江西农业大学学报 2011，33( 2) : 0364 － 0368 http: / / xuebao． jxau． edu． cnActa Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E － mail: ndxb7775@ sina． com

微波辅助萃取法提取家蚕幼虫总黄酮的工艺研究彭金年，程庚金生，胡宏凯，邹思璐，梅蕾蕾

( 赣南医学院 药学院，江西 赣州 341000)

摘要:采用微波辅助萃取法对家蚕幼虫中的总黄酮进行提取，以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定家蚕幼虫中总黄酮的含量，以总黄酮的含量为考察指标，考察微波功率、微波时间、微波温度、乙醇浓度及料液比对总黄酮提取量的影响，在单因素的基础上，采用 L9 ( 3

4 ) 正交试验设计优化家蚕幼虫中总黄酮的提取工艺。结果表明，微波辅助萃取法提取家蚕幼虫总黄酮的最佳工艺条件为: 乙醇体积分数 40%、提取时间 20 min、料液比 1∶ 15 和提取温度 80 ℃。

关键词:微波辅助萃取;家蚕幼虫;总黄酮;提取工艺中图分类号: R284． 2 文献标志码: A 文章编号: 1000 － 2286( 2011) 02 － 0364 － 05

A Study on Optimum Technology for Extracting Total Flavonoidsfrom Silkworm Larvae by Microwave-assisted Extraction

PENG Jin-nian，CHENG Geng Jin-sheng，HU Hong-kai，ZOU Si-lu，MEI Lei-lei

( College of Pharmacy，Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China)

Abstract: The influences of microwave power，temperature，time，solid － liquid ratio and alcohol concen-tration on extracting total flavonoids from silkworm larvae by microwave － assisted extraction were explored bysingle factor experiments，and the optimum technology was determined by orthogonal experiments． The contentof total flavones was analyzed by ultraviolet spectrophotometry． The results indicated that the optimal condi-tions were 1∶ 15 of solid － liquid ratio，40% of alcohol concentration 80 ℃ of temperature and 20 minutes ofextraction time．

Key words: microwave － assisted extraction; silkworm larvae; total flavonoids; optimum technology

家蚕( Bombyx mori) 一生经过幼虫、蛹、成虫和卵 4 个发育阶段，这 4 个发育阶段的家蚕均具有较高的药用价值，并早已载于历代本草及医药典，是传统中药品种［1］。研究证明家蚕幼虫含有丰富的蛋白质、各种必须氨基酸、矿物元素和维生素等［2 － 6］。除上述基本营养成分外，家蚕幼虫还含有丰富的活性成分，主要为黄酮类化合物和 1 －脱氧野尻霉素［7 － 8］。

本文设计单因素和正交实验，采用微波快速反应系统对家蚕幼虫进行提取，以芦丁为对照品，采用紫外 －可见分光光度法测定家蚕幼虫中总黄酮的含量，以总黄酮的含量为考察指标，考察微波功率、提取时间、提取温度、溶剂用量、溶剂体积分数等因素对家蚕幼虫总黄酮提取效率的影响，为家蚕幼虫中总黄酮的提取提供一个最佳工艺条件。

收稿日期: 2010 － 06 － 10 修回日期: 2011 － 02 － 12基金项目:江西省教育厅青年科学基金项目( GJJ09585)作者简介: 彭金年( 1976—) ，女，讲师，博士，主要从事中药成分与活性研究，E － mail: pengjinnian2007@ 126． com。

第 2 期 彭金年等:微波辅助萃取法提取家蚕幼虫总黄酮的工艺研究

1 材料与方法1． 1 主要仪器与试剂

供试家蚕为江西省大余县蚕农饲养的芙·九 ×七·湘 5 龄第 5 d 幼虫。将供试幼虫于 － 30 ℃速冻致死，真空干燥，磨碎并过 20 目筛制备成家蚕幼虫粉。

AB135 － S型电子分析天平( 瑞士梅特勒 －托利多集团) ; WF － 4000C 型常压微波快速反应系统( 上海屹尧分析仪器有限公司) ; DLSB － 20L 型低温冷却液循环泵( 巩义市予华仪器有限公司) ; SHZ －JIIA型循环水式多用真空泵( 西安波意尔精密仪器有限公司) ; EYELA N － 1001 型旋转蒸发仪( 东京理化器械株式会社) ; UV1900PPC型紫外可见分光光度计( 上海亚研电子科技有限公司) 。

