Kor. J. Microbiol. Biotechnol.Vol. 37, No. 4, 340–349(2009)

메주로부터 분리한 항진균 및 항세균 활성의 Bacillus polyfermenticus CJ9

정지혜·장해춘*조선대학교 식품영양학과

Bacillus polyfermenticus CJ9, Isolated from Meju, Showing Antifungal and Antibacterial Activities.Jung, Ji Hye and Hae Choon Chang*. Department of Food and Nutrition, Chosun University, Gwangju 501-759, Korea − A CJ9 bacterial strain, which showed antifungal and antibacterial activities, was isolated frommeju and identified as Bacillus polyfermenticus based on Gram staining, biochemical properties, as well as its16S rRNA sequence. B. polyfermenticus CJ9 showed the antimicrobial activity against the various pathogenicmolds, yeasts, and bacteria. The antibacterial activity was stable in the pH 5.0~9.0, but the activity was lost at37oC for 24 hr. The antifungal activity was stable in the pH range of 3.0~9.0 and reduced at 121oC for 15 min,but antifungal activity was not completely destroyed. The antibacterial activity was completely inactivated byproteinase K, protease, trypsin, and α-chymotrypsin. The antifungal activity was also completely inactivatedby protease and α-chymotrypsin, and reduced its activity by proteinase which indicated that the antifungal andantibacterial compounds have proteineous nature. The apparent molecular mass of the partially purified anti-fungal compound, as indicated by using the direct detection method in Tricine-SDS-PAGE, was approxi-mately 1.4 kDa. The molecular mass of the antibacterial compound could not be determined because of itsheat-liable characteristic.

Key words: Bacillus polyfermenticus, antifungal activity, antibacterial activity, proteineous nature

서 론

오랜 세월동안 식품 및 각종 발효산업에서 이용되어진

Bacillus 속은 산업적으로 중요한 속으로서 생물 산업에서 숙

주로 널리 사용되고 있다[11]. Bacillus 균주는 protease,

amylase, glucanases 및 cellulase 등의 중요한 효소, 다양한

구조를 지니는 항균 활성 물질, 식품풍미개선제용 nucleotides

와 nucleosides, 그리고 아미노산 등을 생산하는 특징을 지

니고 있다[36].

Bacillus 속은 종에 따라 다양한 항균 물질들을 생산하며,

이중 항세균 활성 물질에 관한 보고로는 B. subtilis로부터의

subtilin[15], surfaction[16] 등, B. brevis로부터의 brevistin

[30], edeines[18], gramicidin[41] 등, B. licheniformis로부

터의 bacitracin[32], B. circulans로부터의 polypeptins[8],

EM49[22], B. mesentericus로 부터의 esperin[38] 등이 있으

며, 항진균 활성물질에 관한 보고로는 B. subtilis로부터의alboleutin[24], bacillomycin[7, 37], fengycin[40], iturin[2,

21], mycosubtilin[1, 28], rhizocticins[17] 등이 있으며, 항세

균과 항진균 활성을 동시에 지니는 물질에 관한 보고로는 B.

subtilis로부터의 bacilysin[23] 등이 있다.

B. polyfermenticus는 약 0.8×4~4 µm의 크기의 간균으로

그람 양성의 비병원성균이며, 아포를 형성하고 옅은 황색의

콜로니를 plate 배양시 형성 한다[6]. 또한 20여종의 효소를

분비하여 인체의 3대 영양소인 탄수화물, 지방, 단백질 및

섬유소를 소화, 흡수시키고 병원성 균들인 티프스균, 파라

티프스균, 콜레라균, 적리균 등을 용균시켜 생육을 억제하

는 기능을 가지고 있다[6]. B. polyfermenticus는 일본약국

방외의약품성분규격에 당화균(amylolytic Bacillus)이라 하

여 B. subtilis 및 B. mesentericus와 함께 게재되어 있으나,

Bergey's manual에 따른 국제명명규약에 의한 분류명에는

존재하지 않는다[31]. 그러나 미생물 분류상의 특징들을 비

교해 보면, B. polyfermenticus는 B. subtilis와 상당히 유사

한 것으로 인정되며, B. subtilis와 다른 점은 B. polyfer-

menticus가 유당을 분해하는 능력이 있고 포도당과 유당에

서 초산과 젖산을 더욱 많이 생산하는 것 등이다[20].

최근 Bacillus polyfermenticus를 이용한 프로바이오틱 생

균제에 대한 산업적인 유용성이 증대되고 있으며, 그중에서

도 B. polyfermenticus SCD는 프로바이오틱 생균제로 시판

되고 있다[9]. 기존에 보고된 B. polyfermenticus 유래의 항

진균 물질에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이며, 보고된 연

구들도 대부분 좁은 범위의 항진균 활성만을 가지고 있다

[13, 20]. 향후 프로바이오틱 생균제로 그 활용성이 기대되

는 B. polyfermenticus 중 식품의 부패와 식중독을 일으키는

인체에 유해한 곰팡이, 효모 및 세균 등의 미생물에 대해 적

*Corresponding authorTel: 82-62-230-7345, Fax: 82-62-222-8086E-mail: hcchang@mail.chosun.ac.kr

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACILLUS POLYFERMENTICUS 341

용될 수 있는 넓은 범위의 항균력을 가지고 있는 GRAS

(generally regarded as safe) 등급의 B. polyfermenticus 유

래의 항균제나 생균제재의 개발은 그 유용성을 더욱 크게 할

것이다.

본 연구팀은 우리나라 재래식 메주로부터 항세균 및 항진

균 활성을 나타내는 균주들을 분리하였다. 이중 항세균 활

성과 항진균 활성을 모두 지닌 B. polyfermenticus를 분리하

였고, 이에 본 연구에서는 분리균주의 미생물학적 특성과 이

분리균주가 생산하는 항세균 및 항진균 활성 및 활성 물질

의 특성을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

항진균 활성 균주의 분리항진균 활성 균주를 분리하기 위해 가정에서 제조된 재래

형 메주를 수집하였다. 수집된 메주는 분쇄기를 사용하여 마

쇄 후 이중 1 g을 취하여 10 mL의 멸균수에 현탁한 후, 현탁

액을 100 µL 또는 200 µL를 취하여 평판배지에 도말하였다.

