EFECTO DE LA OFERTA DE OXÍGENO SOBRE EL CRECIMIENTO Y …

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

EFECTO DE LA OFERTA DE OXÍGENO SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA PRODUCCIÓN DE TERPENOIDES CON

CÉLULAS DE Azadirachta indica EN UN BIORREACTOR

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORADO EN CIENCIAS EN DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

PRESENTA

I.Q. M.B. FERNANDO OROZCO SÁNCHEZ

DIRECTOR

Dr. MARIO RODRÍGUEZ MONROY

Yautepec, Morelos, México. Mayo, 2009

Esta tesis corresponde a los estudios realizados con una beca otorgada

a Fernando Orozco Sánchez por la Secretaría de Relaciones Exteriores

del Gobierno de México y con la Comisión de Estudios otorgada por la

Universidad Nacional de Colombia. Se contó con los apoyos

económicos del Programa Institucional de Formación de Investigadores

(PIFI) y de los proyectos CONACYT (P43861-Z y 89321) y SIP - IPN

(20060039, 20070090 y 20090108).

El trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología del Centro de

Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi) del Instituto Politécnico

Nacional de México bajo la dirección del Dr. Mario Rodríguez Monroy.

Los análisis químicos se realizaron en el Centro de Investigación

Biomédica del Sur (CIBIS) del Instituto Mexicano del Seguro Social con

la asesoría del Dr. Alejandro Zamilpa.

A mi familia y a mi compañero

A mis amigos (colombianos, mexicanos y otros más)

A mi país (Colombia) y a mi universidad (Universidad Nacional

de Colombia)

El autor manifiesta su agradecimiento a:

Dr. ALEJANDRO ZAMILPA ÁLVAREZ. Investigador del Centro de Investigación

Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social.

Dr. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO. Investigador del Departamento de

Biotecnología. CeProBi, Instituto Politécnico Nacional.

Dr. ARTURO BELLO PÉREZ. Investigador del Departamento de Biotecnología.

CeProBi, Instituto Politécnico Nacional.

Dr. ENRIQUE GALINDO FENTANES. Investigador del Instituto de Biotecnología,

Universidad Nacional Autónoma de México.

Dra. GABRIELA SEPÚLVEDA JIMÉNEZ. Investigadora del Departamento de

Biotecnología. CeProBi, Instituto Politécnico Nacional.

Dra. GABRIELA TREJO TAPIA. Investigadora del Departamento de Biotecnología.


M.C. JOSÉ LUIS TREJO. Investigador del Departamento de Biotecnología.


Dr. MAURICIO TRUJILLO ROLDÁN. Investigador del Instituto de Investigaciones

Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México.

Dr. MARIO RODRÍGUEZ MONROY. Director de Tesis e investigador del

Departamento de Biotecnología. CeProBi, Instituto Politécnico Nacional.

INSTITUCIONES FINANCIADORAS. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA y

SECRETARÍA DE RELACIONES EXTERIORES, CONACYT, SIP-IPN y PIFI-IPN

DE MÉXICO.

AMIGOS Y COMPAÑEROS DE YAUTEPEC. Alicvajan Díaz, Arianna Hernández,

Dante Avilés, Edgar Valencia (Zega), Eduardo Montes De Oca (Pay), Doña Mago,

Fabián Jaramillo, Francisco Mesa (Pancho), Gustavo Pavón, Irvin Armendáriz,

Jacqueline Capataz, Jesús Arnoldo Sánchez, Jessica Peña, Johana Patiño,

Jonathan Tavera, Jorge Isaac Martínez, Juan Carlos Orbe, Karol Rodríguez, Luis

René Barrios, Michel Salgado, Paul Mauricio Sánchez, Pedro Morales, Rodolfo

Santiago, Sebastián Risser, Santiago Gallegos, Yenny Gómez.

PROFESORES, ESTUDIANTES Y DEMÁS PERSONAL del Centro de Investigación

Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social. Xochitepec, Morelos.

PROFESORES, ESTUDIANTES Y DEMÁS PERSONAL del CeProBi, Instituto

Politécnico Nacional

PROFESORES Y DEMÁS PERSONAL de la Universidad Nacional de Colombia,

Sede Medellín

CONTENIDO

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. i

ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................................. iii

RESUMEN .................................................................................................................. 1

ABSTRACT ................................................................................................................. 3

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 5

2. PRODUCCIÓN DE TERPENOIDES Y CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN DE Azadirachta indica ................................................................. 8

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE TERPENOIDES EN CULTIVOS DE CÉLULAS DE Azadirachta indica ...................................................................... 22

4. LIMITACIÓN POR TRANSFERENCIA DE OXÍGENO PARA CULTIVAR CÉLULAS DE Azadirachta indica EN MATRACES ........................................... 41

5. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN BIORREACTORES CON CÉLULAS DE Azadirachta indica ............................. 57

6. PERSPECTIVAS FUTURAS................................................................................ 83

ÍNDICE DE FIGURAS

No. de figura Página

2.1. Estructura típica de un limonoide (limonina) 9

2.2. Estructura de la azadiractina 10

2.3. Precursores y compartimentación propuestos en el presente trabajo para la síntesis de la azadiractina

12

3.1. Cromatogramas de CLAR correspondientes a muestras de un cultivo de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado

26

3.2. Cromatografías de capa fina de algunas fracciones obtenidas a partir de células de A. indica usando diferentes reveladores

30

3.3. Espectro de RMN13C de la fracción B y estructuras químicas del estigmasterol y β-sitosterol

31

3.4. Esquema propuesto en el presente trabajo para la biosíntesis de algunos limonoides a partir del escualeno, en cultivos de células en suspensión de A. indica

34

3.5. Espectro de CLAR – EM del estándar de azadiractina

35

3.6. Esquema de biosíntesis de algunos limonoides a partir del grupo azadirona, posiblemente presentes en cultivos de células de A. indica

38

4.1. Diagrama para la determinación de transferencia de oxígeno en matraces

44

4.2. Crecimiento, pH y viabilidad celular evaluados durante subcultivos continuos de células de A. indica usando diferentes tipos de tapones

48

4.3. Tamaño de aglomerados de A. indica obtenidos en matraces usando diferentes tipos de tapones

49

4.4. Contenido de azadiractinas (AZRUV) en células de A. indica cultivadas en matraces usando diferentes tapones

49

4.5. Resistencias a la transferencia de oxígeno en matraces de 500 mL. 120 rpm y 100 mL de medio de cultivo

51

4.6. QO2,max (permitido por la transferencia de masa) contra la biomasa de A. indica y U. tomentosa cultivadas en matraces usando diferentes tapones (aluminio, algodón y espuma de silicona) y comparación con los valores medidos en biorreactor

52

ii

4.7. QO2,max (permitido por la transferencia de masa) durante

varios subcultivos de células A. indica en matraces usando diferentes tapones (aluminio, algodón, espuma de silicona)

53

5.1. Impulsor y difusores usados en el biorreactor de tanque agitado

62

5.2. Dinámica de variables de proceso en cultivos de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax

65

5.3. Efecto de OTRmax sobre la cinética de crecimiento considerando la biomasa total (A), la biomasa viable (B) y la viabilidad (C) de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado

67

5.4. Relación entre el crecimiento celular y la OTRmax en cultivos de células de A. indica

70

5.5. Relación entre la producción de azadiractinas (AZRUV) y la OTRmax en cultivos de células de A. indica

71

5.6. Relación entre la producción de metabolitos totales (terpenos, terpenoides y fitoesteroles) y la OTRmax en cultivos de células de A. indica

73

5.7. Efecto de OTRmax sobre el consumo específico de oxígeno de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado

74

5.8. Relación entre OUR, OTRmax y biomasa viable en cultivos de células de A. indica

75

5.9. Relación entre OUR, OTRmax y biomasa viable en dos cultivos de células vegetales, A. indica y especie 2 que consume menos oxígeno

76

5.10. Relación entre el número de Damköhler (Da) y el factor de efectividad de consumo de oxígeno (n) con la biomasa, en cultivos de células de A. indica bajo diferentes condiciones de OTRmax

77

5.11. Relación entre el número de Damköhler (Da) y el factor de efectividad de consumo de oxígeno (n) con las azadiractinas (AZRUV), en cultivos de células de A. indica, bajo diferentes condiciones de OTRmax

79

5.12. Factor de efectividad de consumo de oxígeno (n) contra el Número de Damköhler (Da) en cultivos de células de A. indica, bajo diferentes condiciones de OTRmax

80

ÍNDICE DE TABLAS

2.1. Condiciones de cultivo en callos de A. indica para la

producción de azadiractina

14

2.2. Variables estudiadas para el cultivo de células en suspensión de A. indica.

16

2.3. Productividad de biomasa y azadiractina en cultivos en suspensión de A. indica calculadas en la presente revisión

17

3.1. Compuestos relacionados con la azadiractina (AZRUV) observados en cultivos de células de A. indica

26

3.2. Cinética de crecimiento de un cultivo de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado

28

3.3. Fracciones químicas obtenidas de la biomasa de un cultivo de células de A. indica

30

3.4. Desplazamientos químicos de C (δC, ppm) del estigmaterol y β−sitosterol reportados en la literatura y de la fracción B

32

3.5. Compuestos posiblemente presentes en cultivos de células de A. indica, de acuerdo con las masas de los iones obtenidos por CLAR-EM

37

4.1. Coeficiente global de transferencia de oxígeno (Ko) y OTRmax en matraces de 500 mL usando diferentes tapones

50

5.1. Coeficiente de transferencia de oxígeno característico (kc) y OTRmax de los tratamientos con células de A. indica en biorreactores.

63

5.2. Producción de azadiractina en cultivos de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax

68

5.3 Producción de azadiractinas (AZRUV) en cultivos de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax.

68

RESUMEN

El presente trabajo analiza el efecto de la velocidad de transferencia de oxígeno

(OTR) sobre el crecimiento, la producción de terpenoides y la velocidad específica

de consumo de oxígeno (OUR), en células en suspensión de Azadirachta indica A.

Juss. Esta especie produce alrededor de doscientos terpenoides, algunos con

aplicaciones insecticidas y terapéuticas.

En un cultivo de células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado se

identificaron triterpenos y terpenoides entre ellos el estigmasterol, el sitosterol y el

limonoide, azadiractina. Con los análisis de cromatografía líquida - espectrometría

de masas de algunas fracciones, se puede sugerir que también se produjeron otros

limonoides, algunos de ellos intermediarios en la vía de biosíntesis de la

azadiractina o con estructuras complejas y altamente oxidadas, como los

compuestos de los grupos de limonoides con anillo hemiacetal, vilasinina, salanina,

azadiractol, azadiractinina y azadiractina.

En matraces Erlenmeyer se observó que el tipo de tapón tuvo un efecto sobre la

viabilidad celular, el pH del medio y el tamaño de los aglomerados, los cuales

disminuyeron significativamente usando papel aluminio. Esta disminución no se

observó en matraces con tapones de algodón y espuma de silicona. El análisis de

la OTR máxima (OTRmax) indicó que el oxígeno suministrado con papel aluminio

(0.07 kg O2 m-3 día-1), fue insuficiente para satisfacer la OUR de las células de A.

indica (0.100 kg O2 kg CS-1 día-1). Sin embargo, esta situación no se presenta en

cultivos de otras especies como Beta vulgaris L. y Uncaria tomentosa (Willd) D.C.,

las cuales pueden crecer por un largo periodo de tiempo en matraces con aluminio,

pues consumen 0.25 veces el oxígeno correspondiente a A. indica.

Se realizaron pruebas de crecimiento de los cultivos de A. indica en un biorreactor

de tanque agitado, probando diferentes valores de OTRmax (0.92, 1.70 y 6.21 kg O2

m-3 día-1) por medio del tipo de difusor de aire y la concentración de oxígeno del gas

2

de entrada. El análisis de los resultados obtenidos en biorreactor tipo tanque

agitado y matraz Erlenmenyer, muestra que se presentó un máximo para la

producción de biomasa viable en 0.92 kg O2 m-3 día-1, mientras que se halló una

relación lineal entre la producción de compuestos relacionados con la azadiractina y

la OTRmax. Entre valores de 0.92 y 6.21 kg O2 m-3 día-1 se observó un aumento en el

consumo de oxígeno de casi tres veces por parte de las células.

Mediante los números adimensionales, Damköhler (Da) y factor de efectividad de

consumo de oxígeno (n), se identificaron condiciones de operación en las cuales el

bioproceso se limitó por la transferencia de masa (OTRmax 0.07 kg O2 m-3 día-1),

otras condiciones donde la velocidad de transferencia de masa (OTRmax 0.92 kg O2

m-3 día-1) fue comparable con la velocidad de las reacciones bioquímicas de

consumo de oxígeno y se obtuvo un buen crecimiento celular, y otras condiciones

en las que el bioproceso no se limitó por la transferencia de masa (OTRmax > 1.70 kg

O2 m-3 día-1) que favorecen la producción de azadiractinas pero disminuye la

producción de biomasa viable.

El análisis presentado en este trabajo para A. indica y basado en números

adimensionales, puede ser una herramienta para comprender los fenómenos de

transferencia de masa, de consumo de oxígeno y sus relaciones. Este análisis

podría aplicarse en otras líneas celulares (de la misma u otra especie vegetal) en un

proceso de escalado y definir las correspondientes condiciones de Da y n

adecuadas para la producción de biomasa y de metabolitos secundarios.

ABSTRACT

The objective of this work was to analyze effects of oxygen transfer rate (OTR) on

cell growth, terpenoids production and oxygen uptake rate, in Azadirachta indica A.

Juss cell culture. This species produces almost two hundred terpenoids, some of

them with insecticide and therapeutic activities.

A. indica cell culture growing in a bioreactor produced triterpens and terpenoids such

as: stigmasterol, sitosterol and azadirachtin. The HPLC-MS results suggest that

possibly other limonoids were also produced, some of them intermediates of

azadirachtin biosynthesis pathway or compounds with complex or highly oxygenated

structures. These compounds could belong to the following limonoids groups:

hemiacetal ring liminoids, vilasinin, salanin, azadirachtol, azadirachtinin and

azadirachtin.

It was observed that the plug type in shake flasks affected the cell viability, medium

pH and agglomerates size and those parameters strongly decreased using

aluminum foil. This decrease was not observed in flasks covered with cotton and

silicone foam. The analysis of maximum oxygen transfer rate (OTRmax) indicated that

oxygen supplied with aluminum paper (0.07 kg O2 m-3 day-1), was insufficient to

satisfy the oxygen uptake rate (OUR) of the cells (0.100 kg O2 kg DW-1 day-1). This

situation was not observed with other species as Beta vulgaris L. and Uncaria

tomentosa (Willd) D.C., which can grow for a long time under these conditions

because they consume 0.25 times the oxygen corresponding to A. indica.

Evaluations of A. indica cell growth in one stirred tank bioreactor was done, using

different levels of OTRmax (0.92, 1.70 and 6.21 kg O2 m-3 day-1) varying the operation

conditions by means of sparger kind and oxygen concentration in gas flow. The

analysis of obtained results in stirred tank bioreactor and shaking flask shows that a

maximum for viable biomass production in 0.92 kg O2 m-3 day-1 was presented, while

a linear relationship between compounds related with azadiractin and OTRmax was

4

found. OUR was increased between 0.92 and 6.21 kg O2 m-3 day-1 almost three

times.

Damköhler (Da) and effectiveness factor of oxygen consumption (n) adimensional

numbers were used to identify operational conditions in which the bioprocess should

be limited by mass transfer (OTRmax 0.07 kg O2 m-3 day-1); conditions where the

mass transfer rate was comparable to the rate of biochemical reactions of oxygen

consumption (OTRmax 0.92 kg O2 m-3 day-1) obtaining a satisfactory cell growth; and

conditions (OTRmax > 1.70 kg O2 m-3 day-1) where the bioprocess was not limited by

mass transfer and production of viable biomass was inefficient, although

azadirachtins production was increased.

The analysis presented in this work with A. indica based in the use of adimensional

numbers, may be a tool to understand the phenomena of mass transfer, oxygen

consumption and their relationships. That analysis could be applied for other cell

lines belonging to A. indica or other species in a scale up process, to define

appropriate values of Da and n, for biomass and secondary metabolites production.

1. INTRODUCCIÓN

Se estima que en el planeta existen alrededor de 400 000 especies de plantas

superiores, las cuales podrían producir cientos de miles de metabolitos secundarios

(como alcaloides, terpenos o fenilpropanoides) con aplicaciones en las industrias

farmacéuticas, alimenticias, agrícolas y químicas. La producción comercial de estos

metabolitos por métodos tradicionales, in vivo, comienza a enfrentarse con el uso de

las tierras cultivables, para producir alimentos con fines humanos o animales y

biocombustibles. Esta expansión de tierras cultivables amenaza con destruir

grandes extensiones de selvas tropicales y subtropicales del planeta, con la

consecuente extinción de plantas medicinales utilizadas desde hace cientos o miles

de años por comunidades indígenas y con la pérdida irreversible de biodiversidad y

de recursos genéticos. En un momento en el que existe el problema del

calentamiento global y la crisis alimentaria, se debe enfatizar en el cultivo de células

vegetales en biorreactores, como una alternativa para la producción de metabolitos

secundarios. Aunque algunos de estos metabolitos ya se producen mediante

síntesis química o transformación genética de microorganismos, en la mayoría de

los casos es casi imposible reemplazar la maquinaria metabólica vegetal altamente

compleja.

Los biorreactores permiten controlar variables que afectan el crecimiento celular y la

producción de metabolitos y en principio, es posible obtener productividades

superiores o comparables a las obtenidas con plantas en campo. El primer proceso

comercial para la producción de un metabolito secundario con células vegetales en

suspensión, se desarrolló hace poco más de dos décadas (shikonina a partir de

Lithospermum erythrorhizon). Sin embargo, la producción comercial de nuevos

productos presenta dificultades. Entre las razones que limitan el desarrollo

comercial de otros procesos puede estar el desconocimiento completo de las rutas

metabólicas secundarias y de los mecanismos que regulan su biosíntesis; las líneas

celulares de los cultivos in vitro son inestables, variando tanto en el crecimiento

celular, como la producción de metabolitos; además, en muchas especies no se han

definido las variables de operación de biorreactores (agitación, aireación,

configuración del reactor) más adecuadas para el crecimiento celular y la producción

1. Introducción

6

de metabolitos secundarios. A diferencia de muchos cultivos microbianos, donde se

cuenta con estudios ingenieriles y bioquímicos que definen los efectos de ciertas

variables de operación de los biorreactores y que permiten el desarrollo de

diferentes procesos comerciales, para células vegetales existe la necesidad de

estudiar los efectos de estas variables sobre el metabolismo celular y poder definir

condiciones de operación que permitan incrementar la productividad del sistema,

antes de realizar el escalamiento de estos procesos. La revisión de la literatura

sobre este último punto, muestra una aplicación limitada de la ingeniería bioquímica

y escaso análisis de lo que ocurre dentro de biorreactores con células vegetales.

Por ejemplo, la disponibilidad de oxígeno, afecta tanto el metabolismo primario

como secundario de las células vegetales y aunque se ha estudiado el efecto de

algunas variables relacionadas con la transferencia de oxígeno (e.g. tipo y velocidad

del impulsor, flujo y composición del gas de entrada), en ninguno de estos estudios

se realiza un balance de la cantidad de oxígeno que se suministra a las células.

Tampoco se analiza la posible relación de la velocidad de transferencia de oxígeno

en los cultivos (OTR por sus siglas en inglés) con la velocidad de consumo de

oxígeno por parte de las células (OUR por sus siglas en inglés).

El objetivo del trabajo fue evaluar el efecto de la OTR máxima (OTRmax) y su

relación con la OUR en células en suspensión de Azadirachta indica, especie que

produce alrededor de doscientos terpenoides, algunos con aplicaciones insecticidas

y terapéuticas. El presente documento de tesis se organizó de la siguiente manera:

La sección 2 presenta una revisión bibliográfica del cultivo de células de A. indica,

los principales metabolitos que produce, algunos elementos sobre la biosíntesis de

la azadiractina y su compartimentación a nivel celular, las variables estudiadas en

biorreactores y algunas estrategias usadas para incrementar la producción de

azadiractina. Aunque existen aspectos sin estudiar, tanto en la ruta biosintética de

terpenoides en esta especie, como en la operación de biorreactores para el

crecimiento de las células, se identifica la especie de A. indica como una especie

con potencial para la producción de bioinsecticidas vía biotecnológica.

La sección 3 presenta el aislamiento e identificación de algunos terpenoides en

cultivos de células de A. indica y se establece la metodología para el análisis de

azadiractinas. Contiene los resultados de la extracción y fraccionamiento químico

1. Introducción

7

de las células obtenidas del reactor, el análisis químico de algunos compuestos

obtenidos mediante cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alta

resolución y espectrometría de masas. Se deduce que las células podrían estar

produciendo terpenos, terpenoides y otros limonoides diferentes a la azadiractina.

Estos resultados permitieron hacer un análisis de la ruta de biosíntesis de la

azadiractina y otros limonoides, que tendrían las células de A. indica en suspensión.

En la sección 4 se aborda un estudio realizado en matraces Erlenmeyer, mostrando

el efecto de los tapones sobre el desarrollo de los cultivos. El estudio demuestra

que dependiendo del tipo de tapón usado, se puede ofrecer diferentes OTR a las

células y si el oxígeno suministrado es muy bajo, se pude reducir la viabilidad

celular, especialmente si la especie tiene una alta OUR, como es el caso de A.

indica (0.100 kg O2 kg CS-1 día-1). Con base en el análisis de oferta y demanda de

oxígeno de A. indica y de otras especies, se observó que las células de A. indica no

pueden cultivarse en matraces tapados con papel aluminio, ya que su consumo de

oxígeno es mayor que el de otras especies, como Beta vulgaris y Uncaria

tomentosa.

