breitschawerdt (2004) relatou também nesta
fase a presença de edema de membros e escroto.
Durante a fase aguda ocorre trombocitopenia imunomediada. Os mecanismos
de trombocitopenia podem envolver a destruição imune, o consumo aumentado de
plaquetas, meia vida diminuída das plaquetas, sequestro pelo sistema mononuclear
fagocitário ou pode ser secundário às concentrações aumentadas do fator circulante
inibidor da migração plaquetária (BULLA et al., 2004b).
A contagem de leucócitos é variável para Breitschawerdt (2004). BULLA et al.,
(2004a) em um estudo restrospectivo de dez anos na cidade de Botucatu,
observaram leucopenia por neutropenia, eosinopenia e linfopenia na fase aguda da
doença em cães. Associaram a neutropenia às mesmas causas da trombocitopenia,
e a eosinopenia ao stress provocado pela doença.
A anemia está relacionada à supressão da produção de eritrócitos e à
destruição acelerada dessas células (BREITSCHWERDT, 2004; BULLA et al.,
2004a).
2.4.2 FASE SUBCLÍNICA
Também conhecida como assintomática, ocorre após seis a nove semanas da
inoculação, mas pode durar meses ou ano. É caracterizada por persistência variável
de trombocitopenia, leucopenia e anemia na ausência de sinais clínicos. Nesta fase,
os cães imunocompetentes podem eliminar as erlíquias e cessarem a doença, não
entrando na fase crônica (VARELA, 2003; BREITSCHWERDT, 2004).
Varela (2003) afirma que nessa fase, os cães permanecem com títulos de
anticorpos elevados.
2.4.3 FASE CRÔNICA
22
Segundo Breitschwerdt (2004) os sinais clínicos da fase crônica da erliquiose
são discretos ou ausentes em alguns cães, e graves em outros, sendo diagnosticada
por ocasião da pesquisa de outras doenças. Cães da raça Pastor Alemão e cães
que apresentam outras doenças concomitantemente tendem a desenvolver sinais
graves nesta fase (RIKIHISA, 1991; KNOWLES, 2002).
Os principais sinais clínicos da doença crônica são: fraqueza, depressão,
anorexia, perda crônica de peso, membranas mucosas pálidas, febre, edema,
petéquias e equimoses na pele e mucosas e epistaxe. Pneumonia intersticial,
insuficiência renal, artrite e polimiosite também podem ocorrer. Algumas desordens
reprodutivas foram associadas também com a erliquiose, incluindo sangramento
prolongado durante o estro, infertilidade, abortos e mortes neonatais. Sinais
neurológicos podem ocorrer durante as fases aguda e crônica. São sinais de
meningoencefalite, ou seja, os cães apresentam dores severas no pescoço,
paraparesia ou tetraparesia, ataxia, déficits dos nervos cranianos e convulsões. Os
sinais neurológicos podem ser atribuídos à hemorragia, plasmocitose e infiltrados
perivasculares nas meninges (McDADE, 1990; WANER e HARRUS, 2000).
Gould et al. (2000) observaram um caso clínico de um cão Labrador Retriever
com quatro anos de idade apresentando uveíte bilateral, hemorragia intraocular e
deslocamento de retina associada à infecção crônica por E. canis.
As alterações hemorrágicas incluem pancitopenia, anemia aplásica,
neutropenia e trombocitopenia em resposta a medula óssea hipocelular, com
variados graus de supressão da série eritróide, mielóide e megacariocítica (WANER
e HARRUS, 2000; BREITSCHWERDT, 2004).
Em cães cronicamente infectados nos quais as alterações hematológicas são
mais frequentes, geralmente não respondem bem a terapia específica para o
microrganismo, resultando em óbito (MYLONAKIS et al., 2004).
2.5 Diagnóstico
Como os sinais clínicos da erliquiose canina não são patognomônicos, o
diagnóstico é feito através da associação dos sinais clínicos com a detecção de
mórulas do agente infeccioso no citoplasma de leucócitos, principalmente de
23
linfócitos e monócitos, em esfregaços de sangue periférico corados pelo giemsa
(ELIAS, 1992); da sorologia utilizando-se os métodos de imunofluorescência indireta
e western immunoblot (MATTHEWMAN, 1994), dot-blot e ELISA (ANDEREG &
PASSOS, 1999); reação em cadeia da polimerase - PCR (IQBAL & RIKIHISA,
1994a), cultivo e isolamento da E. canis de sangue e tecidos (IQBAL & RIKIHISA,
1994b).