芦丁对照品( 中国药品生物制品检定所) ;甲醇、乙醇、NaNO2、Al( NO3 ) 3、NaOH 等试剂均为分析纯。1． 2 方法1． 2． 1 样品溶液制备 称取家蚕幼虫粉末 5． 000 g置于微波快速反应罐中，按单因素及正交实验条件分别提取，过滤，减压回收溶剂至少量，转移至 50 mL容量瓶中，以体积分数为 50%乙醇定容至刻度，得样品溶液。1． 2． 2 标准曲线绘制 精密称取 105 ℃干燥至恒重的芦丁对照品 25 mg，用甲醇溶解定容于 25 mL容量瓶中，配成 1． 0 mg /mL芦丁标准溶液。精密吸取芦丁标准溶液 0． 0，0． 2，0． 4，0． 6，0． 8，1． 0 mL，分别置于 10 mL具塞刻度试管中，各加水至 5． 0 mL，分别加入 50 g /L 亚硝酸钠 0． 6 mL，摇匀，放 6 min，加入 100 g /L硝酸铝 0． 6 mL，摇匀后放置 6 min，加入 40 g /L氢氧化钠 3． 0 mL，加水至刻度，摇匀后放置15 min。以第一管作空白，在 506 nm波长处测定吸收度，以吸收度 A 为纵坐标，质量浓度 C 为横坐标，进行回归分析，绘制回归曲线，得回归方程: A = 11． 838C － 0． 029，r = 0． 999 8。在 0． 00 ～ 0． 10 mg /mL的范围内，质量浓度与吸光度有良好的线性关系。1． 2． 3 家蚕幼虫中总黄酮含量测定 吸取样品溶液 20 mL，置于 100 mL容量瓶中，加体积分数为 50%乙醇定容至刻度，摇匀。吸取稀释液 2． 0 mL，置于 10 mL 具塞刻度试管中，按照“标准曲线绘制”项下的方法，在 506 nm下测定其吸光度 A，按回归方程计算出样品溶液中的总黄酮含量( mg /mL) ，根据稀释倍数及样品质量换算出样品中总黄酮的含量( mg /g) 。

2 结果与分析2． 1 乙醇体积分数对提取量的影响

称取家蚕幼虫样品 5． 000 g，按提取功率 500 W，提取时间 30 min，提取温度 80 ℃，料液比 1∶ 20，在不同的乙醇体积分数条件下，按 1． 2 项下的实验方法操作。实验结果如表 1 所示。

表 1 乙醇体积分数对家蚕幼虫中总黄酮提取量的影响Tab． 1 The extraction effects of the different concentrations of ethanol

乙醇体积分数 /%Concentrations of ethanol

40 50 60 70 80 90

总黄酮含量 / ( mg·g －1 )Contents of total flavones

10． 12 7． 22 5． 16 5． 28 7． 16 5． 98

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

从表 1 可以看出: 不同溶剂体积分数对家蚕幼虫总黄酮的提取量影响很大，其中以 40%乙醇溶液效果最好，其次是 80%乙醇溶液。2． 2 料液比对提取量的影响

称取家蚕幼虫样品 5． 000 g，按提取功率 500 W，提取时间 30 min，提取温度 80 ℃，溶剂体积分数40%，在不同料液比条件下，按 2． 2 项下的实验方法操作。实验结果如表 2 所示。

从表 2 可以看出: 不同料液比对家蚕幼虫总黄酮的提取量影响很大，随着料液比的增加，提取量逐渐增加，当料液比为 1∶ 20 时提取量最大，再增加料液比提取量没有增加，表明最佳料液比为 1∶ 20。

·563·

江 西 农 业 大 学 学 报 第 33 卷

表 2 料液比对家蚕幼虫中总黄酮提取量的影响Tab． 2 The extraction effects of the different solid － liquid ratios

料液比 Solid － liquid ratios 1∶ 5 1∶ 10 1∶ 15 1∶ 20 1∶ 25

总黄酮含量 / ( mg·g －1 )Contents of total flavones

4． 80 7． 89 8． 47 9． 54 9． 27

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

2． 3 提取温度对提取量的影响称取家蚕幼虫样品 5． 000 g，按提取功率 500 W，提取时间 30 min，料液比 1 ∶ 20，乙醇体积分数

40%，在不同提取温度条件下，按 2． 2 项下的实验方法操作。实验结果如表 3 所示。表 3 提取温度对家蚕幼虫中总黄酮提取量的影响

Tab． 3 The extraction effects of the different extraction temperature

提取温度 /℃Extraction temperature

40 50 60 70 80 90

总黄酮含量 / ( mg·g －1 )Contents of total flavones

4． 20 5． 05 6． 19 7． 94 6． 45 7． 09

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

从表 3 可以看出: 不同提取温度对家蚕幼虫总黄酮的提取量影响较大，随着温度的升高，提取量逐渐增加，当温度为 70 ℃时提取量最大，再升高温度提取量有所下降，表明最佳温度为 70 ℃。2． 4 提取时间对提取量的影响