La sección 5 constituye la parte central de la investigación. Se analiza el efecto de

la OTRmax sobre el crecimiento celular, la producción de azadiractinas y la OUR en

cultivos de células de A. indica. Se encuentra un valor de OTRmax donde se produce

la mayor cantidad de biomasa viable y se halló que la producción de azadiractinas

se incrementa proporcionalmente con el aumento de la OTRmax. Mediante los

números adimensionales, Damköhler (Da) y factor de efectividad de consumo de

oxígeno (n), se analizan los fenómenos de transferencia de masa, de consumo de

oxígeno y las velocidades relativas entre ellos. Este análisis permitió identificar

condiciones de operación (con valores de OTR, Da y n) que son adecuadas para la

producción de biomasa (0.92 kg O2 m-3 día-1), condiciones favorables para la

producción de azadiractinas (6.21 kg O2 m-3 día-1) y otras condiciones que no

favorecen ni la biomasa ni las azadiractinas (0.07 kg O2 m-3 día-1).

Finalmente, se presentan las perspectivas que tiene la investigación y se formulan

nuevas hipótesis que podrían orientar la continuación de trabajos futuros.

2. PRODUCCIÓN DE TERPENOIDES Y CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN DE Azadirachta indica

INTRODUCCIÓN

Azadirachta indica A. Juss (familia Meliaceae) o árbol del neem, es una de las

plantas con mayores aplicaciones en el mundo y todas las partes de la planta

pueden procesarse para obtener cientos de compuestos con diversas aplicaciones.

La planta es originaria de las zonas áridas de India, Pakistán y África. El término

neem proviene del sánscrito Nimba y era conocido como Sarva Roga Nivarini o

curador de todas las enfermedades. Su nombre científico presenta como sinónimos

Antelea azadirachta, Melia azadirachta y Melia indica y es conocido popularmente

como nim, neem, margosa, paraíso, caoba criolla y caoba haitiana. El árbol puede

alcanzar una altura de 30 m y crece en diferentes condiciones climáticas;

actualmente se cultiva en zonas semiáridas con precipitaciones pluviales de 200 a

1200 mm H2O y tolera temperaturas de 0 a 49 ºC. A. indica es cultivado en más de

50 países en todo el mundo, en Asia, África, Centro y Sur América, el Caribe y se

han establecido pequeñas plantaciones en Norteamérica (Brechelt y Fernández,

1995; Stoney, 1997; Neem Foundation, 2006; Royal Botanic Gardens, 2006).

El pueblo hindú ha usado este árbol de múltiples maneras durante miles de años,

incluyendo usos en reforestación, combustible, forraje para ganado, aplicaciones

medicinales, acondicionador y fertilizante de suelos, insecticida, antialimentario y

pesticida (Brechelt y Fernández, 1995; Stoney, 1997; Bandyopadhyay et al., 2002;

Gajalakshmi y Abussi, 2004; Huang et al., 2004; Parmar et al., 2004; Raveendra et

al., 2004; Kintzios, 2006; Neem Foundation, 2006; Royal Botanic Gardens, 2006).

Su actividad bioinsecticida representa un interés particular para el control de

insectos plaga y en este sentido la azadiractina es reconocida como el compuesto

activo más importante.

2. Terpenoides y cultivos de células en suspensión

9

A pesar de lo anterior, existen limitaciones agroclimáticas para la producción

tradicional de estos compuestos a partir de semillas y su síntesis química es

compleja, por lo que la producción a partir de cultivos de células vegetales in vitro

surge como una alternativa promisoria. En la presente sección se presenta una

revisión de los terpenoides más importantes que produce esta especie y algunos

aspectos de su biosíntesis. Además, se muestra el avance realizado en el cultivo de

las células de A. indica, las estrategias usadas para mejorar el crecimiento y la

producción de azadiractina y se identifican algunos aspectos científicos que aún

están por investigar con A. indica.

TERPENOIDES PRODUCIDOS POR A. indica

A. indica produce más de 300 metabolitos secundarios, un tercio de los cuales son

limonoides (tetranortriterpenoides) de interés comercial y científico por sus efectos

biológicos (Dai et al., 1999; David et al., 2000). Los limonoides son producidos por

especies de las familias Meliaceae, Rutaceae y Simaroubacea. Son compuestos

homogéneos esteoreoquímicamente con una estructura típica derivada de un

esqueleto 4,4,8-trimetil-17-furanilesteroide como precursor (Roy y Saraf, 2006). Los

limonoides cítricos por ejemplo (figura 2.1), contienen un anillo furano unido al anillo

D en C-17, y grupos funcionales que contiene oxígeno en C-3, C-4, C-7, C-16 y C-

17 (Roy y Saraf, 2006). Las variaciones estructurales de los limonoides de

Mealiaceae son mayores que las de Rutaceae y se presentan modificaciones en

todos los anillos. Muchos limonoides de Meliaceae son estructuras complejas con

un alto grado de oxidación y sufren arreglos múltiples.

Figura 2.1. Estructura típica de un limonoide (limonina)


10

En el caso de A. indica, la azadiractina, C35H44O16 (figura 2.2) se considera el

principal limonoide responsable de la actividad insecticida. Además es el limonoide

más abundante, biodegradable, ambientalmente seguro y únicamente es producido

por esta especie (Mordue y Blackwell, 1993; Royal Garden Botanics, 2006). Los

otros limonoides producidos por A. indica tienen aplicaciones potenciales en

diferentes campos. Por ejemplo, el meliantrol y la salanina tienen efecto

antialimentario en insectos. La nimbina y nimbidina poseen actividad antiviral. El

deacetilazadiractinol funciona como antihormona y paraliza el sistema digestivo de

ciertos insectos. La 3-deacetilsalanina y el salanol están relacionados químicamente

con la salanina y también son antialimentarios (National Research Council., 1992;

Royal Botanic Gardens, 2009).

Figura 2.2. Estructura de la azadiractina.

La mayoría de la investigación realizada sobre A. indica se ha enfocado

intensamente en la azadiractina y se han identificado 9 isómeros de esta molécula,

siendo la azadiractina A y la azadiractina B los más abundantes (Brechelt y

Fernández, 1995; Sidhu et al., 2003). La concentración de azadiractina A en las

semillas es de 0.56 – 3.03 g/kg y azadiractina B de 0.04 – 0.59 g/kg (Sidhu et al.,

2003).

La azadiractina es efectiva contra cerca de 200 especies de insectos, no afecta los

mamíferos o los animales que consumen estos insectos, ni tampoco a los insectos

útiles para la polinización o que son benéficos para la planta (Dureja y Johnson,

2000; Neem Foundation, 2006; Royal Botanic Gardens, 2006). Cuando un insecto

ingiere azadiractina no muere inmediatamente; la molécula afecta su patrón de

alimentación (efecto antialimentario), el desarrollo de su cuerpo (metamorfosis) y su

ciclo reproductivo, actuando como una toxina. Así, se sabe que la azadiractina

interfiere con las glándulas corpora cardíaca y corpora alata, inhibiendo la


11

producción de la neurohormona protoracicotrópica, la cual a su vez regula de la

biosíntesis de las hormonas de la metamorfosis (ecdisona) y la hormona juvenil.

Estas hormonas son esenciales para los insectos, pues determinan la muda y la

maduración de huevos; sin ellas, las larvas pueden durar hasta 3 semanas sin

cambiar de estadio e inclusive morirse. Así, los estados larvales pueden lograr

empuparse pero los adultos salen con alas deformadas y otras deficiencias. Los

estados adultos que ingieren demasiada azadiractina demuestran una fecundidad

reducida (National Research Council, 1992; Lonard et al., 1996).

La ruta de biosíntesis de los limonoides (azadiractina) en plantas de neem debe

basarse en la ruta para la producción de isoprenoides en plantas (figura 2.3).

Existen evidencias experimentales que algunos limonoides (nimbina y nimbidina)

presentes en las hojas de A. indica, incorporan en su estructura carbones del ácido

mevalónico, AMV (Akhyla y Rani, 2002). Por otro parte, en cultivos de células en

suspensión, mediante la adición de acetato de sodio (C2H3O2Na), isopentenil

difosfato (IDP, C5H12P2O7) y geranil difosfato (GDP, C10H20 P2O7) - estos dos últimos

intermediarios de la ruta independiente del ácido mevalónico - y escualeno (C30H50)

- precursor de la producción de terpenoides - se logró incrementar la producción de

azadiractina (Balaji et al., 2003). Debe considerarse además que las reacciones

para la síntesis de fitoesteroles a partir del oxidoescualeno, son todas catalizadas

en 21 pasos enzimáticos mediante enzimas enlazadas al retículo endoplasmático

(Bouvier et al., 2005). Estas enzimas son clasificadas en dos grupos, un primer

grupo que involucra reacciones con ciclizaciones, alquilaciones, reducciones e

isomerizaciones. Las enzimas del segundo grupo catalizan reacciones de oxidación

mediante la inserción de oxígeno molecular, catalizadas en parte por la amplia

familia de monooxigenasas citocromo P450 o por varios miembros de la familia de

oxigenasas hierro no hemo, enlazadas a la membrana del retículo.

Dayanandan y Ponsamuel (2000) identificaron células secretoras de terpenoides en

el neem. Cada célula secretora tiene un citoplasma denso con muchos organelos

(vesículas acumuladoras de terpenoides) particularmente abundantes en el retículo

endoplasmático y en ribosomas. Los autores sugieren que cada célula secretora

debe poseer dos grandes rutas biosintéticas, (1) la ruta de isoprenoides de

biosíntesis de terpenoides, que es común en las plantas superiores y (2) una ruta


12

biosintética para la síntesis de protolimonoides y limonoides (Dayanandan y

Ponsamuel, 2000). Con base en las rutas para la producción de isoprenoides en

plantas (Aharoni et al., 2005) y los reportes anteriores, se propone que las unidades

de isopreno necesarias para la síntesis de azadiractina, podrían producirse a nivel

de plastidio (ruta independiente del ácido mevalónico) y a nivel de citosol (ruta del

ácido mevalónico, reacciones del escualeno y post-escualeno). A nivel de citosol y

a nivel del retículo endoplasmático, se estarían realizando las reacciones de

modificación y oxidación de terpenos, propias de la ruta de protolimonoides y

limonoides (figura 2.3)

Acetil-CoA

CITOSOL

AMV IDP

DMADP FDP

Escualeno

PLASTIDIO

PiruvatoGliald-3P

DXP

DMADP

GDP

Esterol X

RETICULO ENDOPLASMÁTICO

Esterol X AzadiractinaCYTP450

IDP

?

Y?

?Y

VESÍCULA DE TERPENOIDESAzadiractina

X y Y intermediarios.

Figura 2.3. Precursores y compartimentación propuestos en el presente trabajo

para la síntesis de la azadiractina. Acetil-CoA, IDP, GDP y escualeno tienen un

efecto comprobado en la síntesis de azadiractina. Adaptado de Aharoni et al. (2005)

con base en los reportes de Dayanandan y Ponsamuel (2000), Akhyla y Rani

(2002), Balaji et al. (2003) y Bouvier et al. (2005). Las líneas punteadas indican

transporte entre compartimentos. AMV (ácido mevalónico), IDP (isopentenil

difosfato), DMADP (dimetilalil difosfato), FDP (farnesil difosfato), Gliald-3P

(gliceraldehido 3-fosfato), DXP (deoxixilulosa-5-fosfato), GDP (geranil difosfato),

CYTP450 (citocromo P450 hidroxilasas).


13

Las células secretoras de terpenoides de neem, se encuentran en las raíces, tallos

jóvenes, cortezas, hojas y cotiledones. Sin embargo, los diterpenoides han sido

aislados del tallo y de la corteza de la raíz, pero no de las semillas. Por el contrario,

la mayoría de los triterpenoides han sido extraídos de las semillas de neem

(Dayanandan y Ponsamuel, 2000). Esto sugiere que existe una maquinaria

metabólica diferente en los diferentes órganos del árbol del neem. En cuanto a la

compartimentación de la azadiractina en cultivos de células en suspensión, la

azadiractina es producida a nivel intracelular y no se excreta fácilmente al medio

(Kuruvilla et al., 1999).

A diferencia del árbol del neem, en el cual se han identificado limonoides en todas

las partes de la planta, en cultivos de células en suspensión de A. indica, sólo se ha

identificado la azadiractina (Orozco-Sánchez y Rodríguez-Monroy, 2007). Un

estudio con cultivos de células A. indica en matraz reportó el contenido de

limonoides relacionados con la azadiractina, usando un método colorimétrico que

mide la absorción de complejos coloreados después de la reacción de vainillina con

terpenoides (Raval et al., 2003). Sin embargo, no se identificaron los limonoides

que podían estar presentes en los cultivos, por lo que sería importante caracterizar

los compuestos químicos presentes en los cultivos de A. indica in vitro.

PRODUCCIÓN DE AZADIRACTINA MEDIANTE CULTIVOS DE CÉLULAS DE A.

indica

Durante las décadas de los 70 y 80, se publicaron varios estudios sobre la

micropropagación, morfogénesis y organogénesis de A. indica (Prakash et al.,

2002). Kearney et al. (1994) publicaron el primer trabajo demostrando el efecto

antialimentario de los metabolitos secundarios producidos por callos y suspensiones

de A. indica sobre insectos. Desde los años 90 se reportó la producción in vitro de

azadiractina en callos y suspensiones celulares (Allan et al., 1994; Wewetzer, 1998;

Prakash et al., 2002). Orozco-Sánchez y Rodríguez-Monroy (2007) presentaron

una revisión mostrando el estado del desarrollo de las tecnológicas biotecnológicas

para la producción de azadiractina, las estrategias usadas para mejorar el

crecimiento y la producción de este limonoide, en cultivos de callos, suspensiones

celulares en matraces y en biorreactores. A nivel de reactores, se tiene referencia


14

de la evaluación de células de A. indica para la producción de azadiractina en

reactores de tanques agitados (2 – 7 L) y airlift, 2 L (Guzmán y Quintero, 2005;

Prakash y Srivastava, 2005a; Prakash y Srivastava, 2006a; Prakash y Srivastava,

2006b; Prakash y Srivastava, 2007; Prakash y Srivastava, 2008).

Las variables que afectan la producción de azadiractina a partir de células in vitro,

pueden agruparse en fisicoquímicas (sistema de crecimiento, composición del

medio, luz, temperatura, etc.) y las inherentes al sistema biológico (tipo de explante,

genotipo, entre otros). La tabla 2.1 resume los datos de producción de azadiractina

en cultivos de callos. Se puede observar que los explantes usados son semillas,

hojas, flores y corteza. En todos los reportes se utilizó el medio de Murashige y

Skoog (1962). Sin embargo, no hay homogeneidad en los reguladores de

crecimiento ni en sus concentraciones. En callos se reportan contenidos de

azadiractina muy variables (0.0005 – 26.8 mg g-1). Es importante señalar que en el

trabajo reportado por Prakash et al. (2005) usaron como explante semillas

provenientes de genotipos con diferente concentración de azadiractina (0.21 y 5.13

mg g-1) y lograron establecer callos que produjeron una concentración de

azadiractina equivalente a la de las semillas de origen.

Tabla 2.1. Condiciones de cultivo en callos de A. indica para la producción de azadiractina. Explante Regulador de

crecimiento Concentración

regulador (mg L-1) Azadiractina

(mg g peso seco-1) Referencia

Semilla IBA BA

4 2 0.0005 Schaaf et al., 2000

Hojas IBA BA

4 2 0.007 Allan et al., 1994

Semillas ANA BA

2 4 0.1 – 1.89

Prakash et al., 2005 Hojas IBA

BA 8 4 0.23

Hojas 2,4 D Kin

1 0.5 26.8

Veeresham et al., 1998 Flores 2,4 D

Kin 1

0.5 24.6

Hojas IAA BA

0.2 1 0.064

Wewetzar, 1998 Corteza IAA

BA 0.2 1 0.044

En todos los reportes fue utilizado el medio basal de Murashige y Skoog (1962), con pH 5.8 y sacarosa 30 g L-1. IBA, ácido indol butírico. BA, benzilaminopurina. ANA, ácido naftalénacético, 2,4 D, ácido 2,4 diclorofenoxiacético. Kin, kinetina. IAA, ácido indolacético.


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El cultivo in vitro tiene la ventaja que el tiempo de crecimiento (20 a 30 días) es

considerablemente menor al que tardaría el proceso de floración y formación de la

semilla en los árboles (meses). Por otro parte, el contenido de azadiractina en

cultivos de raíces (“hairy roots”) es muy bajo, 0.004 – 0.070 mg g peso seco-1 (Allan

et al., 2002) por lo que hasta este momento, este sistema no se considera atractivo

para la producción de azadiractina y se ha optado por investigar con cultivos de

células en suspensión.

La tabla 2.2 resume los reportes con cultivos de suspensiones de A. indica en

matraces Erlenmeyer y en biorreactores. Como estrategias para mejorar la

producción de biomasa y azadiractina se ha reportado: la adición de agentes

permeabilizantes, precursores metabólicos, optimización del medio de cultivo y

estrategias de cultivo en biorreactores. A continuación se analizan algunos de los

resultados presentados. Dado que la azadiractina es un metabolito que se acumula

intracelularmente, se ha utilizado el detergente Tritón X-100 como un agente

permeabilizante para liberarlo de las células (Kuruvilla et al., 1999). Otra estrategia

fue la reportada por Balaji et al. (2003), quienes usaron precursores de la ruta de

síntesis de terpenoides (escualeno e isopentenil pirofosfato), combinado con la

permeabilización con acetato de sodio y lograron incrementar la secreción de

azadiractina al medio de cultivo desde 4.71 mg L-1 hasta 72.81 mg L-1. Raval et al.

(2003) propusieron una estrategia de cultivo en dos etapas, usando un medio

formulado para el crecimiento celular y otro para la producción de limonoides; no

obstante, la producción de azadiractina alcanzada fue sólo de 4.5 mg L-1. En

contraste, Prakash y Srivastava (2005b) propusieron el uso de un medio optimizado

en el contenido de glucosa, nitrógeno y fosfato, con el cual fue posible alcanzar

rendimientos celulares máximos de 15 g PS de células L-1 y 45 mg de azadiractina

L-1. Capataz (2005) determinó que la temperatura y la luz tienen un papel

importante en el crecimiento celular y en la producción de azadiractina,

estableciendo que una condición de 35 °C y luz continua fueron las más favorables

para el crecimiento celular (24.5 g PS L-1); mientras que para la producción de

azadiractina se necesitaron 15 °C y oscuridad, alcanzando producciones de 27.4 mg

azadiractina L-1.


16

Como se puede observar en la tabla 2.2, se ha probado el uso de diferentes tipos de

biorreactores, tales como la columna de burbujeo y el tanque agitado con diferentes

impulsores. Prakash y Srivastava (2005a) hicieron una comparación entre ambos

tipos de biorreactores y observaron que los rendimientos de biomasa y azadiractina

fueron superiores en la columna de burbujeo. Estos mismos autores, buscando

alternativas para el mezclado con el biorreactor tipo tanque agitado, hicieron una

comparación en el desempeño de dos impulsores, setric y centrífugo (Prakash y

Srivastava, 2006b). Sus resultados demostraron que el impulsor centrífugo provee

las características de mezclado que permiten la mejor producción de biomasa (18.7

g PS L-1) y azadiractina (71 mg L-1). Prakash y Srivastava (2006a) propusieron el

uso de un sistema de cultivo por lote alimentado con el biorreactor tipo tanque

agitado y lograron obtener una producción de biomasa de 20 g PS L-1 y de

azadiractina de 82 mg L-1; valores que son comparables con los reportados por los

mismos autores con la columna de burbujeo (Prakash y Srivastava, 2005a).

Tabla 2.2. Variables estudiadas para el cultivo de células en suspensión de A.

indica.

Sistema de cultivo Variable Descripción

Biomasa máxima (g L-1)

Aza máxima (mg L-1)

Referencia

Matraz Agente Permeabilizante Triton X-100 NR1 10 Kuruvilla et al., 1999

Matraz Precursor Acetato sodio

NR1 64.94

Balaji et al., 2003 Esqualeno 72.81 Isopentenil pirofosfato 51.63

Matraz Etapas de cultivo

Una etapa/crecimiento 6,5 2.52 Raval et al., 2003

Dos etapas/ crecimiento y producción 16 4.5

Matraz Medio cultivo Optimización N, P y C 15.02 45 Prakash y Srivastava, 2005b

Matraz Luz y temperatura

Oscuridad 15 ºC 20.2 27.4 Capataz, 2005

Luz 35 ºC 24.6 4.4

Biorreactor Tipo biorreactor Columna burbujeo 2-4L 17.8 81.3 Prakash y Srivastava, 2005a Tanque agitado 3 L 15.5 50

Tanque agitado 3 L Modo de cultivo Lote 15.52 45 Prakash y Srivastava,

2006a Lote alimentado 20.06 82

Tanque agitado 3 L

Tipo de impulsor

Setric2 15.0 45 Prakash y Srivastava, 2006b Centrífugo2 18.7 71

1 NR. No reportado. 2 Impulsores de flujo axial. Aza, azadiractina.


17

Los resultados de las tablas 2.1 y 2.2 indican que se puede mejorar la producción de

biomasa y de azadiractina en un cultivo in vitro, manipulando la composición del

medio de cultivo y modificando la configuración y operación en biorreactor. Sin

embargo, los resultados no son comparables directamente, ya que en algunos

casos, no se reportaron o no son iguales los medios de cultivo, concentraciones de

inóculo y tiempo de cultivo. Con el objeto de poder comparar los resultados de las

investigaciones reportadas para A. indica, se calculó la productividad de biomasa (Q

bio) y la productividad volumétrica de azadiractina (Q pro). De acuerdo con los

resultados presentados en la tabla 2.3, las productividades máximas de biomasa y

azadiractina en matraces corresponden a 0.99 g cel L-1 día-1 y 3.75 mg azadiractina

L-1 día-1, respectivamente. Mientras que en biorreactores, las productividades

máximas alcanzadas son de 1.37 g cel L-1 día-1 y de 7.1 mg azadiractina L-1 día-1.