As alterações laboratoriais encontradas nos animais na fase aguda da
infecção são: anemia e trombocitopenia, leucopenia variável, hipergamaglobulinemia
(HARRUS et al., 1997) e elevação das enzimas citosólicas hepáticas (ALMOSNY,
1998).
O diagnóstico da doença subclínica deve ser baseado em anamnese, na
localização geográfica do cão, em títulos persistentes de anticorpos contra E. canis,
leve trombocitopenia e hipergamaglobulinemia. O diagnóstico da erliquiose na fase
subclínica é um desafio para o médico veterinário, porém quando é reconhecida
precocemente está relacionado a um bom prognóstico, antes que o animal entre na
fase crônica cujo período de prognóstico é sombrio (WANER e HARRUS, 2000).
Harrus et al., (1998) estudando seis cães, após infecção experimental com E.
canis, observaram, através da reação em cadeia pela polimerase, a presença de
DNA de E. canis em baço, medula óssea e sangue. Os títulos de anticorpos
mensurados pela reação de imunofluorescência indireta daqueles cães aumentaram
progressivamente durante os primeiros cinco meses pós-infecção, permanecendo
elevados por um período adicional de mais de 11 meses e declinaram depois disso,
sugerindo que os cães estavam se recuperando da doença. Os resultados obtidos
neste estudo demonstraram que cães clinicamente saudáveis na fase subclínica são
portadores de rikettisia, podendo eliminar o agente e se recuperar sem desenvolver
a doença clínica crônica.
Na fase crônica, as proteínas séricas estão acima dos valores esperados na
maioria dos cães soropositivos para E. canis (BREITSCHWERDT, 2004). A
hipergamaglobulinemia pode representar o desenvolvimento de resposta
imunomediada a componentes celulares dos hospedeiros, evidência que pode ser
verificada pela ocorrência de eritrofagocitose e glomerulonefrite (KELLY, 1994).
Outros achados laboratoriais incluem azotemia associada muitas vezes a
glomerulonefrite por deposição de imunocomplexos; aumento da alanina
aminotransferase, fosfatase alcalina e bilirrubina total (BREITSCHWERDT, 2004).
24
Esplenomegalia, linfoadenopatia e plasmocitose foram observados em vários órgãos
de animais infectados por E. canis. Em cães experimentalmente infectados foi visto
um grande número de mórulas nos pulmões, baço e linfonodos mesentéricos e
através de microscopia eletrônica, em macrófagos pulmonares (McDADE, 1990;
RIKIHISA, 1991).
2.5.1 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Já foi mostrado que todas as erlíquias induzem a produção de anticorpos
específicos, detectáveis no soro ou plasma (RIKIHISA, 1991). Por isso, várias
técnicas sorológicas tem sido usadas para auxiliar no diagnóstico da erliquiose.
2.5.1.1 Imunofluorescência indireta
Esta prova é considerada padrão ouro para diagnóstico da erliquiose canina
(VARELA, 2003; WANER e HARRUS, 2000). É uma das técnicas mais utilizadas
tanto para inquéritos epidemiológicos como para estudos clínicos individuais.
A detecção de imunoglobulinas da classe G (IgG) anti-E. canis, pode ser feita
21 dias após a infecção. Altos títulos de anticorpos podem permanecer por vários
anos em cães que se tenham recuperado clinicamente, e declina gradualmente em
três a cinco meses depois do tratamento efetivo. Título positivo na
imunofluorescência indireta para E. canis significa infecção ativa ou exposição
passada (BANETH et al., 1996). Alguns animais podem apresentar um decréscimo
rápido no título de anticorpos, enquanto que outros pordem permanecer com títulos
elevados por semanas ou meses (MAGNARELLI et al., 1993).
25
2.5.1.2 Imunoensaio enzimático
O DOT-ELISA é um procedimento sensível que detecta anticorpos séricos
que não precisa que equipamentos caros, o antígeno fixado em nitrocelulose
permanece estável por mais de um ano, apresenta facilidade para interpretação sem
necessidade de treinamento especial e os resultados dão um registro permanente
das reações (CADMAN et al., 1994).
