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La polilla de la manzana, Cydia pomonella es la principal plaga que afecta a pomáceasa nivel mundial.
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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Agronomía
Efecto de azadiractina sobre polilla de la manzana (Cydia pomonella L.) (Lepidoptera:
Tortricidae) criada en laboratorio
Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al título de Ingeniero Agrónomo
Fernanda de Groote Páez Valdivia – Chile
2010
PROFESOR PATROCINANTE:
____________________________________
Maritza Reyes C.
Ingeniero Agrónomo, M.Sc. Dr. Cs. Agr.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
PROFESORES INFORMANTES:
____________________________________
Laura Böhm S.
Ingeniero Agrónomo
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
___________________________________
Miguel Neira C.
Ingeniero Agrónomo
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
i
INDICE DE MATERIAS
Capítulo Página
1
RESUMEN
SUMMARY
INTRODUCCIÓN
1
2
3
2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5
2.1 Polilla de la manzana 5
2.1.1 Ciclo biológico 5
2.1.2 Daño 6
2.1.3 Importancia económica 7
2.1.4 Manejo 7
2.1.4.1 Medidas preventivas 8
2.1.4.2 Control químico 8
2.1.4.3 Uso de feromonas 10
2.1.4.4 Controladores biológicos 10
2.1.4.5 Insecticidas microbiológicos 11
2.1.4.6 Bio-insecticidas 11
2.2 Azadirachta indica A. Juss 12
2.2.1 Azadiractina 13
ii
2.2.2 Efectos insecticidas y modo de acción 14
2.2.2.1 Efecto antialimentario 14
2.2.2.2 Efectos fisiológicos 15
2.2.3 Extractos 16
2.2.4
2.2.5
Efecto de la azadiractina en parasitoides
Neem-X®
17
17
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.7.4
3.7.5
3.7.6
3.8
3.9
MATERIAL Y MÉTODO
Lugar del ensayo
Material biológico
Dieta
Insecticida
Tratamientos
Establecimiento del ensayo
Evaluaciones
Comportamiento alimenticio
Anormalidades morfológicas
Mortalidad
Estados de desarrollo
Porcentaje de pupas y adultos
Fecundidad de adultos y fertilidad de huevos
Diseño experimental
Análisis estadístico de los datos
18
18
18
18
18
19
19
20
20
21
21
21
22
22
23
23
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24
iii
4.1
4.2
Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina
sobre el comportamiento alimenticio de larvas de Cydia pomonella
Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina
sobre el desarrollo C. pomonella
24
27
4.3
4.4 4.5 4.6 5 6 7
Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina
sobre anormalidades morfológicas en larvas, pupas y adultos de C.
pomonella
Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina
sobre la mortalidad en larvas de Cydia pomonella
Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina
en la fecundidad y fertilidad de Cydia pomonella
Consideraciones finales
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
31
34
36
39
40
41
47
iv
INDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Grados días requerido para el desarrollo de Cydia pomonella 8
2 Grupos químicos e ingredientes activos utilizados para C. pomonella
en Chile
9
3
4
5
Sensibilidad de los insectos a la azadiractina
Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes
Ingredientes de cada repetición de los distintos tratamientos
15
16
19
v
INDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Ciclo biológico Cydia pomonella 6
2 Neem como plaguicida 12
3
4
Azadiractina
a: Preparación de las soluciones insecticidas, b: Establecimiento del
ensayo
14
20
5 a: Desechos de Cydia pomonella sobre dieta artificial. b: Peso de
larvas (L5) de C. pomonella
20
6 a y b Cápsulas cefálicas de Cydia pomonella 21
7 a. Cilindro plástico con soporte para huevos. b y c . Huevos de C.
pomonella
22
8 Porcentaje de larvas de C. pomonella tratadas con concentraciones
crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3
= 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) que se alimentaron durante los
primeros cinco días de establecido el ensayo.
24
9 Larvas de Cydia pomonella tratadas con concentraciones crecientes de
azadiractina que se encontraron fuera de la dieta, a (T3 = 15 ppm) y b
(T5 = 25 ppm) en la segunda semana del ensayo y c (T5 = 25 ppm) en
la tercera semana.
25
vi
10 Peso (mg) de larvas de C. pomonella de quinto estadío tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 = 5 ppm;
T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm)
26
11 Proporción de larvas (L5) y pupas de C. pomonella luego de tres
semanas alimentándose en dieta con concentraciones crecientes de
azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4
= 20 ppm; T5 = 25 ppm)
28
12 Estado de desarrollo de larvas de C. pomonella tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm;
T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) en la cuarta
semana de establecido el ensayo
29
13 Porcentaje de larvas de C. pomonella tratadas con concentraciones
crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 =
15 ppm) que alcanzaron el estado adulto
30
14 Larvas de C. pomonella tratadas con distintas concentraciones de
azadiractina. a: control (T0 = 0 ppm), b: T3 (15ppm), c y d: T5
(25ppm)
31
15 Pupas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de
azadiractina, a: control (T0 = 0 ppm), b: T5 (25 ppm), c: T4( 20 ppm),
d: T3 (15 ppm)
32
16 Porcentaje de adultos anormales de C. pomonella provenientes de
larvas alimentadas en dieta con concentraciones crecientes de
azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm)
33
vii
17 Mortalidad acumulada corregida de larvas C. pomonella tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm;
T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) durante las primeras cuatro
semanas del ensayo
34
18 Mortalidad semanal corregida de larvas C. pomonella tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm;
T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) durante las primeras cuatro
semanas del ensayo
36
19 Fertilidad (%) de polillas de C. pomonella tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm;
T2 = 10 ppm)
37
20 Porcentaje de larvas eclosadas de C. pomonella tratadas con
concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm;
T2 = 10 ppm)
38
viii
INDICE DE ANEXOS
Anexo Página
1 Mortalidad acumulada corregida de larvas C. pomonella tratadas con
azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5
= 25 ppm) durante las primeras cuatro semanas del ensayo
57
1
RESUMEN
La polilla de la manzana, Cydia pomonella es la principal plaga que afecta a pomáceas
a nivel mundial. Tradicionalmente se han utilizado insecticidas químicos para su
control; sin embargo, debido a las reiteradas aplicaciones de éstos se ha generado
resistencia en diferentes poblaciones de la polilla de la manzana en el mundo.
Actualmente, existe una tendencia global, en la cual, se intenta utilizar la menor
cantidad de químicos, que los alimentos sean inocuos para el ser humano y que el
impacto ambiental sea el menor posible. Debido a esto, es importante recurrir a
alternativas de control, como es el uso de bio-insecticidas. Entre estos, se encuentra el
insecticida Neem-X® cuyo ingrediente activo es la azadiractina. Esta sustancia ha
mostrado acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora de la
oviposición y esterilizante en insectos de varios órdenes. Con el objetivo de probar los
efectos que provoca la azadiractina, en Cydia pomonella se alimentaron larvas desde
primer estadío en dieta artificial (Stonefly Industries Ltd) con distintas concentraciones
del ingrediente activo (5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20 ppm y 25 ppm) durante seis
semanas a una temperatura de 25 ± 2 ºC, con una humedad relativa de 55 ± 5% y un
fotoperíodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad. Al concluir el experimento se determinó
que la azadiractina presentó un efecto disuasivo de la alimentación, observándose una
disminución en el peso de las larvas, a medida aumentó la concentración utilizada. En
insectos alimentados en dieta con azadiractina, se observó un retraso del ciclo de
desarrollo, especialmente en las concentraciones mayores, en las cuales no se alcanzó
el estado adulto. Se presentaron anormalidades en los estados de larva, pupa y adulto;
sin embargo, éstas fueron estadísticamente significativas sólo para los adultos.
También se observaron algunas diferencias en la mortalidad, la cual alcanzó cerca del
50% en las concentraciones mayores a la cuarta semana. Finalmente, se observó una
diferencia significativa en la fertilidad y fecundidad de los insectos alimentados con
azadiractina, con respecto al control. Considerando lo señalado, se puede concluir, que
la azadiractina afecta negativamente a Cydia pomonella en condiciones de laboratorio.