Tabla 2.3. Productividad de biomasa y azadiractina en cultivos en suspensión de A.

indica calculadas en la presente revisión.

Sistema de cultivo T (°C) Luz Q bio (g cel/ L/d)

Q prod mg Aza/L/d Referencia

Matraz una etapa 25 16 h luz 0.20 0.25 Raval et al., 2005 Matraz 2 etapas 0.82 0.32

Matraz medio optimizado 25 Oscuridad 0.84 3.75

Prakash y Srivastava,

2005 b

Matraz 15 Oscuridad 0.70 3.04 Capataz, 2005 35 Luz 0.99 0.49

Columna burbujeo 2,4 L 27 Oscuridad 1.07 6.7 Prakash y

Srivastava, 2005a Tanque agitado 3 L, 1.05 5.0

Tanque agitado 3 L - Lote 27 Oscuridad

0.75 3.2 Prakash y Srivastava,

2006a Tanque agitado 3 L Lote alimentado 1.08 5.8

Tanque agitado 3 L impulsor Setric 27 Oscuridad 0.83 3.7 Prakash y

Srivastava, 2006b Tanque agitado 3 L

Impulsor centrífugo 27 Oscuridad 1.37 7.1

Aza, azadiractina

Lo anterior, muestra que al pasar los cultivos de A. indica de matraces a

biorreactores, se puede mejorar la productividad del proceso. Esto sugiere que a

nivel de matraces existe una variable no identificada que pudiera estar limitando la

producción de células y azadiractina. Este análisis en cultivos de A. indica es


18

contrastante con los resultados obtenidos para otras especies vegetales, en los que

las productividades de biomasa y de metabolitos secundarios, disminuyen al pasar

los cultivos de matraces a biorreactor (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2003).

CONSIDERACIONES

El cultivo de células de A. indica surge como una alternativa para la producción de

azadiractina. Se han desarrollado medios de cultivo y propuesto condiciones para

operar biorreactores con células de A. indica, en los cuales se alcanzan

concentraciones de azadiractina equivalentes a la concentración en las semillas.

Sin embargo, existen aún estrategias de cultivo que pueden estudiarse para mejorar

este sistema de producción biotecnológica. Por ejemplo, aunque se reporta el

efecto de la luz sobre la producción de azadiractina (Capataz, 2005; Prakash et al.,

2005), no se conoce el efecto de la calidad o la intensidad de la radiación luminosa.

En cuanto a la composición del medio de cultivo, a pesar de los resultados

satisfactorios de Prakash y Srivastava (2005b), aún no es claro el efecto de las

hormonas o la composición del gas suministrado (oxígeno, CO2, etileno,

acetaldehído, etc), entre otros. Además, no existen estudios en esta especie en

torno a los efectos que podría tener el estrés hidrodinámico sobre el crecimiento y la

producción de azadiractina. Estos estudios podrían estar relacionados con la

definición de la configuración del biorreactor, del tipo de impulsor, su velocidad de

agitación y flujo de aireación (Rodríguez-Monroy y Galindo, 2003). Se considera

que el tanque agitado sigue siendo una de las mejores opciones por presentar

menos dificultades técnicas en el proceso de escalado, lo cual coincide con las

afirmaciones de Prakash y Srivastava (2006b).

En el proceso de biosíntesis de limonoides, las oxigenasas insertan oxígeno

molecular para producir compuestos altamente oxigenados. No se ha estudiado el

efecto que tiene la disponibilidad de oxígeno en la producción de azadiractina u

otros limonoides. En general los biorreactores de tanque agitado y de columna de

burbujeo, permiten suministrar mayor cantidad de oxígeno a las células con

respecto al suministro en matraces. Es posible que un mayor suministro de oxígeno

en los biorreactores fuera la causa de la mayor productividad de azadiractina con

respecto a los matraces. Tampoco se han reportado limonoides diferentes a la


19

azadiractina en cultivos de células de A. indica. La identificación de otros

terpenoides en cultivos de células, permitiría proponer el uso de esta tecnología con

aplicaciones diferentes a la producción de un insecticida.

REFERENCIAS

Aharoni,A., Jongsma,M.A., and Bowmeester,H.J. (2005). Volatile science? Metabolic engineering of terpenoids in plants. Trends Plant Sci. 10, 594-602. Akhyla,A. and Rani,K. (2002). Biosynthesis of some biologically active limonoids in the leaves of Azadirachta indica (The Indian Neem tree). Indian J. Heterocycl. Chem. 11, 299-302. Allan E. J.; Eeswara J. P.; Jarvis A. P.; Mordue, A. J.; Morgan, E. D. and Stuchbury, T. (2002). Induction of hairy root cultures of Azadirachta indica A. Juss and their production of azadirachtine and other important insect bioactive metabolites. Plant Cell Rep. 21: 374-379. Allan, E. J; Eeswara, J. P.; Johnson, J; Mordue, A. J.; Morgan E. D. and Stuchbury, T. (1994). The production of azadirachtin by in vitro tissue culture of neem, Azadirachta indica. Pesti. Sci. 42: 147-152. Balaji, K.; Veeresham, C.; Srisilam, K. and Kokate C. (2003). Azadirachtin, a novel biopesticide from cell cultures of Azadirachta indica. J. Plant Biotechnol. 5 (2): 121-129. Bandyopadhyay, U.; Biswas, K.; Chatterjee, R.; Bandyopadhyay, D.; Chattopadhyay, I.; Kumar, Ch.; Chakraborty, T.; Bhattacharya, K. and Banerjee, R. (2002). Gastrotective effect of neem Azadirachta indica bark extract: possible involvement of H+-K+-ATPase inhibition and scavenging of hydroxyl radical. Life Sci. 71: 2845–2865. Bouvier,F., Rahier,A., and Camara,B. (2005). Biogenesis, molecular regulation and function of plant isoprenoids. Prog. Lipid Res. 44, 357-429. Brechelt, A. y Fernández C. L. (1995). El nim, un árbol para la agricultura y el medio ambiente. Experiencias en la República Dominicana. Fundación Agricultura y Medio Ambiente. Amigo del hogar, San Cristobal, República Dominicana. 133 p. Capataz, J. (2005). Efecto de elicitores abióticos sobre la producción de metabolitos secundarios en suspensiones celulares de Azadirachta indica y su efecto sobre Spodoptera sp. Tesis de Maestría Biotecnología, U. Nacional de Colombia. Colombia. 67 p. Dai, J.; Yaylayan, V.; Vijaya G. S. and Pare, J. (1999). Extraction and colorimetric determination of azadirachtin-related limonoids in neem seed kernel. J. Agric. Food Chem. 47: 3738-3742 David, E.; Jarvis, A. and Jonesa, G. (2000). Ratio of products formed on photo-oxidation of the neem triterpenoids nimbin and salannin. Arkivok: 1 (3) 312-319 Dayanandan,P. and Ponsamuel,J. (2000). Ulltrastructure of terpenoid secretory cells of Neem (Azadirachta indica A. Juss). In Electron Microscopy in Medicine and Biology, P.D.Gupta and H.Yamamoto, eds. (New Delhi: Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd.), pp. 179-195.


20

Dureja, P. and Johnson, S. (2000). Photodegradation of azadirachtin-A: A neem-based pesticide. Current Science. 79 (12) 1700 – 1703. Gajalakshmi, S. and Abbasi S. A. (2004). Neem leaves as a source of fertilizer-cum-pesticide vermicompost. Bioresour. Technol. 92: 291–296. Guzmán, A. y Quintero L. (2005). Cinética de crecimiento de Azadirachta indica en un biorreactor agitado. Trabajo de Grado de Ing. Química, U. Nacional de Colombia, Colombia. 15 p. Huang, Z.; Shi, P.; Dai, J. and Du, J. (2004). Protein metabolism in Spodoptera litura (F.) is influenced by the botanical insecticide azadirachtin. Pestic. Biochem. Physiol., 80: 85–93 Kearney, M.L.; Allan, E; Hooker J. E. and Mordue, J. (1994). Antifeedant effects of in vitro culture extracts of neem tree, Azadirachta indica against the desert locus (Schitocerca gregaria (Fosskal)) Plant Cell Tiss. Org. Cult. 37: 67 – 71 Kinttzios, S. E. (2006). Territorial plant derived anticancer agents and plant species used in anticancer research. Crit. Rev. Plant Physiol. 25: 79-113. Kuruvilla, T.; Kkomaraiah, P. and Ramkrishna, S.V. (1999). Enhanced secretion of azadirachtin by permeabilized margosa (Azadirachta indica) cells. Indian J. Exp. Biol. 37: 89-91. Lonard, D. M.; Bhasharan, G. and Dahm, R. H. (1996). Control of prothoracic gland activity by juvenile hormone in fourth instar Manduca sexta larvae. J. Insect Physiol. 42 (3) 205-213. Mordue, A. J. and Blackwell, A. (1993). Azadirachtin: an update. J. Insect Physiol, 39 (11) 903-924. Murashige, T. and Skoog. F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497. National Research Council. (1992). Neem: A tree for solving global problems. Ed. National Academic Press. Washington D.C. 141 p. Neem Foundation, (2006). Growing Neem. Disponible en internet: http://www.neemfoundation.org/contact.htm. Consultado el 15 de abril de 2006. Orozco-Sánchez,F. and Rodríguez-Monroy,M. (2007). Cultivos de células en suspensión de Azadirachta indica para la producción de un bioinsecticida. Rev. Mex. Ing. Quim. 6, 251-258. Parmar, B.S; Balraj; Varshney, M and Shah, D.O. (2004). Neem oil microemulsion without cosurfactants or alcohols and a process to form the same. United States Patent 6,703,034. Prakash, G; Bhojwani, S and Srivastava, A. (2002). Production of azadirachtin from plant tissue culture: state of the art and future prospects. Biotechnol. Bioprocess Eng. 7: 185-193. Prakash, G.; Emmanuel, C.J. and Srivastava, A. K. (2005). Variability or azadirachtin in Azadirachta indica (neem) and batch kinetics studies of cell suspension culture. Biotechnol. Bioprocess Eng. 10: 198 – 204. Prakash, G and Srivastava, A.K. (2005a). Production of azadirachtin (biopesticide) by plant cell cultivation of Azadirachta indica in bubble column reactor. Indian Chem. Eng. Congress, Chemcon 2005. New Delhi, 14- 17 Dec.


21

Prakash, G. and Srivastava, A. K. (2005b). Statistical media optimization for cell growth and azadirachtin production in Azadirachta indica (A. Juss) suspension cultures. Process Biochem. 40: 3795–3800. Prakash, G. and Srivastava, A. K. (2006a). Modeling of azadirachtin production by Azadirachta indica and its use for feed forward optimization studies. Biochem. Eng. J. 29: 62 – 88. Prakash, G. and Srivastava, A. K. (2006b). Azadirachtin production in stirred tank reactors by Azadirachta indica suspension culture. Process Biochem, doi: 10.1016/j.procbio.2006.06.020. Prakash,G. and Srivastava,A.K. (2007). Azadirachtin production in stirred tank reactors by Azadirachta indica suspension culture. Process Biochem. 42, 93-97. Prakash,G. and Srivastava,A.K. (2008). Statistical elicitor optimization studies for the enhancement of azadirachtin production in bioreactor Azadirachta indica cell cultivation. Biochem. Eng. J 40, 218-226. Raval, K.; Hellwig, S.; Prakash, G.; Ramos-Plasencia, A.; Srivastava, A. and Buchs, J. (2003). Necessity of a two-stage process for the production of azadirachtin-related limonoids in suspension cultures of Azadirachta indica. J. Biosci. Bioeng.. 96 (1) 16-22. Raveendra, M; Acharya, L. D. and Udupa, N. (2004). Evaluation of antiplaque activity of Azadirachta indica leaf extract gel - a 6 week clinical study. J. Ethnopharmacol. 90: 99–103. Rodríguez-Monroy, M. y Galindo, E. (2003). Las células vegetales ¿frágiles para crecer en biorreactores? BioTecnología. 8 (2): 6 – 17. Roy,A. and Saraf,S. (2006). Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biol. Pharm. Bull. 29, 191-201. Royal Botanic Gardens. (2006). Neem. Plant Cultures, exploring plant and people. Royal Garden Botanics, Kew. Disponible en internet: http://www.plantcultures.org.uk/plants/neem_landing.html. Consultado el 15 de abril de 2006. Saxena, R. C. (2002). Management of insect pests with neem: Global perspective. In: 2002 Neem Proceedings. Neem Foundation, India. Schaaf, O. (2000). Rapid and sensitive analysis of azadirachtin and related triterpenoids from neem (Azadirachta indica) by high performance liquid cromatography atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 886: 89-97. Sidhu, O. P.; Kumar, V. and Behl H. M. (2003). Variability in neem (Azadirachta indica) with respect to azadirachtin content. J. Agric. Food Chem. 51: 910-915. Stoney, C. (1997). Azadirachta indica - neem, a versatile tree for the tropics and subtropics. Forest, Farm, and Community Tree Network (FACT Net). Arkansa, USA. Disponible en internet: http://food-security.info/food-security.info/Winrock%20Archive/neem.htm. Consultado el 18 de abril de 2006. Veeresham C.; Kumar M. R.; Sowjanya, D.; Kokate, C. K and Apte, S. S. (1998). Production of azadirachtin from callus cultures of Azadirachta indica. Fitoterapia 69: 423-424. Wewetzer, A. (1998). Callus cultures of Azadirachta indica and their potential for the production of azadirachtin. Phytoparasitica. 26 (1):47-52.

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE TERPENOIDES EN CULTIVOS DE CÉLULAS DE Azadirachta indica

INTRODUCCIÓN

Azadirachta indica A. Juss es un árbol que produce cientos de terpenoides, algunos

de ellos tetranortriterpenoides o limonoides, con actividad insecticida y medicinal.

En todos los órganos de la planta se han identificado estos compuestos

(Dayanandan y Ponsamuel, 2000; Orozco-Sánchez y Rodríguez-Monroy, 2007).

Los diterpenoides se han encontrado en el tallo y la corteza de la raíz, pero no en

las semillas, y la mayoría de los triterpenoides han sido extraídos de las semillas de

la planta (Dayanandan y Ponsamuel, 2000). Rasheed (2002) reporta la presencia

de diez y siete grupos de triterpenoides en diferentes partes del árbol de A. indica:

protolimonoides como meliantriol, apo-protolimonoides como azadirol, limonoides

con un anillo hemiacetal como limocinina, limonoides con un anillo γ-hidroxi

butenolido, los grupos azadirona, homoazadirona, gedunina, vilasinina, nimbina,

nimbolido, nimbineno, nimbolinina, salanina, azadiractol, azadiractinina,

meliacarpina y azadiractina. Muchos de estos limonoides ya han sido elucidados

estructuralmente (Ghiasuddin, 1993; Rasheed, 2002). En cultivos de callos se

detectó la presencia de azadiractina y nimbina (Rasheed, 2002). Además, se han

realizado estudios que han permitido conocer algunas etapas en la biosíntesis de

estos terpenoides en diferentes órganos de la planta (Dayanandan y Ponsamuel,

2000; Akhyla y Rani, 2002; Rasheed, 2002). Aunque Rasheed (2002), detalla

muchas de estas reacciones, aún no se conoce la ruta completa de la biosíntesis de

los limonoides de A. indica. Los cultivos de células en suspensión pueden constituir

una alternativa biotecnológica para la producción de estos terpenoides, como la

azadiractina y otros limonoides. Sin embargo, en este tipo de cultivos sólo se ha

reportado la presencia de azadiractina (Orozco-Sánchez y Rodríguez-Monroy, 2007)

y no se han abordado estudios de identificación de otros terpenoides.

3. Aislamiento e identificación de terpenoides

23

Con el fin de identificar compuestos de terpenos relacionados estructuralmente con

la azadiractina, que pueden estar produciéndose en los cultivos celulares de A.

indica, se crecieron células de esta especie en un biorreactor de tanque agitado y se

realizó un proceso de aislamiento e identificación de terpenoides. Para la

identificación de los compuestos, se obtuvo un extracto de la biomasa cultivada en

el biorreactor y luego el extracto fue fraccionado y analizado mediante cromatografía

de capa fina (CCF), cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), CLAR

acoplada a espectrometría de masas (CLAR-EM) y resonancia magnética nuclear

del carbono (RMN13C). A partir de los compuestos identificados se presenta un

esquema de la posible ruta de biosíntesis de la azadiractina y otros limonoides que

estarían presentes en los cultivos de A. indica en el biorreactor.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de células de A. indica A. Juss

Los callos de A. indica A. Juss fueron suministrados por el Lab. de Crecimiento y

Desarrollo de las Plantas de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín.

Estos callos provienen de semillas y fueron cultivados en un medio con sales de

Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962), complementado con ácido indol

butírico (4 mg L-1), benzilaminopurina (1 mg L-1), tiamina (0.1 mg L-1), sacarosa (3%

w/v) y PhytagelTM (1.75 g L-1) con pH 5.8 (Capataz-Tafur et al., 2007). Los cultivos

de células en suspensión fueron establecidos adicionando callos friables en un

medio de cultivo con la misma composición indicada anteriormente pero sin

PhytagelTM. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer (500 mL)

conteniendo 100 mL de medio y usando tapones de algodón. Los cultivos se

incubaron en oscuridad a 25 ºC, en un agitador orbital a 120 rpm y con un diámetro

de órbita de 24 mm (Vichi México, Modelo 6040). Las células se subcultivaron cada

8 días.


24

Cultivo de células en el biorreactor

Las suspensiones celulares fueron cultivadas en un sistema de biorreactor tipo

tanque agitado de 7 L (Applikon, Holanda), operando con 4 L de medio de cultivo y

un impulsor de 6 paletas inclinadas 45º a 400 rpm. Para la aireación se utilizó un

difusor de 7 orificios de 1 mm diámetro y un flujo de 0.08 vvm. El oxígeno disuelto

(OD) fue determinado usando un electrodo polarográfico (sensor Applisens

Z010032520, biocontrolador ADI 1030, Applikon Holanda). El pH se controló en 5.8.

Cada 3 días se tomó una muestra de 50 mL del cultivo del reactor y se analizó la

producción de biomasa y azadiractina. El peso seco de la biomasa fue determinado

por filtración de alícuotas de 5 mL del cultivo, a través de un filtro de papel de peso

seco conocido (Whatman UK, grado 1). Las células se secaron hasta peso

constante (70 °C, 1 día).

Análisis por CLAR de los compuestos producidos por las células de A. indica en el

biorreactor.

Extracción y cuantificación de azadiractina. La extracción de terpenoides se hizo

con disolventes orgánicos polares usando la biomasa y el medio libre de células,

con una adaptación de los métodos reportados en la literatura (Schaaf et al., 2000;

Balaji et al., 2003; Capataz-Tafur et al., 2007). Así, la biomasa se llevó a sequedad

mediante un proceso de liofilización y posteriormente se realizó un proceso de

maceración con metanol (3 x 10 mL). Los extractos se combinaron y concentraron

mediante destilación a baja presión a 45 °C. El extracto seco fue sometido a un

fraccionamiento líquido – líquido con 1 mL de cloruro de sodio (0.5% p/v), 10 mL de

agua y 10 mL de diclorometano (3 x 10 ml). Las fases orgánicas se combinaron y

se evaporaron hasta sequedad. Se redisolvieron en 1 mL de metanol para análisis

mediante CLAR. Un procedimiento similar se siguió para el medio libre de células.

El sistema de CLAR estuvo provisto de un módulo de separación Waters 2695

(USA), un detector de arreglo de fotodiodos Waters 2996 y el software Empower

Pro. La separación fue hecha con columna LiChroCART 125-4 LiChrospher 100

RP-18 (125 mm x 4.6 mm D.I, diámetro de poro 5 µm, Merck USA). El flujo de la

fase móvil fue de 1.0 mL min-1 y la composición se controló mediante un programa

de gradiente iniciado en acetonitrilo/agua (ACN/H2O) 35:65 v/v incrementado a


25

45:55 ACN/H2O (minuto 10), 70:30 ACN/H2O (minuto 11) y retornado a 35:65

ACN/H2O (minuto 14). El volumen de inyección fue de 50 µL. El análisis se registró

a una longitud de onda de 213 nm durante 15 min. Para la cuantificación de la

azadiractina se usó como estándar azadiractina grado reactivo (A7430, Sigma

USA). La curva de calibración se realizó con soluciones de azadiractina en

metanol, en un intervalo entre 0.5 y 190.0 mg L-1 (Absorbancia =

13951*concentración azadiractina, r2 = 0.9931).

Cuantificación de azadiractinas relacionadas por su espectro en UV (AZRUV). En

los cromatogramas obtenidos por CLAR, se observan compuestos diferentes a la

azadiractina durante todo el cultivo. Algunos de ellos presentan espectros de

absorción en UV similares a la azadiractina pero en tiempos de retención (tr)

diferentes al de este compuesto. La figura 3.1 A presenta un cromatograma con la

azadiractina (día 0 del cultivo), con sólo un máximo de absorción en 213 nm y un tr

de 8.8 min. La figura 3.1 B presenta un cromatrograma característico obtenido por

CLAR (día 3 del cultivo). Se observan en el cromatograma 13 “picos”

correspondientes a un mínimo de 13 compuestos químicos diferentes. De éstos,

cuatro compuestos (tr de 4.63, 5.36, 6.12 y 8,74 min) presentan un espectro en UV

similar a la azadiractina (figura 3.1C) con un pico de absorción máxima entre 210 y

217 nm. Este grupo de compuestos se denominó como azadiractinas relacionadas

por su espectro en UV (AZRUV). Durante la cinética de crecimiento se observó en

cada día, entre 9 y 20 compuestos químicos diferentes, de los cuales, entre 1 y 3

compuestos fueron AZRUV. De acuerdo con los tiempos de retención y el

espectro en UV, se observaron en total 9 AZRUV. Sus características se presentan

en la tabla 3.1. Debido a la similitud en los espectros de absorción, se sugiere que

la estructura química de estos compuestos pudieran contener grupos funcionales

cromóforos (grupos funcionales que permiten deslocalización de electrones π)

similares a los que posee la azadiractina. Las AZRUV se cuantificaron con base en

la curva de calibración de la azadiractina y se reportan como mg equivalentes de

Aza L-1.