2.6 Tratamento
No tratamento da erliquiose canina, a tetraciclina, oxitetaciclina, doxiciclina e
dipropionato de imidocarb tem sido utilizados em clínicas e hospitais veterinários no
Brasil (MONTEIRO et al., 2003). A administração de doxiciclina, precedida ou não
pelo dipropionato de imidocarb, não parece interferir na resposta terapêutica de cães
com erliquiose (SOUZA et al., 2004). Corticosteróides também são indicados na
preservação da integridade vascular ou da função plaquetária, principalmente na
fase crônica e grave da erliquiose canina (SOUZA et al., 2004). Mesmo com o
tratamento e uma aparente recuperação clínica, o microrganismo pode permanecer
no hospedeiro que se torna portador crônico (BARTSCH; GREENE, 1996; HARRUS
et al., 1998b).
2.7 Imunomoduladores
Como a erliquiose frequentemente causa leucopenia e outras anormalidades
no sistema imune (DAVOUST et al., 1996; MAGNARELLI et al., 1990; WEISER et
al., 2001), tem sido utilizado imunomoduladores que são substâncias que atuam no
sistema imunológico conferindo, entre outros, aumento da resposta imune contra
determinados microorganismos, incluindo vírus, bactérias e protozoários, mediante
principalmente à produção de interferon. Dentre os imunomoduladores utilizados nas
26
enfermidades infecciosas dos animais domésticos destaca-se o levamisol
(APPOLINÁRIO; MEGID, 2007).
2.7.1 LEVAMISOL
O levamisol é um fármaco anti-helmíntico de amplo espectro utilizado no
tratamento de parasitose intestinal. Concomitantemente à ação anti-helmíntica, esse
fármaco atua no sistema imunológico de maneira semelhante ao hormônio
timopoietina, produzido no timo (TIZARD, 2002), estimulando a ação de células T, a
resposta aos antígenos, a produção de interferons, aumentando a atividade
fagocitária de macrófagos e neutrófilos, estimulando a citotoxicidade mediada por
células, a produção de linfocinas e a função das células supressoras (TIZARD,
2002). Os efeitos do levamisol são mais efetivos em animais com redução no
número de células T, sendo que possui pouco ou nenhum efeito em animais com
função normal destas células (JANEWAY et al., 2002; TIZARD, 2002).
A ação imunoestimulante do levamisol depende da dose e da via de
administração. Para que se obtenha a ação imunoestimuladora, deve-se utilizar a
dose entre 0,5 a 2 mg⁄kg (PURZYC; CALKOSINSKI, 1998).
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
O presente experimento foi desenvolvido no período de julho de 2008 a março
de 2009 no Hospital Veterinário da Universidade de Cuiabá (UNIC), em cães
atendidos com suspeita clínica de erliquiose e indicação médico-veterinária de
internação hospitalar. A erliquiose foi posteriormente confirmada pela reação em
cadeia pela polimerase (PCR) através da amplificação um fragmento do gene Dsb
de Ehrlichia
Os animais envolvidos nesse estudo foram somente aqueles cujos
proprietários autorizaram que fizessem parte da pesquisa, assinando assim um
termo de consentimento (Apêndice I).
O experimento foi realizado de acordo com os Princípios Éticos da
Experimentação Animal adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA), tendo, o protocolo, sido aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Animal (CEPA) da UFMT, em reunião ordinária de 15/10/2008 cujo protocolo é n � 23108.021390/08-4 (Anexo I).
3.1 Seleção dos animais
Participaram da pesquisa cães de ambos os sexos, de diversas raças e
idades e leucopênicos. Foram excluídos da pesquisa fêmeas prenhes e lactantes,
recém-nascidos, animais que receberam transfusão sanguínea, com qualquer tipo
de doença concomitante e aqueles que estavam fazendo o uso de corticóides, pois
estes fatores interferem diretamente nos resultados.
No experimento participaram 21 animais distribuídos em dois grupos: o grupo
controle (GC) composto por 10 animais e o grupo que foi tratado com levamisol
(GE), composto por 11 animais. Durante a fase experimental, os cães
permaneceram internados durante cinco dias no Hospital Veterinário da UNIC.
