EE-EP 2 152 872 B1

EE-EP 2 152 872 B1

LEIUTISE ALA

Käesolev leiutis käsitleb selliste rekombinantsete polüklonaalsete valkude produtseerimist,

nagu seda on immunoglobuliini sugukonna valgud, näiteks nende lahustuvad või

membraaniga seotud vormid, või T-raku retseptorid, milles kasutatakse

produktsioonisüsteeme, mis on sõltumatud saitspetsiifilisest integratsioonist. 5

LEIUTISE EELDUS

Paljude haiguste puhul, näiteks selliste, nagu infektsioonilised haigused ja erinevad

vähivormid, puuduvad efektiivsed ravimeetodid. Monoklonaalsed antikehad ei ole

tavaliselt efektiivsed kõikide nende märklaudade vastu, osaliselt nende märklaudade

muutlikkuse ja märklaudvalkude adaptiivsete mutatsioonide tõttu, mis teevadki nad 10

tundmatuteks monoklonaalsetele antikehadele. Teisest küljest, polüklonaalsed antikehad

on võimelised tabama mitut dünaamilist märklauda, näiteks, viirustel, bakteritel või

vähirakkudel. Lisaks sellele, polüklonaalsetel antikehadel on suurim tõenäolisus säilitada

aktiivsus antigeeni mutatsioonide puhul.

On olemas erinevaid kaubanduslikult saadavaid, polüklonaalsetel antikehadel põhinevaid 15

havimeid, kaasaarvatud: 1) normaalne inimese immunoglobuliin, mis on eraldatud

normaalsete inimdoonorite verest; 2) inimese hüperimmuunne immunoglobuliin, mis on

tuletatud individuaasete inimdoonorite verest, mis sisaldab antikehasid konkreetsete

haiguse märklaudade, näiteks, viiruste vastu, millega need inimesed on varem kokku

puutunud, kas infektsiooni või vaktsioneerimise käigus; ja 3) looma hüperimmuunne 20

immunoglobuliin, mis on tuletatud immuniseeritud loomade verest.

Immunoglobuliin, mis oli eraldatud inimese verest, on tõestanud oma efektiivsust selliste

infektsioonitekitajate vastu, nagu seda on hepatiidi B viirus, respiratoorne süntsütiaalne

viirus, tsütomegaloviirus ja teised herpese viirused, marutõve viirus, botuliini toksiin, jne,

aga ka neonataalsel reesus-D profülaktikal. Immunoglobuliini, mis sai puhastatud inimese 25

T-rakkudega immuniseeritud küülikute verest, kasutati, et saavutada T-rakkude

immunosuppression transplantaadi ravil või selle hülgamise ärahoidmisel (nt,

tümoglobuliin). Normaalset inimese immunoglobuliini on kasutatud, et võimendada

immunodefitsiitsete patsientide immuunsüsteemi, aga ka erinevate autoimmuunsete

häirete ravil. 30

Sellele vaatamata, immunoglobuliini laialdast kasutamist piirab doonorivere saadavus,

probleemid, mis on seotud erinevate partiidega ja nende erineva ohutusega. Loomse

EE-EP 2 152 872 B1 2

päritoluga immunoglobuliinide kasutamine põrkub samasuguste immunogeensuste

probleemidega nagu need, mida täheldati loomse päritoluga monoklonaalsete antikehade

kasutamisel 1980-ndatel ja 1990-ndatel aastatel. Ja lõpuks, nagu teistegi verest

valmistatud produktidega, eksiteerib ka siin infektsioonitekitajate, nagu HIV, herpes, või

hepatiidi viirused või prioonid, ülekande oht. Kõige selle tõttu on tekkinud olukord, milles 5

arstid tunnistavad, et polüklonaalsed antikehad on eelistatud ravivahenditeks mõningates

situatsioonides, kuid nende kasutamine on jäänud küllaltki piiratuks.

Transgeensete loomade tehnoloogia kasutamisega on tekkinud uued lähenemisviisid

inimese immunoglobuliinide genereerimisel. On loodud transgeensed hiired, kes kannavad

inimese immunoglobuliini lookuseid (USA patent nr 6111166). Need hiired võivad 10

produtseerida inimese terveid immunoglobuliine ja antikehasid, mis on suunatud

konkreetsete märklaudade vastu, mille puhul kasutatakse tavalisi

immuniseerimismeetoodikaid. Kuid suuremad antikeha saagised on siin piiratud hiirte

suhteliselt väikeste mõõtmetega. Transgeenseteks inimese immunoglobuliini geenide

suhtes on tehtud ka suuremaid loomi, näiteks, lehmi (Kurolwa, Y. et al. Nature 15

Biotechnology; 2002; 20: 889-893). Kuid polüklonaalsete antikehade produtseerimine ravi

tarbeks selliste loomade verest, ei kulge samuti ilma komplikatsioonideta. Esiteks,

konkreetse looma ja inimese immunofüsioloogiad võivad omada olulisi erinevusi, mis

põhjustavad erinevusi tulemusena saadud immuunses spektris, funktsionaalses

ümberkorralduses ja immuunse vastuse mitmekesisuses, antikehade näol. Teiseks, 20

sisestatud immunoglobuliini lookuste mitootiline ebastabiilsus võib mõjustada antikehade

pikaajalist produktsiooni. Kolmandaks, tehniliselt on väga raske eemaldada looma oma

immunoglobuliini lookused nii, et näiteks looma antikeha produktsioon ei ületaks inimese

antikeha produktsiooni. Neljandaks eksisteerib selliste infektsioonitekitajate, nagu

viirused, prioonid või teised patogeenid, ülekandmise risk, mis kaasneb loomades 25

produtseeritud antikehade manustamisega.

Viimasel ajal on välja töötatud uus tüüp polüklonaalseid antikehi, mis on sõltumatud

doonori kätteaadavusest selle produtseerimisel. Need polüklonaalsed antikehad

genereeritakse isoleerides doonoritest, kellel on immuunne reaktsioon soovitava märklaua

vastu, seda antikeha kodeerivad nukleiinhappejärjestused, millele järgneb soovitava 30

märklauaga spetsiifiliselt seostuvate antikehade sõelumine. Need polüklonaalsed

antikehad võivad olla valmistatud imetajatele kohandatud ekspressioonitehnoloogiaga,

mis põhineb ühte antikeha ekspresseeriva plasmiidi saitspetsiifilisel integratsioonil iga

EE-EP 2 152 872 B1 3

raku samasse genoomisaiti nii, nagu on kirjeldatud publikatsioonis WO 2004/061104.

Üheks seda uut tüüpi polüklonaalse antikeha näiteks on rekombinantne polüklonaalne

antikeha, mis on suunatud reesus-D vastu (WO 2006/007850). Saitspetsiifiline

integratsioon annab rakupopulatsiooni, milles iga rakk sisaldab ühte koopiat, ja kus

ekspressioonitasemed ja kasvutempo on oodatavalt suhteliselt ühtlased. 5

WO 2004/029284 avalikustab saitspetsiifilise raku ekspressioonisüsteemi, mis on

võimeline vahetama vähemalt ühe märklaudgeeni, kus see see süsteem sisaldab esimest

integratsioonikassetti, esimest märklaudkassetti ja vähemalt ühte recelementi, mis

kodeerib vähemalt ühe rekombinaasi aktiivsust, mis tunneb ära nende kassettide

rekombinaasi äratundmissaiti. 10

WO 2006/007853 avalikustab meetodid rekombinantse polüklonaalse antikeha või teise

rekombinantse polüklonaalse valgu või sellist valku produtseeriva polüklonaalse rakuliini

struktuurseks iseloomustamiseks, mis on ette nähtud selleks, et kontrollida lõpp-

produktide kokkusobivust partiilt partiile aga ka kompositsioonilist stabiilsust ühe

produktsioonitsükli jooksul. 15

Wiberg et al. (Biotechn. Bioeng. (2006) 94(2):396-405) kirjeldavad reesus-D-vastase

rekombinantse polüklonaalse antikeha ekspressiooni ja produktsiooni, mis sisaldab 25

inimese IgG1 antikehal põhinevat saitspetsiifilist antikeha geeni integratsiooni CHO

rakkudes.

Huang et al. (J. Immunol. Methods (April 2007) 322(1-2):28-39) kirjeldavad 20

märklaudraku vektorgeeni integratsioonisüsteemi, mis on ette nähtud kõrgetasemeliseks

antikeha ekspressiooniks, kasutades positsiooniefektide ületamiseks FRT/FLP strateegiat.

Haurum et al. (IDrugs (2005) 8(5):404-9) annavad ülevaate antikehaterapeutikast alates

esimesest inimese immunoglobuliini generatsioonist kuni teise rekombinantsete

monoklonaalsete antikehade generatsioonini, ja edasi rekombinantsete polüklonaalsete 25

antikehadeni.

LEIUTISE OLEMUS

Käesolev leiutis esitleb alternatiivseid meetodeid rekombinantse polüklonaalse valgu

produtseerimiseks, mis on sõltumatu saitspetsiifilisest integratsioonist ja seetõttu näeb ette

suurendatud paindlikkust rakuliini produktsiooni valiku suhtes, säilitades samal ajal valgu 30

polüklonaalsuse. Lisaks sellele, ekspressiooni tasemed võivad olla kõrgemad, kui see on

võimalik saitspetsiifilise integratsiooni puhul.

EE-EP 2 152 872 B1 4

Käesoleva leiutise kohane lähenemine põhineb huvipakkuvate individuaalsete geenide

juhuslikul integratsioonil peremeesrakkudesse, millele elistatavalt järgneb soovitavate

karakteristikutega üksikute rakkude kloneerimine. Need individuaalsed rakukloonid,

millest igaüks produtseerib individuaalset polüklonaalse valgu liiget, segatakse seejärel, et

tekitada polüklonaalseid valke produtseeriv rakuliin polüklonaalse valgu 5

produtseerimiseks.

Tavaliselt on kõige enam tuntumateks polüklonaalseteks valkudeks, polüklonaalsed

antikehad. Sama käib ka T-raku retseptorite (TcR-d) kohta, mis võivad olla saadud

lahustuval kujul, kui nad on produtseeritud rekombinantses ekspressioonisüsteemis, ja mis

võivad omada, sarnaselt polüklonaalsetele antikehadele, ravipotentsiaali. Kuid käesoleva 10

leiutise kohaste rekombinantsete ekspressioonisüsteemidega on võimalik kokku panna ka

selliseid valke, mis ei ole ilmtingimata homoloogsed, näiteks tuntud tähtsusega erinevad

valgud konkreetse defitsiitsuse või haiguse puhul. Käesolevat leiutist illustreerivad

polüklonaalsete antikehade näited, kuid ette on nähtud hõlmata ka polüklonaalseid TcR-sid

ja teisi polüklonaalseid valke, mis võivad olla soovitavad valmistada koos. Sellisteks 15

valkudeks võivad soovi korral olla ka fusioonvalgud.

Käesolev leiutis võimaldab rekombinantsete polüklonaalsete valkude tööstuslikku tootmist

ühes konteineris, näiteks, nende kasutamiseks farmatseutilistes kompositsioonides.

Käesoleva leiutise üheks tähtsaks tunnusjooneks on see, et tootmise käigus

polüklonaalsete valku moodustavate individuaalsete molekulide nihutatud ekspressiooni 20

on hoitud madalal tasemel, et, minimiseerida ebasoovitavaid muutusi partiilt partiile, ja

vältida polüklonaalse antikeha rühma liikmete kõrvaldamist valmistamise käigus.