26

Figura 3.1. Cromatogramas de CLAR correspondientes a muestras de un cultivo de

células de A. indica en un biorreactor de tanque agitado. (A). Espectro y ubicación

de la azadiractina. (B). Cromatograma con otros compuestos (valores de máximos

de absorción en UV, dentro de los cuadros). (C). Espectros de absorción de dos

compuestos con espectros similares a la azadiractina (AZRUV).

Tabla 3.1. Compuestos relacionados con la azadiractina (AZRUV) observados en

cultivos de células de A. indica

Compuesto Tiempo retención (min) Máxima absorción en UV (nm)

1 3.9 213 – 217 2 4.2 212.2 3 4.7 213 4 5.4 213 5 6.1 216.9 6 7.5 216.9

Azadiractina 8.8 213 8 9.5 215.7 9 10.1 212 - 217

Aislamiento e identificación de terpenoides

La biomasa obtenida del cultivo del biorreactor en el día 21 fue extraída con metanol

(3 x 500 mL). El extracto se concentró y se fraccionó mediante una bipartición con


27

acetato de etilo/agua. La fracción orgánica (AcOEt) fue purificada en una columna

cromatográfica usando sílica gel 60 como fase estacionaria (30 g silica g extracto-1)

y se eluyó usando disolventes con un gradiente de polaridad ascendente (hexano,

acetato de etilo, metanol). Las fracciones se analizaron por medio de CCF, CLAR,

CLAR-EM y RMN para la identificación de los componentes.

CCF. Para las pruebas de CCF se usaron placas de aluminio con sílica gel 60 F254

(Merck 1.05554.001, USA). Las composiciones de la fase móvil se indican en los

resultados respectivos. Se usó sulfato cérico como revelador universal, el cual se

preparó mezclando a 0 ºC, 350 g H2O, 22 mL H2SO4 y 12 g de

(NH4)4Ce(SO4)4•2H2O. También se usó el reactivo de Ehlrich como un revelador

específico para terpenos (Terry et al., 2004), el cual produce una coloración morada

característica de estos compuestos. El reactivo se preparó adicionando 2 g de

metilaminobenzaldehido a 100 mL de una solución H2O:CH3CH2OH (50:50 v/v) y

adicionando luego 30 mL de HCl concentrado. Después de aplicar el revelador las

placas se calentaron a 90 ºC para observar los compuestos presentes.

RMN13C. El análisis de RMN13C se obtuvo a 200 MHz, solvente CDCl3 y usando un

espectrómetro de RMN multinuclear (Varian, USA). Se usó tetrametilsilano como

referencia. Estos análisis fueron realizados en el Centro de Investigaciones

Químicas de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos. El análisis de los

espectros se realizó comparando los desplazamientos químicos1 (δ) RMN13C con los

desplazamientos de compuestos reportados en la literatura.

CLAR-EM. Se utilizó un cromatógrafo de líquidos marca Waters modelo 1525

(USA) acoplado al espectrómetro de masas marca Bruker (Alemania) modelo

Esquire 6000 con electrospray y trampa de iones. Columna SynergiTM

(Phenomenex USA) 4 µm polar RP 150 mm x 2.0 mm. Flujo de la fase móvil 0.2 mL

min-1, controlado mediante un programa de gradiente iniciado en acetonitrilo/agua

(ACN/H2O) 10:90 v/v e incrementado a 100:0 ACN/H2O (minuto 25). ESI con

1 El desplazamiento químico δ en ppm es igual a 106 veces la relación entre la separación de las señales, Δν (la señal de la muestra y la señal de la referencia) y la frecuencia electromagnética del emisor, ν, ambas expresadas en Hz. δ es un número sin dimensiones, independiente del espectrofotómetro. δ = Δν/ν*·106


28

presión del nebulizador 30 psi, gas de secado 8 L min-1, temperatura de secado 365

ºC. Trampa de iones de polaridad positiva, voltaje de salida del capilar 128.5.0 V,

alto voltaje del capilar 4000 V y barrido 100 – 1000 m/z, promedio de 5 espectros,

Trap drive 64.6. Estos análisis fueron realizados en el Instituto de Química de la

Universidad Nacional Autónoma de México.

Análisis estadístico

Los experimentos se realizaron por duplicado y cada muestra fue analizada dos

veces. En las tablas se reportan los valores medios ± el error estándar. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Análisis por CLAR de los compuestos producidos por A. indica en el biorreactor.

La tabla 3.2 presenta los valores de biomasa, número de compuestos totales,

número de AZRUV, concentración de azadiractina y concentración de AZRUV,

durante los diferentes días del cultivo de las células de A. indica en el reactor.

Tabla 3.2. Cinética de crecimiento de un cultivo de células de A. indica en un

biorreactor de tanque agitado.

Tiempo

(día) Biomasa

(g CS día-1) Número de

compuestos observados1

Número de AZRUV

observadas2

Azadiractina (mg L-1) 3

AZRUV (mg L-1)

0 3.3 ± 0.8 15.5 ± 1.5 3.0 ± 0.0 0.1 1.6 ± 0.9 3 4.4 ± 0.3 14.5 ± 3.5 2.5 ± 0.5 0.3 2.3 ± 1.0 7 5.8 ± 0.5 15.0 ± 2.0 2.5 ± 0.5 0.0 0.5 ± 0.2 10 7.0 ± 0.6 13.5 ± 1.5 2.0 ± 0.5 0.1 0.5 ± 0.3 14 11.5 ± 1.2 16.0 ± 3.0 2.0 ± 0.0 0.0 0.7 ± 0.5 17 14.0 ± 0.2 17.5 ± 2.5 1.5 ± 0.5 0.0 0.9 ± 0.1 21 13.3 ± 0.3 9.0 ± 0.0 0.0 ± 0.0 0.0 0.5 ± 0.5

1 Número total de compuestos observados en los cultivos. 2 Nümero de AZRUV observadas (pico máximo de absorción 210 – 217 nm). 3 El análisis de azadiractina no tiene réplicas. Se reportan los valores medios ± el error estándar.


29

La biomasa se incrementó de 3.3 a 14.0 g células secas L-1 y el OD descendió

desde 46.1 % a valores entre 1.0 y 3.0 % a partir del día 10 (datos no mostrados).

Se encontró una concentración variable de azadiractina, alcanzado un valor máximo

de 0.3 mg L-1. Tanto la azadiractina como las AZRUV, presentaron los valores

máximos de concentración los primeros días del cultivo y luego tuvieron una

tendencia a disminuir, mientras la biomasa aumentó. En las muestras del cultivo se

observó un máximo de 20 compuestos (día 17) y hasta 3 AZRUV diferentes (día 0).

Aislamiento e identificación de terpenoides

Aislamiento de terpenoides y análisis por CCF. Con el fin de analizar la presencia

de terpenoides y en su caso elucidar la estructura de los compuestos presentes en

el cultivo de células de A. indica, se realizó un proceso de extracción y separación

de compuestos químicos. A partir de toda la biomasa del biorreactor (35 g CS L-1,

día 21) se obtuvo un extracto metanólico (0.283 g extracto/g CS) y luego en la

bipartición de acetato de etilo/agua se obtuvo el extracto orgánico (0.125 g

extracto/g CS). Del extracto se obtuvieron 44 fracciones, que fueron analizadas por

CCF y reagrupadas de acuerdo con sus perfiles, obteniendo 20 nuevas fracciones.

Los análisis de CCF permitieron observar la presencia de terpenos y algunos

triterpenos, éstos últimos presentes en mayores cantidades en la fracción B (figura

3.2 A). Además, se observaron algunos compuestos con un factor de retención (Rf)

similar al de la azadiractina (figura 3.2 B) y otros con la fluorescencia característica

que producen los terpenoides cuando se excitan con luz UV (figura 3.2 C)

(Dayanandan y Ponsamuel, 2000). La tabla 3.3 presenta las fracciones químicas

obtenidas y los posibles compuestos químicos presentes en cada fracción. En el

proceso de extracción de los compuestos químicos se eliminaron los derivados del

metabolismo primario (azúcares, lípidos, proteínas, etc.) y con base en el

metabolismo conocido de A. indica, es posible que el extracto obtenido contenga

principalmente terpenos, terpenoides y otros fitoesteroles (David y Dayanandan,

1997). A medida que se desciende en la tabla aumenta la polaridad de los

compuestos presentes en cada fracción, iniciando con compuestos poco polares

(solubles en 95:5 hexano/acetato de etilo v/v) como los ácidos grasos y finalizando


30

con compuestos polares (solubles en metanol) que podrían incluir terpenoides

altamente oxigenados.

Figura 3.2. Cromatografías de capa fina de algunas fracciones obtenidas a partir de

células de A. indica usando diferentes reveladores. (A). Terpenos y en círculos,

triterpenos. (B). Comparación de algunos compuestos con el Rf de la azadiractina. (C).

Terpenoides bajo excitación UV. Fase móvil en (A) acetona:H2O:CH3OH 9:0.5:0.5 y en

(B) y (C) CHCl3:acetona 8:2. Sem, extracto de semillas. R, extracto del reactor sin

fraccionar. Aza, estándar de azadiractina. A, B, F, M, Mm, fracciones.

Tabla 3.3. Fracciones químicas obtenidas de la biomasa de un cultivo de células de

A. indica.

Sistema* Nombre de la fracción

Compuestos posiblemente presentes

Hex-AcEt 95:5 A1 Acidos grasos Hex-AcEt 90:10 A2 Acidos grasos, fitoesteroles Hex-AcEt 80:20 B Fitoesteroles, triterpenos Hex-AcEt 70:30 C Fitoesteroles, triterpenos Hex-AcEt 60:40 D, E, F Compuestos polares, terpenoides Hex-AcEt 50:50 G, H, I, J, K, L Compuestos polares, terpenoides Hex-AcEt-MeOH 50:50:5 M Compuestos polares, terpenoides Hex-AcEt-MeOH 50:50:10 N Compuestos polares, terpenoides. Hex-AcEt-MeOH 50:50:20 Ñ Compuestos polares, terpenoides MeOH 100 O, P2, P3, P4 Compuestos polares, terpenoides * Relación volumétrica de los solventes. Hex, hexano. AcEt, acetato de etilo. MeOH, metanol.

Mediante una prueba de CCF se obtuvieron cromatogramas similares entre la

fracción B y un estándar de β-sitosterol. Este compuesto es muy similar al

estigmasterol. Debido a la similitud estructural entre ambos compuestos y a su


31

amplia distribución en el reino vegetal (Kongduang et al., 2008), se sospechó de la

presencia de ambos compuestos en esta fracción.

Análisis por RMN13C. La poca cantidad obtenida de cada fracción sólo permitió

analizar la fracción B por RMN13C. Los desplazamientos químicos del carbono (δC)

obtenidos experimentalmente para esta fracción, tuvieron gran similitud con los

desplazamientos químicos experimentales, reportados para el estigmasterol y el β-

sitosterol (Kovganko et al., 1999). La figura 3.3 presenta el espectro de RMN13C de

la fracción B y las estructuras del estigmasterol y β-sitosterol. La tabla 3.4 presenta

los desplazamientos químicos reportados en la literatura para estos dos compuestos

y los desplazamientos obtenidos para la fracción B.

HO

21

3

45

67

89

10

1112

1314

15

16

17

18

19

20

21 22

2324

25 26

27

2829

HO

21

3

45

67

89

10

1112

1314

15

16

17

18

19

20

21 22

23 24

25 26

27

2829

Estigmasterol

β‐sitosterol

Figura 3.3. Espectro de RMN13C de la fracción B y estructuras químicas del

estigmasterol y β-sitosterol.


32

Las estructuras del estigmasterol y β-sitosterol son similares, sólo se diferencian por

la ausencia del enlace doble entre los carbonos 22 y 23 en el β-sitosterol, enlace

doble que sí presenta el estigmasterol. Así, los desplazamientos químicos también

son similares, excepto los δ de los carbonos 22 y 23, y pequeñas diferencias en los

δ de los carbonos vecinos 24, 25 y 26. De esta manera se confirmó la presencia del

β−sitosterol y estigmasterol en los cultivos de células en suspensión de A. indica.

Tabla 3.4. Desplazamientos químicos de C (δC, ppm) del estigmaterol y β−sitosterol

reportados en la literatura y de la fracción B.

No. Carbono δC estigmasterol* δC β-sitosterol* δC fracción B

1 37.5 37.3 37.5 2 32.0 31.6 31.9 3 71.8 71.8 72.0 4 42.8 42.3 42.5 5 141.3 140.8 140.9 6 122.0 121.7 121.8 7 32.3 32.1 32.1 8 32.3 32.1 32.1 9 50.6 50.2 50.4 10 36.8 36.5 36.7 11 21.2 21.1 21.3 12 40.0 39.8 39.9 13 42.8 42.3 42.4 14 57.4 56.8 57.1 15 24.5 24.3 24.6 16 29.1 28.3 29.1 17 56.5 56.1 56.2 18 12.0 12.3 12.3 19 19.6 19.1 19.2 20 40.8 36.2 36.7 21 21.3 18.8 21.5, 19.6 22 138.8 34.0 138.4, 32.1 23 129.8 26.2 124.4, 25.6 24 51.6 45.2 51.4, 42.4 25 32.3 29.2 32.1, 29.9 26 21.4 18.9 21.3, 19.6 27 19.3 19.1 19.1 28 25.6 23.1 25.6, 24.6 29 12.4 11.9 12.5

* Kovganko et al., 1999.


33

Tomando en cuenta la producción de β-sitosterol, estigmasterol y azadiractina en los

cultivos de A. indica y los reportes en la literatura, se propone un esquema de la

biosíntesis de azadiractina a partir del escualeno, en cultivos de células en

suspensión de A. indica (figura 3.4). El escualeno (1) es precursor del 2,3 epóxido

escualeno (2) y éste a su vez es un intermediario para la biosíntesis de β-sitosterol

(3) y estigmasterol (4) (Wentzinger et al., 2002; Arnqvist et al., 2008). Estos dos

últimos compuestos tienen un papel importante en la biosíntesis de esteroles y

triterpenos en plantas (Brown, 1998; Bouvier et al., 2005). Inclusive, un incremento

en la concentración de estigmasterol condujo a una mayor esterificación de algunos

terpenoides en plantas de Arabidopsis (Arnqvist et al., 2008). Algunos limonoides

como la azadiractina (11), presentan varios grupos ésteres en su molécula

(Rasheed, 2002). Además, puede observarse una relación estructural entre (3) y (4)

con los triterpenoides eufol (5) y tirucallol (6), los cuales se proponen como

precursores de los limonoides (Dayanandan y Ponsamuel, 2000; Rasheed, 2002;

Roy y Saraf, 2006). Rasheed (2002) no reporta la participación de (3) y (4) en la

síntesis de limonoides en la planta de A. indica. Sin embargo, debido a la

identificación de ellos en el presente estudio y por las razones mencionadas

anteriormente, se sugiere que (3) y (4) podrían ser precursores de los limonoides en

los cultivos de A. indica en suspensión.

Los “primeros” limonoides son los protolimonoides, tales como el meliantriol (7) y

azadiractol (8) y a partir de éstos se producen los demás grupos de limonoides

(Dayanandan y Ponsamuel, 2000; Rasheed, 2002). Los anillos carbonados de los

compuestos 3, 4, 5, 6, 7 y 8, se conservan en algunos limonoides reportados para A.

indica como nimbucinol (9) y meliatetraolenona (10). El nimbucinol es un precursor

de la azadiractina (11) (Rasheed, 2002). Al encontrarse el β-sitosterol, el

estigmaterol y la azadiractina en los cultivos de células en suspensión, se podría

suponer que también se produjeron limonoides intermediarios o menos complejos

que la azadiractina. En el esquema propuesto se indica la importancia de la

incorporación del oxígeno molecular que debe estar mediado por oxigenasas

(Hayaishi y Nozaki, 1969; Bouvier et al., 2005).


34

HO

HO

OOHHO

OH

HO

(2) Epóxido 2,3 escualeno

O

(1) Escualeno

HO

(3) Sitosterol (4) Estigmasterol

(5) EufolHO

(6) Tirucallol

PRECURSORESDE LIMONOIDES

?

(7) Meliantriol (8) Azadiractol

OHO

O OAc

HOPROTOLIMONOIDES

LIMONOIDES HO

O

OH

OH

OO

OH

OMeO

O

O

O

ORO

HAcOMeOOC

O

O

OH

O OHCOOMe

O

O OH

OH

(10) Meliatetraolenona (11) AzadiractinaAzadirona

(9) Nimbucinol, R=H

O2

O2

Figura 3.4. Esquema propuesto en el presente trabajo para la biosíntesis de

algunos limonoides a partir del escualeno, en cultivos de células en suspensión de

A. indica. Las flechas discontinuas indican más de un paso. Los compuestos entre

cuadros fueron identificados en el cultivo de A. indica.


35

Análisis por CLAR-EM. Con el fin de tener una referencia para la interpretación de

los resultados de la espectrometría de masas, se realizó el análisis del estándar de

azadiractina. Éste mostró la presencia de dos iones con una masa de 703.4 u.m.a

(provenientes probablemente de los isómeros de la azadiractina, A y B). Es decir,

en la ionización, la azadiractina (720 u.m.a) estaría perdiendo de forma neta un

grupo OH (17 u.m.a.). Además, se confirmó el espectro de absorción en UV con un

máximo de absorción en 212 nm (figura 3.5). Como en la espectrometría de masas

utilizada se realizó una ionización “suave” de los compuestos químicos, se deben

obtener también iones con una masa de ± 1 u.m.a. De esta manera, la masa

molecular de los compuestos químicos presentes en las muestras sería igual a

(masa del ión ± 1) ó (masa del ión + 17).

Figura 3.5. Espectro de CLAR – EM del estándar de azadiractina. A. Tiempo de

retención de los componentes presentes en la muestra. B. Espectro en UV. C.

Espectro de masas del compuesto 1. D. Espectro de masas del compuesto 2.

Debido a la presencia de terpenoides, se escogieron las fracciones F, G, J, Mm y

Nm para el análisis por CLAR-EM. Los espectros de masas de estas fracciones

mostraron la presencia de 27 – 32 compuestos diferentes, lo cual es consistente con

los análisis de CLAR, en los cuales se observaron entre 9 – 19 picos o compuestos

diferentes. Al utilizarse un flujo de fase móvil menor (0.2 mL min-1), se logró una

A

DC

B


36

mejor resolución de los espectros. Con base en los pesos moleculares de los

terpenoides producidos por las plantas de A. indica (Rasheed, 2002) y los pesos

moleculares de los iones observados en los espectros de masas, se proponen

algunos compuestos posiblemente presentes en los cultivos celulares (tabla 3.5).

De acuerdo con la tabla, los cultivos de células de A. indica podrían estar

produciendo algunos limonoides de los grupos vilasinina (12), con anillo hemiacetal

(13), salanina (15), azadiractinina (16), azadiractol (17) y azadiractina (11). Teniendo en cuenta estos compuestos y los esquemas de biosíntesis dados por

Rasheed (2002), se indica un esquema de la biosíntesis de algunos limonoides a

partir del grupo azadirona y posiblemente presentes en los cultivos de células de A.

indica (figura 3.6). Las etapas de biosíntesis se basan en los esquemas

presentados por Rasheed (2002), excepto las etapas entre los compuestos (15) a

(16) y (15) a (17). Estos pasos se proponen ya que de acuerdo con Rasheed, la

azadiractina (11) proviene de la salanina (15), y por la similitud estructural, los

compuestos (16) y (17), podrían provenir también de (15).

Se observa que estos son compuestos con estructuras complejas y algunos de ellos

altamente oxidados, como los limonoides de los grupos azadiractina, azadiractinina

y azadiractol. Como se indicó anteriormente, a medida que aumentó la biomasa en

el cultivo, también disminuyó la concentración del oxígeno disuelto desde 46.1 %

(día 0) hasta valores cercanos a cero, 1.4 – 3.4 % (a partir del día 10). Ya que las

oxigenasas insertan átomos de oxígeno a partir del oxígeno molecular (Hayaishi y

Nozaki, 1969; Bouvier et al., 2005), la poca disponibilidad de oxígeno podría explicar

las concentraciones bajas de AZRUV y la no detección de azadiractina a partir del

día 10.


37

Tabla 3.5. Compuestos posiblemente presentes en cultivos de células de A. indica,

de acuerdo con las masas de los iones obtenidos por CLAR-EM.

Fracción tr, min

Absorción max en UV,

nm

Masa ion exp.