2
SUMMARY
The Codling moth, Cydia pomonella is the main pest affecting the pome fruit production
worldwide. Traditionally chemical insecticides have been used for its control. However,
the repeated applications of these products have generated insecticide resistance in
different codling moth populations around the world. In addition, currently there is a
global tendency, in which people try to use the least amount of chemicals, to obtain
safe food for humans and an environmental impact as low as possible. Because of that
is important to use control alternatives, such as the use of bio-insecticides. Among
these, we found the Neem-X ® insecticide, whose active ingredient is azadirachtin. This
substance has shown feeding deterrence, growth regulation, oviposition inhibition and
sterilizing in insects of several orders. With the aim to test the effects of azadirachtin, in
Cydia pomonella, larvae from first instars were feed on artificial diet (Stonefly Industries
Ltd.) with different concentrations of the active ingredient (5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 20
ppm and 25 ppm) for six weeks at a temperature of 25 ± 2 º C, relative humidity 55 ±
5% and a photoperiod of 16:8 (light: dark). At the end of the experiment we determined
that azadirachtin presented a deterrent effect, which a higher decrease in the weight of
larvae when the concentrations increased. Insects fed on artificial diet containing
azadirachtin presented a delay in develop, especially at the higher concentrations,
where the adult state was not reached. Differences were observed in larvae, pupae and
adults, however these were significant only at the adult stage. Mortality at the fourth
week reached nearly 50 % at the higher concentrations. Finally, azadirachtin produced
a decreased in the fertility and the fecundity when compared to control insects.
Therefore, it can be concluded, that azadirachtin adversely affects Cydia pomonella
under laboratory conditions.
3
1 INTRODUCCION
La polilla de la manzana (Cydia pomonella L.) es la principal plaga que afecta a la
producción de pomáceas en Chile y el mundo. El ataque de este insecto provoca una
disminución en la calidad del fruto, reduciendo su capacidad de almacenamiento. En su
control se utilizan reiteradas aplicaciones de insecticidas químicos, ya que, este insecto
en Chile puede llegar a tener tres generaciones por temporada, en las que se pueden
encontrar en forma simultánea distintos estadíos de desarrollo.
Los insecticidas químicos más utilizados han sido los organofosforados, piretroides,
reguladores de crecimiento e inhibidores de la síntesis de quitina. Sin embargo, debido
a las reiteradas aplicaciones de estos químicos se ha generado resistencia a muchos
de ellos, encontrándose varios casos de tipo múltiple y cruzada.
En la búsqueda de una solución para este problema, así como también en una nueva
visión del manejo de plagas en la agricultura, donde la utilización de químicos sea la
menor posible, el control produzca el menor impacto ambiental y que los alimentos
sean inocuos para el ser humano, toman relevancia nuevas alternativas de control para
este insecto; entre éstas se encuentran los controladores biológicos, la confusión
sexual, los insecticidas microbiológicos y más recientemente el uso de bio-insecticidas.
Entre los últimos se encuentra el insecticida de origen botánico Neem-X®, cuyo
ingrediente activo es la azadiractina (0,4%). Del grupo de los limonoides, este
compuesto actúa como regulador del crecimiento, interrumpiendo la metamorfosis de
larvas y pupas. Neem-X® presenta acción insecticida sobre un gran número de
especies plagas, y se encuentra registrado para Cydia pomonella en Chile. Debido a lo
cual es relevante conocer los efectos que produce en esta importante plaga.
4
De acuerdo a lo mencionado anteriormente, se planteó como hipótesis que la
azadiractina presente en Neem-X® produce efectos en el comportamiento alimenticio,
en el ciclo de desarrollo, en la supervivencia, en la fertilidad y fecundidad de Cydia
pomonella.
El objetivo general de este ensayo fue evaluar el efecto de distintas concentraciones de
azadiractina incorporadas en dieta artificial sobre polilla de la manzana criada en
laboratorio.
Los objetivos específicos fueron:
- Evaluar el efecto de la aplicación de cinco concentraciones de azadiractina sobre el
comportamiento alimenticio y el desarrollo del ciclo de Cydia pomonella.
- Evaluar las posibles anormalidades morfológicas en larvas, pupas y adultos; y la
mortalidad de estados inmaduros de Cydia pomonella, luego de la aplicación de
azadiractina.
- Evaluar el efecto de la incorporación de las distintas concentraciones de azadiractina
en la fertilidad y fecundidad de los insectos que lograron completar su ciclo.
5
2 REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 Polilla de la manzana
Cydia pomonella (L.) conocida como polilla de la manzana o carpocapsa, pertenece al
orden Lepidoptera y a la familia Tortricidae. En Chile es considerada plaga primaria, ya
que produce daño económico directo en pomáceas y es siempre incluida en los
programas de manejo de los huertos (GONZÁLEZ, 1989).
Esta plaga de distribución mundial (COTO y SAUNDERS, 2004), ataca manzano,
membrillo, nogal y peral y, como hospedantes secundarios, puede dañar ciruelo,
damasco, duraznero y nectarino (GONZÁLEZ, 1989). En Chile, se encuentra
distribuida en la XV, I y desde la IV a XI Regiones (KLEIN y WATERHOUSE, 2000).
2.1.1 Ciclo biológico. Este insecto inverna como larva diapausante en lugares
protegidos como corteza suelta, grietas de los árboles, restos de poda, cajas de
madera o en el suelo alrededor del tronco (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000). A
fines del invierno, cuando la temperatura ambiental es de aproximadamente 16ºC, por
al menos 15 días, emergen los adultos (Figura 1) (ARTIGAS, 1994). A las pocas horas
se aparean y comienza la oviposición durante el atardecer, a una temperatura mayor a
16,7ºC (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000). La hembra deposita alrededor de 60 huevos en forma individual o en pequeños grupos sobre hojas o frutos (COTO y
SAUNDERS, 2004).
Los huevos son incubados por tres a quince días, dependiendo de la temperatura. Las
larvas de la primera generación se alimentan de las hojas, hasta que se forman los
frutos y se introducen en ellos, donde permanecen entre 19 y 23 días (ARTIGAS,
1994). La larva madura en su último estadío (quinto) deja el fruto por una galería de
salida y busca un lugar protegido para pupar (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000).
6
El número de generaciones y la duración del ciclo dependen del clima de cada región
(UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000). En Chile, presenta hasta tres ciclos por
temporada. Cerca del 1% de las larvas de primera generación, 15% de las de segunda
generación y 85% de la tercera generación forman las “larvas invernantes” (ARTIGAS,
1994).
FIGURA 1. Ciclo biológico Cydia pomonella
FUENTE: Adaptado de GONZÁLEZ (2001).
2.1.2 Daño. C. pomonella produce daño durante todo su estado larvario. La larva se
introduce al fruto y genera galerías hasta el centro de éste en donde se alimenta de las
semillas y el endocarpo (GONZÁLEZ, 1989). Debido a esto, el fruto presenta una
amplia zona consumida en la parte central, oscurecida por acción de los
microorganismos y por la abundante acumulación de excremento. Estos frutos
generalmente caen al suelo, por lo que sufren deterioro por el golpe y luego se
descomponen (ARTIGAS, 1994).
7
2.1.3 Importancia económica. La infestación de los huertos con polilla de la manzana
produce una depreciación de la fruta, y por lo tanto, provoca un aumento del costo de
producción al controlarla (ARTIGAS, 1994). La fruta no puede venderse al mercado
fresco y debido a las heridas provocadas por el insecto, el fruto queda susceptible al
ataque de microorganismos, lo que limita su uso para jugos (UNIVERSITY OF
CALIFORNIA, 2000).
Las pérdidas en huertos no tratados con productos químicos ni con otros métodos de
control, pueden llegar hasta un 80% (ARTIGAS, 1994; DURÁN, 2001). Según
GONZÁLEZ (1989), se considera que el nivel de daño económico no debe ser mayor a
0,5% en huertos de manzanos, perales y nogales que se encuentran con programas
fitosanitarios definidos.
Cydia pomonella es cuarentenaria para Japón, China y Corea, lo que dificulta y limita la
exportación de pomáceas a estos países (ARTIGAS 1994). Además, Bolivia, Brasil,
Canadá, Colombia, Cuba, China, Ecuador, Filipinas, Honduras, Japón, Panamá y
Taiwán exigen certificación fitosanitaria por parte de los productores chilenos para
importar manzanas a su país (CHILE, SERVICIO AGRÍCOLA Y GANADERO (SAG),
2007).
2.1.4 Manejo. Para mantener controlado el daño que causa esta plaga, es relevante
conocer los “peaks” de vuelo, para determinar cuándo causará el mayor daño y estimar
en qué magnitud se encuentra la población (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000). Si
se conoce el ciclo de la población en cada huerto, es posible aplicar las medidas
adecuadas para su manejo (ARTIGAS, 1994).