28
3.2 Avaliação clínica
Os animais de ambos os grupos passaram por avaliações clínicas no dia zero
e também no dia cinco. Nas consultas foi feita palpação do abdômen e verificada a
temperatura corporal, usando um termômetro inserido no reto, coloração das
mucosas, pele e anexos, pulsação, movimentos respiratórios, batimentos cardíacos
e o estado de hidratação dos animais.
3.3 Procedimento das coletas de sangue
As coletas de sangue foram realizadas nos dias zero e cinco por punção da
veia cefálica ou jugular após assepsia, utilizando tubos a vácuo estéreis com e sem
EDTA, onde foram amostrados aproximadamente de 3 ml de sangue por tubo e
encaminhado ao Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Veterinário da UNIC
para realização do hemograma.
3.4 Tratamento
Durante o período de internação, todos os animais receberam doxiciclina (10
mg/kg) administrada por via oral e cimetidina (5 mg/kg) injetada por via intravenosa,
tendo sido ambos os medicamentos administrados a cada 24 horas. Quando
necessário, os animais foram hidratados. Além desse tratamento, o GE recebeu o
levamisol (1 mg/kg) administrado por via subcutânea, dose única. O GC recebeu 1
ml de solução fisiológica por via subcutânea para manter as mesmas condições que
os animais do GE.
29
3.5 Avaliações hematológicas
Foram realizadas no aparelho centra 80 horiba ABX automação. No
hemograma foram analisados volume globular, hematócrito, hemoglobulimetria,
leucometria global e específica. Paralelamente, foram feitos esfregaços de sangue
periférico corado pelo Panótico Rápido (Laboclin � ) para a contagem dos diferentes
tipos de leucócitos e a pesquisa de estruturas compatíveis com mórula de E.canis.
3.6 Extração do material genômico (DNA)
O DNA genômico foi extraído a partir de leucócitos do sangue periférico
coletado de cada animal no dia zero.
A amostra de sangue em solução de EDTA foi submetida ao processo de
extração de DNA conforme protocolo de Sangioni et al. (2005), utilizando Tiocianato
de Guanidina.
3.7. Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
A confirmação da infecção dos cães por Ehrlichia foi feita através de PCR. A
amplificação de um fragmento do gene Dsb de Ehrlichia, foi feita utilizando-se os
primers Dsb - 330 (5’-GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’) e Dsb - 729
(CTG CTC GTC TAT TTT ACT TCT TAA AGT-3’); 1,25 U de Taq Polimerase
(Platinum® Taq DNA polymerase – Invitrogen); solução tampão (pH 8,4) contendo 50
mM de KCL; 20 mM Tris-HCL e 3 mM de MgCl2 (KUYLER DOYLE et al., 2005). O
volume foi completado com água MiliQ autoclavada para completar 50 µl e a
amplificação foi efetuada em termociclador automático (Eppendorf®). Inicialmente as
amostras foram desnaturadas a 95ºC por dois minutos, seguida de uma sequência
30
de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95ºC, 30 segundos a 58ºC e 30 segundos a
72ºC, seguidos de cinco minutos de extensão final a 72ºC. Os produtos da
amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1.5-2%, em ácido
EDTA tris-bórico tamponado, corado com brometo de etídio (10 � g/ml) em
transluminação ultravioleta. Compararam-se os fragmentos de DNA com marcadores
de DNA de 100 pares de base (pb; Fermentas Life Science® Burlington, On),
considerando como positivas, as amostras cujos produtos apresentam tamanho
aproximado de 409 pb. Em cada série foram incluídos controles positivo (DNA de E.
canis) e negativo (água).
3.8 Análise estatística
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com dois
grupos e dez repetições. Os dados obtidos a partir do hemograma foram tratados
através da análise de variância (ANOVA) seguida do teste Tukey utilizando o
software SAEG-5.0 desenvolvido na Universidade Federal de Viçosa por Ribeiro
Júnior (2001). Foram consideradas estatisticamente significantes as diferenças com
P ≤ 0,05. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão.