이때 사용된 배지로는 Luria broth(LB, 1% bacto-tryptone,

0.5% yeast extract, 1% NaCl) 평판배지, malt extract agar(MEA, Difco Laboratories), potato dextrose agar(PDA,

Difco Laboratories) 배지 또는 이에 2%(w/v) skim milk

(Difco Laboratories)를 첨가한 배지를 사용하였다. LB 평판

배지는 37oC, MEA 평판배지는 30oC, PDA 평판배지는

25oC에서 2~5일 동안 배양하면서 곰팡이 및 세균들에 대해

생육저해 활성을 나타내는 균주를 분리하였다.

분리균주의 동정분리균주의 동정은 형태학적 특성으로 그람 염색 및 포자

형성 관찰과 API 50 CHB system(BioMérieux, Co., France)

을 이용하여 당 이용능을 조사하는 생화학적 특성을 통하여

일차적으로 균주를 동정하였으며, 분리 균주의 16S rRNA

gene 염기서열 결정을 통하여 최종적인 동정을 하였다. 분리

균주의 chromosomal DNA를 Genomic DNA purification

kit(Q-Biogene, U.S.A.)을 이용하여 분리한 후, Universal

primer[42]를 사용하여 1차 PCR을 수행하였다. 2차 PCR은

B. subtilis와 B. polyfermenticus의 16s rRNA gene의 염기

서열 중 상동성이 높은 부분을 primer 서열(Ba4-F: 5'-AGCTGCTCCCTGATGTTAG-3'; 4-subRR: 5'-TCGAAG-

AATCGAATGATCCT-3')로 합성하여 시행하였다. 증폭된

PCR 산물은 pGEM-T easy vector(Promega Co., U.S.A.)에

cloning한 후 ABI PRISM 3730 DNA analyzer(Applied

Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)를 이용하여 염기 서

열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램[10]을 이용

하여 GenBank의 ribosomal RNA gene sequence와 비교하

였으며 sequence의 상동성은 CLUSTAL X program을 이용

하여 비교분석하였다.

분리 균주의 유당 이용능분리균주의 유당 이용능을 조사하였다. 분리균주를 tryptic

soy broth(TSB, Difco Laboratories)에 접종하여 37oC에서

12시간 전배양한 후 전배양액을 TSB 액체 배지와 유당 1%,

2%가 각각 첨가된 TSB 액체 배지에 1% 접종하여 37oC에

서 48시간 동안 진탕배양 후 12시간 간격으로 세포 생육 정

도를 600 nm(Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences,

Uppsala, Sweden)에서 흡광도로 측정하였다. 이때 대조구로

는 유당을 이용하지 못하는 B. subtilis ATCC 6633을 사용

하였다.

생육시기에 따른 항균 활성 측정분리균주의 배양시간에 따른 생육도와 항균 활성을 조사

하기 위하여 분리균주를 50 mL TSB 액체배지에 1% 접종

하여 37oC에서 0~120시간 동안 진탕배양하면서 600 nm에

서 흡광도를 측정하여 생육곡선을 그리고, 이때 생육시기에

따른 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성 측정은 paper disk

method[35]를 사용하여 다음과 같이 시행하였다. 항세균 활

성은 B. subtilis ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 LB 평

판배지에 1×105 cfu/mL로 도말한 후 8 mm 직경의 paper

disk(ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 놓

고 항균 물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다. 항진균 활성

은 감수성 곰팡이인 Aspergillus petrakii PF-1의 포자를

PDA 배지 20 mL에 1×106 cfu/mL로 첨가하여 petri dish에

부은 후에 굳으면 8 mm 직경의 paper disk를 놓고 항진균

물질을 100 µL씩 일정하게 가하였다. 항세균 활성은 37oC에

서 24시간 배양하여, 항진균 활성은 30oC에서 48시간 배양

한 후 활성을 측정하였다. 항균활성은 diamatic caliper(CD-

15CPX, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 생육저지환의 지름으

로 측정하였으며 3회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하

였다.

조항균 물질의 준비조항균 물질을 준비하기 위해 분리 균주를 5 mL TSB 액

체배지에 접종 하여 37oC에서 12시간 전배양한 후 50 mL

TSB 액체 배지에 전배양액을 1% 접종하여 37oC에서 30시

간 동안 본배양하였다. 본배양액을 원심분리(9,500×g, 15

min, 4oC) 후 상등액을 0.2 µm membrane filter(Advantec

MFS, Inc., Japan)로 제균하여 배양상등액을 조항균물질로

사용하거나 또는 동결건조(Labconco Co., U.S.A.)한 후에 3

차 증류수로 녹여 5배, 10배, 20배 농축하여 사용하였다. 이

때 TSB 액체 배지를 동결건조 후 실험구와 같은 배율로 농

축한 것을 대조구로 사용하였다.

항균 spectrum그람 양성과 음성세균, 효모 및 곰팡이에 대한 분리균주

의 항균 활성은 paper disk method 및 direct method[36]를

342 JUNG AND CHANG

사용하여 조사하였다. 항균 활성 실험에 사용한 미생물 중

ATCC 균주는 American Type Culture Collection(ATCC,

Manassas, VA, U.S.A.)로부터 구입하였으며 본 실험실에

서 토양, 된장, 메주 그리고 김치로부터 분리하여 동정한

균주 Bacillus subtilis cx1[4], Bacillus subtilis DJI[5], A.petrakii PF-1[12], Aspergillus ochraceus PF-2[12], Aspergillus

nidulans PF-3[12], Cladosporium gossypiicola KF-2[12]를

사용하였다. 항균 활성 측정을 위한 감수성 세균은 LB 또는

brain heart infusion(BHI, Difco Laboratories) 평판배지,

감수성 곰팡이는 PDA 또는 MEA 평판배지, 감수성 효모

는 YM(Difco Laboratories) 또는 sabouraud dextrose(SD,

Difco Laboratories) 평판배지에 1×106 cfu/mL로 도말하였다.

Paper disk method는 감수성 균주가 도말된 평판배지 위에

8 mm 직경의 paper disk를 놓고 항균 물질을 100 µL씩 일

정하게 가하였다. Direct method에서는 5 mL TSB 액체배

지에서 12시간 배양된 분리균주 6 µL를 감수성 균주가 도

말된 평판배지 위에 micropipette을 사용하여 3 cm 길이로

그어 주었다. Paper disk method와 direct method에 의한

분리균주의 항균 활성 측정시 감수성 세균은 37oC에서 12

시간 동안 배양하고, 감수성 효모와 곰팡이는 25oC 또는

30oC에서 24~72시간 동안 배양하였다. 항균 활성은 diamatic

caliper를 사용하여 생육저지환의 지름으로 측정하였으며 3

회의 반복실험을 한 후 평균값을 사용하였다.