Una forma para conocer el “peak” de vuelo de los adultos es muestrear en forma
periódica con trampas de cartón corrugado, en ramas o troncos, donde se refugian las
pupas. Éstas, son llevadas a laboratorio donde emergen los adultos, y así se conoce el
“peak” de vuelo de cada generación. Otra forma, para estudiar los ciclos de cada
generación es mediante trampas con feromonas para atraer a los machos adultos y
efectuar recuentos periódicos, siendo éste, el sistema de monitoreo más utilizado
(ARTIGAS, 1994).
8
En conjunto con las trampas de feromona, se utiliza el cálculo de los días grados, para
predecir el desarrollo del insecto. El umbral de desarrollo más bajo es 10ºC y el más
alto 31,1ºC (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000), demorando aproximadamente 610
grados días en completar una generación (Cuadro 1) (AUDEMARD, 1992).
CUADRO 1 Grados días requerido para el desarrollo de Cydia pomonella.
Estado Temperatura umbral (°C) Ka(º/días) Huevo 10 90 Larva 10 300 Pupa 11 150 Adulto 11 70 Total 610
FUENTE: AUDEMARD, 1992.
a K: constante térmica
2.1.4.1 Medidas preventivas. Para disminuir la infestación de C. pomonella, se
recomienda recolectar y eliminar las manzanas dañadas y desinfectar los materiales de
almacenamiento (COTO y SAUNDERS, 2004). También, resulta práctico enrollar
bandas de cartón corrugado en la base de los troncos, en donde se refugian las larvas
invernantes. Estas bandas son retiradas durante el invierno y así se disminuye la
población para la temporada siguiente (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000).
2.1.4.2 Control químico. Los insecticidas son aplicados de acuerdo al ciclo de la
polilla en cada huerto (ARTIGAS, 1994). Tradicionalmente, en Chile se han utilizado
insecticidas organofosforados (FUENTES, 2003).
Los grupos químicos y sus respectivos ingredientes activos que se encuentran
recomendados para esta plaga por CHILE, ASOCIACIÓN NACIONAL DE
FABRICANTES E IMPORTADORES DE PRODUCTOS FITOSANITARIOS
AGRÍCOLAS (AFIPA) (2007), se muestran en el Cuadro 2.
9
CUADRO 2 Grupos químicos e ingredientes activos utilizados para C. pomonella en Chile.
Grupo químico Ingrediente activo Carbamatos metomil, metomilo, carbaryl Neonicotinoides (cloronicotinilos) tiacloprid, acetamiprid Organofosforados clorpirifos, azinfos metil, diazinon, dimetoato, fosmet, malation, metamidofos metidation Piretroides deltametrina. fenvalerato, esfenvalerato, lambdacihalotrina, permetrina, bifentrina Diacylhydracinas metoxifenozide, tebufenozide Benzoilureas novaluron Derivado de la benzamida lufenuron
FUENTE: adaptado de AFIPA (2007).
Como se mencionó anteriormente, se ha generado resistencia a distintos grupos de
insecticidas, entre los cuales se encuentran los organofosforados (BUSH et al., 1993;
REUVENY y COHEN, 2007; REYES et al, 2004), piretroides, reguladores de
crecimiento (SAUPHANOR et al., 1998, REYES et al, 2004), e inhibidores de la síntesis
de quitina (SAUPHANOR et al., 1998)
Hace una década DUNLEY y WELTER (2000) indicaron que existía disminución de la
eficacia del azinfos-metil, no obstante, el producto se siguió utilizando, a mayor
concentración o aumentando el número de aplicaciones. Tan grave ha sido esta menor
eficiencia, que para el año 2012, en los Estados Unidos, este insecticida deberá dejar
de ser usado en árboles frutales y los productores deberán optar por otras alternativas
(WILLETT, 2006).
Además, según SAUPHANOR et al. (1998), se ha generado en algunas poblaciones
resistencia múltiple y cruzada. Por lo tanto, para tratar de dar solución al problema, se
ha debido alternar los grupos químicos y se han incorporado nuevos ingredientes
activos con diferentes modo de acción (FUENTES, 2007).
10
2.1.4.3 Uso de feromonas. La confusión sexual, es un método de control no químico,
basado en la interrupción del proceso de acoplamiento sexual. En los huertos, se
liberan altas concentraciones de la feromona sexual femenina sintética saturando el
ambiente, así los machos son incapaces de diferenciar entre la fuente natural de
emisión de la feromona y la sintética y, no pueden encontrar a la hembra (GONZÁLEZ
et al. 1990). Esta práctica podría ser la principal forma de manejar las poblaciones de
polilla de la manzana en la agricultura orgánica (UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2000)
y constituir una adecuada alternativa para el manejo de poblaciones resistentes a
insecticidas. También, existen los “atracticidas”, en los cuales se emplea la feromona
sexual (codlemona) y un insecticida de contacto (piretroide). La técnica consiste en
aplicar a los árboles un formulado viscoso que contiene la mezcla y permite el control
de machos de Cydia pomonella. Los machos son atraídos por la feromona y al tomar
contacto con el formulado mueren por la acción del insecticida (GONZÁLEZ, 1998).
2.1.4.4 Controladores biológicos. HERNÁNDEZ et al. (2006), señalan que en
Argentina, se utiliza Ascogaster quadridentata (Hymenoptera: Braconidae), parasitoide
ovo-larval y Mastrus ridibundus (Hymenoptera: Ichneumonidae) que parasita larvas
desarrolladas, ambos introducidos desde Estados Unidos. También, se emplean
liberaciones inundativas de Trichogramma nerudai y T. pretiosum (Hymenoptera:
Trichogrammatidae).
TORRES y GERDING (2000), indican que para el control biológico de Cydia pomonella
en Chile se determinaron cinco especies de Trichogramma: T. nerudai cacoeciae, T.
dendrolimi, T. platneri, Trichogramma sp. "Cato" y T. cacoeciae. Los autores
observaron que las últimas dos tienen el mayor potencial para ser usadas en biocontrol
de esta plaga
En Chile, también, se ha estudiado Ascogaster quadridentata y Mastrus ridibundus
para el control biológico de esta plaga. Sin embargo, aún no existe la comercialización
de estas especies para su uso en campo (CHILE, CENTRO TECNOLÓGICO DE
CONTROL BIOLÓGICO, s/f).
11
2.1.4.5 Insecticidas microbiológicos. Entre estos insecticidas se encuentra Bacillus
turingensis variedad kurstaki, que afecta a lepidópteros. La bacteria esporula en el
tubo digestivo de Cydia pomonella y produce una protoxina que actúa como proteína
tóxica y que causa canales en el epitelio del esófago, permitiendo la pérdida de iones,
lo que conduce a la muerte celular y posteriormente, a la destrucción del tejido. Sin
embargo, este producto específico es relativamente débil y tiene un corto período de
protección (GONZÁLEZ, 1998).
También, se encuentra disponible el virus granuloso de Cydia pomonella (CpGv), un
baculovirus que ha demostrado ser lo suficientemente virulento como para alcanzar un
nivel aceptable de frutos dañados (MOSCARDI y SOSA, 1995). Este virus ingresa a la
polilla con la ingestión de alimento contaminado con los cuerpos de inclusión, el que
se disuelve en el intestino, debido al pH alcalino; luego, las partículas virales liberadas
se fusionan a la membrana plasmática de las microvellosidades del intestino medio y
las nucleocápsides desnudas penetran al citoplasma de las células. Después se inicia
la replicación del virus y comienza la infección. El insecto disminuye el consumo y
luego, deja de alimentarse, por lo que se debilita y muere en un período de 4 a 25 días
(LECUONA y LOBO, 1996).
El CpGv ha sido por largo tiempo la alternativa casi exclusiva para el manejo de C.
pomonella en huertos orgánicos, sin embargo, ya se han detectado casos de
resistencia a éste en algunas localidades de Europa (SAUPHANOR et al., 2006;
EBERLE y JEHLER 2006).
2.1.4.6 Bio-insecticidas. Desde hace algún tiempo, los insecticidas de origen vegetal
han tomado importancia debido a la manifestación de resistencia de los insectos a los
productos sintéticos, a que éstos también se acumulan en los alimentos y a la
contaminación ambiental que éstos causan (SILVA, 2002).
Los bio-insecticidas son extractos que están formados por un grupo de ingredientes
activos de naturaleza química diversa (SILVA, 2002). El mismo autor señala que ésta,
es una de las ventajas importantes de este tipo de insecticidas, ya que los insectos
demoran más tiempo en generar resistencia a una mezcla de ingredientes activos
12
naturales que a los componentes por separado. Esto debido a que la detoxificación de
un complejo de sustancias, es más difícil que la de una molécula por separado.