Compuestos probables Fórmula Masa

J 16.3 210 a 220 547.2 Limocinina C34H44O6 548

Aza–C1 16.7 212 703.4 Azadiractina C35H44O16 720* F 17.1 210.9 733.2 11β-hidroxizadiractinina C36H46O16 734 1-Tigloi-3-Aceti-11-metoxi-

azadiractinina C36H46O16 734

Aza–C2 17.7 212 703.4 Azadiractina C35H44O16 720*

Nm7 20.2 ND 637 3α-acetoxy-1α-hidroxi-azadiractol

C31H42O14 638

1-detigloil azadiractina o azadiractina E

C30H38O15 638

G 21.6 222.6, 289.9 551.2 1-senecioil-3-acetoxilvilasinina C33H44O7 552 1-tigloil-3-acetilvilasinina C33H4407 552 7-tigloil-12α-acetoxivilasinina C33H44O9 568*

G 22.2 ND 725.5 1α-destigloil-1α-benzoil-azadiractina

C37H42O16 724

J 22.3 210 570.2 3-acetil-7-tigloilvilasinin-lactona C33H46O8 570 Azadiractolido C33H46O8 570 1,3-diacetil-12α-acetoxi-

vilasinina C32H42O9 570

1-senecioil-3-acetilvilasinin-lactona

C33H46O8 570

F 24.2 200, 237.9 753 22,23-dihidro-23β-metoxi-azadiractina o vepaol

C36H48O18 753

F 25.8 210.9, 285.2 600.3 Azadiractanina (grupo vilasinina)

C32H40O11 600

Mm7 27.6 ND 579.2 Salanina C34H44O9 596* Mm7 29.6 210, 265.1,

306.6 679.2 3-demetoxicarbonil-azadiractina

o azadiractina H C33H42O14.2H2O 680

11-hidroxiazadiractina B C33H42O15 678 3-deacetilazadiractina C33H42O15 678 30.1 ND 570.4 3-acetil-7-tigloilvilasinina-

lactona C33H46O8 570

Azadiractólido C33H46O8 570 1,3-diacetil-12α-acetoxi-

vilasinina C32H42O9 570

1-senecioil-3-acetilvilasinina-lactona

C33H46O8 570

G 37 ND 705.4 1-detigloil-1-isovaleroil-azadiractina

C35H46O16 722*

2`,3`-dihidrotigloilazadiractina C35H46O16 722* ND 806.6 3-deacetil-3-cinnamoil-

azadiractina C42H48O16 808

ND. No disponible. Aza, Isómeros de azadiractina. C1, C2, compuestos 1 y 2 observados en espectro de Aza. Exp. Valor experimental. (*) Masa del compuesto obtenida mediante la expresión “masa del compuesto = masa del ión + 17”.


38

Grupo Azadirona(9) Nimbucinol (R=H)

O

O

OR

O

O

O

OH

OMe

C

O

Limonoides con anillo hemiacetal

(13) Limocinina

R1O OR3

OR2

O

O

Grupo Vilasinina(12) Vilasinina (R1=R2=R3=H)

Grupo Nimbina(14) Nimbina (R1=Ac, R2=COOCH3)

R2

O

O

OR1

O

H3COOC

O

O

OR2

R1OO

H3COOC Grupo Salanina(15) Salanina (R1=Ac, R2=Tig)

OR1OMeOOC

OR2

OH

O OR3COOMe

O

O OH

OH

Grupo Azadiractina(11) Azadiractina

(R1=Ac, R2=Tig, R3=H)

OR1OMeOOC

OR2

OH

O HCOOMe

O

O OH

OH

Grupo Azadiractol(17) 3‐tigloil azadiractol

o Azadiractina B(R1=Tig, R2=H)

?

OAcOMeOOC

OR1O OR2

COOMe

OH

O OO OH

Grupo Azadiractinina(16) 1‐tigloil‐3‐acetil‐11‐metoxiazadiractinina

(R1=Tig, R2=Me)

?

Figura 3.6. Esquema de biosíntesis de algunos limonoides a partir del grupo

azadirona, posiblemente presentes en cultivos de células de A. indica. Las etapas

de biosíntesis se basan en los esquemas presentados por Rasheed (2002), excepto

las etapas entre los compuestos (15) a (16) y (15) a (17). Las flechas discontinuas

indican más de un paso. Los compuestos entre cuadros podrían estar presentes, de

acuerdo con el análisis de CLAR-EM.


39

CONCLUSIONES

Las células de A. indica en suspensión cultivadas en un reactor de tanque agitado

produjeron triterpenos y terpenoides entre ellos el estigmasterol, el sitosterol y el

limonoide, azadiractina. Los cultivos podrían estar produciendo también otros

limonoides, algunos de ellos intermediarios de la ruta de biosíntesis de la

azadiractina o con estructuras complejas y altamente oxidadas, como los

compuestos de los grupos de limonoides con anillo hemiacetal, vilasinin, salanin,

azadirachtol, azadiractinina y azadiractina.

REFERENCIAS

Akhyla,A. and Rani,K. (2002). Biosynthesis of some biologically active limonoids in the leaves of Azadirachta indica (The Indian Neem tree). Indian J. Heterocycl. Chem. 11, 299-302.

Arnqvist,L., Persson,M., Jonsson,L., Dutta,P.C., and Sitbon,F. (2008). Overexpression of CYP710A1 and CYP710A4 in transgenic Arabidopsis plants increases the level of stigmasterol at the expense of sitosterol. Planta 227, 309-317.

Balaji,K., Veeresham,C., Srisilam,K., and Kokate,C. (2003). Azadirachtin, a novel biopesticide from cell cultures of Azadirachta indica. J. Plant Biotechnol. 5, 121-129.

Bouvier,F., Rahier,A., and Camara,B. (2005). Biogenesis, molecular regulation and function of plant isoprenoids. Prog. Lipid Res. 44, 357-429.

Brown,G.D. (1998). The biosynthesis of steroids and triterpenoids. Nat. Prod. Rep. 15, 653-696.

Capataz-Tafur,J., Orozco-Sanchez,F., Vergara-Ruiz,R., and Hoyos-Sanchez,R. (2007). Efecto antialimentario de extractos de células en suspensión de Azadirachta indica A. Juss sobre Spodoptera frugiperda J. E. Smith bajo condiciones de laboratorio. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín 60, 3703-3715.

David,A.S.J. and Dayanandan,P. (1997). Identification of terpenoid storage cells of Neem (Azadirachta indica A. Juss). Allelopath. J. 4, 303-312.

Dayanandan,P. and Ponsamuel,J. (2000). Ulltrastructure of terpenoid secretory cells of Neem (Azadirachta indica A. Juss). In Electron Microscopy in Medicine and Biology, P.D.Gupta and H.Yamamoto, eds. (New Delhi: Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd.), pp. 179-195.

Ghiasuddin. (1993). Chemical Studies on the constituents of Azadiractha indica A. Juss. Thesis of Doctor of Philosophy (Chemistry). Research Institute of Chemistry, Intenational Centre for Chemical Sciences University of Karachi.


40

Hayaishi,O. and Nozaki,M. (1969). Nature and mechanisms of oxygenases. Science 164, 389-396.

Kongduang,D., Wungsintaweekul,J., and De-Eknamkul,W. (2008). Biosynthesis of b-sitosterol and stigmasterol proceeds exclusively via the mevalonate pathway in cell suspension cultures of Croton stellatopilosus. Tetrahedron Lett. 4067–4072, 4067-4072.

Kovganko,N.V., Kashkan,Zh.N., and Borisov,E.V. (1999). 13C NMR spectra of sterol derivatives, intermediates in the synthesis of ecdy- and brassinosteroids. Chem. Nat. Compd. 35, 642-645.

Murashige,T. and Skoog,F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-497.

Orozco-Sánchez,F. and Rodríguez-Monroy,M. (2007). Cultivos de células en suspensión de Azadirachta indica para la producción de un bioinsecticida. Rev. Mex. Ing. Quim. 6, 251-258.

Rasheed, M. (2002). Studies on the chemical constituents of Azadirachta indica A. Juss (neem). Thesis of Doctor of Philosophy (Chemistry). Research Institute of Chemistry, International Centre for Chemical Sciences. University of Karachi. Roy,A. and Saraf,S. (2006). Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom. Biol. Pharm. Bull. 29, 191-201.

Schaaf,O., Jarvis,A.P., van der Esch,S.A., Giagnacovo,G., and Oldham,N.J. (2000). Rapid and sensitive analysis of azadirachtin and related triterpenoids from Neem (Azadirachta indica) by high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 886, 89-97.

Terry,L.A., Joyce,D.C., Adikaran,N.K.B., and Khambay,B.P.S. (2004). Preformed antifungal compounds in strawberryfruit and flower tissues. Postharvest Biol. Technol. 31, 201-212.

Wentzinger,L.F., Bach,T.J., and Hartmann,M.A. (2002). Inhibition of squalene synthase and squalene epoxidase in tobacco cells triggers an up-regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Plant Physiol. 130, 334-346.

4. LIMITACIÓN POR TRANSFERENCIA DE OXÍGENO PARA CULTIVAR CÉLULAS DE Azadirachta indica EN MATRACES

INTRODUCCION

Los microorganismos aerobios y las células de las plantas se cultivan en matraces

con diferentes propósitos biotecnológicos, tales como la optimización del medio de

cultivo, elicitación o simplemente el desarrollo de inóculos para biorreactores más

grandes. En cultivos en matraces pueden presentarse producciones bajas de

biomasa y variación en la producción de metabolitos, debido a un suministro de

oxígeno insuficiente (Mantzouridou et al., 2005). Se han publicado varios reportes

acerca de la velocidad de transferencia de oxígeno (OTR por sus siglas en inglés) y

la limitación por oxígeno en cultivos con bacterias, hongos y levaduras. Estos

reportes indican que variables como el tamaño y el volumen de medio de cultivo

contenido en el matraz, la velocidad de agitación y la porosidad del tapón, afectan

los valores de OTR y el metabolismo celular (Veglio et al., 1998; Büchs, 2001;

Nikakhtari y Hill, 2006). Sin embargo, para cultivos de células de plantas, la

determinación de la OTR en matraces y su efecto sobre las células y la producción

de metabolitos ha tenido poca atención, posiblemente porque el consumo de

oxígeno por parte de estas células (10-1 mmol L-1 h-1) es tres o cuatro órdenes de

magnitud menor que el consumido por microorganismos (Kieran et al., 1997) y se ha

supuesto que la OTR no limita el crecimiento de las células de plantas y la

producción de metabolitos.

Para cultivos de células de plantas en matraces se han usado tapones de silicona,

algodón, papel aluminio y polipropileno, entre otros (Lee y Shuler, 1991). Se ha

reportado que el tipo de tapón afecta el metabolismo de las células de plantas y la

composición del espacio gaseoso dentro del matraz. Por ejemplo, células de

Catharanthus rosues cultivadas en matraces tapados con espuma cubierta de

Parafilm® y papel aluminio, tuvieron una acumulación de etileno y CO2, y se

4. Limitación por transferencia de oxígeno en matraces

42

observaron limitaciones de oxígeno (Lee y Shuler, 1991). En este caso, la

producción de ajmalicina sólo se favoreció con papel aluminio. A pesar de esto, no

existe un criterio para escoger el tipo de tapón y no hay disponible información

acerca del posible efecto del papel aluminio u otro tapón y las limitaciones de

oxígeno para cultivos de células de plantas. Además, no se hace un balence de la

OTR y la velocidad de consumo de oxígeno (OUR por sus siglas en inglés).

Los resultados obtenidos en nuestro laboratorio mostraron que varias líneas de

cultivos de células de plantas como Beta vulgaris L. (Rodríguez-Monroy y Galindo,

1999), Solanum chrysotrichum Schltdl. (Rodríguez-Monroy et al., 2004) y Uncaria

tomentosa (Willd) D.C. (Trejo-Tapia et al., 2007) pueden cultivarse por largos

periodos de tiempo en matraces tapados con papel aluminio. Por el contrario, una

línea celular de Azadirachta indica A. Juss incubada en las mismas condiciones

presentó problemas durante los subcultivos; su viabilidad celular y pH disminuyeron

continuamente y fue necesario establecer nuevos cultivos periódicamente en

suspensión a partir de callos. Con el objeto de saber si el poco crecimiento celular

de A. indica en matraces podía deberse a una limitación de oxígeno, en la presente

sección se evaluaron varias condiciones de OTR (0.07, 0.58 y 1.07 kg O2 m-3 día-1)

usando diferentes tipos de tapones (papel aluminio, algodón y espuma de silicona).

Se determinó el comportamiento de A. indica (índice de crecimiento, pH del medio,

viabilidad celular, morfología de los aglomerados y metabolitos secundarios -

azadiractinas) durante el subcultivo en matraces en las condiciones de OTR. Los

resultados indicaron que el oxígeno suministrado al utilizar el papel aluminio, debió

ser insuficiente para satisfacer la OUR de los cultivos en suspensión de A. indica.

Este fenómeno no se presenta para otras especies como B. vulgaris o U. tomentosa

MATERIALES Y METODOS

Cultivos de células de plantas

Cultivos de células de U. tomentosa (Trejo-Tapia et al., 2007), B. vulgaris

(Rodríguez-Monroy y Galindo, 1999), y A. indica (Capataz-Tafur et al., 2007) fueron

mantenidas en medio MS (Murashige y Skoog, 1962) y suplementada con sacarosa


43

como se reportó previamente para cada especie. Los células fueron cultivadas en

matraces Erlenmeyer de Pyrex®, 500 mL y boca angosta (Corning USA, Modelo

4980-500) con 100 mL de medio y subcultivados cada 14 días. Los matraces se

localizaron en un agitador orbital a 120 rpm con un diámetro de órbita de 24 mm a

25 ºC (Vichi México, Modelo 6040).

Efecto del tipo de tapón en cultivos de células de A. indica

Para evaluar el efecto del tipo de tapón sobre el cultivo celular de A. indica se

subcultivaron las células cada siete días durante 6 semanas. Se hicieron

determinaciones de crecimiento celular, pH, tamaño de aglomerados y

azadiractinas. Se usaron tres tipos de tapón: papel aluminio, algodón (pesos de

6.50 ± 0.03 g) y espuma de silicona (Sigma USA, Modelo C1046). El papel aluminio

se puso presionándolo fuertemente contra la boca del matraz. La biomasa se

determinó por medio de filtración de 10 mL de muestras a través de un papel filtro

(Whatman UK, grado 1). Las células se secaron hasta peso constante (70 °C, 1

día). El índice de crecimiento (IC) se calculó con la ecuación (1):

0

0

XXX

IC t −= (1)

Xt es la biomasa en el tiempo t (kg CS m-3) y X0 es la biomasa inicial. CS indica

células secas. La viabilidad celular se determinó considerando la integridad de la

membrana celular mediante la prueba de exclusión del colorante azul de Evans,

0.25 % p/v (Withers, 1985). El tamaño de los aglomerados de las muestras se

observó en un microscopio con enfoque estereoscopio SMZ1500 (Nikon USA). El

contenido de azadiractinas relacionadas por su espectro en UV (AZRUV) se

determinó con base en la metodología presentada en la sección 3 (Aislamiento e

identificación de terpenoides), al final del sexto subcultivo.

Transferencia de oxígeno en matraces

El fenómeno de la transferencia de oxígeno en matraces puede representarse por

medio de la figura 4.1. Las moléculas de oxígeno se difunden a través del tapón del

matraz, y luego desde la fase gaseosa contenida dentro del matraz al seno del

medio líquido.


44

Sensor de oxígenodisuelto

OTRtapón

OTRgas‐liq

po2, aire

po2,int

Co2

Co2,int

Figura. 4.1. Diagrama para la determinación de transferencia de oxígeno en

matraces.

La velocidad de transferencia de oxígeno a través del tapón, OTRtapón (kg O2 m-3 h-1)

se expresa por medio de la siguiente ecuación (Boon y Heijnen, 1998)

( )int,2,21 popokOTR airetapón −= (2)

po2,aire (kg m-1 h-2) es la presión parcial del oxígeno en el aire, po2,int (kg m-1 h-2) es la

presión parcial del oxígeno en la fase gaseosa contenida en el interior del matraz y

k1 es el coeficiente de transferencia de oxígeno a través del tapón (h m-2). La

velocidad de transferencia de oxígeno en la interfase gas – líquido, OTRgas–liq, se

expresa por medio de la ecuación (3) (Doran, 1995)

( )2int,2 CoCoakOTR lliqgas −=− (3)

Co2,lnt (kg m-3) es la concentración de oxígeno en la fase líquida en equilibrio con el

oxígeno en la fase gaseosa contenida en el interior del matraz a la temperatura del

sistema (a po2,int), Co2 es la concentración de oxígeno en la fase líquida (kg m-3) y

kLa es el coeficiente de transferencia de oxígeno en la interfase gas-líquido (h-1).

pO2,int y Co2,int pueden relacionarse con la ley de Henry (Doran, 1995) mediante la

ecuación (4)

int,2int,2 CoHpo ×= (4)

H es la constante de Henry (3.18 * 1013 m2 h-2). Además pO2,aire puede expresarse

por medio de la ecuación (5)


45

*,2,2 aireaire CoHpo ×= (5)

Co2,aire* es la concentración de oxígeno en la fase líquida (medio de cultivo) en

equilibrio con aire a la presión y temperatura del sistema, 6.829 x 10-3 kg O2 m-3

(Doran, 1995). En condición de estado estacionario,

OTROTROTR liqgastapón == − (6)

Así, la ecuación (2) puede igualarse a la ecuación (3) y usando las ecuaciones (4) y

(5) se deduce la siguiente ecuación,

( )2,21

1 * CoCoakHk

HakkOTR aireL

L −+×

××= (7)

Definiendo Ko de la siguiente manera,

akHkHakkKoL

L

+×××

=1

1 (8)

Se obtiene la ecuación (9) para describir la OTR en un matraz con un tapón,

( )2,20 * CoCoKOTR aire −= (9)

Ko es el coeficiente global de transferencia de oxígeno (h-1). La máxima OTR,

OTRmax, está dada por la ecuación (9) cuando Co2 es igual a cero. De este modo,

Ko puede evaluarse usando el método dinámico (Doran, 1995) y midiendo Co2 en el

medio líquido (figura 4.1) contra el tiempo, y de acuerdo con la ecuación (10):

)(ln2,2

,2,2io

ee

iee ttKCoCoCoCo

−=⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

−

− (10)

Co2,ee es la concentración de oxígeno en el medio líquido en estado estacionario,

Co2,i es la concentración de oxígeno en el tiempo inicial (ti) y Co2 es la concentración

de oxígeno en el tiempo t. Los matraces de 500 mL descritos anteriormente se

usaron para realizar estas mediciones. Se usó medio basal MS (Murashige y

Skoog, 1962) suplementado con 30 g sacarosa L-1. El oxígeno disuelto (OD) se

determinó usando un electrodo polarográfico (sensor de oxígeno disuelto Applisens

Z010032520, Applikon Holanda) conectado a un equipo registrador (biocontrolador

ADI 1030, Applikon Holanda). Ko y OTRmax se determinaron usando los mismos

tipos de tapones mencionados anteriormente: papel aluminio, algodón y espuma de

silicona. El kLa también se midió en los matraces pero sin usar tapones y en este

caso Co2,lnt = Co2,aire* (ecuación 3). Las condiciones de agitación fueron las mismas

que se describieron antes.


46

Haciendo una analogía con los sistemas eléctricos, la resistencia total a la

transferencia de oxígeno, Rt (h), es el inverso de Ko y es igual a la resistencia a

través del tapón (R1) más la resistencia a través de la interfase gas – líquido (R2).

Estas resistencias pueden representarse por medio de las siguientes ecuaciones:

211

11 RRHkakHkak

KRt

l

l

o

+=×+

== (11)

HkR

×=

11

1 (12)

akR

L

12 = (13)

Mediciones de OUR de diferentes cultivos de células de plantas

Para conocer el consumo de oxígeno de cada especie de planta, se usó un

biorreactor de tanque agitado de 7 L (Applikon, Holanda) operado con un impulsor

de 6 paletas inclinadas 45º, Di/Dt 0.4 (400 rpm) y con una aireación de 0.08 vvm. El

oxígeno se midió usando el electrodo polarográfico. Se usaron las células en

suspensión cultivadas en matraces (500 mL) para inocular el biorreactor con un

volumen de trabajo de 4 L. La OUR se determinó mediante el método dinámico

(Doran, 1995). Las determinaciones de consumo de oxígeno se hicieron durante la

primera hora después de inocular las células. Los cultivos se sometieron a

condiciones con OD mayor que 30 % para no tener limitaciones por oxígeno (Kieran

et al., 1997). La OUR (kg O2 m-3 día-1) se calculó considerando la variación del OD

con el tiempo, dCo2/dt (sin aireación) y la concentración de biomasa presente en el

biorreactor, de acuerdo con la ecuación (14):

XQOOURdt

dCo×== 2

2 (14)

QO2 representa el consumo específico de oxígeno (kg O2 kg CS-1 día-1) y X es la

concentración de biomasa (kg CS m-3). Graficando Co2 vs. tiempo se puede obtener

OUR (QO2 x X) a partir de del valor de la pendiente de la línea recta.


47

Máximo QO2 permitido por la transferencia de oxígeno en matraces

El máximo consumo de oxígeno que las células pueden tener en un matraz con una

OTRmax particular, puede calcularse con la ecuación QO2,max = OTRmax / X. Así, se

graficó el máximo QO2 (permitido por la transferencia de oxígeno) vs. biomasa, para

matraces tapados con papel aluminio, algodón y espuma de silicona. Estos valores

se compararon con los valores de QO2 medidos en biorreactor sin limitación de

oxígeno.


Los experimentos se realizaron por triplicado y cada muestra fue analizada dos

veces. En las tablas y figuras se reportan los valores medios ± el error estándar.

Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante un análisis de varianza

unifactorial y el test de la diferencia mínima significativa de Fisher (LSD por sus

siglas en inglés) usando Statgraphics para Windows 4.1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto del tipo de tapón en cultivos de células de A. indica

La figura 4.2 muestra que usando algodón y espuma de silicona, la células de A.

indica tuvieron un IC positivo durante los seis subcultivos, con pH entre 4.9 - 5.3 y

viabilidad celular superior a 60 %. Usando papel de aluminio, el IC fue cero en el

cuarto subcultivo y luego fue negativo en el subcultivo 6 (muerte celular). En este

caso, el pH disminuyó desde 5.1 hasta valores menores que 4.0 y la viabilidad

celular disminuyó de 78 % a 16 %. Los cultivos celulares con pH menores que 4.0 y

viabilidades celulares menores que 25 % detuvieron su crecimiento celular. La

figura 4.3 muestra la morfología de los cultivos de A. indica obtenidos en el

subcultivo 6. Es evidente que existieron diferencias en el tamaño de los

aglomerados. Las células cultivadas con papel aluminio estuvieron compuestas por

agregados con un diámetro menor que 1 mm, mientras que los aglomerados en


48

matraces cubiertos con algodón tuvieron un diámetro entre 3 y 5 mm. Finalmente,

los aglomerados obtenidos usando espuma de silicona fueron los más grandes

(hasta 10 mm). En la figura 4.4 se presenta el contenido de azadiractinas (AZRUV)

evaluados en el subcultivo 6. La producción más baja de AZRUV se observó con

papel aluminio (0.52 ± 0.19 mg L-1) y el contenido mayor se observó con tapas de

espuma de silicona (1.51 ± 0.38 mg L-1). Estos dos valores fueron diferentes de

acuerdo con el test LSD de Fisher (p ≤ 0.10). De esta manera, el tipo de tapón

estaría afectando el crecimiento celular, la morfología y el contenido de

azadiractinas, en cultivos de células de A. indica. pH

4,0

4,5

5,0

5,5

AluminioAlgodónEspuma de silicona

Índi

ce d

e cr

ecim

ient

o

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

No. de subcultivos0 1 2 3 4 5 6

Viab

ilida

d (%

)

0

20

40

60

80

100

Figura 4.2. Crecimiento, pH y viabilidad celular evaluados durante subcultivos

continuos de células de A. indica usando diferentes tipos de tapones.


49

Figura 4.3. Tamaño de aglomerados de A. indica obtenidos en matraces usando

diferentes tipos de tapones.

TapónAluminio Algodón Silicona

AZR

UV

(mg

L-1 )

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

a

b

a b

Figura. 4.4. Contenido de azadiractinas (AZRUV) en células de A. indica cultivadas

en matraces usando diferentes tapones. Los valores de AZRUV que tiene la misma

letra no tienen diferencias significativas de acuerdo al test LSD de Fisher (p ≤ 0.10).

Transferencia de oxígeno en matraces

Para conocer si las diferencias observadas (en el crecimiento, morfología y

contenido de azadiractinas) en las células de A. indica cultivadas con diferentes

tapones, pudieron ser una consecuencia de la diferente transferencia de oxígeno, se

midió el coeficiente global de transferencia de oxígeno (Ko) y se calculó la OTRmax

(tabla 4.1).


50

Tabla 4.1. Coeficiente global de transferencia de oxígeno (Ko) y OTRmax en

matraces de 500 mL usando diferentes tapones.

Tapón Ko (h-1) OTRmax

(kg O2 m-3 día-1)

Aluminio 0.42 ± 0.03 a 0.07 ± 0.00 a

Algodón 3.51 ± 0.07 b 0.58 ± 0.01 b

Espuma silicona 6.37 ± 0.17 c 1.04 ± 0.03 c

Los valores medios seguidos por letras diferentes en la misma columna son diferentes de

acuerdo al test LSD de Fisher (p ≤ 0.05).

La OTRmax muestra que la transferencia de oxígeno en matraces, usando papel

aluminio, es 8 y 15 veces menor que la transferencia usando algodón y espuma de

silicona, respectivamente. La figura 4.5 representa las resistencias a la

transferencia de oxígeno usando los diferentes tapones. Estos resultados indicaron

que la resistencia en el tapón representa el 95.4, 60.7 y 31.2 % de la resistencia

total, usando papel aluminio, algodón y espuma de silicona, respectivamente.

Nótese que para aluminio y algodón, la principal resistencia al flujo de oxígeno está

en el tapón y no en la interfase gas – líquido y en ninguno de los tres casos, puede

despreciarse esta resistencia. Algunos investigadores han modelado la resistencia

a la transferencia de masa en matraces (Maier et al., 2004), pero despreciando la

resistencia en el tapón. Esta consideración puede conducir a errores significativos

en los cálculos de la transferencia de oxígeno.


51

TapónAluminio Algodón Silicona

Res

iste

ncia

* 10

(h)

1

2

3

4

21

22

23

24

0

20

25

Rt, totalR2, int g-lR1, tapón

Figura. 4.5. Resistencias a la transferencia de oxígeno en matraces de 500 mL.

120 rpm y 100 mL de medio de cultivo. Resistencia total (Rt), resistencia en el

tapón (R1) y resistencia en la interfase gas – líquido (R2).

Mediciones de OUR para diferentes especies de plantas en biorreactor y

comparación con el QO2, max en matraces

Los siguientes son los valores obtenidos de OUR (kg O2 kg CS-1 día-1): A. indica

0.100 ± 0.016, B. vulgaris 0.027 ± 0.010 y Uncaria tomentosa 0.026 ± 0.005. La

OUR de A. indica fue mayor a la de las otras especies (p ≤ 0.05). Usando los

valores de OTRmax para los diferentes tapones (tabla 4.1), se calculó el QO2, max

permitido por la transferencia de oxígeno, con diferentes concentraciones de

biomasa (figura 4.6). En esta figura también se presenta el QO2 medido en

biorreactor para A. indica y U. tomentosa (líneas horizontales). Estas medidas

fueron realizadas conservando el OD por encima de 30 %, así que puede

considerarse que las células no tuvieron limitación por oxígeno. Se ha reportado un

OD crítico de 15 – 20 % de saturación del aire, para cultivos de células en

suspensión de plantas (Kieran et al., 1997). La intersección de las líneas

horizontales (QO2 medido en biorreactor sin limitación por oxígeno) con las líneas

correspondientes al máximo QO2 permitido por la transferencia de masa usando los

diferentes tipos de tapones en matraces, indica la biomasa celular a partir de la cual

las células tendrían que disminuir su consumo de oxígeno con respecto al consumo


52

en biorreactor. De acuerdo con este análisis (usando el mismo tipo de tapón), los

cultivos celulares de U. tomentosa podrían alcanzar mayores biomasas que A.

indica, antes de que las células disminuyan su actividad metabólica. De este modo,

las células de A. indica tendrían que disminuir la OUR por debajo de 0.100 kg O2 kg

CS-1 día-1 cuando ellas alcanzan una concentración de biomasa mayor que 0.7, 5.7 y

10.4 g CS L-1 en matraces tapados con papel aluminio, algodón y espuma de

silicona, respectivamente. Por otro lado, las células de U. tomentosa deben reducir

el consumo de oxígeno por debajo de 0.026 kg O2 kg CS-1 día-1 cuando ellas

alcanzan una concentración mayor que 2.7, 22.1 g y 40.0 CS L-1 en matraces

tapados con papel aluminio, algodón y espuma de silicona, respectivamente.

Biomasa (gCS L-1)

0 10 20 30 40

QO

2 m

ax *

103 (k

gO2

kgC

S-1

día-

1 )

0

50

100

150

200

250

Aluminio AlgodónEspuma de silicona

QO2 de A. indica en biorreactor

QO2 de U. tomentosa en biorreactor

Figura 4.6. QO2,max (permitido por la transferencia de masa) contra la biomasa de A.

indica y U. tomentosa cultivadas en matraces usando diferentes tapones (aluminio,

algodón y espuma de silicona) y comparación con los valores medidos en

biorreactor.

Es posible hacer un análisis similar pero usando los datos experimentales obtenidos

durante los subcultivos de A. indica con los diferentes tipos de tapones (figura 4.7).

Comparando el QO2, max permitido por la transferencia de masa en matraces con el

QO2 medido en biorreactor, se sugiere que las células de A. indica tuvieron que

reducir su consumo de oxígeno en matraces cubiertos con papel aluminio. Sin

embargo esta disminución es menor con algodón y ocurriría sólo con las tapas de


53

silicona después del segundo subcultivo (biomasa mayor que 11 g CS L-1, dato no

mostrado).

No. de subcultivos0 1 2 3 4 5 6

QO

2 m

ax*1

000

(kgO

2 kg

CS-

1 dí

a-1 )

0

50

100

150

200

AluminioAlgodónEspuma de siliconaQO2 en biorreactor

Figura 4.7. QO2,max (permitido por la transferencia de masa) durante varios

subcultivos de células A. indica en matraces usando diferentes tapones (aluminio,

algodón, espuma de silicona).

La reducción observada en los valores de pH con los cultivos cubiertos con papel

aluminio (figura 4.2), podría ser una consecuencia de acumulación de ácido láctico

causada bajo condiciones de hipoxia o anoxia, la cual se presenta cuando las

células tienen que reducir su actividad metabólica debido a una baja disponibilidad

de oxígeno (Geigenberger, 2003; Tadege et al., 1999). Es posible que las células

de A. indica bajo anoxia no pudieran soportar esta reducción de pH por un largo

periodo de tiempo y que ellas perdieran la viabilidad y murieran. Por otro lado, las

células responderían a muy poca disponibilidad de oxígeno reduciendo el tamaño de

aglomerados (con papel aluminio). Se han observado respuestas morfogénicas

inducidas por estrés en plantas expuestas a una variedad de factores abióticos,

tales como: inundación, sequedad, radiación UV o cambios químicos en los

componentes del suelo (Potters et al., 2007). Así, la reducción en el tamaño de

aglomerados de A. indica podría ser una respuesta morfogénica a muy poco

oxígeno. En Catharanthus roseus se ha observado que el tamaño de aglomerados

afecta la producción de ajmalicina, encontrándose más ajmalicina en los

aglomerados pequeños (< 150 μm) (Keβler et al., 1999). Los mismos autores hacen


54

referencia de una ecuación matemática para calcular el diámetro máximo de un

aglomerado celular con una respiración no limitada por oxígeno, indicando que el

diámetro de aglomerado es proporcional a la raíz cuadrada de la concentración

superficial de oxígeno. Estas observaciones fueron hechas bajo las mismas

condiciones de suministro de oxígeno. La relación entre el tamaño de los

aglomerados y la concentración superficial de oxígeno está de acuerdo con las

observaciones realizadas en el presente estudio para A. indica. Una OTRmax mayor

debe estar relacionada con una concentración mayor de oxígeno en el medio líquido

y permitir a su vez aglomerados más grandes, como sucedió en los matraces con

tapones de espuma de silicona. En cuanto a los metabolitos secundarios, el mayor

contenido de AZRUV con estos tapones, podría estar relacionado con cierta

diferenciación celular (Zhao et al., 2003) o con un mejor suministro de oxígeno, lo

cual podría conducir a la mayor producción de las azadiractinas.

U. tomentosa y B. vulgaris no perdieron su viabilidad en los matraces con papel

aluminio (datos no mostrados), aunque estas especies sólo consumieron el 25 % del

oxígeno que consumió A. indica. Estas dos especies podrían adaptarse más

fácilmente a bajas condiciones de oxígeno. Los resultados obtenidos en el presente

trabajo concuerdan con estudios previos en tejidos de plantas (Geigenberger, 2003),

los cuales mostraron que las células pueden reducir el consumo de oxígeno cuando

la concentración de oxígeno externo cae o cuando la concentración de oxígeno

dentro del tejido disminuye, aún en atmósferas bien oxigenadas. Las plantas

pueden reducir la velocidad de respiración, los procesos biosintéticos, la

degradación de proteínas o modificar su morfología para evitar anoxia interna, y sólo

cuando la concentración de oxígeno está cercana a cero, ellas activan la lactato

deshidrogenasa y la alcohol deshidrogenasa para la producción de ATP aneróbico

(Geigenberger, 2003). De esta manera, los resultados obtenidos en los matraces

cubiertos con papel aluminio, de menor tamaño de aglomerados y bajo contenido de

AZRUV, podrían estar relacionados con el poco suministro de oxígeno y una

reducción en el proceso biosintético.

Los resultados obtenidos en este trabajo, muestran que es necesario analizar el

consumo de oxígeno de las diferentes especies de plantas, para el establecimiento

in vitro de un nuevo cultivo celular o en un proceso de escalado. Si el cultivo de


55

células de plantas tiene un alto consumo de oxígeno, debería estudiarse el efecto de

una baja OTR en el metabolismo primario y secundario, y su morfología, ya que

podría limitarse el crecimiento y el metabolismo secundario. Para incrementar la

OTR en matraces puede ser necesario modificar el tipo de tapón u otras variables

que afectan la OTR (e.g. volumen del medio de cultivo en el matraz o la velocidad

de agitación).

CONCLUSIONES El tipo de tapón usado en matraces ofrece diferentes OTR. De acuerdo con el tipo

de tapón usado, los cultivos de células de plantas en matraces pueden presentar

limitaciones por oxígeno. Si la OTR ofrecida por el matraz es demasiado baja, las

células pueden reducir su viabilidad y el metabolismo secundario, especialmente si

la especie vegetal tiene una alta OUR. Este es el caso de células de A. indica

cultivadas en matraces usando papel aluminio. En esta condición, el análisis de

OUR indicó que el oxígeno es insuficiente para satisfacer la OUR de células de A.

indica (0.100 kg O2 kg CS-1 día-1), pero no para otras especies como Beta vulgaris y

Uncaria tomentosa, las cuales pueden crecer por un largo periodo de tiempo en

matraces cubiertos con papel aluminio.

REFERENCIAS

Boon,M. and Heijnen,J.J. (1998). Gas-liquid mass transfer phenomena in bio-oxidation experiments of sulphide minerals: A critical review of literature data. Hydrometallurgy 48, 187-204.

Büchs,J. (2001). Introduction to advantages and problems of shaken cultures. Biochem. Eng. J. 7, 91-98.

Capataz-Tafur,J., Orozco-Sanchez,F., Vergara-Ruiz,R., and Hoyos-Sanchez,R. (2007). Efecto antialmentario de extractos de suspensiones celulares de Azadirachta indica sobre Spodoptera frugiperda J. E. Smith bajo condiciones de laboratorio. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín 60, 3703-3715.

Doran,P. (1995). Bioprocess engineering principles. Academic Press. (London: Academic Press).

Geigenberger,P. (2003). Response of plant metabolism to too little oxygen. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 247-256.


56

Kebler,M., ten Hoopen,H.J.G., and Furusaki,S. (1999). The effect of the aggregate size on the production of ajmalicine and tryptamine in Catharanthus roseus suspension culture. Enzyme Microb. Technol. 24, 308-315.

Kieran,P.M., MacLoughlin,P.F., and Malone,D.M. (1997). Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. J. Biotechnol. 59, 39-52.

Lee,C.W.T. and Shuler,M.L. (1991). Different shake flask closures alter gas phase composition and ajmalicine production in Catharanthus roseus cell suspensions. Biotechnol Techniq 5, 178.

Maier,U., Losen,M., and Büchs,J. (2004). Advances in understanding and modeling the gas-liquid mass transfer in shake flasks. Biochem. Eng. J. 17, 155-167.

Mantzouridou,F., Roukas,T., and Achatz,B. (2005). Effect of oxygen transfer rate on [beta]-carotene production from synthetic medium by Blakeslea trispora in shake flask culture. Enzyme Microb. Technol. 37, 687-694.

Murashige,T. and Skoog,F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15, 473-497.

Nikakhtari,H. and Hill,G.A. (2006). Closure effects on oxygen transfer and aerobic growth in shake flasks. Biotechnol. Bioeng. 96, 15-21.

Potters,G., Pastarnak,T., Guisez,Y., and Palme,K. (2007). Stress-induced morphogenic respondes: growing out of trouble? Trends Plant Sci. 12, 98-105.

Rodríguez-Monroy,M., Trejo-Espino,J.L., Jiménez-Aparicio,A., Morante,M., and Trejo-Tapia,G. (2004). Evaluation of morphological properties of Solanum chrysotrichum cell cultures in a shake flask and fermentor and rheological properties of broths. Food Technol. Biotechnol. 42, 153-158.

Rodríguez-Monroy,M. and Galindo,E. (1999). Broth rheology, growth and metabolite production of Beta vulgaris suspension culture: a comparative study between cultures grown in shake flasks and in a stirred tank. Enzyme Microb. Technol. 24, 687-693.

Tadege,M., Dupuis,I., and Kuhlemeier,C. (1999). Ethanolic fermentation: new functions for an old pathway. Trends Plant Sci. 4, 320-235.

Trejo-Tapia,G., Sepúlveda-Jiménez,G., Trejo-Espino,J.L., Cerda-García-Rojas,C.M., De la Torre,M., Rodríguez-Monroy,M., and Ramos-Valdivia,A.C. (2007). Hydrodynamic stress induces monoterpenoid oxindole alkaloid accumulation by Uncaria tomentosa (Willd) D. C. cell suspension cultures via oxidative burst. Biotechnol. Bioeng. 98, 230-238.

Veglio,F., Beolchini,F., and Ubaldini,S. (1998). Empirical models for oxygen mass transfer: a comparison between shake flask and lab-scale fermentor and application to manganiferous ore bioleaching. Process Biochem. 33, 367-376.

Withers,L.A. (1985). Cryopreservation and storage of germplasm. In Plant cell culture, a practical approach, R.A.Dixon, ed. (Oxford: IRL Press), pp. 169-192.

Zhao,D., Huang,Y., Jin,Z., Qu,Z., and Lu,D. (2003). Effect of aggregate size in cell cultures of Saussurea medusa on cell growth and jaceosidin production . Plant Cell Rep. 21, 1129-1133.

5. EFECTO DE LA VELOCIDAD DE TRANSFERENCIA DE OXÍGENO EN BIORREACTORES CON CÉLULAS DE Azadirachta indica

INTRODUCCIÓN Los cultivos de células vegetales en biorreactores ofrecen un potencial para el

estudio y la producción de metabolitos secundarios, con aplicaciones en la industria

química, farmacéutica o alimenticia. En estos sistemas se pueden controlar

diversas variables que afectan el crecimiento celular y la producción de metabolitos

secundarios, de tal manera que es posible establecer cultivos de células en

suspensión con una producción de metabolitos secundarios comparable a la de la

planta (Sajc et al., 2000). Sin embargo, para escalar estos sistemas a nivel piloto o

industrial deben solucionarse una serie de problemas tanto de operación del reactor

como de la expresión del metabolismo deseado de la especie vegetal. Por ejemplo,

las suspensiones de células vegetales tienden a crecer en forma de aglomerados y

producen caldos con comportamientos reológicos complejos; las características

operacionales y de diseño de los biorreactores, así como las dimensiones, el

sistema de aireación o el tipo de agitador, influencian el crecimiento celular y la

formación de algunos productos de interés (Doran, 1999; Sajc et al., 2000; Orozco-

Sánchez y Rodríguez-Monroy, 2007).

A diferencia de muchos cultivos microbianos donde se cuenta con estudios

ingenieriles y bioquímicos para definir los efectos de ciertas variables de operación

de los biorreactores sobre el metabolismo celular, para células vegetales existe la

necesidad de investigar más estas variables y comprender sus efectos, antes de

proponer condiciones para escalar estos sistemas. Por ejemplo, la disponibilidad de

oxígeno afecta tanto el metabolismo primario como el metabolismo secundario de

las células vegetales (Geigenberger, 2003) y muchas de las variables de operación

del biorreactor (e.g. tipo y velocidad del impulsor, flujo y composición del gas de

entrada, tipo de difusor), están relacionadas con la transferencia de oxígeno.

5. Efecto de la velocidad de transferencia de oxígeno

58

Algunos estudios que analizan el efecto de las variables de operación sobre el

crecimiento celular y la producción de metabolitos reportan lo siguiente: en cultivos

de Panax ginseng se observó que una concentración de oxígeno del 40 %, fue

adecuada para el crecimiento celular y la producción de saponinas, pero

concentraciones mayores y menores al 40 % fueron desfavorables sobre ambas

parámetros (Nguyen et al., 2006). En cultivos de Stizolobium hassjoo productores

de L-DOPA (Huang et al., 2002) y en cultivos de Taxus chinensis que sintetizan

taxanos (Zhong et al., 2002) se evaluó el efecto de variables de operación del

reactor (flujo de aire, velocidad de agitación y tipo de impulsor) sobre el kLa y

mediante la manipulación de estas variables, se obtuvieron suministros de oxígeno

con los cuales se favoreció la producción de biomasa y los metabolitos de interés. A

pesar de lo anterior, en ninguno de estos estudios se presentan cálculos de la

cantidad de oxígeno que se suministra a las células, ni de la velocidad de

transferencia de oxígeno en los cultivos (OTR). Tampoco se conocen estudios

donde se analice si el suministro de oxígeno es adecuado para satisfacer la

demanda de oxígeno de las células vegetales o su relación con la velocidad de

consumo de oxígeno por parte de las células (OUR).

El uso de los números adimensionales Damköhler modificado (Da) y factor de

efectividad de consumo de oxígeno (n) propuestos para sistemas microbianos (Çalik

et al., 2004; Gómez et al., 2006), pueden ser una herramienta de gran utilidad para

entender fenomenológicamente la relación de la OTR y la OUR. Es decir,

determinar si el proceso está limitado por la velocidad de la transferencia de oxígeno

desde la fase gaseosa al seno del medio de cultivo, o por la velocidad de consumo

de oxígeno por parte de las células, esto es, la velocidad de las reacciones

bioquímicas que consumen oxígeno (Çalik et al., 2004; Gómez et al., 2006). Da

está definido como la relación entre la máxima velocidad posible de utilización de

oxígeno (OURmax) y la máxima velocidad de transferencia de masa (OTRmax).

max

max

OTROUR

Da = (1)

Los valores de Da indican la velocidad relativa de la reacción bioquímica de

consumo de oxígeno contra el transporte de masa. Cuando Da >1, bien sea porque


59

QO2 es grande o porque algún factor en las ecuaciónes de transferencia de masa,

definidas en la sección 4, kLa(Co2* - Co2) ó Ko(Co2

* - Co2), es pequeño, la velocidad

de consumo de oxígeno en las reacciones bioquímicas son mayores que la

velocidad de transferencia de masa. Por otro lado, cuando Da < 1, bien sea porque

QO2 es pequeño o porque algún factor de la ecuación de transferencia de masa es

grande, la velocidad de transferencia de masa es mayor que la velocidad de

reacción bioquímica. Adicionalmente, la utilización de oxígeno puede ser analizada

mediante el factor de efectividad de consumo de oxígeno el cual se expresa por la

razón entre la velocidad de reacción bioquímica observada (OUR) y la velocidad de

reacción bioquímica sin resistencia a la transferencia de masa (OURmax) (Gómez et

al., 2006):

maxOUROURn = (2)

Azadirachta indica A. Juss es una especie de interés para estudios biotecnológicos

por cultivo de células vegetales, porque produce terpenoides (como las

azadiractinas y otros limonoides) con actividades insecticidas y terapéuticas

(Orozco-Sánchez y Rodríguez-Monroy, 2007; Prakash y Srivastava, 2008). El

objetivo de la presente sección es analizar el efecto de OTRmax sobre el crecimiento

celular, la producción de azadiractinas y la OUR, en cultivos de células de A. indica.