항균 물질의 안정성항세균 및 항진균 물질의 온도, pH 및 각종 효소처리에

대한 안정성을 조사하였다.

온도에 의한 영향을 알아보기 위하여 분리 균주 배양상

등액을 25oC, 37oC, 50oC, 70oC에서 24시간, 100oC에서

30분, 121oC에서 15분간 열처리한 후에 잔존활성을 측정하

였다[4, 20].

pH에 대한 영향을 알아보기 위하여 배양상등액을 5 N

HCl과 5 N NaOH를 사용하여 pH 3.0~9.0으로 조정한 후

4oC에서 4시간 동안 처리한 후 항균 활성을 측정하였다[4,20].

분리균주의 항균 물질의 각종 효소에 대한 영향을 알아보

기 위하여 배양 상등액에 proteinase K(EC 3.4.21.64,

Sigma Co., U.S.A.)는 10 mM Tris-HCl 50 mM NaCl 5

mM EDTA(pH 7.5), protease(type I, Sigma) 및 trypsin(EC

3.4.21.4, Sigma)은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), pepsin(EC

3.4.23.1, Sigma)은 10 mM citrate(pH 6.0), α-chymotrypsin

(EC 3.4.21.1, type I-S, Sigma)은 10 mM phosphate(pH

7.0), lipase(EC 3.1.1.3, type VII, Sigma)는 50 mM Tris-HCl 10 mM CaCl2(pH 7.0), α-amylase(EC 3.2.1.1, Type

VIII, Sigma)는 50 mM sodium phosphate 10 mM NaCl

(pH 7.0)에 4 mg/mL의 농도로 25oC에서 24시간 처리한 후

에 잔존하는 항균 활성을 측정하였다[4, 20]. 이때 대조구로

서는 동일한 반응조건에서 효소만을 제외한 것으로 삼았다.

잔존하는 항세균 및 항진균 활성 측정은 paper disk method

를 사용하여 감수성 세균으로 B. subtilis ATCC 6633을 감

수성 곰팡이로는 A. petrakii PF-1을 사용하였다.

항균 물질의 부분 정제분리균주의 생산물을 분리정제하기위해 분리균주를 50 mL

TSB 액체 배지에서 37oC, 30시간동안 진탕배양 한 후 원심

분리(9,500×g, 15 min, 4oC)하여 얻은 상등액을 0.2 µm

membrane filter로 제균하였다. 소수성 column인 C18 Sep-

Pak(Waters Co., Massachusetts, U.S.A.)을 100% methanol

과 3차 증류수로 미리 soaking한 후에 제균된 상등액을 흡착

시킨 후, 3차 증류수로 수세하고 100% methanol로 용출하였

다. Methanol에 녹아있는 분획을 Speed Vac Concentrator

(Centra-Vac VS-802, Vision, Korea)를 이용하여 용매를 제

거한 후 멸균수에 녹여 항세균 활성과 항진균 활성 측정 및

Tricine-SDS-PAGE[29]에 사용하였다.

Tricine-SDS-PAGE

C18 Sep-Pak column으로 부분 정제한 시료의 항세균 및

항진균 활성을 나타내는 물질의 분자량을 Tricine-SDS-PAGE

를 통하여 결정하였다. 18% acrylamide gel을 사용하여 전

기영동을 시행하였으며, 표준 분자량 물질로는 polypeptide

SDS-PAGE standards(Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하였다. 전기

영동 후 coomassie brilliant blue G(Sigma Co., U.S.A.)로

단백질을 염색 하였고, gel 상에서 항균활성을 나타내는 물

질의 band 확인은 direct detection 방법[3]으로 시행하였다.

분리균주의 부분 정제 시료를 전기영동 후 gel을 25%(v/v)

isopropanol과 10%(v/v) glacial acetic acid 용액에 담가 상

온에서 30분간 고정시키고 증류수로 1시간 30분 동안 세척

하였다. 세척한 gel은 1개의 lane으로 잘라 PDA 평판배지

위에 놓은 후 그 위에 PDA top agar(0.7%, w/v) 10 mL를

분주하여 굳힌 배지 표면에 C. gossypiicola KF-2를 전면에

도말하여 25oC에서 72시간 배양한 후 항진균 생육 저해환

이 생성되는 부분을 확인하였다. 항세균 활성은 B. subtilis

ATCC 6633을 지시균으로 사용하여 1개의 lane으로 자른 gel

을 LB 평판배지 위에 놓고 그 위에 LB top agar(0.7%, w/

v) 10 mL에 B. subtilis ATCC 6633(1×105 cfu/mL)을 첨가

하여 분주하여 굳힌 후 37oC에서 12시간 배양하여 항세균

생육 저해 활성을 보이는 부분을 확인하였다. 대조구로는 분

리균주의 부분 정제한 시료를 첨가 하지 않은 acrylamide

gel을 direct detection에 사용된 band gel과 같은 크기로 잘

라 동일한 세척 및 활성 측정법을 시행하여 acrylamide 성

분에 의한 생육 저해 작용이 없음을 확인하였다.

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACILLUS POLYFERMENTICUS 343

결과 및 고찰

항균 활성 균주의 분리 및 동정항균 활성 균주를 분리하기 위해 멸균수에 현탁된 메주가

루 시료를 희석하여 LB, MEA, PDA, MEA-skim milk,

PDA-skim milk 평판배지에 도말하여 2~5일간 배양한 후,

형성된 미생물의 집락을 관찰하였다. 관찰 결과 다양한 종

류의 세균(352종)과 곰팡이(10종)들이 관찰되었다. 이중 동

일한 평판 배지 내에서 형성된 곰팡이 집락들에 대해 생육

저해활성을 나타내는 균주를 선별하였다(Fig. 1). 선별된 미

생물(18종)은 곰팡이, 효모, 세균에 대해 direct method 및

paper disk method을 통하여 항진균 활성과 항세균 활성을

조사하였다. 이중 항균 활성 범위가 넓고 그 활성도 강한 균

주 1종을 최종 선별하고(data not shown), 이를 CJ9라 명명

하였다.