Los derivados del árbol Neem (Azadirachta indica A. Juss.), corresponden a los bio-
insecticidas más ampliamente utilizados. Su principal ingrediente activo, la
azadiractina, ha mostrado acción antialimentaria, reguladora del crecimiento, inhibidora
de la oviposición y esterilizante en insectos de varios órdenes (SILVA, 2002).
2.2. Azadirachta indica A. Juss.
Es un árbol conocido comúnmente como margosa o neem que pertenece la familia
Meliaceae. Nativo del sur de Asia, se encuentra en las zonas semiáridas de Asia y
África (PARROTTA y CHATURVEDI, 1994).
MORDUE (2004), menciona que este árbol se utiliza para la reforestación como
proveedor de sombra. El aceite del fruto se emplea en jabones y detergentes.
También, indica que los productos del neem han sido utilizados para fabricar
antisépticos, anticonceptivos, antipiréticos y antiparasitarios.
FIGURA 2 Neem como plaguicida.
Fuente: KOUL (2004).
NEEM
Acaricida
Fungicida
Nematicida
Bactericida
Viricida
Molusquicida
Repelente
Antigonadal
Antialimentario
Insecticida
Regulador del crecimiento
Inhibidor de la oviposición
Anti-insecto
13
PARROTTA y CHATURVEDI (1994), señalan que en las hojas, frutos y corteza del
neem se encuentra agentes medicinales e insecticidas. De acuerdo a KOUL (2004), los
derivados del neem tienen efecto sobre 500 especies de insectos de distintos órdenes.
El autor considera al neem como un plaguicida el cual no sólo afecta a los insectos,
sino que también a algunos ácaros, hongos, nemátodos, bacterias, moluscos y virus
(Figura 2). Además, aclara que este plaguicida no mata directamente a las plagas, sino
que altera su comportamiento y fisiología, lo que a futuro contribuye con su manejo.
2.2.1 Azadiractina. Según RAMOS (s/f), el neem contiene varios terpenoides, siendo
los pertenecientes al grupo de los limonoides (triterpenoides) los más importantes en el
manejo de plagas por su actividad y concentración. Dentro de este grupo, destaca la
azadiractina (Figura 3), la más activa y efectiva para combatir a los insectos. Este
compuesto se encuentra en la corteza, hojas y frutos del árbol, aunque la mayor
concentración se ubica en la semilla (SILVA, 2002). Las proporciones en la semilla
varían entre 0,1 a 0,9% (RAMOS, s/f).
La compleja estructura de esta molécula está constituida por, al menos, nueve
isómeros estrechamente relacionados (RAMOS, s/f). La azadiractina tipo A es el
ingrediente activo que se encuentra en mayor concentración y el cual tiene el mayor
nivel insecticida (RUCH, 2001). Se estima que del tipo A existe un 83 %, del tipo B 16
% y el resto lo constituyen las variaciones de C a K.
Debido a su complejidad, la azadiractina no ha podido ser sintetizada en laboratorio,
por lo cual, los insecticidas en base a neem son obtenidos directamente del árbol.
Además, cuando la molécula ha sido aislada y probada por sí sola, los resultados han
sido menores a cuando se aplican extractos (SILVA, 2002).
RAMOS (s/f), indica que dosis de 30 - 60 g ha-1 de azadiractina controlarían a varios
insectos de hábitos chupador y masticador.
14
FIGURA 3 Azadiractina.
Fuente: MORGAN (2009).
2.2.2 Efectos insecticidas y modo de acción. MORGAN (2009), indica que la
azadiractina es un compuesto que posee propiedades biológicas, teniendo efecto
disuasivo de la alimentación en muchos insectos e interrumpiendo el crecimiento de la
mayoría de éstos y de muchos artrópodos.
2.2.2.1 Efecto antialimentario. Este efecto se puede dividir en dos categorías. El
primero gustativo, que actúa cuando los quimiorreceptores del gusto del insecto, en las
patas y en las piezas bucales, detectan la azadiractina (MORDUE, 1997). Según
Simmonds y Blaney 1984 citado por MORDUE (2004), la azadiractina estimula las
“células de disuasión” en los quimiorreceptores y también bloquea la secreción de las
“células receptoras de azúcar”, las cuales estimulan la alimentación. Por lo tanto, se
inhibe la alimentación, y el insecto muere por inanición.
El segundo, anorexia, provocada por los efectos tóxicos de la azadiractina, después de
la ingestión o absorción (MORDUE, 1997). Estos efectos son debidos a la perturbación
hormonal y/o a otros sistemas fisiológicos (MORDUE, 2004).
MORDUE (1997) menciona que el efecto antialimentario gustativo varía según las
especies (CUADRO 3), los lepidópteros son las más sensibles a la azadiractina,
mientras que los órdenes Coleoptera, Hemiptera e Hymenoptera, presentan una
15
sensibilidad media. Los insectos del orden Orthoptera, presentan distintos grados de
sensibilidad.
CUADRO 3 Sensibilidad de los insectos a la azadiractina.
Orden DL50 a(ppm) Lepidoptera < 0,001 - 50 Coleoptera 100 - 500 Hemiptera 100 - 500 Hymenoptera 100 - 500 Orthoptera 0,001 - > 1000
FUENTES: Adaptado de MORDUE (1997).
a DL50: dosis letal para el 50% de la población.
MORDUE (2004), señala que los hemípteros, al ser de sensibilidad media, consumen
cantidades suficientes de azadiractina para que produzca efectos fisiológicos.
2.2.2.2. Efectos fisiológicos. RAMOS (s/f), indica que la azadiractina tiene efectos en
el crecimiento y reproducción de los insectos. Este compuesto es semejante a la
estructura de la ecdisona, hormona que controla la metamorfosis. Según MORDUE
(1997), estos efectos pueden ser directos o indirectos. Los directos, actúan en un tejido
específico y los indirectos, por el sistema endocrino. Este último, se ve afectado por el
bloqueo de la liberación de la ecdisona y la hormona juvenil (Morgue y Blackwell, 1993
citado por MORDUE, 1997).
El mal funcionamiento de las hormonas puede producir malformaciones en cualquier
estadío, retrasar la muda, inducir incapacidad para completar la ecdisis, pudiendo
además, disminuir la fecundidad y fertilidad (RAMOS, s/f).
MORDUE (2004), señala que la azadiractina afecta los procesos reproductivos de los
machos y hembras. En los machos, se ha visto una inhibición del desarrollo de los
testículos, mientras que en las hembras, se inhibe el desarrollo de los ovarios.
16
En ensayos realizados por OKUMU et al. (2007), el aceite de neem a una
concentración de 32 ppm de azadiractina provocó el 93% de mortalidad en larvas de
Anopheles gambiae. AGUILERA et al. (2009), indican que la azadiractina demostró
afectar la oviposición e inhibir la embriogénesis en Aegorhinus superciliosus,
presentándose un 86% de efectividad en la reducción de la embriogénesis a una
concentración de 20 ppm de azadiractina.
2.2.3 Extractos. Según RAMOS (s/f), existen tres procesos básicos de extracción: la
extracción acuosa, la extracción alcohólica y la extracción de aceite (Cuadro 4).
KLEEBERG (2004), menciona que el contenido de azadiractina varía según la calidad
de las semillas de neem y del procedimiento de extracción. Debido a las diferencias de
los productos en el mercado, indica que la FAO ha dividido estos productos en dos
grupos, los que contienen aceite de neem y los extractos ricos en azadiractina libres de
aceite de neem.
CUADRO 4 Cantidad de azadiractina obtenida utilizando distintos solventes.
Azadiractina encontrada Solvente usado µg/10µL Etanol (95%) 2,8 Metanol / agua (85:15) 2,6 Metanol 2,19 Acetona 0,74 Etil-éter 1,28
FUENTE: adaptado de RAMOS s/f.
Los insecticidas en base a neem pueden variar en su actividad biológica, ya que
además de azadiractina pueden contener otros químicos que se encuentran en la
semilla del neem que también tienen actividad insecticida como nimbina, melantriol, y
salanina. Este último, por ejemplo inhibe la alimentación de los insectos, sin embargo
no afecta su fisiología (MORDUE, 1997).
17
Además, la actividad biológica y toxicidad de los insecticidas en base a neem pueden
variar debido a los diferentes procesos de extracción, los solventes de la formulación y
adyuvantes (Isman 1999, citado por LIANG et al., 2003).