31
4 RESULTADOS
4.1 Efeito do levamisol sobre os parâmetros clínicos de cães com erliquiose
Os achados clínicos verificados durante a primeira e segunda avaliação
clínica, antes e após a internação dos cães pertencentes ao GC são mostrados no
Quadro I.
Quadro I. Achados clínicos do GC verificados nos dias 0 e 5
Achado clínico Dia 0 Dia 5 Apatia 9/10 4/10 Mucosa hipocorada 2/10 0/10 Esplenomegalia 5/10 3/10 Petéquias abdominais 2/10 1/10 Linfadenopatia 5/10 3/10 Anorexia 7/10 3/10 Desidratação 3/10 0/10
Assim como no GC, os animais do GE passaram por consultas no dias zero e
cinco, antes e após a internação, cujos achados clínicos estão mostrados no Quadro
II.
Quadro II. Achados clínicos do GE nos dias 0 e 5
Achado clínico Dia 0 Dia 5 Apatia 9/11 3/11 Mucosa hipocorada 3/11 0/11 Esplenomegalia 7/11 3/11 Petéquias abdominais 4/11 0/11 Linfadenopatia 7/11 2/11 Anorexia 4/11 0/11 Epistaxe 1/11 0/11 Uveíte 1/11 0/11 Desidratação 3/11 0/11
32
4.2 Avaliação do efeito do levamisol sobre o número de leucócitos no sangue
periférico
Os dados apresentados na figuram 1 mostram no dia zero os cães de ambos
os grupos apresentavam leucopenia, (GC = 5.200 ± 970 leucócitos/mm3; GE = 4.327
± 1.228 leucócitos/mm3; p=0,1). Após cinco dias de tratamento, os cães que
receberam levamisol atingiram valores de leucócitos totais significantemente
superiores àqueles do grupo controle (GC = 8.450 ± 1.374 leucócitos/mm3; GE =
10.627 ± 2.757 leucócitos/mm3; p = 0,04) (Figura 1).
�
�����
�����
����
������
������
Controle Experimental
Leuc
ócito
s to
tais
/mm
3
��� ����������� ������� ���
Figura 1: Leucócitos totais de cães tratados e não tratados com levamisol. Os dados estão expressos
como média ± desvio padrão
4.3 Avaliação do número de neutrófilos no sangue periférico de cães com
erliquiose
Os dados expressos na figura 2A mostram que, no dia zero, os cães de
ambos os grupos apresentavam neutropenia. Decorridos cinco dias do tratamento,
90% (9/10) dos animais do grupo controle atingiram valores normais dos neutrófilos
(dia zero: 4.109,5 ± 1.121,9 neutrófilos/mm3; dia cinco: 5.924,8 ± 1.306,1
33
neutrófilos/mm3; p=0,005). Já todos os cães tratados com levamisol atingiram
valores normais dos neutrófilos, no quinto dia após o tratamento. Essa diferença é
significante, considerando o dia zero do grupo experimental (dia zero: 3.312,3
±1.450,9 neutrófilos/mm3; dia cinco: 7.419,8 ± 2.555,2 neutrófilos/mm3; p=0,0004).
Entretanto, não houve diferença estatística entre os grupos, considerando-os no
quinto dia (p=0,12).
Além do aumento da quantidade de neutrófilos segmentados, no quinto dia
após o tratamento, os animais do GC apresentaram um aumento significante do
número de bastonetes no sangue periférico (p=0,003) (Figura 2B).
Por outro lado, os animais que receberam levamisol mantiveram os mesmos
valores de bastonetes no sangue periférico (p=0,7) (Figura 2B).
Figura 2A: Neutrófilos de cães tratados e não tratados com levamisol. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão
34
Figura 2B: Bastonetes de cães tratados e não tratados com levamisol. Os dados estão expressos
como média ± desvio padrão
4.4 Efeito do levamisol sobre número de linfócitos
Antes de iniciar o tratamento, no dia zero, oito dos dez cães do grupo controle
apresentavam linfopenia (1.104,5 ± 167,71 linfócitos/mm3). Após cinco dias de
tratamento, três cães do grupo controle mantiveram-se linfopênicos (Figura 3). Por
outro lado, dos 11 cães tratados com levamisol, apenas 1 mantive-se linfopênico.