분리균주 CJ9은 그람염색 및 포자 형성 관찰 결과 그람

양성의 간균이며 내생포자를 형성하였다. API 50 CHB

system을 이용한 당 이용성 조사를 통한 균주 동정 결과

Bacillus subtilis와 87%의 상동성을 나타내었으며, B.

subtilis ATCC 6633이 유당을 분해하지 못한 결과와 달리

분리균주 CJ9은 유당을 분해하여 대사에 이용하였다(Table

1). 최종 동정을 위하여 16S rRNA gene의 염기서열을 결정

하여(1,520 bp) 이를 GenBank에 등록된 표준균주(type

strain)나 참고균주(reference strain)의 16S rRNA gene 염기

서열들과 상동성을 비교하였다. 그 결과 분리균주 CJ9은 B.

polyfermenticus와 99.9%의 상동성을 나타내어 최종적으로

Fig. 1. Screening of microorganism showing antagonic activityagainst other microorganisms. B, bacteria; F, fungi. MEA-skimmilk medium was used in this experiment.

Table 1. Carbohydrate utilization profile of the CJ9 isolate, as determined using the API 50 CHB system.

Characteristics CJ9 Bacillus subtilis ATCC 6633 Characteristics CJ9 Bacillus subtilis ATCC 6633

Control - - Esculine + +Glycerol - + Salicine + +Erythritol - - Cellobiose + +D-Arabinose - - Maltose + +L-Arabinose + + Lactose + -Ribose + + Melibiose - -D-Xylose + - Sucrose + +L-Xylose - - Trehalose + +Adonitol - - Inuline - +β-Methyl-xyloside - - Melezitose - -Galactose - - D-Raffinose + -D-Glucose + + Starch + -D-Fructose + + Glycogene + +D-Mannose + + Xylitol - -L-Sorbose - - Gentiobiose - +Rhamnose - - D-Turanose - -Dulcitol - - D-Lyxose - -Inositol - - D-Tagatose - -Mannitol + + D-Fucose - -Sorbitol + + L-Fucose - -α-Methyl-D-mannoside - - D-Arabitol - -α-Methyl-D-glucoside + + L-Arabitol - -N-Acetyl glucosamine + + Gluconate - -Amygdaline + - 2-Keto-gluconate - -Arbutine + + 5-Keto-gluconate - -

+, positive; -, negative.

344 JUNG AND CHANG

B. polyfermenticus로 동정되었으며 이를 B. polyfermenticus

CJ9라 명명하였고, 그 16S rRNA gene의 염기서열은

GenBank(FJ436015)에 등록하였다.

분리 균주의 유당 이용능분리균주의 유당 이용능을 조사하기 위하여 유당을 첨가

하지 않은 TSB 액체 배지와 1%, 2% 유당을 각각 첨가한

TSB 배지에서 B. subtilis ATCC 6633 균주와 B. polyfer-

menticus CJ9의 생육도를 600 nm에서 흡광도로 측정하였다.

B. subtilis ATCC 6633은 유당의 첨가 여부와 관계없이 비

슷한 생육도를 나타내었으나, B. polyfermenticus CJ9은 1%

와 2% 유당을 첨가한 TSB 배지에서 유당을 첨가하지 않은

TSB 배지보다 더 높은 생육도를 각각 나타내었다(Fig. 2).

B. polyfermenticus CJ9에 유당을 1%와 2% 첨가한 TSB 배

지에서 48시간 생육시 유당을 첨가하지 않은 TSB 배지보다

훨씬 높은 생육도(A600: 0%-7.37, 1%-11.22, 2%-9.74)를

나타내었다(Fig. 2). 이러한 결과로부터 B. polyfermenticus

CJ9은 유당을 분해하여 대사에 이용함을 알 수 있었으며, 이

와 같은 결과는 Table 1의 API 50 CHB system을 이용한

당 이용성 조사 결과와 함께 기존 보고에서 B. polyfermenti-

cus는 B. subtilis와 상당히 유사한 것으로 인정되고 있으나,

B. subtilis와 다른 점은 유당을 분해하는 능력이 있다는 보

고와 일치하는 결과이다[20].

생육시기에 따른 항균 활성B. polyfermenticus CJ9의 생육에 따른 항세균 및 항진균

활성을 조사하였다. B. polyfermenticus CJ9은 배양 6시간경

대수기를 나타내며 12시간~24시간경 잠시 균체 생육이 정

체되어 보이다가 배양 30시간에 다시 균체 생육이 급격히

증가되며 생육 42시간경 최대 생육도(A600: 7.3)를 나타내

었다. 생육 60시간 이후에는 사멸기에 접어들면서 세포 현

탁도가 서서히 떨어지는 현상을 나타내었다(Fig. 3).

항세균 활성은 대수기인 배양 6시간부터 높은 활성을 보

였으며 배양 12시간에 최대 활성을 나타내었다. 그 이후 배

양 18시간부터 활성이 서서히 감소하다가 72시간 이후 급격

히 활성이 감소되어 배양 120시간에는 활성이 완전히 소실

되었다(Fig. 3).

항진균 활성은 항세균 활성보다 늦게 나타나기 시작하여

배양 24시간 이후부터 최대 활성을 나타내었으며, 배양 60

시간 이후부터 활성이 급격히 감소되었으나 72시간 이후부

터는 최대 활성의 50% 정도를 유지하며 배양 120시간까지

그 활성을 그대로 유지하였다(Fig. 3).

기존 보고에서는 B. polyfermenticus SCD를 TSB 배지에

배양하여 항세균 물질인 polyfermenticin SCD를 생산할 때

3시간에 최대 활성을 나타내다 4시간에 정지기에 이르러 급

격히 활성이 감소되는 것으로 보고하였다[20]. 이것은 항균

물질이 영양원이 고갈된 상태에서 생산되어 일반적으로 생

Fig. 2. Lactose utilization characteristics of the B. subtilisATCC 6633 and B. polyfermenticus CJ9. B. subtilis ATCC 6633(A) and B. polyfermenticus CJ9 (B) were grown in TSB (◆),TSB+1% lactose (■), and TSB+2% lactose (▲). All values weremean ± S.D (n=3).

Fig. 3. Growth and antimicrobial activity of B. polyfermenticusCJ9. □, Cell growth; ▲, antifungal activity (%) against A.petrakii PF-1; ●, antibacterial activity (%) against B. subtilisATCC 6633. All values were mean ± S.D (n=3).

