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遺伝子の転写と翻訳
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RNAポリメラーゼがプロモーター領域に結合
プロモーター
転写開始点
5’----TTGACA---------TATAAT---
-35 -1016-19 bp 5-9 bp
5’---- CAAT------TATAAT-----------
CAAT Box25 bp
真核
原核
RNA polymerase
Genomic DNA
mRNA
TATA Box
遺伝子上の配列転写産物のmRNAには見つからない
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5
3
RNAポリメラーゼがらせんをほどく
5
3
5
3
転写開始点
5
転写開始点からmRNAを合成しながら
この図では 右へすすんでいく
5
3
転写終了点で転写が終わりポリメラーゼがはずれる。
5’ AUG
AAAAAAAAAA
Gppp
真核生物の場合、あたまに5’キャップ構造しっぽにポリAが付加される。
Gppp
---AATAAA-----(10-30 upstream)
(100-200)
いくつかある終結部位まで伸長し続ける
別のポリメラーゼ
(The cell)
遺伝子調節領域
TATA
プロモーター
転写開始点
mRNA遺伝子調節領域
遺伝子転写調節タンパクが結合
アクチベーターリプレッサーエンハンサー
RNAポリメラーゼが結合Poly-A付加
部位
AUG翻訳開始点
-AAAAA
UAA終止コドン
G-ppp-
リボゾーム結合部位
5‘
5’- atttactcca gccatgctaa gaaagctacc-3’
3’- taaatgaggt cggtacgatt ctttcgatgg-5’
RNA ポリメラーゼによる転写まず、二重らせんをほどいてから、
下の方の 3’ > 5’の鎖を読んで、mRNAをつくる。
できたmRNAは上の方の鎖と同じ配列になる。
5’-auuuacucca gccaugcuaa gaaagcuacc-3’
* DNA情報としてデーターベースに記録するのは上の方
1 ggccgatata tatcagtgcc tgatttgaga ttgggtccca ggtctcggtg gaatcggga61 cgtggtgatt gtgggtgggg gctttggcgg gatcgcagca gccagccagc tgcaggccct121 gaacgtcccc ttcatgctgg tggacatgaa ggactccttc caccacaatg tggctgctct181 ccgagcctcc gtggagacag ggttcgccaa aaagacattc atttcttact cggtgacttt241 caaggacaac ttccggcagg ggctagtagt ggggatagac ctgaagaacc agatggtgct301 gctgcagggt ggcgaggccc tgcccttctc tcatgttatc ctggccacgg gcagcactgg361 gcccttcccg ggcaagttta atgaggtttc cagccagcag gccgctatcc aggcctatga421 ggacatggtg aggcaggtcc agcgctcacg gttcatcgtg gtggtgggag gaggctcggc481 tggagtggag atggcagcag agattaaaac agaatatcct gagaaagagg tcactctcat541 tcactcccaa gtggccctgg ctgacaagga gctcctgccc tccgtccggc aggaagtgaa601 ggagatcctc ctccggaagg gcgtgcagct gctgctgagt gagcgggtga gcaatctgga661 ggagctgcct ctcaatgagt atcgagagta catcaaagtg cagacggaca aaggcacaga721 ggtggccacc aacctggtga ttctctgcac cggcatcaag atcaacagct ccgcctaccg781 caaagcattt gagagcagac tagccagcag tggtgctctg agagtgaacg agcacctcca841 ggtggagggc cacagcaacg tctacgccat tggtgactgt gccgacgtga ggacgcccaa901 gatggcctat cttgccggcc tccacgccaa catcgccgtg gccaacatcg tcaactctgt961 gaagcagcgg cctctccagg cctacaagcc gggtgcactg acgttcctcc tgtccatggg
1021 gagaaatgac ggtgtgggcc aaatcagtgg cttctatgtg ggccggctca tggttcggct1081 gaccaagagc cgggacctgt tcgtctctac gagctggaaa accatgaggc agtctccacc1141 ttgatggaga ggccaggcgg gagaactacc gcagcaggtg ggcgtacgga ctgcttggcg1201 catggcaccc gcctggcaag tgctagaact aatgctattc ttctggaata agatgccaat1261 gatgtggtgg ctagaaatgc aacttgtata aaacaaaaat gggagagaga gaggtattaa1321 acaaataccc
TGA (終止コドン)
ATG(開始コドン)TATA BOX(プロモーターの配列)
タンパク合成(翻訳の開始)
M
-AAAAAG-ppp-
M
-AAAAAG-ppp-
M
AUG
リボゾーム小サブユニット
開始 tRNA
リボゾーム大サブユニットが結合して翻訳が進む
5‘キャップの識別
AUGコドンを
探索
cDNAの合成
組織、細胞
細胞破砕/RNA抽出
総RNArRNA(リボゾーム)mRNA(メッセンジャー)
一部DNAの混入
rRNA
mRNA
DNA除去後のRNA
28S
18S
Oligo dT カラム
rRNA, mRNA
rRNA
溶離液
mRNA
AAAAAA-3’5‘
AAAAAA-3’5‘ 3’-TTTTTT-5’合成プライマーTTTTTTTを対合させる
TTTTTT-5’AAAAAA-3’
逆転写酵素でDNAを合成
細胞から取り出し、精製したmRNA
TTTTTT-5’3‘RNAを分解する
TTTTTT-5’
DNAポリメラーゼで相補鎖を合成
TTTTTT-5’AAAAAA-3’
二本鎖cDNAの完成
配列を示すとき、5‘ 3’に書く
遺伝子の分断
エキソンとイントロンの発見(1977)RNAスプライシング
染色体150 Mb (1000 x kb)
染色体の0.5%
15 個の遺伝子が存在
調節配列イントロン(非コード領域)
エキソン(コード領域)
AAAAAA
AAAAAARNAスプライシング
mRNA
5‘-------/AG GU / AGU-------
---////////N/AG /--------3’
C
A
AG
U U UU U U U U
C C CC C C C C
GA
5‘スプライス部位の
配列 3‘スプライス部位の
配列
イントロン
遺伝子クローニング
cDNAライブラリーと
ゲノミックライブラリー
cDNAライブラリー
ベクター (Vector)の選択
ファージ(Phage)を使う方法
プラスミド(Plasmid)を使う方法
cDNA
パッケージング
ファージ遺伝子
ライゲーション
ファージcDNAライブラリー
クローニングの際に作るcDNA
AAAAAA-3’5‘ 3’-TTTTTT-gattcgaa-5’
アダプター
TTTTTT-gattcgaa-5’AAAAAA-ctaagctt-3’
アダプター
あらかじめ寒天培地を作るその上に寒天にとかした大腸菌液とファージ液を重層
ファージが感染したところは溶菌する=プラーク
プラークからファージを回収中の遺伝子を推定して必要なものを選別=スクリーニング
大腸菌とファージ
cDNA プラスミド
ライゲーション
大腸菌(コンピテントセル)
形質転換
抗生物質入り寒天培地に大腸菌を播く
プラスミドを持ったものが生き残る
プラスミドに別のDNA分子が
入ったものだけ白くなる
ゲノミックライブラリー
ファージによるもの
プラスミドによるもの
染色体150 Mb (1000 x kb)
染色体の0.5%
制限酵素でランダムに切断
プラスミド
ファージ
イントロンを持ったDNA断片のクローニング
動物への遺伝子導入
右:ひと成長ホルモン遺伝子を導入したラット
左:対照ラット
Science 222巻11/18号(1983)
hGH 遺伝子