Ühest aspektist käsitleb käesolev leiutis meetodit polüklonaalse rakkuliini

genereerimiseks, kus see rakuliin on võimeline ekspresseerima polüklonaalset valku, mis

sisaldab 2 kuni n erisugust liiget, kus nimetatud meetod sisaldab: 25

a) Ekspressioonivektorite komplekti ettevalmistamist, milles iga nimetatud vektor

sisaldab vähemalt ühte koopiat erisugustest nukleiihapetest, mis kodeerivad nimetatud

polüklonaalsete valkude rühma konkreetset liiget;

b) Peremeesrakkude eraldi transfekteerimist iga nimetatud ekspressioonivektoriga

tingimustes, milles hoitakse ära ekspressioonivektorite saitspetsiifiline integratsioon 30

rakkude genoomi, misläbi saadakse 2 kuni n kompositsiooni rakke, milles iga

kompositsioon ekspresseerib ühte distinktset polüklonaalse valgu liiget;

EE-EP 2 152 872 B1 5

c) Nimetatud 2 kuni n rakukompositsiooni kokkusegamist, et saada polüklonaalne

rakuliin.

Eelistatud teostusviisis kasutatakse leiutisekohaseid polüklonaalseid rakuliine, kui

polüklonaalseid tootmisrakuliine, ja külmutatakse, säilitatakse ning kasutatakse kui

polüklonaalset baasrakkude panka (Master Cell Bank - pMCB), millest võetud proovid 5

(näiteks, ampullid) võivad olla üles sulatatud ja kasutatud otse rekombinantse

polüklonaalse valgu valmistamiseks või polüklonaalse töörakkude panga (Working Cell

Bank - pWCB) genereerimiseks.

Ühes teostusviisis on leiutisekohasteks ekspressioonivektoriteks episoomivektorid. Teises

eelistatud teostusviisis on leiutisekohased ekspressioonivektorid stabiilselt ja juhuslikult 10

integreeritud peremeesrakkude genoomi. Need ekspressioonivektorid või olla stabiilselt

integreeritud juhuslikes asendites ühes või enamas peremeesraku kromosoomis.

Etapil b) saadud transfekteeritud rakud eelistatavalt kloneeriti. Ühes teostusviisis teostati

kloneerimine, kasutades FACS-kloneerimist, nagu seda on kirjeldatud käesolevas

dokumendis. 15

Leiutisekohased kloonid võivad olla valitud vähemalt ühe kriteeriumi järgi, mis on valitud

rühmast, millesse kuuluvad: kasvu kiirus, kahekordistumise aeg, ekspressiooni tase,

produktsiooni tase, produtseerimise stabiilsus ajas, elujõulisus, töökindlus, vastupidavus,

morfoloogia ja koopiate arv. Eelistatavalt on need kloonid valitud nii, et nad oleksid

ühtlased vähemalt ühe nimetatud kriteeriumi suhtes. Enam eelistatavalt, on kloonid valitud 20

nii, et nad oleksid ühtlased kahekordistumise aja ja ekspressioonitaseme suhtes.

Igale kindlale polüklonaalsele valguliikmele võib olla valitud üks kloon, või enam, kui üks

kloon. Seega, iga kindla polüklonaalse valguliikme kohta võib olla valitud 2 klooni, või

võib olla valitud 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40,

45, 50, 60, 70, 80, 90, või 100 klooni. 25

Leiutisekohaste rakkude kompositsioon, mis ekspresseerib erinevaid kindlaid liikmeid,

võib olla segatud proportsioonides 1:1, või suhtes, mis erineb 1:1 suhtest.

Eelistatavalt on leiutisekohased ekspressioonivektorid identsed, väljaarvatud

variatsioonid, mis kodeerivad leiutisekohase polüklonaalse valgu järjestust.

See meetod võib olla rakendatud nii monomeersete kui ka multimeersete polüklonaalsete 30

valkude puhul.

EE-EP 2 152 872 B1 6

Multimeersete valkude üks ekspressioonivektor võib kodeerida ühe kindla polüklonaalse

valguliiksme kõiki subühikuid. Alternatiivselt koosneb leiutisekohane kogum

ekspressioonivektoreid etapil a) kahest või enamast ekspressioonivektorite alakogumist,

kus esimene alakogum sisaldab sellist varianti nukleiinhappe järjestustest, mis kodeerib

ühte valgu subühikut, ja teine alakogumist sisaldab nukleiinhappe järjestuste varianti, mis 5

kodeerib teist valgu subühikut, nii, et iga transfektsioon teostatakse liikmega esimesest

ekspressioonivektorite alakogumist ja liikmega teisest ekspressioonivektorite alakogumist.

See transfektsioon võib olla üheaegne või järjestikune. Konkreetselt võib see kogum

ekspressioonivektoreid etapil a) koosneda kahest alakogumist ekspressioonivektoritest,

kus see esimene alakogum sisaldab varianti nukleiinhappe järjestusest, mis kodeerib 10

antikeha rasket ahelat ja teine alakogum sisaldab varianti nukleiinhappe järjestustest, mis

kodeerib antikeha kerget ahelat nii, et iga transfektsioon teostati liikmega esimesest

ekspressioonivektorite alakogumist ja liikmega ekspressioonivektorite teisest alakogumist.

Leiutisekohane ekspressioonivektor või järgmine ekspressioonivektor kodeeris

eelistatavalt selekteeritavat markerit. Lisaks sellele, rakke kultiveeritakse pidevalt sellistes 15

tingimustes, mis soodustavad leiutisekohast selekteeritavat markerit ekspresseerivate

rakkude kasvu. See on kõige paremini tagatav, kasutades selekteeritava markerina

geeniprodukti, mille suhtes peremeesrakk on defitsiitne. See selekteeritav marker on ühes

teostusviisis kodeeritud transkriptiga, mis kodeerib ka polüpeptiidliiget või nimetatud

polüpeptiidliikme subühikut, eelistatavalt, kui see selekteeritav marker on kodeeritud 20

transkriptiga, mis kodeerib suurimat subühikut.

Üks käesoleva leiutise aspekt käsitleb meetodit polüklonaalse valgu valmistamiseks,

milles nimetatud polüklonaalne valk sisaldab 2 kuni n distinktset liiget, kus nimetatud

meetod sisaldab:

a) polüklonaalse rakuliini ettevalmistamist, mis saadakse, kasutades käesoleva leiutise 25

kohast meetodit;

b) leiutisekohase polüklonaalse rakuliini kultiveerimist tingimustes, mis võimaldavad

polüklonaalse valgu ekspressiooni;

c) polüklonaalse valgu saagi kogumist ja valikulist puhastamist rakkudest või

söötmest; ja valikuliselt 30

d) iga erineva kogutud liikme ja valikuliselt puhastatud polüklonaalse valgu

juuresoleku kontrollimist.

EE-EP 2 152 872 B1 7

Käesoleva leiutise autorid on kindlaks teinud, et eri kloonide jaotuvus säilib üllataval

kombel produktsioonitsükli modelleerimise käigus, mis on omane rekombinantse

ravimprodukti tööstusliku tootmise tingimustele. See on väga üllatav, kuna polüklonaalse

antikeha individuaalsete liikmete ekspressioonivektorid integreeruvad erinevates asendites

ja seetõttu, et koopiate arv erineb. Sellest tulenevad erinevused nii ekspressioonitasemes ja 5

kasvu kiiruses.

Vastupidiselt ootustele, selline produtseerimine ei põhjustanud ühe või enama

polüklonaalse antikeha liikme täielikku või osalist kadu. Isegi väikeste erinevuste puhul

kasvu kiirustes erinevatel rakuliinidel on oodata, et mõne aja möödudes polüklonaalne

kompositsioon kaotab kas täielikult või osaliselt vähemalt ühe liikme sellest 10

polüklonaalsest kompositsioonist. Seega, selles käesoleva leiutise teostusviisis on

kompositsiooniline stabiilsus säilinud enam, kui 10 raku pooldumise kestel pärast

töörakkude panga (Working Cell Bank) ülessulatamist, eelistatavalt enam, kui 15

rakupooldumise, näiteks, enam, kui 20 raku pooldumise, näiteks enam, kui 25 raku

pooldumise, näiteks, enam, kui 30 raku pooldumise, näiteks, enam, kui 40 raku 15

pooldumise, näiteks, enam, kui 50 raku pooldumise, näiteks, enam, kui 75 raku

pooldumise, näiteks, enam, kui 100 raku pooldumise kestel.

Lisatud näited demonstreerivad, et see kompositsiooniline stabiilsus säilib vastuvõetavates

piirides enam, kui 25 raku pooldumise kestel.

Kuigi rõhuvas enamuses juhustest on eelistatud eraldi transfektsiooni, 20

ekspressioonivektorite kogumine enne transfektsiooni on võimalik teatud tingimustes. Kui

leiutisekohaseks polüklonaalseks valguks on monomer, on see tõepoolest valikuvõimalus,

kuna see ei ole probleem, et rakk ekspresseerib mitut erinevat polüklonaalse valgu liiget.

Kui leiutisekohaseks polüklonaalseks valguks on multimeer, siis ekspressioonivektorite

kogumine ühisvaruks enne transfektsiooni on vaid siis võimalik, kui kasutatakse võtteid, 25

mis kindlustavad selle, et rakku saab olema sisestatud ainult üks koopia. Muidu võib

toimuda ebasoovitav subühikute segipaiskamine (scrambling).

Kuna ekspressioonivektorite kogumine ühisvaruks on teatud võimalus, siis on see vähem

eelistatav, kui eraldi transfektsioon, kuna on oodata, et see põhjustab vähem töökindla

tootmissüsteemi kompositsioonilise stabiilsuse säilitamise suhtes. 30

Kummagi käesoleva leiutise kohase meetodi puhul on eelduseks võetud, et polüklonaalne

valk on tavaliselt see, mis on loomulikult assotsieeritud rakkudega, milles ekspressioon

EE-EP 2 152 872 B1 8

toimub.

Käesolevas leiutises on kirjeldatud mõningaid meetodeid, mille abil nukleiinhappe

järjestuse variantide raamatukogu võib olla sisestatud peremeesrakuliini, et genereerida

rakkude kollektsiooni, mis on polüklonaalsete valkude valmistamiseks sobilikuks

rakuliiniks. Nende meetodite hulka kuuluvad rakkude kollektsiooni põhimassi 5

transfektsioon nimetatud raamatukoguga, rakualikvootide transfektsioon raamatukogu

fraktsioonidega või, eelistatavalt, individuaalne transfektsioon, kui peremeesrakud on

transfekteeritud nimetatud raamatukogu individuaalsete liikmetega, millele järgneb

selektsiooni käigus genereeritud kloonide kogumine ühisvaruks. Käesolev leiutis kasutab

peremeesrakuliinina eelistatavalt imetajarakke (rakuliine või rakutüüpe). 10

Käesoleva leiutise ühest aspektist on polüklonaalse valgu individuaalsed liikmed

kodeeritud sõltumatute geenisegmentide paaridega. Polüklonaalsete valkude hulka, kus

need individuaalsed liikmed koosnevad kahest või enamast polüpeptiidahelast, kuuluvad

antikehade ja T-raku retseptorite lahustuv või membraaniga seotud vormid. Järgmises

käesoleva leiutise teostusviisis geeni segmentide paar kodeerib antikeha raske ahela ja 15

kerge ahela variaabelpiirkonda, või T-raku retseptori alfa-ahela ja beeta-ahela

variaabelpiirkonda või T-raku retseptori gamma-ahela ja delta-ahela variaabelpiirkonda.