2.2.4 Efecto de la azadiractina en parasitoides. Según CÓNDOR (2007), el impacto
de los insecticidas a base de neem es mínimo en los parasitoides si se aplican bajas
dosis o las dosis que se utilizan comúnmente en el campo. Además, destaca que las
suspensiones acuosas de neem son menos tóxicas que los extractos de aceite de esta
planta para los parasitoides.
En el ensayo realizado por TANG et al. (2002), en el cual alimentaron adultos de
Lysiphlebus testaceipes (parasitoides de Toxoptera citricida) con hojas de cítricos
rociadas con neemix 4.5 (4,5% de azadiractina) no existió una disminución de la tasa
de supervivencia de este parasitoide cuando se aplicaron 11 y 45 ppm de azadiractina.
Sin embargo, los autores señalan que al aplicar 180 ppm del compuesto existió una
reducción de la supervivencia y emergencia de los parasitoides, pero a la vez, indican
que esta dosis no es económicamente viable y tampoco se requiere una dosis tan alta
para controlar a Toxoptera citricida.
2.2.5. Neem-X® Neem-X® es un insecticida orgánico, cuyo ingrediente activo
mayoritario es la azadiractina, la que se extrae utilizando etanol. Pertenece al grupo
químico de los limonoides, contiene 0,4% de este ingrediente activo y se encuentra
formulado como suspensión concentrada. En cuanto a su toxicidad, se clasifica en el
grupo IV, por lo que se considera no peligroso para mamíferos. Este producto está
recomendado para varios insectos, entre los cuales se encuentra Cydia pomonella
AFIPA (2007), estando permitido para el control de plagas en la producción orgánica
en Chile (CHILE, MINISTERIO DE AGRICULTURA, 2007).
18
3 MATERIAL Y MÉTODO
3.1 Lugar del ensayo
El ensayo se realizó en el Laboratorio de Entomología, perteneciente al Instituto de
Producción y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad
Austral de Chile.
3.2 Material biológico
Las larvas de Cydia pomonella fueron obtenidas de huevos procedentes del Instituto de
Investigación Agropecuaria (INIA) Quilamapu (Chillán), en donde se mantienen crías
continuas en laboratorio, sobre dieta artificial.
3.3 Dieta
Las larvas fueron alimentadas con la dieta artificial “Stonefly Industries Ltd.”, la cual se
encuentra como sólido (polvo). De acuerdo a las indicaciones del fabricante, ésta fue
preparada con un 25% del sólido, 75% de agua, 0,1% de formaldehído y 0,2% de ácido
acético.
3.4 Insecticida
Se utilizó el producto comercial Neem-X® (Marketing Arm International Inc.), formulado
a partir de semillas de neem (0,4% azadiractina). Según lo señalado por AFIPA (2007)
la dosis recomendada está en el rango de 2,5 -5 mL de producto comercial por litro de
agua.
En este ensayo se consideró la dosis menor (2,5 mL L-1), la dosis mayor (5 mL L-1), el
promedio de éstas (3,75 mL L-1) y dos dosis adicionales (1,25 mL L-1 y 6,25 mL L-1).
19
3.5 Tratamientos
Se realizaron seis tratamientos, un control sin la aplicación del insecticida y cinco
tratamientos con concentraciones crecientes de éste.
Cada repetición fue preparada con 10 g de la dieta artificial, 28 mL de agua destilada, 2
mL de la solución insecticida, 30 μL de formalina y 60 μL de ácido acético. Para el
control (T0), la solución insecticida se reemplazó por agua destilada (Cuadro 5).
A continuación se específica los ingredientes de cada repetición de los tratamientos:
CUADRO 5 Ingredientes de cada repetición de los distintos tratamientos.
Dieta Agua destilada Neem-X® Formalina Ácido acético AzadiractinaTratamiento g mL mL L-1 μL μL ppm
0 10 30 0,00 30 60 0 1 10 28 1,25 30 60 5 2 10 28 2,50 30 60 10 3 10 28 3,75 30 60 15 4 10 28 5,00 30 60 20 5 10 28 6,25 30 60 25
3.6 Establecimiento del ensayo
Para establecer el ensayo se procedió a preparar las soluciones insecticidas, y fueron
incorporadas a la dieta de acuerdo a cada tratamiento (Figura 4a). Aproximadamente 4
g de de la dieta, fueron distribuidas en frascos de plástico de 8 mL (Figura 4b).
En cada frasco se introdujo, mediante un pincel húmedo, una larva de menos de 4
horas de edad. Los frascos se taparon herméticamente y se mantuvieron en cámara
de crianza con una temperatura de 25 ± 2 ºC, humedad relativa de 55 ± 5% y
fotoperíodo de 16 horas luz y 8 h de oscuridad (EBERLE y JEHLER, 2006).
20
FIGURA 4 a: Preparación de las soluciones insecticidas, b: Establecimiento del ensayo.
3.7 Evaluaciones
A continuación, se describirán las evaluaciones que se realizaron durante el ensayo.
3.7.1 Comportamiento alimenticio. Durante los primeros cinco días del ensayo, se
evaluó el comportamiento alimenticio de las larvas. Se consideró que una larva se
alimentaba cuando se encontraba al interior de la dieta o se observaban los desechos
sobre la superficie de ésta (Figura 5a). En cambio, una larva que se encontraba en la
superficie de la dieta o en las paredes del frasco, se consideró como no alimentándose.
FIGURA 5 a: Desechos de Cydia pomonella sobre dieta artificial. b: Peso de larvas (L5) de C. pomonella.
a b
b a
21
Adicionalmente, para determinar diferencias entre los diferentes concentraciones se
pesaron las larvas cuando éstas alcanzaron el quinto estadío (Figura 5b).
3.7.2 Anormalidades morfológicas. Una vez por semana y durante todo el período
del ensayo, se observó la existencia de posibles anormalidades en las larvas, pupas o
adultos. Se consideraron como anormalidades diferencias en la coloración y el
tamaño, respecto a un insecto normal, así como también la dificultad en la muda de las
larvas y pupas (formas anormales y mudas incompletas) y las deformaciones de los
adultos.
3.7.3 Mortalidad. La mortalidad de las larvas se evaluó una primera vez, a los siete
días de establecido el ensayo (EBERLE y JEHLE, 2006), y posteriormente se
realizaron observaciones semanalmente, en tres ocasiones. Para esta actividad, se
escarbó en la dieta hasta encontrar la larva y verificar si ésta se movía luego de
estimularla con un pincel.
3.7.4 Estados de desarrollo. Al momento de observar la mortalidad, se evaluó
también el estadío en el que se encontraban las larvas. Para ellos se realizaron
comparaciones en relación al testigo, para determinar si las larvas tratadas tuvieron
alteraciones en el ciclo normal de desarrollo (adelanto o retraso de éste).
FIGURA 6 a y b Cápsulas cefálicas de Cydia pomonella.
a b
22
Para determinar el estadío de las larvas se contabilizaron cuidadosamente las cápsulas
cefálicas que se encontraron en el frasco (Figura 6a y 6b).
3.7.5 Porcentaje de pupas y adultos. Desde la tercera semana de establecido el
ensayo, una vez por semana y durante un periodo de cuatro semanas, se determinó el
porcentaje de insectos que pasaron a los estados de pupa o adulto.
3.7.6 Fecundidad en adultos y fertilidad de huevos. Para determinar los posibles
efectos subletales de las concentraciones evaluadas en este ensayo, se determinó la
fecundidad y fertilidad de los insectos que llegaron al estado adulto. Para ello, se
consideraron 4 parejas de los tratamientos T0, T1 y T2, debido a que en éstos emergió
la cantidad necesaria de adultos para realizar esta evaluación. Las parejas fueron
instaladas en forma individual en cilindros plásticos con un soporte para los huevos
(Figura 7a). Los adultos que conformaron las parejas fueron seleccionados de acuerdo
a las condiciones físicas, es decir, que no se encontraran con defectos morfológicos.
Éstas fueron mantenidas bajo las mismas condiciones ambientales utilizadas durante
la primera etapa del ensayo. Luego, de cinco días se evaluó el número de huevos
(Figura 7b y 7c) y posteriormente, a los seis días, y durante tres días, el porcentaje de
ellos que eclosó.