Sendo que os cães que receberam levamisol atingiram valores de linfócitos
significantemente superiores àqueles dos animais controle (GC = 1.705,1 ± 346,95
linfócitos/mm3; GE = 2.793,3 ± 1.229,93 linfócitos/mm3; p = 0,02).
35
!
"#!�!�!
$%!�!�!
&%!�!�!
'�!�!�!
(%!�!�!
Controle Experimental
Linf
ócito
s/m
m3
)�* +�,�-/.10)�* +�2/*�32�0
Figura 3: Linfócitos de cães tratados e não tratados com levamisol. Os dados são mostrados
como média ± desvio padrão.
4.5 Verificação do número de monócitos
Os dados apresentados na figura 4 mostram que os cães de ambos os grupos
apresentavam diminuição no número de monócitos no dia zero (GC: 58 ± 61,5
monócitos/mm3; GE: 41,2 ± 35,7 monócitos/mm3). Após cinco dias de tratamento,
60% (6/10) dos cães do grupo controle atingiram valores normais dos monócitos
(132,1 ± 36,9 monócitos/mm3); sendo essa diferença estatisticamente significante
em relação ao dia zero (p=0,007). Por outro lado, 72,7% (8/11) dos cães tratados
com levamisol atingiram valores normais dos monócitos, no quinto dia após o
tratamento (219,7 ± 99,2 monócitos/mm3). Essa diferença é estatisticamente
significante em relação ao dia zero dentro do mesmo grupo (p=0,0001), bem como
em relação ao quinto dia considerando o grupo controle (GC: 132,1 ± 36,9
monócitos/mm3; GE: 219,7 ± 99,2 monócitos/mm3; p=0,02).
36
Figura 4: Efeito do levamisol sobre monócitos no sangue periférico de cães. Os dados são mostrados
como a média ±o desvio padrão.
4.6 Avaliação do número de eosinófilos
Houve diferença significativa comparando-se os dias zero e cinco dentro de
cada grupo (grupo controle p=0,01; grupo experimental p= 0,03) e também entre os
grupos com relação ao quinto dia (GC: 167,6 ± 83,5 eosinófilos/mm3; GTL: 217,4 ±
199,6 eosinófilos/mm3 (p=0,04) conforme ilustrado na figura 5).
Figura 5: Efeito do levamisol sobre eosinófilos no sangue periférico de cães com erliquiose. Os dados
são mostrados como média ± desvio padrão
37
4.7 Avaliação do efeito do levamisol sobre hemácias e plaquetas
4.7.1 ERITRÓCITOS E HEMATÓCRITO
Os dados expressos nas figuras 6A e 6B mostram que no dia zero, cinco dos
dez animais do grupo controle estavam com o número de hemácias e hematócrito
reduzidos. No quinto dia, apenas dois cães continuaram anêmicos. No dia zero, sete
dos onze cães pertencentes ao grupo que recebeu o imunoestimulante
apresentavam anemia. Decorridos cinco dias, quatro permaneceram com o número
de eritrócitos e hematócrito reduzidos. Não houve diferença estatisticamente
significante entre os dois grupos (p=0,4).
Figura 6A: Os dados estão expressos como média ± desvio padrão
38
Figura 6B: Os dados estão expressos como média ± desvio padrão
4.7.2 PLAQUETAS
No dia zero, os animais de ambos os grupos apresentavam redução no
número de plaquetas. Porém havia diferença significativa entre os animais de ambos
os grupos, onde os cães do GE apresentavam número de plaquetas
significantemente menor do que os do GC. Decorridos cinco dias do tratamento,
cinco dos dez animais do grupo controle permaneceram com o número de plaquetas
reduzido, já no grupo que recebeu o levamisol, quatro dos onze animais atingiram
número normais de plaquetas. Considerando o quinto dia, não houve diferença
significante entre os grupos (GC: 196.000 ± 33.461,7 plaquetas/µl; GE: 173.181,8 ±
66.311,6 plaquetas/µl; p=0,3), conforme mostrado na figura 7.
39
Figura 7: Efeito do levamisol sobre as plaquetas no sangue periférico de cães com erliquiose.