Käesolev leiutis esitleb edasi polüklonaalset rakuliini, mis sisaldab 2 kuni n populatsiooni

rakku igast populatsioonist, millest igaüks ekspresseerib rekombinantse polüklonaalse

valgu erinevat liiget, milles see rekombinantne polüklonaalne valk sisaldab erinevaid, kuid 20

homoloogseid valgumolekule, kus need rakud sisaldavad vähemalt ühte

ekspressioonikonstrukti, mis on juhuslikult integreeritud genoomi nii, et

integratsioonisaidid varieerivad polüklonaalsete rakuliinide liikmete vahel. Ühes

teostusviisis on vähemalt üks ekspressioonikonstrukt juhuslikult integreeritud

kromosoomivälisesse elementi. Teises teostusviisis on vähemalt üks 25

ekspressioonikonstrukt integreeritud juhuslikku asendisse ühes või enamas peremeesraku

kromosoomis.

Leiutisekohane rakuliin pärineb eelistatavalt sellisest imetajaraku liinist, nagu seda on

hiina hamstri munasarja (Chinese hamster ovary - CHO) rakud, COS rakud, BHK rakud,

müeloomirakud (nt Sp2/0 rakud, NS0, YB2/0), NIH 3T3, fibroblastid või 30

immortaliseeritud inimese rakud, sellised nagu HeLa rakud, HEK 293 rakud või PER.C6.

Kuigi kasutatud võivad olla samuti ka sellised mitteimetaja eukarüootsed rakud või

prokarüootsed rakud, nagu taimerakud, putukarakud, pärmirakud, bakterid, seened jne.

EE-EP 2 152 872 B1 9

Samuti on avalikustatud siin DHFR-negatiivne CHO rakk, mis sisaldab stabiilselt

integreeritud nukleiinhapet, mis kodeerib tüüpi 5 adenoviiruse transaktivaatorit E1A, mis

on toimivalt seostatud konstitutiivse promootoriga.

Selline modifitseeritud CHO rakuliin konstrueeriti siin kirjeldatud eksperimentide tarbeks. 5

See rakuliin osutus erakordselt stabiilseks kasvu kiiruste ühtluse ja ekspressiooni tasemete,

ning stabiilsuse suhtes pika aja jooksul, nagu on näidatud käesolevasse dokumenti

lülitatud näidetes, ja on seetõttu eriti hästi kohandatud kasutamiseks käesolevas leiutises.

Hilisemad eksperimendid näitasid, et E1A mRNA ei olnud tuvastatav kaks korda

alakloonitud rakus. See tähendab, et saadud tulemusi, mis osutavad märkimisväärsele 10

kompositsioonilisele stabiilsusele, ei saa kanda ainult E1A ekspressiooni arvele. Sellest

hoolimata on oodata, et DHFR-negatiivne CHO rakuliin, mis ekspresseerib stabiilselt

E1A-d, põhjustab selle rakuliini väga stabiilse ja kõrge ekspressiooni.

Eelistatud teostusviisis on see rakuliin tuletatud DG44 rakuliinist, mis on homosügootne

DHFR-knockout. See rakuliin võib ellu jääda vaid tümidiinidefitsiitses söötmes, kui need 15

rakud sisaldavad rekombinantset DHFR ekspressioonikonstrukti.

Eelistatud teostusviisis sisaldab käesoleva leiutise kohane rakuliin lisaks vähemalt ühte

koopiat stabiilselt integreeritud ekspresseerivat konstrukti, mis kodeerib huvipakkuvat

polüpeptiidi. Selleks huvipakkuvaks polüpeptiidiks võib olla multimeerne valk ja

eelistatavalt on selleks multimeerseks valguks antikeha. 20

Selleks, et võimaldada selekteerimist tümidiinidefitsiitses söötmes, kodeerib see

huvipakkuvat polüpeptiidi kodeeriv ekspressioonikonstrukt, lisaks ka DHFR-i.

Eelistatavalt on DHFR ja vähemalt üks huvipakkuva polüpeptiidi subühik kodeeritud

sama transkriptiga, enam eelistatavalt on DHFR kodeeritud transkriptis, mis kodeerib

suurimat subühikut. See viib soovitava produkti tugeva seostumiseni huvipakkuva 25

polüpeptiidi ja selektsiooni markeri, DHFR-ga, ja tagab, et ellujäänud rakud

ekspresseeriva huvipakkuvat polüpeptiidi.

Huvipakkuva polüpeptiidi ekspressiooni edasiseks suurendamiseks võib huvipakkuva

polüpeptiidi ekspressioon olla kontrollitud ühe või enama promootoriga, mida on võimalik

aktiveerida transkriptsionaalse aktivaatoriga E1A, eelistatavalt sellisega, milles 30

promootoriks on CMV promootor või promootor, mis on tuletatud CMV promootorist.

EE-EP 2 152 872 B1 10

Definitsioonid

Terminiga "valk" või "polüpeptiid" on peetud silmas ükskõik millist aminohapete ahelat,

hoolimata selle pikkusest või post-translatsionaalsest modifikatsioonist. Valgud võivad

eksisteerida monomeeride või multimeeridena, mis sisaldavad kahte või enamat

kokkupandud polüpeptiidahelat, valgu fragmenti, polüpeptiidi, oligopeptiidi või peptiidi. 5

Kasutatuna käesolevas dokumendis, termin "polüklonaalne valk" või "polüklonaalsus"

viitab valgu kompositsioonile, mis sisaldab erinevaid, kuid homoloogseid valgumolekule,

mis on eelistatavalt valitud immunoglobuliinide sugukonnast. Seega iga valgumolekul on

homoloogne teiste kompositsiooni molekulidega, kuid sisaldab kas ühte või enamat

fragmenti variaabelpolüpeptiidjärjestust, mida iseloomustab(vad) erinevus(ed) 10

polüklonaalse valgu individuaalsete liikmete aminohappejärjestus(t)e vahel. Selliste

polüklonaalsete valkude tuntud näidete hulka kuuluvad antikehade või immunoglobuliini

molekulid või nende derivaadid (sellised nagu Fab Fab2; üheahelalised Fvs jne), T-raku

retseptorid ja B-raku retseptorid. Polüklonaalne valk võib koosneda defineeritud

alakogumist valgumolekulidest, millel on defineeritud ühiseid tunnusjooni, selliseid nagu 15

ühine seostumisaktiivsus soovitava märklaua suhtes, näiteks polüklonaalse antikeha puhul

on see seostumise aktiivsus suunatud soovitava märklaudantigeeni vastu.

Termin " huvipakkuv polüklonaalne valk" hõlmab defineeritud polüklonaalsete valkude

alakogumit, millel on selliseid ühised tunnusjooned, nagu seostumisaktiivsus, mis on

suunatud soovitava märklaua vastu, näiteks, juhul, kui tegemist on kirjeldatud 20

polüklonaalsete antikehadega, millel on seostumisaktiivsus või spetsiifilisus suunatud

märklaudantigeeni vastu, kus nimetatud antigeeniks on üks või enam, näiteks, eraldi

valku, mikroorganismi, parasiiti, rakutüüpi, allergeeni või süsivesikumolekule, või

ükskõik millist teist struktuuri, molekuli või ainet, mis võib olla märklauaks antikeha

spetsiifilisel seostumisel, või nimetatud antigeenide segud. 25

Terminid "rekombinantse polüklonaalse valgu kompositsiooni üks liige" või

"rekombinantse polüklonaalse valgu üks liige" tähendab ühte valgumolekuli valgu

kompositsioonis, mis sisaldab erinevaid, kuid homoloogseid valgumolekule, kus iga

valgumolekul on homoloogne teiste kompositsiooni molekulidega, kuid sisaldab ka ühte

või enamat fragmenti variaabelpolüpeptiidjärjestusest, mida iseloomustavad erinevused 30

polüklonaalse valgu individuaalsete liikmete aminohappejärjestuste vahel.

EE-EP 2 152 872 B1 11

Termineid "variaabelpolüpeptiidjärjestus" ja "variaabelpiirkond" on kasutatud

vahetatavalt.

Terminid "rekombinantse polüklonaalse valgu eristatav liige" tähendab ühte

valgumolekuli valgu kompositsioonist, mis sisaldab erinevaid, kuid homoloogseid

valgumolekule, kus iga valgumolekul on homoloogne teiste kompositsiooni molekulide 5

suhtes, kuid sisaldab ka ühte või enamat variaabelpolüpeptiidjärjestuse fragmenti, mida

iseloomustavad erinevused polüklonaalse valgu individuaalsete liikmete

aminohappejärjestustes vahel.

Termin "antikeha" kirjeldab seerumi funktsionaalset komponenti, ja seda nimetatakse tihti

kas molekulide kogumiks (antikehad või immunoglobuliinid) või üheks molekuliks 10

(antikehamolekul või immunoglobuliinimolekul). Antikeha molekul on võimeline

seostuma või reageerima spetsiifilise antigeense determinandiga (antigeeni või antigeense

epitoobiga), mis omakorda võib käivitada immunoloogiliste efektorite mehhanismid.

Individuaalset antikehamolekuli vaadeldakse tavaliselt kui monospetsiifilist, ja

antikehamolekulide kompositsioon võib olla monoklonaalne (s.o, koosneb identsetest 15

antikehamolekulidest) või polüklonaalne (s.o, koosneb erinevatest antikeha molekulidest,

mis reageerivad sama või erinevate epitoopidega samal antigeenil või isegi distinktsetel,

erinevatel antigeenidel). Igal antikehamolekulil on unikaalne struktuur, mis võimaldab

sellel spetsiifiliselt seostuda vastava antigeeniga, ja kõikidel loomulikel

antikehamolekulidel on samad ühised põhistruktuurid, mis sisaldavad kahte identset kerget 20

ahelat ja kahte identset rasket ahelat. Antikehi tuntakse ka üheskoos kui

immunoglobuliine. Terminid antikeha või antikehad hõlmavad, kasutatuna käesolevas

dokumendis, ka kimäärseid ja üheahelalisi antikehasid, aga ka selliseid antikehade

seostumisfragmente, nagu Fab-, Fv-fragmendid või scFv-fragmendid, aga ka selliseid

multimeerseid vorme, nagu dimeersed IgA molekulid või pentavalentsed IgM molekulid. 25

Termin "polüklonaalne antikeha" kirjeldab kompositsiooni erinevatest

antikehamolekulidest, mis on võimelised seostuma või reageerima mõningate erinevate

spetsiifiliste antigeensete determinantidega samal või erinevatel antigeenidel. Tavaliselt

polüklonaalse antikeha variaablus on arvatavasti lokaliseeritud polüklonaalse antikeha

niinimetatud variaabelpiirkondades. Kuid käesoleva leiutise kontekstis võib 30

polüklonaalsuse all mõista ka kirjeldatud erinevusi individuaalsete antikehamolekulide

vahel, mis paiknevad niinimetatud konstantsetes piirkondades, näiteks, kui tegemist on

antikehade segudega, mis sisaldavad kahte või enamat sellist antikeha isotüüpi, nagu

EE-EP 2 152 872 B1 12

inimese isotüübid IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD ja IgE, või the hiire

isotüübid IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ja IgA.

Termin "huvipakkuv rekombinantne polüklonaalne antikeha" kirjeldab defineeritud

rekombinantsete polüklonaalsete antikehade alakogumit, mida iseloomustab võime

seostuda soovitava märklauaga või soovitavate märklaudade kogumiga, kus nimetatud 5

märklaudadeks on, näiteks, eraldi valk, mikroorganism, parasiit, rakk, allergen või

süsivesikumolekul või teine struktuur, molekul või substants, mis võib olla märklauaks

spetsiifilise antikeha seostumisel, või nende segud.

Terminit "immunoglobuliin" kasutatakse tavaliselt tähistamaks veres või seerumis leitud

antikehade kogu segu, kuid see võib samuti olla kasutatud, et tähistada teistest allikatest 10

tuletatud antikehade segu.