FIGURA 7 a. Cilindro plástico con soporte para huevos. b y c . Huevos de C. pomonella.
a c b
23
3.8 Diseño experimental.
Para este ensayo fue utilizado un diseño experimental completamente al azar con
cinco tratamientos. La unidad experimental fue constituida por 10 larvas y se
realizaron 4 repeticiones (40 larvas por tratamiento).
3.9 Análisis estadístico de los datos.
Las mortalidades observadas fueron corregidas de acuerdo a la fórmula de ABBOTT
(1925):
Donde,
M= número de larvas muertas con el insecticida.
T= número total de larvas tratadas con insecticida.
%MC= porcentaje de mortalidad de larvas tratadas sólo con el solvente.
Para determinar las diferencias entre la proporción de los distintos estadíos se utilizó la
Prueba de G (SOKAL y ROHLF, 1995). Los demás resultados fueron sometidos a un
análisis de varianza (ANDEVA). Para detectar diferencias entre los tratamientos, las
medias fueron comparadas a través de la prueba de Fisher (FPLSD) con una
significación del 5%. Los datos fueron procesados con el programa estadístico
computacional STATISTICA 7.1
Mortalidad corregida = (((M/T)*100) - %MC)
(100 - %MC)*100
24
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina sobre el comportamiento alimenticio de larvas de Cydia pomonella.
Durante los primeros cinco días de evaluación las larvas de C. pomonella se
introdujeron en la dieta y en la mayoría de los casos, se mantuvieron dentro de ella
durante todo este período. De acuerdo a esto, el producto utilizado no tuvo un efecto
repelente inmediato en las larvas, presentándose en todos los tratamientos un alto
porcentaje de alimentación. El tratamiento T4 (20 ppm) presentó el menor porcentaje
de larvas alimentándose (94%), no obstante no se diferenció del tratamiento control
(T0). Los demás tratamientos tuvieron un porcentaje mayor a éste (Figura 8).
FIGURA 8 Porcentaje de larvas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) que se alimentaron durante los primeros cinco días de establecido el ensayo.
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa de acuerdo a la prueba de Fisher
(F=3,03, p=0,0014).
bc* a a a
b
abc
25
Estos resultados no concuerdan con lo señalado por BURBALLA et al. (1995), quiénes
utilizando 30 ppm de azadiractina incorporada a dieta artificial, detectaron durante los
primeros tres días del ensayo la detención de la alimentación en un 49% de las larvas
de C.pomonella criadas en dicha dieta. Esta diferencia podría deberse a que la
concentración usada por los autores fue superior a las consideradas en la presente
investigación (25 ppm). Por otra parte, KOUL (1999) señala que Macrosiphoniella
sanbornii (Homoptera: Aphididae) y Macrosiphum rosae (Homoptera: Aphididae) no
mostraron repelencia a la azadiractina en concentraciones entre 10 a 200 ppm, lo que
indicaría que existen otros factores que pueden influenciar esta respuesta.
Pese a que durante los primeros cinco días no se observaron diferencias en la
alimentación de las larvas sobre los distintos tratamientos, sí se detectaron algunas
larvas fuera de la dieta durante el transcurso del ensayo (Figura 9). Esto concuerda
con el estudio realizado por LIANG et al. (2003), quienes observaron que al introducir
larvas de Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) de segundo, tercer y cuarto
estadío en discos de hojas de repollo tratadas con distintas concentraciones de
azadiractina (4,8 y 20 ppm), éstas se alimentaron por un cierto tiempo, y luego dejaron
de hacerlo.
FIGURA 9 Larvas de Cydia pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina que se encontraron fuera de la dieta, a (T3 = 15 ppm) y b (T5 = 25 ppm) en la segunda semana del ensayo y c (T5 = 25 ppm) en la tercera semana.
a c b
26
Como se observa en la Figura 10, los periodos sin alimentarse originaron diferencias
de peso de larvas de quinto estadío entre los tratamientos. Las larvas control (T0)
presentaron el mayor peso, y éste fue disminuyendo en los demás tratamientos a
medida que aumentaba la concentración de azadiractina incorporada en la
dieta.
FIGURA 10 Peso (mg) de larvas de C. pomonella de quinto estadío tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm).
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa de acuerdo a la prueba de Fisher
(F=32,837, p<0,01).
Una reducción en el peso al aplicar azadiractina ha sido detectada también por LIANG
et al. (2003) en Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) y por BURBALLA et al.
(1995) en Cydia pomonella. Estos últimos, observaron que al utilizar concentraciones
variables de azadiractina (7,5 a 60 ppm) se produjo una reducción del peso de las
larvas dependiente de la concentración utilizada.
a*
c b
d d
b
27
El efecto de la azadiractina en el comportamiento alimenticio de los insectos puede ser:
primario o gustativo, en el cual, el insecto deja de alimentarse debido a que los
quimioreceptores detectan este compuesto y se inhibe la alimentación; o, secundario o
anoréxico, que se refiere a los efectos fisiológicos que produce la ingesta del
compuesto en el intestino medio, donde las células digestivas no se producen
(MORDUE, 1997).
De acuerdo a esto, los resultados de este ensayo indican que en las larvas evaluadas
no se presentó el efecto gustativo, existiendo sí un efecto anoréxico, evidenciado por
una disminución del peso de los insectos en quinto estadío, el cual puede deberse a
que los éstos no pudieron digerir el alimento consumido.
4.2 Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina sobre el desarrollo de C. pomonella
En la Figura 11, se presenta la proporción de insectos que en la tercera semana del
ensayo, se encontraba en quinto estadío larval (L5) y en pupa para cada uno de los
tratamientos. La diferencia entre los valores presentados en la figura y el 100%,
correspondían a larvas en otros estadíos o muertas. Como se puede observar, no se
produjeron diferencias en la proporción de larvas L5 entre T1 (5 ppm), T2 (10 ppm) y
T0 (control), con valores de 5,1%, 28,2% y 24,1%, respectivamente. Sin embargo,
estos tratamientos sí se diferenciaron de aquéllos con concentraciones más altas de
azadiractina, con valores de 51,4% en T3 (15 ppm), 50% en T4 (20 ppm) y 61% en T5
(25 ppm), siendo este último el que mostró el mayor retraso, sin insectos pupando a la
tercera semana. Estos resultados confirmarían las propiedades retardadoras del
desarrollo de la azadiractina sobre C.pomonella.
28
0102030405060708090
100
T0 T1 T2 T3 T4 T5
Esta
do d
e de
sarr
ollo
(%)
Tratamientos
Pupa
L5
FIGURA 11 Proporción de larvas (L5) y pupas de C. pomonella luego de tres semanas alimentándose en dieta con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0ppm, T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm).
*Letras mayúsculas distintas indican diferencias significativas entre tratamientos en el estado de
pupa. Letras minúsculas distintas indican diferencias significativas entre tratamientos en el estado
de larva (p < 0,05).
La diferencia entre los valores presentados en la figura y el 100%, correspondían larvas en otros
estadíos o muertas.
Esta alteración en el normal desarrollo del ciclo de la polilla de la manzana fue también
detectada en la cuarta semana del ensayo, momento en el cual se observaron los
primeros adultos en los tratamientos T0 (control), T1 (5 ppm) y T2 (10 ppm), no
presentándose diferencias entre ellos (Figura 12). Adicionalmente, se puede observar
que en esta fecha el porcentaje de larvas L5 fue muy pequeño en todos los
tratamientos, exceptuando T5 (25 ppm), el cual fue significativamente diferente a los
tratamientos T0 (control), T1 (5 ppm) y T2 (10 ppm). De la misma forma, el porcentaje
de pupas del mismo tratamiento (8,3%) fue significativamente menor que en el resto de
los tratamientos.
a
AB AB BCD ABC*
a a b b c
D E
29
0102030405060708090
100
T0 T1 T2 T3 T4 T5
Esta
do d
e de
sarr
ollo
(%)
Tratamientos
Adulto
Pupa
L5
FIGURA 12 Estado de desarrollo de larvas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) en la cuarta semana de establecido el ensayo.
*Letras mayúsculas distintas indican diferencias significativas entre tratamientos en el estado de
pupa. Letras minúsculas distintas indican diferencias significativas entre tratamientos en el estado
de larva. (p < 0,05)
La diferencia entre los valores presentados en la figura y el 100%, correspondían larvas en otros
estadíos o muertas.