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACILLUS POLYFERMENTICUS 345

육 시기별로 보면 정지기에 축적되었다가 사멸기가 시작되

면서 배양액내에 증가되는 단백질 분해효소의 작용에 의해

분해되기 때문에 활성이 사멸기에 빠르게 소멸된다고 보고

되었다[25]. B. polyfermenticus CJ9 역시 사멸기에 도달하면

서 세포 현탁도와 항세균 및 항진균 활성이 감소되는 현상

은 균이 사멸기에 이르러 포자형성과 세포의 자가분해에 의

한 세포 내 단백분해효소의 방출에 의하여 분해 작용의 결

과로 생각된다. 이로부터 B. polyfermenticus CJ9이 생산하

는 항세균 및 항진균은 B. polyfermenticus CJ9 균체에 의해

분비되는 단백분해효소에 의해 분해되는 단백질성 물질임을

추정할 수 있다.

분리균주의 항세균 및 항진균 활성B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액을 곰팡이 7종, 효모

3종, 세균 10종에 대한 항균 활성을 paper disk method로 조

사하였다. B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액은 그람 양

성균인 B. subtilis ATCC 6633과 식중독 원인균인 Listeria

monocytogenes ATCC 19113에 대하여 강한 저해 활성을 나

타내었으며, 배양상등액을 5배, 10배, 20배 농축하여 처리한

구에서는 그람 양성균과 음성균에 대해 모두 저해 활성을 나

타내었다(Table 2). 이때 사용된 TSB 액체배지만을 5배~20

배 농축하여 처리한 구에서는 본 실험에 사용된 20종의 미

생물에 대하여 어떠한 생육 저해 활성을 나타내지 않음을 확

인 하였다.

B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액의 항진균 활성을

측정한 결과 곰팡이 독소인 ochratoxin A를 생성하는 A.

petrakii PF-1, 식품과 사료의 저장기간 중 부패를 일으키며

곰팡이 독소인 ochratoxin A, B, C를 생산하는 A. ochraceus

PF-2, 알레르기, 폐렴 및 피부염을 일으키는 C. gossypiicola

KF-2의 곰팡이에 대해 강한 저해 활성을 나타내었다(Table

2). 또한 배양상등액을 10배 농축한 구간에서 Penicillium

roqueforti ATCC 10110에 대한 생육 저해활성을 나타내었

으며, 배양상등액을 20배 농축한 구간에서 피부, 손톱, 여

성의 질에 염증을 일으키는 병원성 효모인 Candida

albicans strain에 대해서도 저해활성을 나타내었다(Table 2).

그동안의 연구보고에서 항세균 활성을 나타내는 Bacillus

속에 대한 많은 보고가 있었고 이는 주로 박테리오신과 같

은 항세균 활성에 대한 보고로서[20, 26, 43], 항세균 활성

과 항진균 활성이 동시에 나타나는 보고는 많지 않다[34].

그 중에서도 B. polyfermenticus 유래의 항진균 물질의 생산

에 관한 보고는 미미한 실정이며, 기존에 연구된 B. poly-

fermenticus SCD가 생산하는 항균 물질인 polyfermenticin

SCD도 곰팡이에 대한 항진균 활성이 단 두 종에 제한되어

나타났다[13, 20]. 그러므로 항세균 활성과 항진균 활성을 동

시에 나타내는 B. polyfermenticus CJ9에 관한 본 연구 결과

는 식품 및 사료에 천연보존제로 사용함으로서 저장성을 향

상시킬 뿐 아니라 식중독을 일으키는 병원성 세균, 인체에

유해한 곰팡이의 제어에도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Table 2. Inhibitory spectrum of B. polyfermenticus CJ9.

Microorganisms IndicatorAntimicrobial activity

Supernatant 5× 10× 20×

Gram-positive bacteria

Bacillus subtilis ATCC 6633 Micrococcus luteus ATCC 13513 Streptococcus mutans ATCC 25175 Listeria monocytogenes ATCC 19113 Bacillus subtilis DJIBacillus subtilis cx1

++- - +- -

+++ - -

+++ +-

+++ + +

+++ +++

+++++ ++ ++++++

+

Gram-negative bacteria

Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Salmonella enterica serovar Typhi ATCC 19430

- - - -

-+- -

++ + +

+++++

++

Molds

Aspergillus flavus ATCC 22546 Aspergillus fumigatus ATCC 96918 Aspergillus petrakii PF-1 Aspergillus ochraceus PF-2 Aspergillus nidulans PF-3 Cladosporium gossypiicola KF-2 Penicillium roqueforti ATCC 10110

- - ++- + -

- - ++ -

++ -

- -

++++

-++ +

- -

++++++

-+++

+

YeastsCandida albicans ATCC 24433 Candida albicans ATCC 11006 Candida albicans ATCC 18804

- - -

- - -

- --

+++

Activity was expressed as the diameter of inhibition zone against each sensitive indicator. Degree of clarity of clear zone by growth inhibition:-, no inhibition zone; +, below 14.05 mm; ++, 14.05~17.05 mm; +++, above 17.05 mm.

346 JUNG AND CHANG

항균 물질의 안정성B. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질의 열 안정성 실험

결과 항세균 활성은 25oC에서 24시간 처리시 그 활성이 다

소 저하되며 37oC에서 24시간 처리 후 역가가 완전히 소실

되어 열에 불안정함을 알 수 있었다(Table 3). 그러나 항진

균 활성은 100oC에서 30분간 열처리 후에 활성을 100% 유

지하였으며 121oC에서 15분간 열처리하였을 때도 항진균 활

성이 50%는 잔존하여 열에 매우 안정한 물질임을 알 수 있

었다(Table 3).

pH에 대한 안정성 실험에서 B. polyfermenticus CJ9의 항

세균 활성은 pH 3.0~4.0 구간에서 활성이 감소하였으나 pH

5.0~9.0 구간에서는 안정함을 나타내어 산성영역에서는 불안

정하지만 알칼리 영역에서는 안정함을 알 수 있었다(Table

3). 항진균 활성 물질은 pH 3.0~9.0 구간에서 안정한 활성을

나타내어 분리균주가 생산하는 항진균 물질은 산성에서부터

알칼리 영역에서 안정함을 알 수 있었다(Table 3).