Termin "immunoglobuliinimolekul" tähendab individuaalset antikehamolekuli, näiteks,

kui osa immunoglobuliinist, või osa ükskõik millisest polüklonaalsest või

monoklonaalsest antikehakompositsioonist.

Kui kinnitatakse, et polüklonaalse valgu liige seostub antigeeniga, siis peetakse silmas 15

seostumist seostumiskonstandiga, mis on alla 1 mM, eelistatavalt alla 100 nM või veelgi

enam eelistavalt, alla 10 nM.

Terminit "huvipakkuv variantnukleiinhapemolekulide raamatukogu" kasutatakse, et

kirjeldada nukleiinhappemolekulide kollektsiooni, mis üheskoos kodeerivad

"huvipakkuvat rekombinantset polüklonaalset valku". Kasutatuna transfektsiooniks, see 20

huvipakkuvate variantnukleiinhappe molekulide raamatukogu sisaldub

ekspressioonivektorite raamatukogus. Selline raamatukogu sisaldab tüüpiliselt vähemalt 2,

3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 või 106 erinevat liiget.

Käesolevas dokumendis kasutatud terminit "distinktne nukleiinhappejärjestus" tuleb

mõista kui nukleiinhappe järjestust, mis võib kodeerida erinevaid polüpeptiidahelaid, mis 25

üheskoos moodustavad huvipakkuva valgu. Kui need distinksed nukleiinhappe järjestused

koosnevad enam, kui ühest kodeerivast järjestusest, siis need järjestused võivad olla

bitsistronilise transkriptsiooniühiku kujul, või nad võivad töötada kui kaks eraldi

transkriptsiooniühikut, kui nad on toimivalt seostatud sobivate promootoritega. Samuti on

mõeldav tri- ja kvatrorotsistroniliste transkriptsiooniühikute kasutamine, kui huvipakkuv 30

valk koosneb 3 või 4 subühikust, või kui selektsioonimarker on sisse lülitatud

transkriptsioonaalsesse ühikusse koos nukleiinhappega, mis kodeerib huvipakkuvat valku

EE-EP 2 152 872 B1 13

või selle subühikut. Eelistatavalt on distinktne käesoleva leiutise kohane

nukleiinhappejärjestus osaks nukleiinhappemolekulist, näiteks sellise, nagu vektor.

Mõningate näidete hulka, kus on vaja enam, kui ühte kodeerivat järjestust, et tekitada

huvipakkuva valgu terve molekul, kuuluvad B raku retseptorid, antikehad ja selliseid

antikehade fragmendid, nagu Fab's ja variaabeldomeenid, või T-raku retseptorid. 5

Sisestatuna rakku, need geenid, mis üheskoos kodeerivad tervet kokkupandud

huvipakkuvat valku, paiknevad samas vektoris, olles seega sidestatud kokku ühes

nukleiinhappejärjestuses.

Termin "huvipakkuv geen" kasutatuna käesolevas dokumendis, viitab nukleiinhappe

järjestusele, mis koosneb ühest või enamast geeni segmendist (genoomsest või cDNA-st), 10

mis kodeerivad ühte huvipakkuva valgu liiget. "Huvipakkuvate geenide" mitmene vorm

viitab nukleiinhappejärjestuste raamatukogule, mis kodeerib huvipakkuvat polüklonaalset

valku. Terminit "GOI" kasutatakse kui lühendit huvipakkuv(ad) geen(id) (gene(s) of

interest).

Kasutatuna käesolevas dokumendis, termin "vektor" viitab nukleiinhappemolekulile, mille 15

nukleiinhappejärjestus võib olla selle transportimiseks sisestatud erinevatesse

geneentilistesse keskkondadesse ja/või ekspressiooniks peremeesrakku. Kui see vektor

kannab regulatoorseid elemente, mis on vajalikud vektorjärjestusse inserditud

nukleiinhappe transkriptsiooniks (vähemalt sobivat promootorit), siis seda vektorit

nimetatakse "ekspressioonivektoriks". Kui see nukleiinhappe järjestus, mis on sisestatud 20

eelpool identifitseeritud vektoritesse, kodeerib huvipakkuvat valku, nagu on siin

defineeritud, siis kasutatakse järgmiseid termineid " huvipakkuv vektor" ja " huvipakkuv

ekspressioonivektor". Termin "isotüüpi kodeeriv vektor" viitab vektorile, mis kannab

antikeha isotüüpi kodeerivat nukleiinhappejärjestust. Käesolevas spetsifikatsioonis

kasutatakse termineid "fagemiidi vektor" ja "faagi vektor" vahetatavalt. 25

Terminid "plasmiid" ja "vektor" kasutatakse vahetatavalt. Käesolevasse leiutisse on ette

nähtud lülitada sellised teised vektorite vormid, millel võivad olla ekvivalentsed

funktsioonid, näiteks plasmiidid, fagemiidid ja viiruse genoomid või ükskõik millised

nukleiinhappe molekulid, mis on võimelised suunama soovitava valgu produktsiooni õiges

peremeesorganismis. 30

Terminit "huvipakkuvate vektorite raamatukogu iga liige" kasutatakse, et kirjeldada

individuaalseid vektormolekule, millel on eristatav nukleiinhappe järjestus, mis on

tuletatud huvipakkuvate vektorite raamatukogust, kus see nukleiinhappe järjestus kodeerib

huvipakkuva rekombinantse polüklonaalse valgu ühte liiget.

EE-EP 2 152 872 B1 14

Terminit "massiline ülekanne" kasutatakse, et kirjeldada huvipakkuvate

nukleiinhappejärjestuste ülekannet ühest vektorite populatsioonist teise vektorite

populatsiooni ja teha nii iga DNA-ga üheaegselt, kasutamata abinõuna huvipakkuvate

individuaalsete DNA-de eraldamist. Sellisteks vektorite populatsioonideks võivad olla

raamatukogud, mis sisaldavad näiteks huvipakkuvaid variaabelpiirkondi, promootoreid, 5

liiderjärjestusi või intensiivistavaid elemente. Need järjestused võivad seejärel olla

liigutatud ilma eelneva eraldamiseta näiteks faagi vektorist imetaja

ekspressioonivektorisse. Eriti antikeha järjestuste puhul tagab see metoodika selle, et side

VH ja VL mitmekesisuste vahel ei kao raamatukogude üleviimisel, näiteks,

selektsioonivektorist (nt, faagil eksponeeritavast vektorist) imetaja 10

ekspressioonivektorisse. Siinjuures säilitatakse algne VH ja VL paardumine.

Terminit "transfektsioon" on siin kasutatud laias mõttes võõr-DNA sisestamisel rakku.

See termin hõlmab käesolevas dokumendis ka teisi funktsionaalselt ekvivalentseid

meetodeid võõr-DNA sisestamiseks rakku, selliseid nagu näiteks, transformatsioon,

infektsioon, transduktsioon või doonorraku ja aktseptorraku fusioon. 15

Terminit "selektsioon" kasutatakse, et kirjeldada meetodit, kus rakud on omandanud teatud

tunnusjoone, mis võimaldab neid eristada rakkudest, mis ei ole omandanud seda

tunnusjoont. Selliseks tunnusjooneks või olla resistentsus tsütotoksiliste agensite suhtes

või olulise tähtsusega toitaine, ensüüm või värvaine produktsioon.

Termineid "selekteeritav markergeen", "selektsiooni markergeen", "selektsioonigeen" ja 20

"markergeen" on kasutatud, et kirjeldada geeni, mis kodeerib selekteeritavat markerit

(näiteks, geeni, mis annab resistentsuse mõningate selliste tsütotoksiliste ravimite suhtes,

nagu teatud antibiootikumid, geeni, mis on võimeline produtseerima olulise tähtsusega

toitainet, mis võib olla ammendatud kasvusöötmest, geeni, mis kodeerib ensüümi, mis

produtseerib metaboliite, mis võivad olla analüüsitavad, või geeni, mis kodeerib värvilist 25

valku, mis võimaldab, näiteks, sorteerimist FACS abil), mis on sisestatud rakkudesse koos

huvipakkuva(te) geeni(de)ga.

Terminit "rekombinantne valk" kasutatakse, et kirjeldada valku, mida ekspresseeritakse

rakuliini poolt, mis on transfekteeritud valku kodeeriva nukleiinhappejärjestust sisaldava

ekspressioonivektoriga. 30

Kasutatuna käesolevas dokumendis, viitab termin "toimivalt seostatud" segmendile, mis

on seostatud teise segmendiga, kui see on pandud funktsionaalsesse sõltuvusse teisest

EE-EP 2 152 872 B1 15

segmendist. Näiteks, DNA, mis kodeerib signaaljärjestust, on toimivalt seostatud DNA-

ga, mis kodeerib polüpeptiidi, kui seda ekspresseritakse kui liidrit, mis osaleb polüpeptiidi

ülekandes endoplasmaatiline retiikulumi. Ka promootor või võimendusjärjestus on

toimivalt seostatud kodeeriva järjestusega, kui see stimuleerib selle järjestuse

transkriptsiooni. 5

Termin "valdav osa individuaalseid rakke" viitab sellisele rakkude protsendile, nagu enam,

kui 80%, eelistatavalt enam, kui 85%, enam eelistatavalt 90%, 95%, või isegi 99% või

enam.

Kasutatuna käesolevas dokumendis, terminit "genoom" ei tasu võtta täht-tähelt kui tavalist

kromosoomide täiskomplekti, mis on esindatud rakus, vaid ka kromosoomiväliseid 10

elemente, miks võivad olla sisestatud rakku, ja säilitatakse selles. Selliste

kromosoomiväliste elementide hulka võivad kuuluvda, kuid ei ole nendega piiratud, mini-

kromosoomid, YACs (yeast artificial chromosomes – pärmi kunstlikud kromosoomid),

MACs (mouse artificial chromosomes - hiire kunstlikud kromosoomid), või HACs (human

artificial chromosomes - inimese kunstlikud kromosoomid). 15

Termin "promootor" viitab DNA piirkonnale, millega seostub RNA-polümeraas, et

initsieerida transkriptsiooni.

Termin "head-to-head promootorid" (”pea-pea promootorid”) viitab promootoripaarile,

mis on paigutatud teineteise vahetusse lähedusse nii, et nende kahe geenifragmendi

transkriptsioon juhitakse nimetatud promootorite abil vastassuundades. Head-to-head 20

promootorid võivad samuti olla konstrukeeritud täidisega, mis koosneb mitteasjakohastest

nukleiinhapetest nimetatud kahe promootori vahel. Selline täidisfragment võib kergesti

sisaldada enam, kui 500 nukleotiidi.

"Geeniks, mis vastutab resistentsuse eest antibiootkumide suhtes" on geen, mis kodeerib

valku, mis võib ületada antibiootikumi inhibitoor- või toksilise efekti rakule, kindlustades 25

rakkude ellujäämise ja jätkuva proliferatsiooni antibiootikumi juuresolekul.

Termin "sisemine ribosoomi sisenemissait" või "IRES" (internal ribosome entry site)

kirjeldab struktuuri, mis erineb tavalisest 5' cap-struktuurist mRNA-l. Kumbki neist

struktuuridest või olla ära tuntud ribosoomi poolt, et initsieerida AUG-koodoni

skaneerimist ning, et initsieerida translatsiooni. Kasutades ühte promootorjärjestust ja 30

kahe AUG-koodoni initsieerimist, esimene ja teine polüpeptiidjärjestus võib olla

transleeritud üksikult mRNA-lt. Seega, et võimaldada esimese ja teise

EE-EP 2 152 872 B1 16

polünukleotiidjärjestuse koostranslatsiooni ühelt kahetsistroniliselt mRNA-lt, esimene ja

teine polünukleotiidjärjestus võivad olla transkriptsiooniliselt kokkusulandatud

linkerjärjestuse kaudu, mis sisaldab IRES järjestust ja võimaldab selle

polünukleotiidjärjestuse translatsiooni allavoolu IRES järjestusest. Sel juhul

transkribeeritud kahetsistroniline RNA molekul transleeritakse kahetsistronilise RNA 5

molekuli kummastki capped 5' otsast ja sisemisest IRES järjestusest, produtseerides nii

esimest, kui ka teist polüpeptiidi.