Os dados são mostrados como média ± desvio padrão
40
5 DISCUSSÃO
Um estudo experimental realizado por Rodrigues et al., (2005) utilizando
caprinos clinicamente sadios, demonstrou que, o uso de levamisol como
imunoestimulante não influencia no aumento do conjunto de sua imunidade, visto
que os efeitos do levamisol são mais efetivos em animais com redução no número
de células T, sendo que possui pouco ou nenhum efeito em animais com função
normal destas células (JANEWAY et al., 2002).
Em experimento realizado por Cazella (2009) com bovinos para avaliar a
influência do levamisol na resposta imune humoral anti-rábica mostrou que, o uso de
levamisol em bovinos primovacinados contra raiva não apresentou efeito
imunoestimulante.
A erliquiose canina é uma enfermidade endêmica, causada principalmente
pela Ehrlichia canis, uma bactéria intracelular obrigatória que parasita monócitos,
macrófagos e possivelmente outros leucócitos (RIKIHISA, 1991; DUMLER et al,
2001), causando leucocitose ou leucopenia e várias anormalidades da resposta
imune (MAGNARELLI et al, 1990; WEISER et al, 1991; MENESES, 1995; DAVOUST
et al, 1996;). No presente estudo, foram usados somente cães com erliquiose que
apresentavam leucopenia para verificar o efeito imunoestimulante do levamisol
sobre o número de leucócitos periféricos. A administração do levamisol
concomitante com o antibiótico para o tratamento da erliquiose aumentou
significantemente a quantidade de leucócitos periféricos comparando-se ao
tratamento de cães com antibiótico somente. O mecanismo pelo qual o levamisol
aumenta a quantidade de leucócitos periféricos em cães com erliquiose não foi
estudado no presente experimento. Entretanto, pode-se especular que o levamisol,
direta ou indiretamente estimula a ação microbicida de macrófagos, facilitando assim
a eliminação das erlíquias e, consequentemente a recuperação da quantidade de
leucócitos periféricos. Outra hipótese que pode ser formulada é que o levamisol
pode, diretamente, aumentar a produção de células do sistema imune, agindo na
medula óssea. Esses resultados corroboram dados da literatura mostrando que a
administração de levamisol em camundongos elevou o número global de leucócitos
e o número absoluto de linfócitos (SOUSA, 1992; RAYCHAUDHURY et al., 2005).
Até onde se sabe, esse é o primeiro estudo mostrando que o levamisol aumenta a
quantidade de leucócitos periféricos em cães com erliquiose e leucopênicos. Como
41
se sabe, cães com erliquiose crônica mais frequentemente apresentam alterações
hematológicas e não respondem bem ao tratamento específico indo a óbito
(MYLONAKIS et al., 2004). Como mostrado no presente estudo, uma única dose de
1 mg/Kg de levamisol corrigiu a leucopenia de cães com erliquiose, sugerindo que,
nesse caso específico, a associação do levamisol ao tratamento com antibiótico leva
a uma recuperação no número de leucócitos periféricos o que reflete na recuperação
clínica do animal, já que a erliquiose pode causar leucopenia o que dificulta a
eliminação da bactéria. A leucopenia dos cães usados no presente experimento era
decorrente da neutropenia, linfocitopenia e monocitopenia. No que tange à
neutropenia, o levamisol não elevou o número dessas células quando comparado
aos animais que receberam somente o antibiótico. Esse resultado poderia sugerir
que o levamisol não age sobre neutrófilos. Entretanto, essa hipótese não pode ser
formulada visto que, antes de iniciar o tratamento, os cães que receberia o levamisol
apresentavam uma neutropenia significantemente mais acentuada do que os cães
controle. Além disso, todos os cães que receberam levamisol associado ao
antibiótico recuperaram da neutropenia, enquanto um dos dez cães que receberam
somente o antibiótico permaneceu neutropênico no período do experimento.
Verificou-se no presente experimento, que os cães tratados somente com antibiótico
recuperam da neutropenia, mas tiveram um aumento significante do número de
bastonetes circulantes, comparados aos animais que receberam o levamisol. Esse
resultado sugere que houve morte dos neutrófilos segmentados na periferia e que os
bastonetes, que são neutrófilos imaturos, estariam saindo da medula óssea para
suprir a demanda de neutrófilos maduros na circulação. Se essa hipótese for
verdade, pode-se especular que o levamisol estimularia a resposta imune e
consequentemente controlaria a morte de neutrófilos na periferia.