Además, evaluar la relación entre OTR y OUR mediante los números Da y n, y sus

implicaciones en el crecimiento y la producción de azadiractinas. Para suministrar

diferentes cantidades de oxígeno a las células, se definieron condiciones de

operación en un biorreactor tipo tanque agitado, variando el tipo de difusor y la

concentración de oxígeno en el gas de entrada y en matraces Erlenmeyer, usando

varios tipos de tapones. Se analizaron las relaciones de crecimiento celular y

azadiractinas contra la OTRmax. Finalmente, mediante los números Da y n, se trató

de diferenciar condiciones de operación de biorreactores donde el proceso pudiera

estar limitado por la transferencia de masa o por las reacciones bioquímicas de

consumo de oxígeno.


60

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de células de A. indica A. Juss

Las células de A. indica se cultivaron en matraces Erlenmeyer (500 mL) conteniendo

100 mL de medio y usando tapones de algodón, bajo las condiciones y con el medio

de cultivo indicados en la sección 3.

Medición de OUR, kLa y OTRmax en el biorreactor de tanque agitado

Las mediciones del coeficiente de transferencia de oxígeno (kLa), OTRmax y OUR

fueron realizadas mediante el método del “desgaseo” o método dinámico (Doran,

1995). El oxígeno disuelto (OD) se midió usando un electrodo polarográfico con un

tiempo de respuesta del electrodo menor a 30 segundos (Applisens Z010032520,

Applikon Holanda) y conectado a un aparato registrador (biocontrolador 1030

Applikon, Holanda). La OUR (kg O2 m-3 día-1) se calculó considerando la variación

del oxígeno con el tiempo, la biomasa presente en el biorreactor y de acuerdo con

la siguiente ecuación:

XQOOURdt

dCo×== 2

2 (3)

Siendo QO2 el consumo específico de oxígeno (kg O2 kg CS-1 día-1) y X la biomasa

(kg CS m-3). CS son células secas y cuando se indique, CSV, son células viables

secas. Así, mediante un gráfico de Co2 contra el tiempo, se calculó la pendiente de

la línea recta, la cual corresponde a la OUR (QO2 x X). Luego de reestablecer la

aireación, la variación de oxígeno con el tiempo puede representarse mediante la

siguiente ecuación:

( ) XQoCoCoakdt

dCoL ×−−= 22

*2

2 (4)

En la cual, Co2 es la concentración de oxígeno en el medio del cultivo (kg O2 m-3) y

Co2* la concentración de oxígeno en la interfase gas – líquido en equilibrio con aire

(kg O2 m-3). Aproximando los diferenciales a deltas y como Co2 es proporcional a

OD (%), la ecuación (4) puede reorganizarse para obtener la ecuación (5),


61

( )ODak

bXQoCoak

tOD

LL ×−

×−×=

ΔΔ 2

*2

(5)

Siendo b, la constante de proporcionalidad entre Co2 y OD (6.829 x 10-5 kg O2 m-3

%-1) y puede calcularse con base en la composición del medio de cultivo y las

condiciones de temperatura y presión de trabajo (Doran, 1995). kLa puede

calcularse como la pendiente de la línea ΔOD/Δt vs OD. La OTR puede calcularse

mediante la ecuación (6)

( )2*

2 CoCoakOTR L −= (6)

La OTRmax se presenta cuando Co2 es igual a cero.

Condiciones de operación del biorreactor de tanque agitado

Las suspensiones celulares fueron cultivadas en un sistema de biorreactor

(Applikon, Holanda). Un tanque agitado de 7 L se operó con 4 L de medio de cultivo,

un impulsor de 6 paletas inclinadas a 45º, 400 rpm, relación Di/Dt (0.4) y 0.08 vvm

de gas de entrada. El OD y el pH se monitorearon con electrodos y los valores

fueron registrados con el biocontrolador ADI 1030. El pH fue controlado en un valor

de 5.8 adicionando NaOH 0.3 M. Se definieron tres condiciones de operación del

biorreactor para suministrar diferentes cantidades de oxígeno al cultivo celular:

difusor de acero inoxidable sinterizado (gas de entrada 6.2 y 21 % O2) y difusor

difusor de 7 orificios (gas de entrada 21 % O2). En cada una de estas condiciones

de operación se evaluó el kLa y la OTRmax. La figura 5.1 presenta el impulsor y los

difusores utilizados.


62

Figura 5.1. Impulsor y difusores usados en el biorreactor de tanque agitado. A.

Impulsor de 6 paletas inclinadas 45º. B. Difusor de 6 orificios. C. Difusor de acero

inoxidable sinterizado.

Evaluación de variables en los cultivos

Se tomaron muestras de 50 mL del reactor (cada tres días) y se determinó el

crecimiento celular, la producción de azadiractina, azadiractinas relacionadas por su

espectro en UV (AZRUV), el QO2, el kLa y la OTRmax. El crecimiento celular, la

producción de azadiractina y AZRUV se evaluaron de acuerdo con las metodologías

presentadas en la sección 3. La viabilidad celular se evaluó de acuerdo con el

procedimiento de la sección 4.

Condiciones de cultivo y mediciones en matraces Erlenmeyer

Se integraron los resultados de los experimentos en matraces presentados en la

sección 4: valores del coeficiente global de transferencia de oxígeno (Ko), OTRmax,

índice de crecimiento (IC) y AZRUV, evaluados con los tres tipos de tapones (papel

aluminio, algodón y espuma de silicona).


Los experimentos se realizaron por duplicado y cada muestra fue analizada dos

veces. En las tablas y figuras se reportan los valores medios ± el error estándar.

Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante análisis de varianza y mediante

el test de la diferencia minima significativa (LSD) de Fisher, con un nivel de

confianza del 95 %.


63

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Caracterización de las condiciones de operación del biorreactor

En las condiciones de operación del biorreactor tipo tanque agitado, definidas para

suministrar diferentes cantidades de oxígeno, se midió el kLa y se calculó la OTRmax.

Las mediciones se hicieron durante toda la cinética de crecimiento celular y los

valores medios se reportan en la tabla 5.1. De manera similar, se evaluó el Ko y la

OTRmax para las condiciones de cultivo en matraces Erlenmeyer. La tabla 5.1

presenta la OTRmax y el coeficiente de transferencia de oxígeno característico (kc), el

cuál está dado para el biorreactor de tanque agitado por el kLa y para los matraces

Erlenmeyer por el Ko.

Tabla 5.1. Coeficiente de transferencia de oxígeno característico (kc) y OTRmax de

los tratamientos con células de A. indica en biorreactores.

Condición del biorreactor kc (h-1) OTRmax

(kg O2 m-3 día-1)

Tanque agitado - difusor poroso, 21 % O2 37.9 ± 1.0 a 6.21 ± 0.17 a

Tanque agitado - difusor poroso, 6.2 % O2 36.4 ± 1.4 a 1.70 ± 0.07 b

Tanque agitado - difusor 7 orificios, 21 % O2 5.6 ± 0.3 b 0.92 ± 0.05 c

Matraz Erlenmeyer – tapón espuma silicona 6.37 ± 0.2 c 1.04 ± 0.03 d

Matraz Erlenmeyer – tapón algodón 3.51 ± 0.1 d 0.58 ± 0.01 e

Matraz Erlenmeyer – tapón aluminio 0.42 ± 0.0 e 0.07 ± 0.00 f

Los valores medios seguidos por letras diferentes en la misma columna son diferentes de acuerdo con el test LSD de Fisher (p ≤ 0.05).

En los matraces, el cambio del tapón afectó significativamente la transferencia de

oxígeno. En el tanque agitado, el cambio del difusor poroso por el difusor de 7

orificios (con 21 % O2) disminuyó la velocidad de transferencia de oxígeno 6.8

veces. Además, la disminución en la concentración de oxígeno del gas de entrada

del reactor de 21 a 6 % (con el difusor poroso) disminuyó la velocidad de

transferencia 3.6 veces. Este resultado es consistente con el reportado por otros

investigadores (Martín et al., 2008), quienes observaron que el tamaño y la dinámica

de las burbujas dentro del biorreactor de tanque agitado, están relacionados con el


64

flujo de gas, tipo del difusor, diámetro de orificio, tipo de agitador y velocidad de

agitación. Estos factores a su vez afectan la velocidad de transferencia de oxígeno.

En algunos reportes de la literatura se evalúan parámetros que afectan la velocidad

de transferencia de oxígeno en biorreactores con células vegetales, como el tipo de

impulsor, velocidad de agitación o composición del gas de entrada (Huang et al.,

2002; Zhong, 2002; Nguyen et al., 2006; Prakash y Srivastava, 2006). Sin embargo,

pocos investigadores en esta área mencionan el tipo de difusor usado.

Dinámica de variables de proceso durante las fermentaciones

La figura 5.2 presenta la concentración de oxígeno en el gas de entrada del reactor,

OD y kLa durante los experimentos en el biorreactor de tanque agitado. Dos

tratamientos (difusor poroso y difusor de 7 orificios) se realizaron con aire (21 %) y

el tercer tratamiento (difusor poroso) con una mezcla de aire y nitrógeno (6.2 ± 0.3

%) (figura 5.2 A). La variación del OD en un cultivo se da como respuesta a la OTR

del sistema y a la OUR de las células (Gómez et al., 2006) y a medida que avanza

la fermentación, el OD debe disminuir si las células incrementan su consumo de

oxígeno. Así, en todos los casos se presentó una disminución en el OD (figura 5.2

B). Aunque en el tratamiento de 6.21 kg O2 m-3 día-1, se observa un aumento en el

OD a partir del día 7, lo cual indicaría una disminución en el consumo de oxígeno.

El kLa disminuyó a medida que avanzaba la fermentación con una OTR de 6.21 y

1.70 kg O2 m-3 día-1 (figura 5.2 C). En el caso de la OTR de 0.92 kg O2 m-3 día-1, el

OD cayó por debajo del 10 % a partir del día 7 y no fue posible seguir utilizando el

método dinámico para la medición del kLa. Esta medición requiere

aproximadamente una variación de 15 unidades de oxígeno (%). Se reporta en la

literatura que el kLa en un cultivo puede incrementarse si hay una mejora en el

transporte debido a la presencia o al consumo de oxígeno de las células o de los

microorganismos; o puede reducirse indicando un efecto de “bloqueo físico”, esto

es, un aumento en la resistencia a la transferencia de oxígeno debido a la adsorción

celular sobre la superficie de las burbujas (García-Ochoa y Gómez, 2009). De esta

forma, la disminución en el kLa en el presente trabajo sugiere que hubo una

tendencia a “bloquearse” la transferencia de oxígeno a medida que avanzaba la

fermentación.


65

O2

entr

ada

reac

tor (

%)

0

5

10

15

20

25

6.21 kg O2 m-3día-1

1.700.92

Oxí

geno

dis

uelto

(%

)

0

20

40

60

80

100

Tiempo (día)0 5 10 15 20

k La

(h-1

)

0

10

20

30

40

50

A

B

C

Figura 5.2. Dinámica de variables de proceso en cultivos de células de A. indica en

un biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax. El oxígeno de

entrada (%) de los tratamientos 6.21 y 0.92 kg O2 m-3 día-1 se superponen en el

panel A.


66

Efecto de la OTR sobre las cinéticas de crecimiento celular de A. indica y la

producción de azadiractinas en un biorreactor de tanque agitado

La figura 5.3 presenta la cinética de crecimiento considerando la biomasa total

(viable y no viable), la biomasa viable y la viabilidad de los cultivos bajo diferentes

condiciones en el biorreactor. Hasta el día 12 no se observaron diferencias en la

producción de biomasa total, pero sí se presentaron diferencias significativas en la

producción de biomasa viable y en la viabilidad celular (p ≤ 0.05). La biomasa

viable casi se duplicó en los niveles de OTR de 6.21 y 1.70 kg O2 m-3 día-1, mientras

que con la OTR de 0.92 kg O2 m-3 día-1, ésta presentó un aumento de 4.2 veces en

el día 19. Este comportamiento está relacionado con la viabilidad celular. Con la

OTR de 0.92 kg O2 m-3 día-1, se observaron viabilidades superiores al 61 %,

mientras que en los otros tratamientos de OTR la viabilidad disminuyó

considerablemente, alcanzando 20 % a los 14 días con 6.21 kg O2 m-3 día-1.


67

Bio

mas

a to

tal (

g C

S L-1

)

2

4

6

8

10

12

14

16

Bio

mas

a vi

able

(g C

SV L

-1)

2

4

6

8

10

12

6.21 kg O2 m-3 día-1

1.70 0.92

Tiempo (día)

0 5 10 15 20

Viab

ilida

d (%

)

0

20

40

60

80

A

B

C

Figura 5.3. Efecto de OTRmax sobre la cinética de crecimiento considerando la

biomasa total (A), la biomasa viable (B) y la viabilidad (C) de células de A. indica en

un biorreactor de tanque agitado


68

Las tablas 5.2 y 5.3 presentan la producción total (intra y extracelular) de

azadiractina y de AZRUV. La OTRmax no tuvo un efecto significativo sobre la

producción de azadiractina y sólo se obtuvo una concentración mayor de este

compuesto al final de la fermentación (día 10) con 6.21 kg O2 m-3 día-1 (p ≤ 0.05).

Por el contrario, la OTRmax sí tuvo un efecto sobre la producción de AZRUV

encontrándose también las mayores concentraciones de estos compuestos al final

de la fermentación en el tratamiento con 6.21 kg O2 m-3 día-1 (p ≤ 0.05), es decir, con

la más alta disponibilidad de oxígeno.

Tabla 5.2. Producción de azadiractina en cultivos de células de A. indica en un

biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax.

Tiempo (día) Azadiractina (mg L-1) 0.92 kg O2 m-3 día-1 1.70 kg O2 m-3 día-1 6.21 kg O2 m-3 día-1

0 0.1 0.1 ± 0.0 a 0.1 ± 0.0 a3 0.3 0.1 ± 0.0 a 0.2 ± 0.1 a 7 0.0 0.3 ± 0.1 ab 0.2 ± 0.0 a

10 0.1 0.1 ± 0.0 a 0.8 ± 0.5 b 14 0.0 0.0 ± 0.0 a 0.4 ± 0.3 ab 21 0.0 ND ND

El análisis de azadiractina no tuvo replicas en el nivel de 0.92 kg O2 m-3 día-1. ND. No disponible. Los valores de azadiractina que tienen la misma letra no tienen diferencias significativas de acuerdo al test LSD de Fisher (p ≤ 0.05). Tabla 5.3. Producción de azadiractinas (AZRUV) en cultivos de células de A. indica

en un biorreactor de tanque agitado con diferentes valores de OTRmax.

Tiempo (día) AZRUV (mg L-1) 0.92 kg O2 m-3 día-1 1.70 kg O2 m-3 día-1 6.21 kg O2 m-3 día-1

0 1.6 ± 0.9 ab 1.2 ± 0.3 a 2.8 ± 0.5 abcd 3 2.3 ± 1.0 abc 2.9 ± 0.7 abcd 3.0 ± 0.6 abcd 7 0.5 ± 0.2 a 2.7 ± 0.9 abc 3.9 ± 1.2 bcd

10 0.5 ± 0.3 a 1.7 ± 0.1 ab 4.8 ± 1.8 cd

14 0.7 ± 0.5 a 1.7 ± 0.8 ab 5.3 ± 1.8 d

21 0.5 ± 0.5 a ND ND ND. No disponible. Los valores de AZRUV que tienen la misma letra no tienen diferencias significativas de acuerdo al test LSD de Fisher (p ≤ 0.05).


69

Análisis del crecimiento de células de A. indica y producción de AZRUV en función

de la OTRmax

La relación entre el crecimiento celular y la producción de azadiractinas con la

OTRmax, se muestra en las figuras 5.4 y 5.5. Para este análisis se tomaron los

valores obtenidos en el día 14 de los tratamientos realizados en el biorreactor de

tanque agitado y los valores del sexto subcultivo de A. indica en matraces con los

diferentes tipos de tapones (sección 4). En la figura 5.4 se observa el

comportamiento del IC calculado con base en la biomasa total y biomasa viable, y la

viabilidad celular. El IC calculado con la biomasa total tuvo una tendencia a

aumentar con la OTRmax, desde valores negativos (en 0.07 kg O2 m-3 día-1) hasta

valores cercanos a 2 (en 1.70 kg O2 m-3 día-1). La producción de biomasa viable

presentó valores de IC positivos entre 0.58 y 1.70 kg O2 m-3 día-1, fue cercano a cero

en 6.21 kg O2 m-3 día-1 y negativo en 0.07 kg O2 m-3 día-1, indicando en el último

caso muerte celular. Por su lado, la viabilidad celular tuvo un comportamiento con

una menor dispersión y una función pico muy bien definida. De esta manera,

valores de OTRmax en el intervalo 0.58 - 1.04 kg O2 m-3 día-1 permitieron obtener

cultivos con IC de biomasa viable entre 0.9 y 3.4, que corresponden a viabilidades

celulares superiores al 60 %.


70

IC b

iom

asa

tota

l

-1

0

1

2

3

4

5

IC b

iom

asa

viab

le

-1

0

1

2

3

4

5

OTRmax (kg O2 m-3día-1)

0 1 2 3 4 5 6

Viab

ilida

d ce

lula

r (%

)

0

20

40

60

80

Matraz ErlenmeyerReactor tanque agitado

A

B

C

Figura 5.4. Relación entre el crecimiento celular y la OTRmax en cultivos de células

de A. indica. Índice de crecimiento (IC) de biomasa total (A), biomasa viable (B) y

viabilidad celular (C).


71

La figura 5.5 presenta la relación entre la producción de AZRUV y la OTRmax en los

cultivos. El comportamiento lineal sugiere que la producción de AZRUV se puede

incrementar con el aumento de la OTR en el intervalo de estudio y se obtuvo la

siguiente ecuación para relacionar estas variables:

AZRUV=0.7710 x OTRmax+0.5308 r2 = 0.9965

OTRmax (kg O2 m-3día-1)

0 1 2 3 4 5 6

Aza

dira

ctin

as A

ZRU

V (m

g L-1

)

0

2

4

6

8

Matraz ErlenmeyerReactor tanque agitado

Figura 5.5. Relación entre la producción de azadiractinas (AZRUV) y la OTRmax en

cultivos de células de A. indica.

La presente investigación puede considerarse pionera en este campo, ya que no se

encontraron reportes que evalúen el efecto de la OTR sobre el crecimiento celular o

el metabolismo secundario en cultivos de células vegetales. En algunos trabajos se

ha estudiado el efecto de variables relacionadas con la transferencia de oxígeno.

En cultivos de Taxus chinensis la limitación de oxígeno por un mezclado

insuficiente, disminuyó la producción de biomasa y taxuyunannina (Zhong et al.,

2002). Células de Stizolobium hassjoo incrementaron tanto el crecimiento celular

como la producción de L-DOPA cuando se aumentó la velocidad de agitación de un

impulsor Maxblend (Huang et al., 2002). Cultivos de Panax ginseng incrementaron

tanto la producción de biomasa como de ginsenósidos cuando se aumentó la

concentración de oxígeno del gas de entrada del reactor de 21 a 40 %, pero estas

variables disminuyeron cuando la concentración de O2 se aumentó a 50 % (Nguyen

et al., 2006). Sin embargo, en ninguno de estos reportes se cuantifica la cantidad


72

de oxígeno suministrada a los cultivos y como se mostró, una sola modificación en

el biorreactor (como el cambio del difusor) puede variar considerablemente la OTR

del sistema.

Se reporta que tejidos vegetales sometidos a diferentes concentraciones de

oxígeno, disminuyeron su actividad metabólica (síntesis, degradación y consumo de

sacarosa, síntesis de biomoléculas y de algunos metabolitos secundarios como los

fenilpropanoides), cuando se disminuyó la concentración de O2 (Geigenberger,

2003). En concentraciones demasiado bajas de O2 (cercanas a 0), se activaron los

procesos propios de anoxia, produciéndose ácido láctico y etanol (Geigenberger,

2003). Estas observaciones podrían explicar el porqué los cultivos de A. indica en

valores de OTR de 0.07 kg O2 m-3 día-1 (en matraces cubiertos con papel aluminio)

presentaron un IC limitado y disminuyeron su viabilidad. Así, la muerte celular

observada en este tratamiento, pudo presentarse como consecuencia de un

metabolismo de anoxia, el cual las plantas no pueden sostener indefinidamente

(Tadege et al., 1999; Geigenberger, 2003).

Por otro lado, organismos fotosintéticos (algas verdes y cianobacerias) sometidos a

un aumento de la presión de O2 de 52 a 200 kPa tuvieron un menor crecimiento,

entre el 96 y 26 % del crecimiento en condiciones normales, a una presión de O2 de

21 kPa (Raven y Larkum, 2007). Cultivos en matraces del hongo Blakeslea trispora

desarrollados en matraces, incrementaron la concentración de H2O2 en el medio de

cultivo de 500 a 3000 μM, cuando se aumentó el nivel de OTR de 3.8 a 26.7 kg O2

m-3 día-1 (Mantzouridou et al., 2005). Lo que sugiere que en niveles de OTR entre

1.70 y 6.21 kg O2 m-3 día-1, con una mayor disponibilidad de oxígeno, se pudo

presentar un ambiente oxidante adverso para el crecimiento de las células de A.

indica, pero que favoreció la producción de algunos metabolitos secundarios

relacionados con la azadiractina.