Terminit "indutseeritav ekspressioon" kasutatakse, et kirjeldada ekspressiooni, mis vajab

selleks, et ekspressioon leiaks aset, interaktsiooni indutseeriva molekuliga või

korepressormolekuli ja regulaatorvalgu vabastamist. 10

Termin "konstitutiivne ekspressioon" viitab ekspressioonile, mis tavaliselt ei ole

indutseeritav.

Termin "segipaiskamine" ("scrambling") kirjeldab situatsioone, milles kaks või enam

erinev polüklonaalse valgu liiget, millest igaüks sisaldab kaks või enam erinevat

polüpeptiidahelat, näiteks immunoglobuliini sugukonnast, ekspresseeritakse 15

individuaalsest rakust. Selline olukord võib tekkida, kui individuaalne rakk on

integreerinud genoomi enam, kui ühe paari geenisegmente, kus iga paar geenisegmente

kodeerib erinevat polüklonaalse valgu liiget. Sellistes olukordades võivad tekkida

nimetatud geeni segmentidest ekspresseeritud mitte ettenähtud polüpeptiidahelate

kombinatsioonid. Neil polüpeptiidahelate mitte ettenähtud kombinatsioonidel võib 20

terapeutiline efekt üldse puududa.

Termin "VH-VL ahelate segipaiskamine" on üheks selliseks eelpool määratletud

segipaiskamine näiteks. Selles näites geeni segmendid, mis kodeerivad VH ja VL ahelaid,

moodustavad geenisegmentide paari. Nimetatud segipaiskamine leiab aset, kui VH- ja VL-

polüpeptiidide mitte ettenähtud kombinatsioonid produtseeritakse nende rakkude poolt, 25

millesse on integreeritud kaks erinevat VH- ja VL-polüpeptiididi kodeerivat geenisegmendi

paari. Selline skrambleeritud antikeha molekul tõenäoliselt ei säilita algset spetsiifilisust,

ja seega sellel võib puududa mis tahes terapeutiline toime ja isegi mitte ettenähtud

terapeutiline toime.

Termin "rekombinantne polüklonaalne produtseeriv rakuliin" viitab valku ekspresseerivale 30

rakkude populatsioonile, mis on transfekteeritud huvipakkuva variantnukleiinhappe

järjestuste raamatukoguga nii, et need individuaalsed rakud, mis üheskoos moodustavad

EE-EP 2 152 872 B1 17

rekombinantse polüklonaalse produtseeriva rakuliini, kannavad ühte või enamat

huvipakkuva nukleiinhappe järjestuse erinevat koopiat, mis kodeerib ühte selle

huvipakkuva rekombinantse polüklonaalse valgu liiget, ja et iga koopia on integreeritud

iga raku genoomi. Rakud, mis moodustavad selle rekombinantse polüklonaalse

produtseeriva rakuliini, on valitud nende võime järgi säilitada distinktse huvipakkuva 5

nukleiinhappe järjestuse integreeritud koopia, näiteks selektsiooniga, kasutades

antibiootikumi. Rakkudeks, mis võivad moodustada sellise produtseeriva rakuliini, võivad

olla näiteks bakterid, seened, selliseid eukarüootsed rakud, nagu pärm, putukarakud või

imetajarakud, eriti selliseid surematud imetajaraku liinid, nagu CHO rakud, COS rakud,

BHK rakud, müeloomirakud (nt, Sp2/0 rakks, NS0, YB2/0), NIH 3T3 ja selliseid 10

immortaliseeritud inimese rakud, nagu HeLa rakud, HEK 293 rakud või PER.C6.

Terminit "kõrvalekalle" (”bias”) kasutatakse, et tähistada fenomeni, mis leiab aset

rekombinantse polüklonaalse valgu produktsiooni kestel, milles polüklonaalse vektori,

polüklonaalse rakuliini või polüklonaalse valgu kompositsioon muutub pika aja jooksul,

mille põhjuseks on juhuslikud geneetilised mutatsioonid, erinevused individuaalsete 15

rakkude proliferatsiooni kineetikates vahel, erinevused ekspressioonitasemetes erinevate

ekspressioonikonstruktide järjestuste vahel, või erinevused DNA kloneerimise

efektiivsuses.

Termin "RFLP" viitab "restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismile" (restriction

fragment length polymorphism), meetodile, millega analüüsitakse nukleiinhappe 20

molekulide fragmentide migratsioonimustrit geelis pärast lõikamist

restriktsiooniensüümidega.

Termin "5'-UTR" viitab mRNA 5'-otsa transleerimata piirkonnale (untranslated region).

Termin "tingimused, mis hoiavad ära saitspetsiifilise integratsiooni" viitab

transfektsiooniprotsessile, mis ei sisalda ühtegi võimalikest viisidest, millega on võimalik 25

saavutada saitspetsiifiline integratsioon. Saitspetsiifiline integratsioon võib, näiteks, olla

saavutatud, kasutades rekombinaasi ja rekombinaasi äratundmissaidi kombinatsiooni

peremeesraku kromosoomis. See rekombinaas võib samuti olla kovalentselt seostatud

nukleotiidfragmendiga, mis tunneb ära konkreetse saidi kromosoomis. Saitspetsiifiline

integratsioon võib olla saavutatud ka, kuigi väiksema efektiivsusega, kasutades 30

homoloogset rekombinatsiooni. Saitspetsiifilise integratsiooni vältimine põhjustab sageli

integratsiooni juhuslikes asendites peremeesraku genoomi ulatuses, kui kasutatud on

integratsioonivektoreid.

EE-EP 2 152 872 B1 18

Termin "juhuslik integratsioon" viitab ekspressioonivektori integratsioonile peremeesraku

genoomi, asendites, mis on juhuslikud. Sõnastiku kohaselt sõna ”juhuslik” tähendab, et

igal elemendil on võrdsed võimalused selle integratsiooni saidi puhul. Rakkude

transfekteerimisel ei ole kõigil integratsioonisaitidel absoluutselt võrdsed võimalused

integratsiooniks, kuna mõningad kromosoomide osad on enam altid integratsiooniks, kui 5

teised. Kui midagi ei tehta ekspressioonivektori juhtimiseks konkreetsesse

integratsioonisaiti, integreerub see asendis, mis on juhuslik võimalike integratsioonisaitide

rühmas. Seega, terminit "juhuslik integratsioon" tuleb käesoleva leiutise kontekstis mõista

kui transfektsiooniprotsessi, mille puhul mitte midagi ei tehta, et juhtida

ekspressioonikonstrukti ettemääratud asendisse. Vahendite puudumine 10

ekspressioonivektori ettemääratud asendisse juhtimiseks, on piisav selleks, et kindlustada

"juhuslik integratsioon". Seeläbi integratsioonisait(did) transfekteeritud populatsioonis

varieerub rakult rakule ja täpset(eid) integratsioonisaiti(te) võib vaadelda

ettearvamatutena.

Termin "stabiilselt integreeritud" viitab ekspressioonivektori integratsioonile 15

peremeesraku genoomi, milles see integratsioon jääb stabiilseks vähemalt 20, enam

eelistatavalt 30, enam eelistatavalt 40, enam eelistatavalt 50, näiteks, 75, näiteks, 100

põlvkonna jooksul või kauemgi.

Lühendid: "CMV" = (inimese) tsütomegaloviirus (Cytomegalo Virus). "AdMLP" =

adenoviiruse peamine hiline promootor (Major Late Promoter). SV40 poly A = 20

ahviviiruse 40 (Simian Virus 40) polü-A signaaljärjestus. GFP = rohelised fluorestseeruvad

vagud (Green Flourescent Proteins). TcR = T-raku retseptor. ELISA = ensüümseotud

immunosorbent analüüs (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). LTR= pikk otsmine

kordus (Long Terminal Repeat).

JOONISTE KIRJELDUS 25

Joonis fig 1. Skemaatiline ülevaade polüklonaalsete rakkude panga genereerimisest.

See joonis illustreerib skemaatiliselt etappe, mis on vajalikud polüklonaalsete rakkude

panga, näiteks, polüklonaalse baasrakkude panga (Master Cell Bank) saamiseks. a)

Illustreerib erinevaid ekspressioonivektoreid N.A,1, N.A,2, N.A,3, jne, millest igaüks

kodeerib erinevat ja distinkset polüklonaalse valgu liiget. b) Illustreerib 30

ekspressioonivektoritega, transfekteeritavaid peremeesrakke. c) Illustreerib

ekspressioonivektorite integratsiooni erinevates asendites ja erinevatel koopia arvudel

individuaalsetes rakkudes. d) Illustreerib rakukloonide selektsiooni iga polüklonaalse

EE-EP 2 152 872 B1 19

valgu liikme suhtes. Sellel konkreetsel juhul, illustreerimise lihtsustamiseks, on näidatud

ainult üks kloon polüklonaalse valgu ühe eristatava liikme kohta. Etapp e) illustreerib

kloonide segamist, mis olid valitud etapil d), et genereerida polüklonaalsete rakkude pank.

Joonis fig 2a. Prototüüpvektor, mis kodeerib rasket ja kerget ahelat

Selle vektori elemendid on järgmised: 5

• Kaks identset head-to-head inimese CMV promootorit speiserelemendiga nende

vahel

• rasket (VH + gamma 1 konstantne piirkond) ja kerge ahelat (kappa 02-286)

kodeerivad piirkonnad

• bGH=härja kasvuhormooni polüadenülatsioonijärjestus 10

• SV40 pA=SV40 polüadenülatsioonijärjestus

• raske ja kerge ahela genoomsed liidrid

• IRES + DHFR=ECMV sisemine ribosoomi sisenemissait ja hiire

dihüdrofolaatreduktaasi cDNA

• pUC ori=pUC replikatsiooni algus (origin of replication) 15

• bla, amp=ampitsilliini resistentsuse geen

Joonis fig 2b. E1A ekspressioonivektor pML29

Selle vektori elemendid on järgmised:

See vektor põhineb plasmiidil pcDNA3,1+ (Invitrogen)

CMV=inimese CMV promootor 20

Ela=adenoviiruse tüüpi 5 13S transaktivaatori cDNA

bGH=härja kasvuhormooni polüadenülatsiooni piirkond

SV40EP=SV40 varajane promootor

Neo=neo resistentsuse geen

SV40 polyA=SV40 polüadenülatsiooni piirkond AMP=β-laktamaasi geen, mis kodeerib 25

ampitsilliiniresistentsust

Joonis fig 3. IgG sisaldus segudes 1 - 9 viienädalase perioodi kestel, mil see eksperiment

läbi viidi. Detaile vaata näites 1.

EE-EP 2 152 872 B1 20

Joonis fig 4. Ioonvahetuse kromatogrammid, mis näitavad Mix 8 koostist eksperimendi

alguses (must) ja 5 nädalase kultiveerimisperioodi lõpus (sinine).

Joonis fig 5. Esimene (hall) ja viimane (must) proov kõikidest 9 segust analüüsiti

ioonvahetus-kromatograafiaga ja iga individuaalse antikeha sisaldus on arvutatud välja ja

näidatud graafiliselt 5

Joonis fig 6 Proove neljast segust (näide 5), mis olid võetud külvi ja bioreaktori töö kestel,

analüüsiti ioonvahetuskromatograafiaga ja iga individuaalse antikeha sisaldus arvutati

välja, ja see on näidatud graafiliselt.