각종 효소에 대한 영향을 살펴본 결과 B. polyfermenticus

CJ9의 항세균 물질은 pepsin, α-amylase, lipase 처리에 영향

을 받지 않았으나, proteinase K, protease, trypsin, α-chy-

motrypsin의 단백분해 효소에 역가를 상실하였다(Table 3).

항진균 활성 물질은 pepsin, trypsin, α-amylase, lipase 처리

에는 영향을 받지 않았으나, proteinase K 처리시 역가가 크

게 감소하였으며 protease, α-chymotrypsin의 단백분해효소

처리로 항진균 활성이 불활성화 되었다(Table 3).

이상의 결과로부터 B. polyfermenticus CJ9은 서로 다른

특징을 지닌 항세균 물질과 항진균 물질을 생산함을 알 수

있었다. 또한 두 물질은 일부 단백 분해 효소에 영향을 받아

단백질성 물질임을 추측할 수 있었다. B. licheniformis M-4

가 생산하는 fungicin M4, B. subtilis가 생산하는 항진균 활

성 물질인 bacillomycin D와 plipastatin B1 등의 기존에 연

구된 Bacillus 속 유래의 항진균 활성 물질은 cyclic peptide

구조를 가지거나 구조내에 D형 아미노산을 가지므로 열에

매우 안정하며 단백분해효소에 영향을 받지 않았다[14, 19,

27, 33, 39]. 그러나 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항

진균 물질은 일부 단백분해효소에 분해되며 pH와 열에는 안

정하여 기존에 보고된 Bacillus 유래의 항진균 활성 물질들

과 서로 다른 구조를 가지는 단백질성 물질임을 추정할 수

있었다.

항균 물질의 부분 정제 및 Tricine-SDS-PAGEB. polyfermenticus CJ9의 항세균 물질과 항진균 물질을

부분 정제하기 위해서 배양상등액을 C18 Sep-Pak column에

흡착시킨 후 100% methanol로 용출하여 얻은 분획에서만

강한 항세균 활성과 항진균 활성을 관찰하였으며, 이로부터

B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 및 항진균 물질

이 소수성 물질임을 알 수 있었다(data not shown).

B. polyfermenticus CJ9의 배양상등액을 C18 Sep-Pak

column으로 부분 정제한 시료를 Tricine-SDS-PAGE로 단백

질 분리를 하였을 때 세 개의 주된 band를 나타내었다(Fig.

4). 세 개의 band의 항세균 및 항진균 활성을 direct detec-

tion 방법으로 측정하였다. 항세균 활성은 B. subtilis ATCC

6633을 지시균으로하여 측정한 결과 세 개의 band에서 항세

균 저해 활성을 보이는 부분이 관찰되지 않았다. 이와 같은

결과는 Table 3에서 보여진 B. polyfermenticus CJ9의 항세

균 물질이 열에 몹시 불안정한 특성을 고려하여 볼 때,

Tricine-SDS-PAGE 시행시 시료를 100oC에서 5분간 처리해

주는 과정에서 그 활성이 상실되었을 것으로 생각되어진다.

그러나 열에 안정한 항진균 물질의 활성은 Tricine-SDS-

PAGE 상의 세 개의 band 중 분자량 1.4 kDa 부분의 band

에서만 항진균 활성을 나타내었으며 다른 두 band 부분에서

는 항진균 활성이 관찰되지 않았다(Fig. 4). 이상의 실험 결

과로부터 B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 물질의

분자량은 본 실험으로부터 확인할 수 없었으며, 항진균 물

질은 약 1.4 kDa 분자량을 가지는 단백질성 물질임을 추정

할 수 있었다.

B. polyfermenticus CJ9이 생산하는 항세균 물질과 항진균

Table 3. Effect of heat, pH and enzyme treatment on the antimi-crobial activities of B. polyfermenticus CJ9.

TreatmentAntibacterial

activityAntifungal

activity

Heat

Control +++ +++25oC, 24 hr ++ +++37oC, 24 hr - +++50oC, 24 hr - +++70oC, 24 hr - +++100oC, 30 min - +++121oC, 15 min - ++

pH

Control +++ +++3.0 ++ +++4.0 ++ +++5.0 +++ +++6.0 +++ +++7.0 +++ +++8.0 +++ +++9.0 +++ +++

Enzyme

Control ++ +++Proteinase K - +Protease - -Pepsin ++ +++Trypsin - +++α-Chymotrypsin - -Lipase ++ +++α-Amylase ++ +++

Activity was expressed as the diameter of inhibition zone againsteach sensitive indicator. Degree of clarity of clear zone by growthinhibition: -, no inhibition zone; +, below 11.50 mm; ++,11.50~13.70 mm; +++, above 13.70 mm.

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACILLUS POLYFERMENTICUS 347

물질은 생육곡선에 따른 역가 차이를 보였으며, 열 및 pH

안전성 등의 특성에서 큰 차이를 보여 두 물질은 서로 다른

물질임을 알 수 있었다. 그러나 단백분해효소에 의해 항세

균 활성과 항진균 활성이 크게 감소되거나 소실되어 항세균

물질과 항진균 물질은 모두 단백질성 물질임을 추정할 수 있

었다.

세균이 생산하는 천연 항균성 peptide 또는 단백질 물질

인 bacteriocin은 생산균주와 계통학적으로 유사한 균종에 대

하여 좁은 항균 spectrum을 가진다. Bacteriocin과 생화학적

인 활성은 유사하나 기능적, 구조적 차이를 보이는 bacterio-

cin-like substances(BLS)는 광범위한 항진균 및 항세균 활성

을 가지며 일부 단백분해효소에 내성을 나타내는 특징을 지

닌다. B. polyfermenticus CJ9은 그람 양성균으로 단백질성

물질의 항세균 물질과 항진균 물질을 생산하며, 일부 단백

분해효소에 내성을 보이는 BLS의 특징을 나타내었다.

B. polyfermenticus는 B. subtilis와 더불어 GRAS균주로서

대표적 프로 바이오틱 미생물로 알려져 있으며, 특히 B.

polyfermenticus는 현재 정장용 생균제재(probiotic)로 시판되

고 있다[9]. 우리나라 메주로부터 분리된 B. polyfermenticus

CJ9이 생산하는 항세균 물질과 항진균 물질에 관한 본 연구

는 인체와 식품에 유해한 곰팡이, 효모 및 세균에 항진균 활

성과 항세균 활성을 동시에 가지는 B. polyfermenticus 유래

의 항균 물질에 관한 보고이다. 본 연구 결과를 통하여 새로

운 항균 활성 미생물의 개발이라는 측면과 아울러 식품 및

사료 등에 천연보존제(biopreservative), 생균제재(probiotic)

및 항생제 대체 의약품으로 활용될 수 있을 것으로 기대된

다. 이를 위하여 본 실험실에서는 현재 항세균 물질과 항진

균 물질의 정제 및 구조분석, 프로바이오틱 미생물로서의 기

능적 특성규명 등의 연구를 수행 중에 있다.