Al parecer, las azadiractinas no fueron los únicos compuestos cuya producción se

incrementó con la OTR. En los cromatogramas de los extractos se observaron entre

9 y 20 “picos” diferentes, que podrían corresponder al mismo número de

compuestos químicos. Como se indicó en la sección 3, estos compuestos pueden

ser terpenos, terpenoides y fitoesteroles principalmente. Considerando que a bajas


73

concentraciones, la unidad de absorbancia (V) es proporcional a la concentración

química, se sumó la absorbancia de estos compuestos bajo las diferentes

condiciones de OTRmax (figura 5.6). Los resultados sugieren que tanto el

rendimiento específico como el rendimiento volumétrico de estos compuestos

aumentaron con la OTRmax y la diferencia es significativamente mayor en el nivel de

6.21 kg O2 m-3 día-1 con respecto a los niveles inferiores de OTR estudiados (p ≤

0.05). M

etab

olito

s (V

g-1

)

0

2

4

6

8

10

OTRmax (kg O2 m-3 día-1)

0 1 2 3 4 5 6

Met

abol

itos

(V L

-1)

0

20

40

60

80

100

A

B

Figura 5.6. Relación entre la producción de metabolitos totales (terpenos,

terpenoides y fitoesteroles) y la OTRmax en cultivos de células de A. indica. (A)

Unidades de absorbancia por unidad de biomasa. (B) Unidades de absorbancia por

unidad de volumen.


74

Análisis fenomenológico de la transferencia de oxígeno

Hasta el momento se ha analizado el efecto que tuvo la OTRmax sobre el crecimiento

celular y la producción de azadiractinas. Se sugiere que hubo limitaciones de

oxígeno en el nivel de OTR de 0.07 kg O2 m-3 día-1 y posiblemente un exceso de

oxígeno entre de 1.70 y 6.21 kg O2 m-3 día-1. Para probar dichas hipótesis y precisar

porqué se presentaría una limitación o un exceso en el suministro de oxígeno, es

necesario relacionar la cantidad de oxígeno suministrado al sistema (OTR) con la

cantidad de oxígeno consumido por parte de las células (OUR) y la producción de

biomasa viable. Para esto, se analiza primero el efecto de la OTR sobre el

consumo específico de oxígeno (QO2) de las células de A. indica en el biorreactor.

La figura 5.7 presenta el consumo específico de oxígeno durante las fermentaciones

realizadas en el biorreactor tipo tanque agitado.

Tiempo (día)0 5 10 15 20

QO

2 x

103 (k

g O

2 kg

CSV

día

-1)

0

100

200

300

400

5006.21 kg O2 m3 día-1

1.700.92

Figura 5.7. Efecto de la OTRmax sobre el consumo específico de oxígeno de células

de A. indica en un biorreactor de tanque agitado.

A medida que aumenta la OTRmax, se observa que las células presentaron mayor

consumo de oxígeno. Para 0.92 y 1.70 kg O2 m-3 día-1, el QO2 disminuyó con el

tiempo, mientras que para 6.21 kg O2 m-3 día-1 se obtuvo un comportamiento

diferente, presentándose un valor máximo en el QO2 de 0.448 kg O2 kg CSV-1 día-1.

Los valores de QO2 obtenidos para A. indica están en el orden de magnitud de los

valores reportados para otras especies. Por ejemplo, se reporta un QO2 máximo de


75

0.130 kg O2 kg CSV-1 día-1 para cultivos de células en suspensión de Fragaria

ananassa y 0.544 kg O2 kg CSV-1 día-1 para Vitis vinifera (Doran, 1999). No

obstante, no se indica en que condiciones de OTR fueron realizadas estas

mediciones y tampoco se indica si pudiera haber una relación entre la OTR y el QO2

o la OUR. Con el objeto de visualizar la relación entre OTRmax – OUR – Biomasa

Viable y con base en los datos de QO2, se construyó la figura 5.8.

0,00,20,40,60,81,01,21,4

23

45

67

89

123456

OU

R (k

g O

2 m

-3 d

ía-1

)

Biom

asa (

kg C

SV m

-3 )


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Figura 5.8. Relación entre OUR, OTRmax y biomasa viable en cultivos de células de

A. indica.

Entre valores de 1.70 y 6.21 kg O2 m-3 día-1 las células presentaron el mayor

consumo de oxígeno (valores máximos de 0.74 y 1.17 kg O2 m-3 día-1

respectivamente), pero sólo se logran valores de biomasa viable de 3.4 y 2.8 kg

CSV m-3, respectivamente. Con una OTRmax de 0.92 kg O2 m-3 día-1 se observa que

el cultivo pudo alcanzar 9.5 kg CSV m-3 y aunque valores de OTR de 0.07 kg O2 m-3

día-1 (correspondientes a matraces cubiertos con papel aluminio) inicialmente

permitieron generar un crecimiento satisfactorio, las células perdieron la viabilidad

después de varios subcultivos, tal como se presentó en la Sección 4. Este

comportamiento contrasta con el de una especie como Uncaria tomentosa, la cual

consume cuatro veces menos oxígeno que A. indica (ver sección 4) y puede crecer


76

de una forma adecuada y subcultivarse por un largo periodo de tiempo (años) en

niveles de OTR de 0.07 kg O2 m-3 día-1. Con el fin de realizar un análisis

comparativo entre dichas especies, se construyó la figura 5.9, en la cual se propone

que una especie 2 (como U. tomentosa) podría tener un valor de OTRmax óptimo

para el crecimiento, por debajo de 0.9 kg O2 m-3 día-1. De esta manera, las

condiciones de OTR que son adecuadas para el crecimiento de una especie

vegetal, no necesariamente lo son para otra especie y estas condiciones deben

definirse de manera particular, bien sea que las células se cultiven en matraz o en

biorreactor.

0,00,20,40,60,81,01,21,4

234

56

78

9123456

OU

R (k

g O

2 m

-3 d

ía-1

)

Biom

asa (

kg C

SV m

-3)


0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

A. indica

Especie 2

Figura 5.9. Relación entre OUR, OTRmax y biomasa viable en dos cultivos de

células vegetales, Azadirachta indica y especie 2 que consume menos oxígeno.

Por último, se calcularon los números adimensionales Damköhler modificado (Da)

y factor de efectividad de consumo de oxígeno (n). Utilizando el valor máximo de

QO2 hallado para A. indica (0.448 kg O2 kg CSV-1 día-1) se calculó la OURmax

mediante la expresión QO2,max x (X). Se utilizaron los valores de OUR reportados en


77

la figura 5.8 y para el cálculo de la OTRmax, se usaron los valores de kLa medidos en

los experimentos (figura 5.2). De esta manera se calcularon los valores de Da y n

para cada uno de los tratamientos en el biorreactor. Adicionalmente, se usaron los

valores de QO2 y OTRmax indicados en sección 4, para calcular los correspondientes

valores de las células cultivadas en matraz (0.07 kg O2 m-3 día-1). La figura 5.10

presenta los valores de Da y n contra la biomasa viable. D

a (-)

0,01

0,1

1

10

100

6.21 kg O2 m-3 día-1

1.700.920.07

Biomasa (kg CSV m-3)

0 2 4 6 8 10 12

n (-)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Figura 5.10. Relación entre el número de Damköhler (Da) y el factor de efectividad

de consumo de oxígeno (n) con la biomasa, en cultivos de células de A. indica bajo

diferentes condiciones de OTRmax.

Se observa que Da aumenta y n disminuye cuando la biomasa se incrementa,

sugiriendo esto que el efecto de la resistencia a la transferencia de masa aumenta y


78

la eficiencia en el consumo de oxígeno disminuye con el aumento de la biomasa. El

nivel de OTRmax de 6.21 kg O2 m-3 día-1 tuvo valores de Da cercanos a 0.1 lo cual

significaría que en estas condiciones la velocidad de transferencia de oxígeno fue

mayor que la velocidad de las reacciones bioquímicas que usan oxígeno, es decir, la

velocidad de la transferencia de oxígeno no limitó el bioproceso. En este nivel de

OTRmax, el cultivo creció poco (aumento de biomasa viable) y perdió la viabilidad

celular (figura 5.4). Además, n fue mayor que 0.4. El nivel de OTR de 0.07 kg O2 m-

3 día-1 presentó valores de Da entre 10 y 100, sugiriendo esto que la transferencia de

masa limitó el bioproceso. Además, n fue muy bajo en este caso (menor que 0.1).

Así, la velocidad de transferencia de oxígeno limitada impediría la producción de

biomasa durante los subcultivos repetidos (sección 4) y ocasionaría la perdida de la

viabilidad celular (figura 5.4).

En el nivel de OTRmax de 0.92 kg O2 m-3 día-1 se tuvieron valores de Da alredor de 1

y n alrededor de 0.2. En este caso se presenta un régimen intermedio y la velocidad

de la transferencia de masa sería comparable con la velocidad de las reacciones

bioquímicas que consumen oxígeno. Éstas fueron las condiciones más favorables

para el crecimiento celular (figura 5.4). En esta condición de régimen intermedio, la

transferencia de oxígeno puede ser lo suficientemente alta para que no se presente

hipoxia o anoxia, pero también puede ser baja para que no se presente un ambiente

de estrés oxidativo que afecte la viabilidad celular. La equivalencia relativa entre la

OTRmax y las reacciones bioquímicas de consumo de oxígeno, explica porqué el OD

disminuyó cuando la biomasa aumentó, descendiendo a valores cercanos a cero a

partir del día 10 (figura 5.2).

Como se mencionó, la variación en el OD en un cultivo se da como respuesta a la

OTR del sistema y a la OUR de las células (Gómez et al., 2006). Si existe

limitación en algún grado a la transferencia de masa, esta puede presentarse tanto

para la entrada del oxígeno al sistema como para la salida de metabolitos volátiles o

gaseosos (e.g. CO2, etileno). Al respecto se tiene documentado que en un cultivo

de Catharanthus roseus en un biorreactor de 3 L, una reducción en el flujo de aire

de 7.5 a 1.8 L h-1, incrementó la concentración de CO2 disuelto de 0.3 a 1.2 mmol L-1

y aunque no se afectó el crecimiento celular, esta condición disminuyó la producción

de ajmalicina (Shalatmann et al., 1997). En un cultivo de raíces de Panax ginseng


79

en biorreactor, concentraciones de etileno de 10 y 20 ppm, incrementaron

significativamente la producción de biomasa pero disminuyeron la producción de

ginsenósidos (Jeong et al., 2006). Esto sugiere que en el tratamiento de 0.92 kg O2

m-3 día-1, una acumulación de algunos metabolitos gaseosos como el etileno o el

CO2, pudieron favorecer también el crecimiento celular.

La figura 5.11 presenta los valores de Da y n contra AZRUV. Se observan bajos

valores de AZRUV en los tratamientos con 0.07 y 0.92 kg O2 m-3 día -1,

presentándose en estos casos una baja efectividad en el consumo de oxígeno (n <

0.2) y una mayor resistencia a la transferencia de oxígeno (Da > 1).

Da

(-)

0,01

0,1

1

10

1006.21 kg O2 m

-3 día-1

1.700.920.07

AZRUV (mg L-1)

0 1 2 3 4 5 6

n (-)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Figura 5.11. Relación entre el número de Damköhler (Da) y el factor de efectividad

de consumo de oxígeno (n) con las azadiractinas (AZRUV), en cultivos de células de

A. indica, bajo diferentes condiciones de OTRmax.


80

Por otro lado, la mayor producción de AZRUV se presentó en 6.21 kg O2 m-3 día -1,

asociada con n > 0.4 y Da < 0.2. La figura 5.12 presenta los valores de n contra

Da. Se observa que n disminuyó con el aumento de Da, obteniéndose una buena

correlación entre ambas variables

n 10 . . D r2=0.9413

Da (-)0,01 0,1 1 10 100

n (-)

0,01

0,1

1

106.21 kg O2 m

-3 día-1

1.700.92 0.07

Figura 5.12. Factor de efectividad de consumo de oxígeno (n) contra el Número de

Damköhler (Da) en cultivos de células de A. indica, bajo diferentes condiciones de

OTRmax.

En este gráfico se diferencian más claramente las condiciones analizadas

anteriormente. Se encontró una mejor producción de biomasa en la región de Da ≅

1 y n ≅ 0.2 (IC de 3.4 y viabilidad del 68 %), mayor producción de azadiractinas en

Da ≅ 0.1 y n ≅ 1 (alcanzando 5.3 mg L-1) y poco crecimiento y baja producción de

azadiractinas en Da > 10 y n < 0.1. De esta manera, se sugiere que si en un cultivo

de células vegetales en suspensíon (no autótrofa) se aumenta la resistencia a la

transferencia de oxígeno (mayor Da), la especie disminuirá el consumo de oxígeno

(menor n), y esto traerá consecuencias en el crecimiento celular y la producción de

algunos metabolitos secundarios.

El análisis presentado en este trabajo basado en el uso de números

adimensionales, permite estudiar los fenómenos de transferencia de masa y


81

consumo de oxígeno y las velocidades relativas entre ellos. Además, por tratarse

de un estudio con números adimensionales, las condiciones halladas podrían

utilizarse para un proceso de escalado. Este análisis podría aplicarse en otras

líneas celulares (de la misma u otra especie vegetal) y definir los correspondientes

valores de Da y n adecuados para la producción de biomasa y de metabolitos

secundarios. CONCLUSIONES

La OTRmax afectó la producción de biomasa viable, azadiractinas (AZRUV) y el

consumo de oxígeno de células vegetales en suspensión de A. indica. En el

intervalo de estudio (0.07 – 6.21 kg O2 m-3 día-1) la biomasa viable presentó un

máximo en 0.92 kg O2 m-3 día-1, mientras que la producción de AZRUV tuvo una

correlación lineal con la OTRmax. Mediante el uso de los números adimensionales

Da y n, se pudo identificaron condiciones en las cuales el bioproceso se limitó por la

transferencia de masa (OTRmax 0.07 kg O2 m-3 día-1), condiciones donde la velocidad

de transferencia de masa fue comparable con la velocidad de las reacciones

bioquímicas de consumo de oxígeno y se obtuvo un buen crecimiento celular

(OTRmax 0.92 kg O2 m-3 día-1), y otras en las que el bioproceso no se limitó por la

transferencia de masa (OTR > 1.70 kg O2 m-3 día-1) que favorecieron la producción

de azadiractinas pero disminuyeron la producción de biomasa viable. Además, el

aumento de la resistencia a la transferencia de oxígeno (mayor Da) tuvo como

consecuencia un menor consumo de oxígeno (menor n) por parte de las células.

REFERENCIAS Çalik,P., Yilgör,P., Ayhan,P., and Demir,A.S. (2004). Oxygen transfer effects on recombinant benzaldehyde lyase production. Chem. Eng. Sci. 59, 5075-5083.

Doran,P. (1995). Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. (London: Academic Press).

Doran,P. (1999). Design of mixing systems for plant cell suspension in stirred reactors. Biotechnol. Prog. 15, 319-335.

García-Ochoa,F. and Gómez,E. (2009). Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes. And overview. Biotechnol. Adv. 27, 153-176.

Geigenberger,P. (2003). Response of plant metabolism to too little oxygen. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 247-256.


82

Gómez,E., Santos,V.E., Alcon,A., and García-Ochoa,F. (2006). Oxygen transport rate on Rhodococcus erythropolis cultures: Effect on growth and BDS capability. Chem. Eng. Sci. 61, 4595-4604.

Huang,S.Y., Shen,Y.W., and Chan,H.S. (2002). Development of a bioreactor operation strategy for L-DOPA production using Stizolobium hassjoo suspension culture. Enzyme Microb. Technol. 30, 779-791.

Jeong,C.S., Chakrabarty,D., Hahn,E.J., Lee,H.L., and Paek,K.Y. (2006). Effects of oxygen, carbon dioxide and ethylene on growth and bioactive compound production in bioreactor culture of ginseng adventitious roots. Biochem. Eng. J. 27, 252-263.

Mantzouridou,F., Roukas,T., and Achatz,B. (2005). Effect of oxygen transfer rate on [beta]-carotene production from synthetic medium by Blakeslea trispora in shake flask culture. Enzyme Microb. Technol. 37, 687-694.

Martín,M., Montes,F.J., and Galán,M.A. (2008). Bubbling process in stirred tank reactors I: Agitator effect on bubble size, formation and rising . Chem. Eng. Sci. 63, 3212-3222.

Nguyen,T.T., Hosakatte,N.M., Yu,K.W., Jeong,C.S., Hahn,E.J., o, and Paek,K.Y. (2006). Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng. J. Plant Physiol. 163, 1337-1341.

Orozco-Sánchez,F. and Rodríguez-Monroy,M. (2007). Cultivos de células en suspensión de Azadirachta indica para la producción de un bioinsecticida. Rev. Mex. Ing. Quim. 6, 251-258.

Prakash,G. and Srivastava,A.K. (2006). Modeling of azadirachtin production by Azadirachta indica and its use for feed forward optimization studies. Biochem. Eng. J. 29, 62-68.

Prakash,G. and Srivastava,A.K. (2008). Statistical elicitor optimization studies for the enhancement of azadirachtin production in bioreactor Azadirachta indica cell cultivation. Biochem. Eng. J. 40, 218-226.

Raven,J.A. and Larkum,A.W.D. (2007). Are there ecological implications for the proposed energetic restrictions on photosynthetic oxygen evolution at high oxygen concentrations? Photosynth. Res. 94, 31-42.

Sajc,L., Grubisic,D., and Vunjak-Novakovic,G. (2000). Bioreactors for plant engineering: an outlook for further research. Biochem. Eng. J. 4, 89-99.

Shalatmann,J.E., Moreno,P.R.H., Vinke,J.L., Hoopen,H.J.G., Verpoorte,R., and Heijnen,J.J. (1997). Gaseous metabolites and the ajmalicine production rate in high density cell cultures of Catharanthus roseus . Enzyme Microb. Technol. 20, 107-115.

Tadege,M., Dupuis,I., and Kuhlemeier,C. (1999). Ethanolic fermentation: new functions for an old pathway. Trends Plant Sci. 4, 320-235.

Zhong,J.J. (2002). Plant cell culture for production of paclitaxel and other taxanes. J. Biosci. Bioeng. 94, 591-599.

Zhong,J.J., Pan,Z.W., Wang,Z.Y., Wu,J., Chen,F., Takagi,M., and Yoshida,T. (2002). Effect of mixing time on taxoid production using suspension cultures of Taxus chinensis in a centrifugal impeller bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 94, 244-250.

6. PERSPECTIVAS FUTURAS

Con los hallazgos encontrados en la presente investigación se demuestra que para

el desarrollo de una línea de células vegetales en suspensión, se debe conocer

adecuadamente las necesidades de oxígeno por parte de las células (OUR) y la

oferta de oxígeno que se suministra en determinado biorreactor (OTR), sea un

matraz Erlenmeyer o un biorreactor de tanque agitado. Las relaciones que puedan

existir entre la OTR y la OUR afectarán de algún modo el crecimiento celular y la

producción de algunos metabolitos secundarios.

Surgen también nuevos interrogantes, cuya solución requiere más investigación. A

nivel de matraz, es posible que las líneas celulares que crecen cubiertas con papel

aluminio por largos periodos de tiempo (e.g. Beta vulgaris y Uncaria tomentosa),

correspondan a especies que verdaderamente consumen menos oxígeno o son

líneas que se adaptaron a estas condiciones de suministro de oxígeno limitado. Si

especies como B. vulgaris y U. tomentosa consumen per se menos oxígeno, es

posible que las células de Azadirachta indica consumieran más oxígeno por la

necesidad de este compuesto para la síntesis de terpenoides oxigenados. Sería

necesario en este caso, cuantificar cuánto oxígeno insertan las células de A. indica

en los terpenoides oxigenados o si se produjeron especies reactivas de oxígeno,

cuya producción consumiera oxígeno molecular. En este caso, se podrían realizar

los balances de materia y proponer una relación entre oferta de oxígeno - estrés

oxidativo – consumo de oxígeno – producción de terpenoides oxigenados. Este

estudio sería realizable en el biorreactor de tanque agitado, ya que en matraces es

más difícil la medición dinámica de la OUR. A nivel del reactor de tanque agitado,

es posible que el estrés hidrodinámico ocasionara también un mayor consumo de

oxígeno por parte de las células, lo cual incrementara la OUR de las células con

respecto a la OUR en matraces.

6. Perspectivas futuras

84

Sobre los números adimensionales Damköhler (Da) y factor de efectividad de

consumo de oxígeno (n), éstos brindaron la posibilidad de analizar y comparar la

velocidad de transferencia de oxígeno con la velocidad de las reacciones de

consumo de oxígeno. Por tratarse de un análisis adimensional, surge la posibilidad

de extrapolar los resultados obtenidos en la presente investigación a otras líneas

celulares de esta especie u otras diferentes. Sin embargo, esta hipótesis deberá

corroborarse, especialmente para especies que tienen un metabolismo similar a los

cultivos celulares de A. indica, es decir, especies con un metabolismo heterótrofo.

Si se caracteriza adecuadamente una especie, la relación entre Da, n, crecimiento

celular y metabolismo secundario, puede brindar una guía para predecir el

comportamiento en determinadas condiciones de OTR y escalar un proceso

bioquímico

Finalmente, hay evidencias para afirmar que las células en suspensión de A. indica,

produjeron otros limonoides diferentes a la azadiractina. Se debe cuantificar estos

limonoides y evaluar el poder insecticida de los extractos obtenidos en los cultivos.

Debe considerarse que la producción de azadiractina fue muy baja con respecto a la

obtenida por otros investigadores (sección 2). Al respecto, sería interesante analizar

el contenido de estructuras secretoras de terpenoides en las células en suspensión

y determinar si la baja presencia de células secretoras de terpenoides fue la causa

de la poca producción de azadiractina.

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