Segu 1 A - 3 A sisaldas ühte klooni ühe antikeha kohta. Need rakukloonid, mis

ekspresseerivad igat 6 antikeha, olid erinevad segus 1 A (joonis fig 6a), segus 2 A (joonis 10

fig 6b) ja segus 3 A (joonis fig 6c).

Segu 4 A (joonis fig 6d) sisaldas 3 klooni ühe antikeha kohta.

LEIUTISE DETAILNE KIRJELDUS

Rekombinantne polüklonaalse valgu ekspressioonisüsteem

Käesolev leiutis esitleb meetodeid rekombinantsete polüklonaalsete valkude järjekindlaks 15

tootmiseks, kus need valgud on eelistatavalt valitud immunoglobuliini sugukonnast,

immunoglobuliiniga sarnaseid domeene omavate valkude perekonnast. Suurem osa

nendest liikmetest on kaasatud raku pinnal toimuvate sündmuste äratundmiseks.

Järjestuste analüüs näitab, et antikehad, T-raku retseptorid, MHC-molekulid, mõned

rakuadhesioonimolekulid ja tsütokiinide retseptorid on suure homoloogsusega. Eriti selle 20

perekonna liikmed, mis sisaldavad variaabelpiirkondi, on sobilikud käesoleva leiutise

kohaste rekombinantsete polüklonaalsete valkude genereerimiseks. Selliste liikmete hulka

kuuluvad antikehad, membraaniga seotud antikehad (B-raku retseptorid), Fab-fragmendid,

Fv- fragmendid, üheahelalised Fv-fragmendid (scFv), T-raku retseptorid (TcRs),

lahustuvad TcR-d, TcR variaabeldomeeni fragmendid, TcR variaabeldomeeni fragmendid, 25

mis on seostatud polüpeptiidlinkeri või teise antikeha või TcR-st tuletatud fragmentidega.

Konkreetselt, kaalutakse, kas käesolev leiutis või olla kasutatud rekombinantsete

terapeutiliste polüklonaalsete antikehade ja TcR-de suuremastaabiliseks tootmiseks ja

produktseerimiseks.

Üks käesoleva leiutise kohase tootmise peamistest eelistest on see, et kõik liikmed, mis 30

moodustavad rekombinantse polüklonaalse valgu, võivad olla produtseeritud ühes või

EE-EP 2 152 872 B1 21

mõnes bioreaktoris või nende ekvivalentides. Edasi, see rekombinantne polüklonaalne

valgukompositsioon võib olla eraldatud ja puhastatud reaktorist üksiku preparaadina ilma

eraldi individuaalse liikmeta, mis moodustavad rekombinantse polüklonaalse valgu selle

protsessi kestel. Erinevalt sellest, kui tahetakse imiteerida rekombinantse polüklonaalse

antikeha kompositsiooni, segades kokku puhastatud monoklonaalseid antikehi (nagu, 5

näiteks, on pakutud publikatsioonis WO 91/16074), see nõuab iga kompositsiooni

lülitatava antikeha eraldi valmistamist bioreaktoris ja samuti peaksid need antikehad

olema puhastatud eraldi. Selline monoklonaalse segu tootmine saab olema väga kulukas,

ja peale selle on see aega ja ruumi nõudev, võrreldes siin kirjeldatud rekombinantsete

polüklonaalsete antikehade või teiste polüklonaalsete valkude produtseerimise meetodiga. 10

Seega on meetodil, mida on kirjeldatud publikatsioonis WO 91/16074 loomulikud

praktilised piirangud produtseeritavate monoklonaalsete antikehade arvu suhtes, mis

võiksid olla sisse lülitatud sellisesse segusse, samal ajal kui käesoleva leiutise kohase, siin

kirjeldatud tehnoloogiaga, võib üldiselt produtseerida polüklonaalse antikeha ükskõik

millist individuaalset liiget, põhimõtteliselt ilma ülemiste piiranguteta. 15

Kasutatud peremeesrakuliiniks on eelistatavalt imetajaraku liin, mis sisaldab raku liine,

mida tüüpiliselt kasutatakse biofarmatseutiliseks valgu ekspressiooniks, näiteks, CHO

rakke, COS rakke, BHK rakke, müeloomi rakke (nt, Sp2/0 rakke, NS0, YB2/0), NIH 3T3,

ja immortaliseeritud inimese rakke, selliseid nagu HeLa rakud, HEK 293 rakke või rakke

PER.C6. Käesolevas leiutises kasutati CHO rakke, konkreetsemalt, modifitseeritud DG44 20

klooni. Valik sellele konkreetsele rakuliinile langes seetõttu, et CHO rakke kasutatakse

laialdaselt rekombinantsete antikehade valmistamiseks, ja seetõttu, et DG44 kloon võib

olla kasutatud kombinatsioonis metaboolse selektsioonimarkeriga DHFR, mis lisaks

võimaldab kodeeritud geeni amplifitseerida.

Seda DG44 rakuliini modifitseeriti tranfekteerides E1A transaktivaatoriga, mis kodeerib 25

ekspressioonivektorit. Seda tehti, et suurendada üldsaagist, kui huvipakkuv geen on

operatiivselt seostatud CMV promootoriga. See CMV promootor transaktiveeritakse E1A-

ga. See modifikatsioon annab erakordselt stabiilse rakuliini, mis annab rakukloonid, millel

on ühtlased kasvukiirused ja erinevate antikehade ühtlased ning kõrged

ekspressioonitasemed. Seetõttu usutakse, et see modifikatsioon parandab pika aja jooksul 30

kompositsioonilist stabiilsust. Katsed tuvastada E1A ekspressiooni modifitseeritud

rakuliinis ebaõnnestusid. Seetõttu on vähetõenäoline, et ühtlased kasvu kiirused ja

ühtlased ning kõrged ekspressiooni tasemed võivad olla kantud eranditult E1A

EE-EP 2 152 872 B1 22

ekspressiooni arvele. Kuna antud juhul E1A ekspressioon ei olnud tuvastatav, siis endiselt

arvatakse, et CMV promootori transaktivatsioon, milles kasutatakse E1A ekspressiooni

võib põhjustada isegi kõrgemaid ja stabiilsemaid ekspressioonitasemeid.

Ekspressiooniks kasutatakse eelistatavalt BHK-21 rakke või CHO rakke. Sobivate CHO

rakkude hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud CHO-K1 ja CHO-S rakud. 5

Käesoleva leiutise praktikas on eelistatud selliseid imetajarakud, nagu CHO Dhfr-miinus

mutandid, nagu CHO-DUKX-B11 või DG44. Need rakud on sellel alal hästi tuntud ja

laialt kättesaadavad, näiteks, Ameerika Tüüpkultuuri Kollektsioonist (A.T.C.C. - American

Type Culture Collection) Rockville, Md. (BHK-21) või Dr. Lawrence Chasin, Columbia

University, New York (CHO DUKX-B11 või DG44). Need rakkud kohanevad hästi 10

kasvama suspensioonikultuurides (ka seerumivabades tingimustes) ja/või võivad kasvada

väikeste seerumikontsentratsioonide juures ja võivad olla kasutatud ühenduses DHFR

selektsioonimarkeriga.

Eelistatavalt see rakuliin alakloneeritakse ja selekteeritakse kloonide suhtes, millel on

polüklonaalsete valkude liikmete kõrge ja stabiilne ekspressioon. 15

Järelikult, keskmise kogemusega spetsialist on võimeline asendama DG44 klooni teiste

kloonidega ja asendada CHO rakud teiste imetajarakkudega, nagu on kirjeldatud, või isegi

kasutada teist tüüpi rakke, kaasaarvatud taime rakud, pärmirakud, putukarakud, seened ja

bakterid. Seega, rakutüübi valik ei ole piiravaks käesolevas leiutises.

Saagised, mis on saadavad, kasutades käesoleva leiutise kohaseid meetodeid, sõltuvad 20

suurest hulgast parameetritest, mille hulka kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, selle

kultuuri kasvatamise tingimused ja kasutatud peremeesrakkude liik. Käesoleva leiutise

teostusviisis ületab see saagis eelistatavalt 50 mg/l valku, näiteks, enam, kui 60 mg/l,

näiteks enam, kui 75 mg/l, näiteks, enam, kui 100 mg/l, näiteks enam, kui 125 mg/l,

näiteks, enam, kui 150 mg/l, näiteks enam, kui 200 mg/l, näiteks, enam, kui 250 mg/l, 25

näiteks enam, kui 300 mg/l, näiteks, enam, kui 400 mg/l, näiteks enam, kui 500 mg/l,

näiteks, enam, kui 600 mg/l, näiteks enam, kui 700 mg/l, näiteks, enam, kui 750 mg/l,

näiteks enam, kui 800 mg/l, näiteks, enam, kui 900 mg/l, näiteks enam, kui 1,000 mg/ l

näiteks, enam, kui 2 g/l, näiteks enam, kui 3 g/l, näiteks, enam, kui 4 g/l, näiteks enam, kui

5 g/l. 30

Silmas on peetud, et käesoleva leiutise kohane rekombinantne polüklonaalne valk hõlmab

valgukompositsiooni, mis sisaldab erinevaid, kuid homoloogseid valgumolekule, mis on

EE-EP 2 152 872 B1 23

looduslikult varieeruvad, mis tähendab seda, et eelistatud teostusviisis, sisaldab

variantnukleiinhapete raamatukogu loomulikult asetleidvat mitmekesisust. Seega iga

valgumolekul on homoloogne teiste kompositsiooni molekulidega, kuid sisaldab ka ühte

või enamat variaabelpolüpeptiidjärjestust, mida iseloomustavad erinevused

aminohappejärjestuses polüklonaalsete valkude individuaalsete liikmete vahel. Erinevused 5

aminohappejärjestus(t)es, mis moodustavad variaabelpolüpeptiidjärjestuse võivad olla nii

väikesed, nagu üks aminohape. Eelistatavalt moodustavad need erinevused

aminohappejärjestuses enam, kui ühe aminohappelise erinevuse.

Tavaliselt arvatakse, et see loomulik polüklonaalse antikeha või TcR variaablus

lokaliseerub nende polüpeptiidahelate niinimetatud variaabelpiirkondades või V-10

piirkondades.

Polüklonaalse valgu individuaalsed liikmed võivad sisaldada variaabelpiirkondi, mis on

ligikaudu 80 kuni 120 aminohappejäägi pikkused. Need variaabelpiirkonnad võivad

sisaldada hüpervariaabeldomeene, näiteks, komplementaarsust määravaid piirkondi

(CDR). 15

Looduslikes TcR-des on neli CDR-i igas variaabelregiooni. Looduslikult leiduvates

antikehades on kolm CDR-i raskes ahelas ja kolm CDR-i kerges ahelas.

Lisaks sellele, need polüklonaalse valgu individuaalsete liikmete variaabelpiirkonnad

võivad sisaldada vähemalt ühte hüpervariaabeldomeeni, mis on 1 kuni 26

aminohappejäägi pikkune, eelistatavalt 4 kuni 16 aminohappejäägi pikkune. See 20

hüpervariaabeldomeen võib vastata CDR3 piirkonnale. Antikehade puhul on iga

variaabelpiirkond eelistatavalt moodustatud kolmest hüpervariaabeldomeenist. Need

võivad vastata CDR1-le, CDR2-le ja CDR3-le. TcR-de iga variaabel piirkond on

eelistatavalt moodustatud neljast hüpervariaabeldomeenist. Need võivad vastata CDR1-le,

CDR2-le, CDR3-le ja CDR4-le. Nimetatud hüpervariaabeldomeenid võivad üksinda 25

moodustada variaabeljärjestusi käesoleva leiutise kohase rekombinantse polüklonaalse

valgu variaabelpiirkonnas.