요 약

메주로부터 항진균 및 항세균 활성을 나타내는 균주를 분

리하고 동정하여 B. polyfermenticus CJ9로 명명하였다. B.

polyfermenticus CJ9의 생육에 따른 항균 활성을 측정한 결

과 항세균 활성은 배양 12시간에 최대 활성을 나타내며 72

시간까지 90% 이상 활성을 유지하다 120시간에 활성을 완

전히 상실하였다. 항진균 활성은 배양 24시간 이후부터 최

대 활성을 나타내었고, 사멸기 이후 활성이 다소 감소되었

으나 배양 120시간까지 활성이 유지되었다. B. polyfermenti-

cus CJ9은 식품과 인체에 유해한 곰팡이, 효모, 그람 양성

및 음성 세균에 대한 항진균 활성과 항세균 활성을 동시에

나타내었다. B. polyfermenticus CJ9의 항세균 활성은 37oC

에서 24시간 열처리 후에 활성을 상실하였으며, pH 5.0~9.0

구간에서는 안정한 활성을 나타내었으나 pH 3.0~4.0 구간에

서 활성이 감소하였다. 항진균 물질은 121oC에서 15분간 열

처리시 활성이 감소되었으나 역가가 완전히 소실되지 않았

으며, pH 3.0~9.0 구간에서 안정한 활성을 나타내었다. 항세

균 물질과 항진균 물질은 proteinase K, protease, trypsin,

α-chymotrypsin 등의 단백분해효소 처리로 역가를 상실하거

나 일부 감소되어 단백질성 물질임을 추정하였다. B.

polyfermenticus CJ9의 항세균 물질과 항진균 물질을 C18

Sep-Pak column에 흡착된 분획으로부터 역가를 확인하여 소

수성 물질임을 알 수 있었으며, Tricine-SDS-PAGE 및

direct detection 실험을 통하여 분자량을 확인한 결과 항진

균 물질은 약 1.4 kDa의 물질임을 확인하였다. 그러나 항세

균 활성 물질은 열 불안정성 때문에 동 실험법상에서 그 분

자량을 확인할 수 없었다. B. polyfermenticus CJ9이 생산하

는 항균 물질은 항세균 및 항진균 활성을 동시에 가지는 단

백질성 물질로서 천연 식품보존제 및 정장제재로 활용이 기

대되며, 이를 위하여 항세균 물질과 항진균 물질의 정제 및

구조분석 등의 연구가 필요하다.

감사의 글

본 연구는 지식경제부 지방기술혁신 사업에 의한 연구비

로 수행된 것으로 이에 감사드립니다.

REFERENCE

1. Besson, F. and G. Michel. 1990. Mycosubtilins B and C:

Fig. 4. Tricine-SDS-PAGE and direct detection of partiallypurified antimicrobial compounds from B. polyfermenticusCJ9. A. Tricine-SDS-PAGE of partially purified antimicrobialcompounds after Coomassie Brilliant Blue G staining. Lane 1,molecular weight markers; lane 2, partially purified B. polyfermen-ticus CJ9 antimicrobial compounds. B. Direct detection of antifun-gal compounds from B. polyfermenticus CJ9 by using the geloverlaid with the indicator stain, C. gossypiicola KF-2.

348 JUNG AND CHANG

minor antibiotics from mycosubtilin-producer Bacillussubtilis. Microbios. 62: 93-99.

2. Besson, F., M. L. Hourdou, and G. Michel. 1990. Studies onthe biosynthesis of iturin, an antibiotic of Bacillus subtilis,and a lipopeptide containing beta-hydroxy fatty acids.Biochim. Biophys. Acta. 1032: 101-106.

3. Bhunia, A. K., M. C. Johnson, and B. Ray. 1987. Directdetection of an antimicrobial peptide of Pediococcusacidilactici in sodium dodecyl-polyacrylamide gel electro-phoresis. J. Indust. Microbiol. 2: 319-322.

4. Chang, M. and H. C. Chang. 2006. Enhancement ofBacteriocin Production by Bacillus subtilis cx1 in thePresence of Bacillus subtilis ATCC 6633. Kor. J. Microbiol.Biotechnol. 34: 221-227.

5. Chang, M. and H. C. Chang. 2007. Characteristics ofBacterial-Koji and Doenjang(soybean paste) Made by usingBacillus subtilis DJI. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 35: 325-333.

6. Duc, L. H. and S. M. Cutting. 2003. Bacterial spores as heatstable vaccine vehicles, pp. 1263-1270. Expert Opinion onBiological Therapy. School of Biological Sciences, RoyalHolloway, University of London.

7. Eshita, S. M., N. H. Roberto, J. M. Beale, B. M. Mamiya,and R. F. Workman. 1995. Bacillomycin Lc, a new antibioticof the iturin group: isolations, structures, and antifungalactivities of the congeners. J. Antibiot. 48: 1240-1247.

8. Howell, S. F. 1950. Polypeptin, an antibiotic from a memberof the Bacillus circulans group. II. Purification, crystalliza-tion, and properties of polypeptin. J. Biol. Chem. 186: 863-877.

9. http://www.bi-nex.com/(2001)10. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi.(2006)11. Jack, R. W., J. R. Tagg, and B. Ray. 1995. Bacteriocins of

gram-positive bacteria. Microbiol. Rev. 59: 171-200.12. Jung, J. H. and H. C. Chang. 2009. Antifungal activity of

Bacillus polyfermenticus CJ6 isolated from meju. J. Kor.Soc. Food Sci. Nutr. 38: 509-516.

13. Kang, J. S. 2004. Animals fodder for composition Bacilluspolyfermenticus. Korean patent. 10-0458487.

14. Katz, E. and A. L. Demain. 1977. The peptide antibiotics ofBacillus: chemistry, biogenesis, and possible functions.Bacteriol. Rev. 41: 449-474.