Como se observa en la Figura 13, ninguna de las larvas alimentadas en dieta con las
concentraciones más altas de azadiractina (T4 (20 ppm) y T5 (25 ppm)) alcanzaron el
estado adulto. En las concentraciones menores, por otro lado, las emergencias fueron
de 59%, 50% y 37%, para T1 (5 ppm), T2 (10 ppm) y T3 (15 ppm), respectivamente,
no existiendo diferencia entre el control (T0) (67,3%) y los tratamientos T1 (5 ppm) y T2
(10 ppm). Sólo T3 (15 ppm) se diferenció de los demás tratamientos.
Estos resultados son comparables con lo obtenido por MUSABYIMANA et al. (2001)
quienes alimentaron a larvas de Cosmopolites sordidus (Coleoptera: Curculionidae)
con pseudotallos de banana sumergidos en extractos (4.000 ppm, 5.500 ppm y 5.800
ppm) o aceite (850 ppm) de neem, en el cual ningún adulto emergió. Sin embargo, las
A A* A A A B
ab a ab bc abc c
30
concentraciones usadas en este ensayo son menores, lo que podría explicar la
emergencia de adultos en las dosis más bajas probadas.
FIGURA 13 Porcentaje de larvas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm) que alcanzaron el estado adulto.
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa de acuerdo a la prueba de Fisher
(F=14,05, p<0,05)
De acuerdo a lo presentado, la azadiractina a las concentraciones más altas evaluadas
originó un importante retraso del desarrollo en Cydia pomonella. Esto era esperable
debido a que este compuesto es conocido por bloquear la liberación de las hormonas,
lo que conlleva a una obstrucción o liberación retardada de la ß-ecdisona y de la
hormona juvenil (Morgue y Blackwell, 1993 citado por MORDUE, 1997). Este retraso
del desarrollo también fue observado previamente en este mismo insecto al utilizar
otros productos a base de neem como Azatin® y Sukrina New®, para los cuales el
retraso del desarrollo también fue dependiente de la concentración utilizada
(BURBALLA et al., 1995).
a* a
a
b
31
4.3 Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina sobre anormalidades morfológicas en larvas, pupas y adultos de C.pomonella.
En la Figura 14, se puede observar una larva normal y algunas de las anormalidades
provocadas por el insecticida en larvas de la polilla de la manzana. Éstas
correspondieron a la presencia de manchas negras en todo el cuerpo, anillo necrótico
en el dorso, larvas transparentes y exuvios adheridos al cuerpo. También se
observaron larvas de menor tamaño que el control (T0) en el mismo estadío.
FIGURA 14 Larvas de C. pomonella tratadas con distintas concentraciones de azadiractina. a: control (T0 = 0 ppm), b: T3 (15 ppm), c y d: T5 (25 ppm).
Algunas de las anormalidades encontradas en este ensayo fueron también observadas
por BURBALLA et al. (1995), quiénes al incorporar extractos a base de neem en dieta
para polilla de la manzana, encontraron que las larvas muertas mostraron además
otras sintomatologías: imposibilidad de desprenderse de la vieja cápsula cefálica o del
exuvio larvario, transparencia de la nueva cápsula cefálica e incluso del resto del
cuerpo y la presencia de un anillo negro en el primer segmento torácico.
d a c b
32
FIGURA 15 Pupas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina, a: control (T0 = 0 ppm), b: T5 (25 ppm), c: T4 (20 ppm), d: T3 (15 ppm).
Al igual que lo sucedido con las larvas, en las pupas se presentaron también algunas
malformaciones (Figura 15). En general, algunos individuos no lograron formar sus
pupas normalmente, produciéndose la muerte de muchas de éstas sin lograr
completar su ciclo. Estos resultados concuerdan con un ensayo realizado por NAQVI et
al. (2007) en el cual observaron anormalidades en larvas y pupas; y una parcial
emergencia de adultos de Musca domestica (Diptera: Muscidae), luego de la aplicación
de azadiractina. En el presente ensayo, pese a que se generaron anormalidades en
larvas y pupas alimentadas en dieta con azadiractina, no hubo diferencias significativas
entre los tratamientos.
Como se aprecia en la figura 16, al considerar malformaciones al estado adulto sí se
presentaron diferencias entre los tratamientos, siendo T3 (15 ppm) el con mayor
porcentaje de adultos anormales (66,7 %). Los demás tratamientos no se diferenciaron
entre sí, con valores de 8,6; 17,4 y 16,6%; para T0 (control), T1 (5 ppm) y T2 (10
ppm), respectivamente. Cabe destacar, que en el gráfico no aparecen los tratamientos
T4 (20 ppm) y T5 (25 ppm) debido a que en éstos no hubo emergencia de adultos.
a c b d
33
FIGURA 16 Porcentaje de adultos anormales de C. pomonella provenientes de larvas alimentadas en dieta con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm, T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm)
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba de
Fisher (F=6,975; p<0,05).
La presencia de malformaciones en adultos también ha sido observada en Podisus
maculiventris (Say) (Hemiptera: Pentatomidae) al ser alimentado con orugas que
recibieron aplicaciones tópicas con soluciones insecticidas en base a azadiractina
(VIÑUELA et al., 1998). Este insecto presentó plegamiento incompleto de las alas,
restos de exuvios adheridos al cuerpo, gotas de hemolinfa pegadas al cuerpo,
coloraciones anómalas en las membranas alares y pronoto asimétrico.
De acuerdo a MORDUE (1997), las malformaciones en los insectos tratados con
insecticidas en base a neem son provocadas por el mal funcionamiento de las
hormonas relacionadas con la muda y la metamorfosis (ecdisona y la hormona juvenil),
lo que se provoca anomalías en ésta y la incapacidad de completarla.
a* a a
b
34
4.4 Efecto de la aplicación de distintas concentraciones de azadiractina sobre la mortalidad en larvas de Cydia pomonella.
En la Figura 17 se presenta la mortalidad acumulada corregida durante las cuatro
semanas de ensayo. Como se puede observar, en la primera semana la diferencia en
la mortalidad de los diferentes tratamientos fue nula. Sin embargo, a medida que
transcurrió el tiempo, la diferencia se hizo más notoria. Al finalizar, en la cuarta
semana, en los tratamientos T4 (20 ppm) y T5 (25 ppm) la mortalidad alcanzó
alrededor del 50%, mientras que en T1 (5 ppm) y T3 (15 ppm), fue sólo de alrededor
del 20% y en T2 (10 ppm) menor al 10%. Sin embargo, este último se diferenció
significativamente de T1 (5 ppm), pero no de T3 (15 ppm) (Anexo 1).
0
10
20
30
40
50
60
1 2 3 4
Semanas
Mor
talid
ad a
cum
ulad
a (%
)
T1
T2
T3
T4
T5
FIGURA 17 Mortalidad acumulada corregida* de larvas C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) durante las primeras cuatro semanas del ensayo.
*Mortalidad acumulada corregida por la fórmula de Abbott (1925)
De acuerdo a lo anterior, el efecto de la azadiractina sobre la mortalidad de larvas de
Cydia pomonella fue dependiente de la concentración, a excepción de lo ocurrido en
T2 (10 ppm) que presentó una mortalidad inferior al T1 (5 ppm).
35
Los porcentajes de mortalidad observados en la presente investigación, fueron muy
bajos al compararlos con ensayos similares, como el realizado por BURBALLA et al.
(1995). Los autores detectaron un 49% mortalidad de Cydia pomonella en los tres
primeros días, al incorporar 30 ppm de azadiractina a la dieta, alcanzándose la muerte
del 100% de los individuos después de siete semanas. Sin embargo, esta diferencia
puede deberse a que las concentraciones utilizadas en el mencionado ensayo fueron
mayores a las utilizadas en éste.
Por su parte OKUMU et al. (2007), aplicó formulados de aceite de neem en larvas
Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae), observando que a una concentración 32 ppm
de azadiractina la mortalidad alcanzó alrededor del 100%, a 16 ppm ésta disminuyó
aproximadamente a 70% y al utilizar 8 ppm a 55%.
De acuerdo a RAMOS (s/f), la mortalidad corresponde a uno de los efectos indirectos
de la azadiractina sobre los insectos, ya que ésta se produce por causas como
inanición (MORDUE, 1997), desnutrición (MORDUE, 1997) y malformaciones o
influencia sobre el sistema endocrino del insecto, lo que a la larga le produce la muerte.
Considerando los resultados de peso de las larvas y de las anormalidades en este
ensayo, la mortalidad observada podría deberse principalmente al efecto anoréxico y
por el desorden provocado en sistema endocrino. Estos resultados concuerdan con lo
descrito por KOUL (1999), en el cual, observaron que los áfidos Macrosiphoniella
sanbornii y Macrosiphum rosae murieron aparentemente por la inanición y por efectos
de la inhibición del crecimiento, luego de ser tratados con azadiractina.