Käesoleva leiutise kontekstis on polüpeptiidjärjestuse variaablus (polüklonaalsus) samuti

mõistetav, et kirjeldada erinevusi individuaalsete antikehamolekulide vahel, mis paiknevad

niinimetatud konstantsetes piirkondades või antikeha polüpeptiidahelate C- piirkondades, 30

näiteks, antikehade segude puhul, mis sisaldavad kaks või enam erinevat antikeha

isotüüpi, näiteks sellist, nagu inimese isotüübid IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2,

EE-EP 2 152 872 B1 24

IgM, IgD ja IgE, või hiire isotüübid IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM ja IgA. Seega

rekombinantne polüklonaalne antikeha võib sisaldada antikehamolekule, mida

iseloomustavad järjestuste erinevused individuaalsete antikeha molekulide vahel

variaabelpiirkonnas (V-piirkond) või konstantses piirkonnas (C-piirkond) või mõlemas.

Eelistatavalt on need antikehad sama isotüüpi, kuna see kergendab järgnevat puhastamist 5

oluliselt. On samuti mõeldav kombineerida antikehasid, näiteks, isotüüpi IgG1, IgG2, ja

IgG4, kuna nad võivad olla kõik puhastatud üheskoos, kasutades affiinsuskromatograafiat

valguga A. Eelistatud teostusviisis on kõikidel antikehadel, mis moodustavad

polüklonaalse antikeha, sama konstantne piirkond, et nende puhastamist veelgi

hõlbustada. Enam eelistatavalt, on neil antikehadel raske ahela konstantsed piirkonnad 10

samad. Kerge ahela konstantne piirkond võib samuti olla kõikidel distinktsetel antikehadel

sama.

Selleks, saada variantnukleiinhappe järjestusi, mis kodeerivad valke, mis seostvad

konkreetset antigeeni, võib olla kasutatud suur hulk sellel alal tuntud meetodeid. Reeglina

on käesolevas leiutises kasulik kasutada sõelumist, mis võimaldab nende nukleiinhapete 15

identifitseerimist ja/või eraldamist, mis kodeerivad valku, mis seostab konkreetset

antigeeni. Mõned nendest meetoditest sisaldavad rikastamise etappi või niinimetatud

biopanning etappi, mis on tuntud sellistest tehnoloogiatest, nagu Symplex™ (Mejier et al,

2006, J. Mol. Biol, 358:764-772; WO 2005/042774), faagil eksponeerimise (Kang, A. S. et

al. 1991. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 4363-4366), ribosoomil eksponeerimise 20

(Schaffitzel, C. et al. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119-135), DNA-l eksponeerimise

(Cull, M. G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 1865-1869), RNA-peptiidil

eksponeerimise (Roberts, R. W., Szostak, J.W., 1997. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 12297-

12302), kovalentselt eksponeerimise (WO 98/37186), bakteri pinnal eksponeerimise

(Fuchs, P. et al. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372), pärmiraku pinnal eksponeerimise 25

(Boder, E. T., Wittrup, K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557) ja eukarüootsete viirusel

eksponeerimise (Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4,

185-192), meetodid, mis kõik on tuntud sellel alal, ja kõik nad on huvipakkuvateks

abivahenditeks käesoleva leiutise. praktikas FACS ja magnetgraanulitel sorteerimine on

samuti rakendatavad rikastamise (panning) eesmärkidel, milles kasutatakse märgistatud 30

antigeeni. Sellised immunodetektsioonitestid, nagu ELISA (Dreher, M. L. et al. 1991. J.

Immunol. Methods 139, 197-205) ja ELISPOT (Czerkinsky, C. C. et.al,1983. J Immunol

meetods. 65, 109-21) võivad samuti olla kasutatud kas pärast biopanning (“biouhtmise”)

etappi või omaette.

EE-EP 2 152 872 B1 25

Huvipakkuv rekombinantse polüklonaalse valgu kompositsioon sisaldab defineeritud

alakogumit valke, mida iseloomustavad selliseid üldised tunnusjooned, nagu ühine

seostumisaktiivsus soovitavate märklaudadega, näiteks, polüklonaalsete antikehade puhul

soovitava märklaudantigeeni vastu. Reeglina on polüklonaalses valgu kompositsioonis

vähemalt 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 või 106 erinevat variantliiget. 5

Distinktseste liikmete arv, mida on vaja polüklonaalse valgu kompositsiooniks, sõltub

märklaua komplitseeritusest. Juhul, kui tegemist on antikehadega, siis

märklaudantigeeni(de) komplitseeritus mõjub distinktseste variantliikmete arvule, mis on

vajalik polüklonaalse antikeha kompositsioonis. Väikeste või mitte eriti komplekssete

märklaudade puhul, näiteks väikese valgu puhul, mis sisaldab polüklonaalse antikeha 10

kompositsiooni 2-st või 3-st kuni 100 erineva variantliikmeni, võib olla piisav, ja on

eelistatud, et nende variantide arv ei ületa 90, või isegi 80 või 70. Paljudel juhtudel

distinktsete variantide arv ei ületa 60 või 50, ja on eelistatud, et see variantide arv kõigub

vahemikus 5 kuni 40, näiteks, vahemikus 5 kuni 30. Teisest küljest, komplekssemate

märklaudade puhul võib olla piisav, kui polüklonaalse antikeha kompositsioon sisaldab 20 15

kuni 500 distinkset variantliiget. Väga komplekssete märklaudade puhul, kus antigeen

sisaldab palju erinevaid molekule, võib vaja minna, et polüklonaalse antikeha

kompositsioon sisaldaks 50 kuni 10000 erinevat variantliiget.

Imetajatel on mitmeid tuntud näiteid looduslikult leiduvatest polüklonaalsetest valkudest,

mis kas ringlevad vabalt veres, selliseid nagu antikehad või immunoglobuliini molekulid, 20

või on nad esindatud rakkude pindadel, sellised, nagu T-raku retseptorid ja B-raku

retseptorid. Nende looduslikult leiduvate polüklonaalsete valkude mitmekesisus

mõningates imetajates saavutatakse nende valkude variaabelpiirkondi kodeerivate geenide

geneetilise rekombinatsiooniga. Lisaks, on teada, et antikehade mitmekesisust

suurendavad somaatilised mutatsioonid. Käesolevas leiutises on ära kasutatud antikehade 25

loomulikku mitmekesisust, eraldades nukleiinhappejärjestusi, mis vastutavad nende

(näiteks, variaabeldomeenide või immunoglobuliini molekulide CDR piirkondade või

TcR-de) mitmekesisuse eest, ja genereeridess neist raamatukogu. Valkude puhul, mis on

kodeerid kahe sõltumatu geeni segmendis, näiteks antikeha raske ahela variaabelpiirkond

ja kerge ahela variaabelpiirkond, TcRa-ahel ja β-ahel või TcRδ-ahel ja γ- ahel, iga 30

raamatukogus sisalduv vektor moodustab paari nendest variaabelpiirkondadest, mis

kodeerivad järjestusi. Järjestusi kodeerivate variaabelpiirkondade paaride raamatukogude

genereerimine on sellel alal tuntud.

EE-EP 2 152 872 B1 26

Raamatukogudeks, mis sisaldavad looduslikult aset leidvaid mitmekesisusi on näiteks,

kombinatoriaalsed raamatukogud (järjestusi kodeerivate variaabelpiirkondade juhuslik

paardumine), aga ka suguluses olevate paaride raamatukogud (samast rakust, näiteks, WO

2005/042774 tuletatud variaabel piirkondi kodeerivate järjestuste paarid). Järgmised

raamatukogud, mis on genereeritud eraldatud CDR geeni fragmentidest, mis on sisse 5

lülitatud vastavasse karkassi (nt Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856),

näiteks sellisesse, nagu antikeha või TcR variaabelpiirkond, on rakendatavad käesolevas

leiutises. Need raamatukogud on eelistatavalt välja sõelutud, et saada soovitava

spetsiifilisusega alaraamatukogud (huvipakkuvad raamatukogud).

Valkude mitmekesisut võib tekitada ka kunstlikul teel, näiteks sünteetilisel teel või 10

mutatsioonide abil. Mutatsioonid võivad olla kas juhuslikud või punktmutatsioonid

nukleiinhappejärjestuses, mis kodeerib üksikut valku, mille puhul genereeritakse üksiku

valgu polüklonaalne populatsioon. Kunstlike antikehade raamatukogude genereerimise

teist näidet on kirjeldatud publikatsioonis EP 0 859 841, kus on toodud meetod, mis

põhineb variaabelpiirkondade karkasside raamatukogu genereerimisel, mis võib olla 15

kombineeritud teise CDR-de raamatukoguga.

Käesoleva leiutise eelistatud teostusviisis on selleks rekombinantseks polüklonaalseks

valguks rekombinantne polüklonaalne antikeha või antikeha fragment.

Teises käesoleva leiutise eelistatud teostusviisis on rekombinantseks polüklonaalseks

valguks rekombinantne polüklonaalne TcR- või TcR-fragment. 20

Käesoleva leiutise kohane rekombinantne polüklonaalne valk võib seetõttu olla

moodustatud erinevatest isotüüpidest, või enam eelistatult, erinevatest alaklassidest.

Immunoglobuliinide polüklonaalsus võib aset leida immunoglobuliinimolekuli

konstantses osas või selle variaabeldomeenis, või nii konstantses osas kui ka

variaabeldomeenis. 25

Polüklonaalsus niinimetatud konstantses piirkonnas ja konkreetselt, antikehade raskes

ahelas, on huvipakkuv antikehade terapeutilise rakendamise seisukohalt. Erinevatel

immunoglobuliini isotüüpidel on erinevad bioloogilised funktsioonid (mis on

summeeritud tabelis 1), mis võiksid olla soovitavalt kombineeritud antikehade kasutamisel

ravi eesmärgil, kuna loomulikes immuunsetes vastustes võivad osaleda erinevad 30

immunoglobuliini isotüübid (Canfield ja Morrison 1991. J.Exp.Med. 173, 1483-91;

Kumpel et al. 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45.-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol.

EE-EP 2 152 872 B1 27

Infect,124, 153-162).

Tabel 1: Inimese immunoglobuliini isotüüpide biolooglised funktsioonid

Inime immunoglobuliin

Ig

G1

Ig

G2

IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgM IgD IgE

Klassikaline komplemendi

aktivatsioon

++

+

++ ++++ + - - ++++ - -

Vahelduv komplemendi

aktivatsioon

+ + + +++ + - - + -

Platsentaalne ülekanne + ++ + ++ - - - - -

Bakteriaalne lüüs + + + + +++ +++ + ? ?

Makrofaagi/teiste fagotsüütide

seostamine

+ - + + + + - - -

Nuumraku/basofiilide seostamine - - - - - - - - -

Stafülokoki valgu A reaktiivsus + + - + - - - - -

Järgmiseks käesoleva leiutise aspektiks on rekombinantset polüklonaalset valku

produtseeriv rakuliin, mis sisaldab polüklonaalset rakuliini, mis sisaldab 2-n populatsiooni 5

rakku igast populatsioonist, mis ekspresseerivad rekombinantse polüklonaalse valgu

erinevaid liikmeid, rakud, mis sisaldavad ekspressioonikonstrukte, mis on juhuslikult

integreeritud selle genoomi. Eelistatavalt on need ekspressioonikonstruktid genoomi

integreeritud stabiilselt. Ühes teostusviisis on need konstruktid integreeritud ühte või

enamasse kromosoomi. 10

Raku populatsioonide arv polüklonaalses rakuliinis, n, või olla 3 või enam, näiteks 4 või

enam, näiteks 5 või enam, näiteks, 6 või enam, näiteks 7 või enam, näiteks, 8 või enam,

näiteks 9 või enam, näiteks, 10 või enam, näiteks 11 või enam, näiteks, 12 või enam,


näiteks 17 või enam, näiteks, 18 või enam, näiteks 19 või enam, näiteks, 20 või enam, 15

EE-EP 2 152 872 B1 28





näiteks 80 või enam, näiteks, 90 või enam, näiteks 100 või enam. 5

Suuremal osal eesmärkidest võib n olla vähem, kui 50, näiteks, vähem kui45, näiteks

vähem kui 40, näiteks, vähem kui 35, näiteks vähem kui 30.