15. Klein, C., C. Kaletta, and K. D. Entian. 1993. Biosynthesisof the lantibiotic subtilin is regulated by a histidine kinase/response regulator system. Appl. Environ. Microbiol. 59:296-303.

16. Kluge, B., J. Vater, J. Salnikow, and K. Eckart. 1998. Studieson the biosynthesis of surfactin, a lipopeptide antibiotic fromBacillus subtilis ATCC 21332. FEBS Lett. 231: 107-110.

17. Kugler, M., W. Loeffler, C. Rapp, A. Kern, and G. Jung.1990. Rhizocticin A, an antifungal phosphono-oligopeptideof Bacillus subtilis ATCC 6633: biological properties. Arch.Microbiol. 153: 276-281.

18. Kurylo-Borowska, Z. 1975. Biosynthesis of edeine: II.Localization of edeine synthetase within Bacillus brevis

Vm4. Biochim. Biophys. Acta. 399: 31-41.19. Lebbadi, M., A. Galvez, M. Maqueda, M. Martinez-Bueno,

and E. Valdivia. 1994. Fungicin M4: a narrow spectrumpeptide antibiotic from Bacillus licheniformis M-4. J. Appl.Bacteriol. 77: 49-53.

20. Lee, K. H., K. D. Jun, W. S. Kim, and H. D. Paik. 2001.Partial characcterization of polyfermenticin SCD, a newlyidentified bacteriocin of Bacillus polyfermenticus. Lett. Appl.Microbiol. 32: 146-151.

21. Maget-Dana, R. and F. Peypoux. 1994. Iturins, a specialclass of pore-forming lipopeptides: biological and physico-chemical properties. Toxicology. 87: 151-174.

22. Meyers, E., W. E. Brown, P. A. Principe, M. L. Rathnum,and W. L. Parker. 1973. EM49, a new peptide antibiotic. I.Fermentation, isolation, and preliminary characterization. J.Antibiot. 26: 444-448.

23. Newton, G. G. 1949. Antibiotics from a strain of B. subtilis;bacilipin A and B and bacilysin. Br. J. Exp. Pathol. 30: 306-319.

24. Omura, S., Y. Iwai, R. Masuma, M. Hayashi, T. Furusato,and T. Takagaki. 1980. A new peptide antibiotic, alboleutin.J. Antibiot. 33: 758-759.

25. Paik, H. D., S. S. Bae, S. H. Park, and J. G. Pan. 1997.Identification and partial chaacterization of tochicin, abacteriocin produced by Bacillus thuringiensis subsp.tochigiensis. J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 19: 297-298.

26. Park, S. Y., Y. J. Yang, Y. B. Kim, J. H. Hong, and C. Lee.2002. Characterization of Subtilein, a Bacteriocin fromBacillus subtilis CAU131(KCCM 10257). J. Microbiol.Biotechnol. 12: 228-234.

27. Peypoux, F., F. Besson, G. Michel, and L. Delcambe. 1981.Structure of bacillomycin D, a new antibiotic of the ituringroup. Eur. J. Biochem. 118: 323-327.

28. Peypoux, F., M. T. Pommier, D. Marion, M. Ptak, B. C. Das,and G. Michel. 1986. Revised structure of mycosubtilin, apeptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis. J. Antibiot. 39:636-641.

29. Schägger, H. and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodiumdodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for theseparation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal.Biochem. 166: 368-379.

30. Shoji, J., R. Sakazaki, Y. Wakisaka, K. Koizumi, and M.Mayama. 1976. Isolation of brevistin, a new peptideantibiotic. Studies on antibiotics from the genus Bacillus. IX.J. Antibiot. 29: 375-379.

31. Sneath, P. H. A. 1986. Endospore-forming gram-positiverods and cocci, p. 1104-1139. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair,M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual ofsystematic bacteriology. The Williams & Wilkins Company,Baltimore, Md.

32. Snoke, J. E. 1960. Formation of Bacitracin by washed cellsuspensions of Bacillus licheniformis. J. Bacteriol. 80: 552-557.

33. Stein, T. 2005. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syn-theses and specific functions. Mol. Microbiol. 56: 845-857.

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF BACILLUS POLYFERMENTICUS 349

34. Sun, L., Z. Lu, X. Bie, F. Lu, and S. Yang. 2006. Isolationand characterization of a co-producer of fengycins andsurfactins, endophytic Bacillus amyloliquefaciens ES-2,from Scutellaria baicalensis Georgi. World J. Microbiol.biotechnol. 22: 1259-1266.

35. Tagg, J. R. and A. R. McGiven. 1971. Assay system forbacteriocin. Appl. Microbiol. 21: 943.

36. Tagg, J. R., A. S. Dajani, and L. W. Wannamaker. 1976.Bacteriocins of gram-positive bacteria. Bacteriol. Rev. 40:722-56.

37. Tenoux, I., F. Besson, and G. Michel. 1991. Studies on theantifungal antibiotics: bacillomycin D and bacillomycin Dmethylester. Microbios. 67: 187-193.

38. Thomas, D. W. and T. Ito. 1969. The revised structure of thepeptide antibiotic esperin, established by mass spectrometry.Tetrahedron. 25: 1985-1990.

39. Tsuge, K., T. Ano, and M. Shoda. 1995. Characterization ofBacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin

and plipastatin B1. J. Gen. Appl. Microbiol. 41: 541-545.40. Vanittanakom, N., W. Loeffler, U. Koch, and G. Jung. 1986.

Fengycin-a novel antifungal lipopeptide antibiotic producedby Bacillus subtilis F-29-3. J. Antibiot. 39: 888-901.

41. Winnick, R. E., H. Lis, and T. Winnick. 1961. Biosynthesisof gramicidin S. I. General characteristics of the process ingrowing cultures of Bacillus brevis. Biochim. Biophys. Acta.49: 451-462.

42. Yoon, J. H., S. T. Lee, and Y. H. Park. 1996. Inter- andintraspecific phylogenic analysis of the genes Nocardioidesand related taxa based on 16s rDNA sequences. Int. J. Syst.Bacteriol. 48: 187-194.

43. Zheng, G. and M. E. Slavik. 1999. Isolation, partial purifi-cation and characterization of a bacteriocin produced by anewly isolated Bacillus subtilis strain. Lett. Appl. Microbiol.28: 363-367.

(Received Oct. 20, 2009/Accepted Dec. 9, 2009)