En cuanto a la mortalidad semanal, durante la primera semana, todos los tratamientos
indujeron una mortalidad menor al 5%. En la segunda semana, comienza a notarse el
efecto de las concentraciones de azadiractina donde los tratamientos T4 y T5, mataron
al 10% de los insectos. En cambio, en T1 (5 ppm) la mortalidad fue sólo de 6% y en T2
y T3, fue menor al 5%. En la tercera semana la mortalidad en T1, T2 y T3 también fue
menor al 5%. Sin embargo, en T4 y T5 ocurre la mayor mortalidad, con un 19,4% y
25% respectivamente. En la cuarta semana, se puede observar que aumenta la
mortalidad en las tratamientos de menores concentraciones del producto, T1 con un
20,5%, T2 con un 7,9% y T3 con un 16,2% (Figura 18), lo que confirmaría que ésta
36
ocurre fundamentalmente por los efectos fisiológicos que produce la azadiractina en los
insectos
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
Mor
talid
ad (
%)
1 2 3 4
Semanas
T1
T2
T3
T4
T5
FIGURA 18 Mortalidad semanal corregida* de larvas C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) durante las primeras cuatro semanas del ensayo.
4.5 Efecto de distintas concentraciones de azadiractina en la fecundidad y fertilidad de Cydia pomonella.
A pesar de que el producto no afectó el número de adultos emergidos entre los
tratamientos T0 (control), T1 (5 ppm) y T2 (10 ppm), si produjo un efecto en la fertilidad
de éstos. Para el control (T0), ésta alcanzó un 86,8% siendo significativamente
diferente de los tratamientos T1 (5 ppm) y T2 (10 ppm). La menor fertilidad la obtuvo
T1 (5 ppm), con un 13,3%, T2 (10 ppm), en cambio, un 38,8% (Figura 19). Resultados
similares fueron observados por WEATHERSBEE y MCKENZIE (2005) en el cual más
huevos fueron depositados por Diaphorina citri (Homoptera: Psyllidae) a medida que
aumentaba la concentración de azadiractina. Esto podría deberse al instinto de
sobrevivencia de los insectos, los que al verse amenazados, tratan de asegurar su
descendencia.
37
Una reducción de la fertilidad ha sido observada también, por AGUILERA et al. (2009),
en el cual alimentaron con el mismo producto a adultos de Aegorhinus superciliosus
(Guérin) (Coleoptera: Curculionidae).
FIGURA 19 Fertilidad (%) de polillas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm).
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa de acuerdo a la prueba de
Fisher (p<0,05).
Este mismo efecto de la disminución de la fertilidad fue encontrado en un estudio
realizado por MAHMOUND y SHOEIB (2008), al incorporar Nimbecidene (0,03% de
azadiractina) en dieta sobre la cual alimentaron larvas de Bactrocera zonata
(Saunders) (Diptera: Tephritidae). El mayor porcentaje de disminución de la fertilidad
fue de un 46,4% al incorporar 600 ppm de azadiractina, diferenciándose
significativamente del control. Sin embargo, al incorporar 37,5 y 18,7 ppm, no existió
una diferencia significativa respecto al testigo.
Además, de la disminución en la fertilidad producida por la azadiractina, también se
apreció un efecto en la fecundidad (Figura 20). El control obtuvo un promedio de 33,5
b
c
a*
38
larvas por pareja, siendo significativamente mayor que T1 (5 ppm) y T2 (10 pmm). Sin
embargo, la reducción de la fecundidad fue más alta en T1 (95,5%) que en T2 (65,2%).
Esta reducción es similar a la encontrada en el estudio realizado por TANG et al.
(2002), en el cual, la descendencia disminuyo en un 65-85% respecto al control, luego
de alimentar adultos de Toxoptera citricida (Kirklady) (Hemiptera: Aphididae), con hojas
tratadas con Neemix 4.5 (0,45% de azadiractina)
FIGURA 20 Porcentaje de larvas eclosadas de C. pomonella tratadas con concentraciones crecientes de azadiractina (T0 = 0 ppm; T1 = 5 ppm; T2 = 10 ppm).
* Letras distintas sobre las columnas indican diferencia significativa de acuerdo a la prueba de
Fisher (p<0,05).
Una disminución en la fertilidad y fecundidad ha sido también documentada por KOUL
(1999) en Macrosiphoniella sanbornii (Homoptera: Aphididae) y Macrosiphum rosae.
(Homoptera: Aphididae).
Según MORDUE (1997), los efectos causados por la azadiractina en la fertilidad y
fecundidad de los insectos se deben al mal funcionamiento de las hormonas ecdisona
c
b
a*
39
y juvenil, ya que éstas también se encuentran en el adulto y están relacionadas con el
desarrollo de los huevos. Por lo tanto, se podría provocar una inhibición del desarrollo
de los ovarios y la reabsorción de los huevos. Además, la azadiractina afecta a los
tejidos de rápida división celular, afectando la función de los testículos al inhibir la
formación de espermatozoides (MORDUE, 2004).
4.6 Consideraciones finales.
La dosis de Neem-X recomendada por AFIPA (2007) para el manejo de Cydia
pomonella va en el rango de 2,5 a 5 mL de producto comercial por litro de agua. Sin
embargo, los resultados de este ensayo indican que a la dosis menor, correspondiente
a T2 en este ensayo, no se generan efectos importantes en la mortalidad de los
insectos. En la cuarta semana del ensayo la mortalidad a la misma dosis es menor al
10%, por lo que no se estaría controlando la población en el corto plazo.
A pesar de lo mencionado, sí existe una importante disminución de la fertilidad y
fecundidad a esta dosis. Por lo que, el control estaría dado por la disminución de la
población futura, contribuyendo al manejo en el largo plazo, lo que constituye una
posibilidad para el manejo orgánico de C. pomonella.
Adicionalmente, es importante considerar que estas dosis son recomendadas para su
aplicación en campo, lugar donde las condiciones de alimentación son diferentes: el
insecticida se encuentra en la superficie del fruto, y el insecto lo ingiere sólo antes de
ingresar al interior del fruto. Debido a esto, sería importante realizar ensayos de
campo para determinar si las dosis recomendadas realmente manejan la población de
la polilla de la manzana.
40
5 CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados de este trabajo la azadiractina produce efectos en el
comportamiento alimenticio, en el ciclo de desarrollo, en la supervivencia, en la
fertilidad y fecundidad de Cydia pomonella, por lo que se acepta la hipótesis planteada.
Las distintas concentraciones de azadiractina en la dieta, produjeron un efecto en el
comportamiento alimenticio de las larvas, generando un efecto secundario de la
alimentación. Esto se vio reflejado en la considerable disminución del peso de las
larvas a medida que se aumentó la concentración incorporada en la dieta.
Paralelamente, se observó un retraso en el desarrollo del insecto, especialmente en las
dos concentraciones mayores, en las cuales no se alcanzó el estado adulto.
Todos los estados de desarrollo evaluados (larva, pupa y adulto) presentaron
anormalidades morfológicas, sin embargo, éstas fueron significativas sólo en el caso
de los adultos.
La mortalidad de las larvas no fue la esperada, a pesar que en las concentraciones
mayores ésta alcanzó alrededor del 50% a la cuarta semana del ensayo.
Algunas de las concentraciones de azadiractina evaluadas, produjeron reducciones
significativas en los parámetros de fertilidad y fecundidad de C. pomonella. Esta última,
presentó una reducción del 95,5% respecto al control en el tratamiento T1 (5 ppm).
41
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47
7 ANEXO
Anexo 1. Mortalidad acumulada corregida de larvas C. pomonella tratadas con azadiractina (T1 =5 ppm; T2 = 10 ppm; T3 = 15 ppm; T4 = 20 ppm; T5 = 25 ppm) durante las primeras cuatro semanas del ensayo.
Tratamiento Semana 1ab Semana 2 ab Semana 3 ab Semana 4 ab T1 0,0 a 5,1 ab 8,0 abc 25,9 cd T2 0,0 a 0,0 a 0,0 a 4,6 ab T3 0,0 a 3,6 abc 8,9 abc 21,9 bcd T4 0,0 a 8,8 abc 31,3 de 49,1 e T5 0,0 a 10,3 abc 34,5 de 48,3 e
a Mortalidad acumulada corregida por la fórmula de Abbott (1925)
b Letras distintas en las columnas indican diferencia significativa entre los tratamientos