Com mostrado, no dia zero, antes de iniciar o tratamento, oito dos dez cães
do grupo controle e todos os animais do grupo de que receberia levamisol estavam
linfopênicos. Após o tratamento com antibiótico, apenas cinco dos oito cães do
grupo controle que apresentavam linfopenia recuperam a quantidade dessas células
na circulação. Por outro lado, somente um animal dos onze cães que receberam
levamisol manteve-se linfopênico, cinco dias após receber apenas 1 mg/kg desse
fármaco. Além disso, os cães que receberam levamisol atingiram valores de
linfócitos significantemente superiores àqueles dos animais controle. Esse resultado
sugere que o levamisol pode, direta ou indiretamente, agir sobre linfócitos
42
controlando sua morte na periferia. A hipótese do levamisol controlar a morte celular
na periferia, advém do fato de não se ter visualizado células imaturas quando da
realização do hemograma, usando sangue periférico, no quinto dia após o início do
tratamento. Antes de iniciar o tratamento, todos os cães que participaram da
pesquisa apresentavam monocitopenia. A administração do levamisol associado ao
antibiótico promoveu a recuperação de oito dos onze animais que receberam esse
fármaco. Por outro lado, somente seis dos dez cães que receberam somente o
antibiótico se recuperaram da monocitopenia. Mais uma vez, deve-se salientar que
os valores do número de monócitos atingidos pelos cães que receberam o levamisol
foram significantemente superiores àqueles dos animais que receberam somente o
antibiótico. A partir do conjunto de dados pode-se especular que, possivelmente, o
uso de duas doses de levamisol levaria à recuperação da quantidade de todas as
células da circulação em cães com erliquiose.
No presente estudo, verificou-se que antes de iniciar o tratamento, os cães
apresentavam valores normais de eosinófilos. Porém, após cinco dias de tratamento
a quantidade de eosinófilos aumentou significantemente em relação ao dia zero.
Além disso, os cães que receberam o levamisol apresentaram uma eosinofilia
significantemente superior àquela dos animais controle. A partir desse resultado,
pode-se especular que a eosinofilia poderia estar mascarada pela leucopenia
observada antes de iniciar o tratamento. Essa hipótese foi formulada a partir de
dados da literatura mostrando que a erliquiose canina desequilibra a resposta imune
para um padrão do tipo 2, o que dificultaria a eliminação da bactéria, que é
intracelular obrigatória.
No presente experimento, antes de iniciar o tratamento, cinco dos dez cães
controle e sete dos onze animais que receberia o levamisol apresentavam anemia.
No quinto dia após o início do tratamento, dois dos cinco animais controle haviam-se
recuperado da anemia. Por outro lado, somente dois dos sete cães que receberam o
levamisol permaneceram anêmicos. Além de estarem anêmicos, antes do início do
tratamento, todos os cães apresentavam trombocitopenia. Porém, os cães que
receberiam o levamisol tinham valores de plaquetas significantemente inferiores aos
dos animais controle. No quinto dia após iniciar o tratamento, cinco dos dez cães do
grupo controle mantiveram-se trombocitopênicos, mas, somente dois dos onze
animais que receberam o levamisol não recuperaram da trombocitopenia.
43
Em conjunto, verificou-se que o levamisol associado ao antibiótico promove
um aumento significante do número de várias subpopulações de leucócitos na
periferia de cães com erliquiose. Embora os resultados tenham sido estatisticamente
significantes, estudos no sentido de descrever o mecanismo de ação do levamisol,
enquanto imunoestimulante ainda precisam ser feitos antes de se adicionar esse
fármaco aos protocolos terapêuticos para a erliquiose canina.
44
6 CONCLUSÕES
Considerando-se os resultados obtidos no presente experimento, conclui-se
que o uso de levamisol associado à antibioticoterapia aumentou significativamente o
número global de leucócitos, linfócitos e monócitos em cães com erliquiose e
leucopênicos. Além disso, os animais do GE apresentaram uma melhora clínica
superior àquela dos cães do GC.
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ANEXO I – Parecer do Comitê de Ética
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APÊNDICE I – Termo de Consentimento
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