称取家蚕幼虫样品 5． 000 g，按提取功率 500 W，料液比 1∶ 20，乙醇体积分数 40%，温度 70 ℃，在不同提取时间条件下，按 2． 2 项下的实验方法操作。实验结果如表 4 所示。

表 4 提取时间对家蚕幼虫中总黄酮提取量的影响Tab． 4 The extraction effects of the different extraction time

提取时间 /minExtraction time

5 10 15 20 25 30

总黄酮含量 / ( mg·g －1 )Contents of total flavones

9． 06 9． 65 10． 54 12． 01 1． 067 10． 95

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

从表 4 可以看出: 不同提取时间对家蚕幼虫总黄酮的提取量影响较大，随着时间的延长，提取量逐渐增加，当时间为 20 min时提取量最大，再延长时间提取量有所下降，表明最佳时间为 20 min。2． 5 提取功率对提取量的影响

称取家蚕幼虫样品 5． 000 g，按料液比 1∶ 20，乙醇体积分数 40%，提取时间 20 min，提取温度 70 ℃，在不同微波功率条件下，按 2． 2 项下的实验方法操作。实验结果如表 5 所示。

表 5 微波功率对家蚕幼虫中总黄酮提取量的影响Tab． 5 The extraction effects of the different microwave power

微波功率 /WMicrowave power

300 400 500 600 700 800

总黄酮含量 / ( mg·g －1 )Contents of total flavones

11． 91 11． 44 10． 01 11． 22 10． 92 12． 67

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

·663·

第 2 期 彭金年等:微波辅助萃取法提取家蚕幼虫总黄酮的工艺研究

从表 5 可以看出:微波功率对家蚕幼虫总黄酮的提取量没有明显的影响，分析原因可能因为在微波快速反应系统中，功率的大小只是影响加热速度的快慢，当温度达到预定值后，功率的大小就没有太大意义了，实验中功率超过 300 W就能很快达到预设温度，考虑到节省能源，故微波功率定为 300 W。2． 6 正交实验

为了确定微波提取的适宜条件，在单因素实验的基础上，选择乙醇体积分数、提取时间、提取温度和料液比 4 个因素，进行四因素三水平正交实验，因素水平安排和实验结果如表 6、表 7 所示。

表 6 提取条件因素水平Tab． 6 Factors and levels of the best extraction conditions

水平Levels

乙醇体积分数 ( A) /%Concentrations of ethanol

时间( B) /minExtraction time

温度( C) /℃Extraction temperature

料液比( D) /℃Solid － liquid ratios

1 30 15 60 1∶ 15

2 40 20 70 1∶ 20

3 50 25 80 1∶ 25

表 7 提取条件正交实验设计及实验结果Tab． 7 Results of the best extraction conditions

实验号Order

提取因素 Factors

乙醇体积分数( A) /%Concentrations of ethanol

时间( B) /minExtraction time

温度( C) /℃Extraction temperature

料液比( D)Solid － liquid ratios

总黄酮含量 /

( mg·g －1 )Contents of total flavones

1 30 15 60 1∶ 15 9． 67

2 30 20 70 1∶ 20 8． 15

3 30 25 80 1∶ 25 10． 10

4 40 15 70 1∶ 25 11． 89

5 40 20 80 1∶ 15 18． 27

6 40 25 60 1∶ 20 9． 96

7 50 15 80 1∶ 20 10． 44

8 50 20 60 1∶ 25 11． 76

9 50 25 70 1∶ 15 12． 20

K1 27． 92 32． 00 31． 39 40． 14

K2 40． 12 38． 18 32． 24 28． 55

K3 34． 40 32． 26 38． 81 33． 75

k1 9． 31 10． 67 10． 46 13． 38

k2 13． 37 12． 73 10． 75 9． 52

k3 11． 47 10． 75 12． 94 11． 25

R 4． 06 2． 06 2． 48 3． 86

表中数据为 5 次重复实验的平均值。The data in the table is the average of 5 repeated experiments．

由表 7 直观分析可知，各因素对家蚕幼虫总黄酮提取量影响程度由大到小依次为: 乙醇体积分数( A) ，料液比( D) ，提取温度( C) ，提取时间( B) ，乙醇体积分数( A) 以 A2 为最好，料液比( D) 以 D1 为最好，提取温度( C) 以 C3 为最好，提取时间( B) 以 B2 为最好，即 A2D1B2C3 组合提取效果最好，即乙醇体积分数 40%、料液比 1∶ 15、提取温度 80 ℃和提取时间 20 min，在此条件下，家蚕总黄酮的提取得率为18． 27 mg /g。

3 结论与讨论微波辅助萃取法具有缩短提取时间及提取量高等特点，是中药有效成分理想的提取手段。该法提

·763·

江 西 农 业 大 学 学 报 第 33 卷

取家蚕幼虫总黄酮最佳的提取工艺为: 乙醇体积分数 40%、料液比 1 ∶ 15、提取提取温度 80 ℃和时间20 min。

不同结构类型的黄酮类化合物具有不同的溶解特性［9］，并且在不同的动、植物体内溶解性亦不同［10］，同时采用不同的提取方法对黄酮类化合物的提取效果也不尽相同［11］。本试验采用微波辅助萃取法就微波功率、乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等对家蚕幼虫体黄酮类化合物提取效果的影响进行了单因素实验，并在单因素实验的基础上设计了正交试验，优选出微波萃取最佳工艺条件。

文献［12 － 15］对黄酮类化合物的提取方法进行了报道，多以体积分数为 60% ～ 70%乙醇为提取溶剂，本试验的结果却表明体积分数为 40%乙醇提取效果最好，这可能与采用的提取方法有关。本试验采用的是微波辅助萃取法，微波辅助萃取法是利用微波能加热与固态样品接触的溶剂，使所需要的化合物从样品中分配到溶剂里的提取过程。微波辅助提取的效率取决于溶剂的极性和介质相容性。选择适当的有机溶剂对微波辅助提取的成功至关重要。选择溶剂应考虑目标分析物在溶剂中的溶解度，溶剂与基质的相互作用以及溶剂的微波吸收特性［16 － 17］。本试验在单因素实验中体积分数为 40%乙醇提取效果最好，为了验证其真正最好，正交实验设计了体积分数为 30%乙醇作为溶剂，结果表明还是体积分数为 40%乙醇最好。单就黄酮类化合物的溶解性而言，一般提取方法以体积分数为 60% ～70%乙醇较佳，但微波辅助萃取还要考虑溶剂的极性，一般溶剂偶极矩越大，微波效果越好，同时还要考虑溶剂与基质的相互作用。综合各种因素，实验表明微波辅助萃取黄酮类化合物以体积分数为 40%乙醇效果佳。

参考文献:

［1］江苏新医学院． 中药大辞典［M］．上海: 上海科学技术出版社，1986: 1762．［2］陈智毅，廖森泰，李清兵，等．多化性黄血蚕的食用和药用价值的研究［J］．蚕业科学，2002，28( 2) : 173 － 176．［3］桂仲争，戴建一，陈军建，等．全蚕粉的食用价值及其降血糖的临床试验效果［J］．蚕业科学，2004，30( 1) : 107 － 110．［4］彭金年，李银保，程庚金生．采用微波消解 －火焰原子吸收光谱法测定家蚕幼虫体中 6 种金属元素的含量［J］．蚕业科学，2009，35( 4) : 893 － 895．

［5］杨辉，黄亦琦，罗友华，等．家蚕氨基酸、微量元素及总黄酮含量测定分析［J］．福建医药杂志，2009，31( 6) : 86 － 88．［6］王四旺，王晓娟，谢艳华，等．蚕宝素中化学成分分析及其抗肿瘤活性初探［J］．西北药学杂志，1997，12( 5) : 211 －213．［7］颜新培，蔡光先，李顺祥，等．桑蚕及相关产物的化学成分与药理研究现状［J］．湖南中医药大学学报，2009，29( 5) :

7 － 80．［8］贺伟强，金洁，时连根，等．家蚕幼虫活性物质的药理学研究进展［J］．蚕桑通报，2005，36( 2) : 5 － 8．［9］吴立军． 天然药物化学［M］． 5 版．北京: 人民卫生出版社，2007: 177．［10］谭沛，刘永隆． 植物黄酮甙类化合物［J］．天然产物研究与开发，1995，7( 1) : 45 － 53．［11］彭金年，李银保，程庚金生，等． 菟丝子总黄酮不同提取方法的比较［J］．西北林学院学报，2010，25( 2) : 140 － 142．［12］刘淑梅，时连根，李有贵．家蚕幼虫体黄酮类化合物的提取及测定方法［J］．蚕业科学，2005，31( 1) : 74 － 78．［13］张喜梅，李琳，陈玲，等．葛根总黄酮提取工艺研究［J］．现代食品科技，2008，24( 1) : 42 － 45．［14］王军，王敏，季璐．苦荞麦麸皮总黄酮提取工艺及其数学模型研究［J］．农业工程学报，2006，22( 7) : 223 － 225．［15］郁建生，郁建平．草珊瑚总黄酮提取工艺及其含量动态变化［J］．中国中药杂志，2007，32( 4) : 30 － 309．［16］李攻科，杜甫佑，肖小华．微波辅助萃取技术在中药现代化中的应用［J］．精细化工，2007，24( 12) : 1184 － 1191．［17］王志祥，李红娟，万水昌，等． 微波萃取技术及其在中药有效成分提取中的应用［J］．时珍国医国药，2007，18( 5) :

1244 － 1246．

·863·