Üheks käesoleva leiutise tähtsaks teostusviisiks on raku kloneerimise etapp, mis on

teostatud enne lõplikku polüklonaalse rakuliini lõplikku segamist. Selle etapi tulemusena

paraneb saadud polüklonaalsete rakkude pankade saagis ja stabiilsus, mis leiab aset 10

klonaalse nihke minimiseerimise tagajärjel. Rakud, mis ekspresseerivad ühte

rekombinantse polüklonaalse valgu distinktset liiget, võivad olla tuletatud 1 või enamast

kloneeritud rakust, näiteks, 2-st või enamast, näiteks 3-st või enamast, näiteks, 4-st või

enamast, näiteks 5-st või enamast, näiteks, 6-st või enamast, näiteks 7-st või enamast,

näiteks, 8-st või enamast, näiteks 9-st või enamast, näiteks, 10-st või enamast, näiteks, 11 15

või enamast, näiteks, 12-st või enamast, näiteks 13-st või enamast, näiteks, 14 või


näiteks, 18 või enamast, näiteks 19-st või enamast, näiteks, 20-st või enamast, näiteks 21-

st või enamast, näiteks, 22-st või enamast, näiteks 23-st või enamast, näiteks, 24-st või

enamast, näiteks 25-st või enamast, näiteks, 26-st või enamast, näiteks 27-st või enamast, 20

näiteks, 28-st või enamast, näiteks 29-st või enamast, näiteks, 30-st või enamast, näiteks

35-st või enamast, näiteks, 40-st või enamast, näiteks 45-st või enamast, näiteks, 50-st või


näiteks, 90-st või enamast, näiteks 100-st või enamast kloneeritud rakust. Suurema osa

eesmärkide puhul klooneritud rakkude arv on väiksem kui 50, näiteks väiksem kui 20, 25

näiteks, väiksem kui 15, näiteks väiksem kui 10.

Eelmises teostusviisi lisateostusviisis need variantnukleiinhappejärjestused, mis

kodeerivad polüklonaalset valku (eelistatavalt immunoglobuliinide sugukonnast), on kõik

tuletatud looduslikult leiduvatest järjestustest, näiteks on eraldatud doonorist.

Klonaalne mitmekesisus 30

Polüklonaalse valgu üheks karakteristikuks on see, et see on moodustatud hulgast

individuaalsetest valgumolekulidest, kus iga valgumolekul on homoloogne teiste

EE-EP 2 152 872 B1 29

polüklonaalae valgu molekulidega kuid on samuti variaabel, see tähendab, et seda

iseloomustavad polüklonaalse valgu individuaalsete liikmete erinevused

aminohappejärjestustes. Eelistatavalt, need polüklonaalse valgu üldstruktuuri erinevused

on piiratud erinevate piirkondadega. Sellisteks piirkondadeks on, näiteks, antikeha või

TcR-i variaabelpiirkond ja, võimalik, et need erinevused on piiratud CDR piirkondadega 5

nendel aladel. See variaablus võib samuti olla kirjeldatud kui mitmekesisus, mis võib olla

identifitseeritud nii nukleiinhappe tasemel kui ka valgu funktsionaalsel tasemel, näiteks,

spetsiifilisuse ja afiinsuse erinevustes märklaua suhtes.

Rakuliini klonaalne mitmekesisus võib olla analüüsitud RFLP-ga kloonidel, mis on

eraldatud rekombinantset polüklonaalset valku ekspresseerivate rakkude ühisvarust. 10

Teiseks võimaluseks analüüsida klonaalset mitmekesisust, on (RT)-PCR-produktide

sekveneerimine. See mitmekesisus võib samuti olla analüüsitud selle rakuliini poolt

produtseeritud rekombinantse polüklonaalse valgu funktsionaalsete testidega (nt, ELISA).

WO 2006/007853 avalikustab meetodid, mis on ette nähtud polüklonaalse rakuliini ja

polüklonaalse valgu iseloomustamiseks. Need meetodid võivad olla kasutatud rakuliini 15

klonaalse mitmekesisuse ja tulemusena saadud polüklonaalse valgu analüüsimiseks.

Klonaalne nihe (s.o, järk-järguline muutus polüklonaalseid antikehi moodustavates

individuaalsetes antikehades), kui see on olemas, siis või olla hinnatud võrreldes

transfektsiooniks kasutatud algse raamatukogu klonaalset mitmekesisust,

mitmekesisusega, mis leiti rekombinantset polüklonaalset valku ekspresseerivate rakkude 20

ühisvarus (rakuliinis).

Rakuliinist ekspresseeritud polüklonaalse valgu klonaalne mitmekesisus võib olla

hinnatud kui polüklonaalvalgu märklaudulatus. Juhul, kui ligikaudu 25-100%

soovitavatest märklaudmolekulidest on seotud polüklonaalse valguga, siis loetakse, et see

on omandatud piisava mitmekesisuse. Näiteks, polüklonaalse antikeha puhul, antikeha 25

seostumine vähemalt 25% mitteidentsete epitoopidega märklaudantigeeni pinnal räägib

kompositsiooni piisavast mitmekesisusest. Eelistatavalt on klonaalne mitmekesisus

märklaudulatuses vähemalt 50%, ja isegi enam, eelistatavalt vähemalt 75%. Antikehade

puhul, sellist märklaudulatust võib hinnata, näiteks,epitoopide kaardistamisega.

Alternatiivselt, klonaalset mitmekesisust võib hinnata, kui polüklonaalse kompositsiooni 30

individuaalsete liikmete jaotuvust. See jaotuvus võib olla hinnatud kui erinevate

individuaalset liikmete üldarv lõplikus polüklonaalse valgu kompositsioonis, võrreldes

EE-EP 2 152 872 B1 30

erinevate kodeerivate järjestuste arvuga, mis olid sisestatud rakuliini transfektsiooni

kestel. Sel juhul piisavaks omandatud mitmekesisuseks on, kui vähemalt 50%

kodeerivatest järjestustest, mida kasutati algselt transfektsiooniks, võib olla

identifitseeritud polüklonaalsete valkude erinevate individuaalsete liikmetena, eelistatavalt

vähemalt 75%, enam eelistatavalt vähemalt 80%, enam eelistatavalt vähemalt 90%, 5

näiteks, vähemalt 95%, 97%, 98% või 99%. Väljendatuna teisel viisil võib klonaalne

mitmekesisus olla vaadeldud piisavana, kui produtseerimise kestel on kaotatud ainult üks

polüklonaalse valgu liige, või kui kaotatud on 2, 3, 4 või 5 liiget.

Polüklonaalse kompositsiooni individuaalsete liikmete jaotuvust võib hinnata ka üksikute

individuaalsete liikmete vahelise vastastikuse jaotuvuse suhtes. Sel juhul loetakse 10

omandatuks piisavat klonaalset mitmekesisust, kui mitte ükski kompositsiooni üksik liige

ei moodusta enam, kui 75 % polüklonaal valgu kompositsiooni lõplikust üldkogusest.

Eelistatavalt, ükski individuaalne liige ei ületa enam, kui 50%, veelgi enam eelistatult 25

% ja enim eelistatult 10% kogu individuaalsete liikmete arvust lõplikus polüklonaalses

kompositsioonis. Klonaalse mitmekesisuse hindamine, mis põhineb polüklonaalse 15

kompositsiooni individuaalsete liikmete jaotusel võib olla teostatud RFLP analüüsiga,

järjestuste analüüsiga ja valkude analüüsiga, näiteks, kasutades selliseid lähenemisviise,

mida on käesolevas dokumendis hiljem kirjeldatud seoses polüklonaalse kompositsiooni

iseloomustamisega.

Klonaalne mitmekesisus võib väheneda tekkida võiva klonaalse nihke tulemusena a) 20

erinevate ekspressioonitasemete tõttu, b) rakuproliferatsioonis aset leidvate muutuste tõttu.

Kui sellised nihked tekivad, siis iga selline klonaalse mitmekesisuse kadu on kegesti

parandatav väikeste modifikatsioonidega, mis on sisse viidavad siin kirjeldatud

meetoditesse.

On võimalik, et variatsioonid individuaalsete rakkude proliferatsiooni kiirustes 25

konkreetses rakuliinis võivad pika aja jooksul viia sisse nihke rekombinantse

polüklonaalse valgu ekspressiooni, suurendades või vähendades rakuliini poolt

ekspresseeritud mõningate rekombinantsete polüklonaalse valgu liikmete esindatust. Kuna

käesoleva leiutise kohased meetodid võivad põhineda juhuslikul integratsioonil

peremeesraku genoomi, siis nii asend kui ka koopiate arv varieeruvad polüklonaalse 30

rakuliini liikmelt liikmele. Tõenäolislt see põhjustada erinevusi kloonide proliferatsiooni

kiirustes ja ekspressiooni tasemetes. Valides rakukloone, millel on ühesugused

proliferatsioonikiirused, võib seda probleemi minimiseerida. Järgmiseks võimaluseks on

EE-EP 2 152 872 B1 31

kasutada enam, kui ühte klooni iga polüklonaalse valgu liikme kohta. Näited

demonstreerivad, et kompositsiooniline stabiilsus kasvab, kui kasutada nii 3 kuni 5 klooni,

mis ekspresseerivad polüklonaalse valgu üht liiget võrreldes ainult ühe klooni

kasutamisega ühe polüklonaalse valgu liikme kohta.

Teine moodus selle probleemi lahendamiseks, on ühe või enama selektsioonikriteeriumi 5

kasutamine, tagamaks, et rakud oleksid ühtlased teatud etteantud piirides ühe või enama

kriteeriumi suhtes, mis on valitud rühmast, milllesse kuuluvad kasvu kiirus,

kahekordistumise aeg, ekspressiooni tase, produktsioonitase, produtseerimise stabiilsus

ajas, elujõulisus, töökindlus, vastupidavus, morfoloogia ja koopiate arv.

Üheks põhjuseks, mispärast muutuvad rakkude proliferatsiooni kiirused, võib olla see, et 10

selle populatsiooni rakkud, mis moodustavad algseks transfektsiooniks kasutatud rakuliini,

on heterogeensed. On teada, et individuaalsed rakud arenevad rakuliinis pikema

ajavahemiku jooksul erinevalt. Et tagada homogeensem algmaterjal, võib olla läbi viidud

rakuliini alakloneerimine või korduv alakloneeirmine enne seda transfektsiooni

huvipakkuva ekspressioonivektoriga, kasutades selle rakuliini piiratud lahjendamist kuni 15

üksiku raku tasemeni ja iga üksiku raku kasvatamist kuni uue rakkude populatsiooni

saamiseni (niinimetatud rakkude alakloneerimine piiratud lahjendamisega).

Alternatiiviks ja eelistatud meetodiks üksiku raku kloneerimisel hästi defineeritud

rakupopulatsiooni tagamiseks, on fluorestsetselt aktiveeritud rakkude sorteerimine (FACS)

pärast nende transfektsiooni. See võib olla teostatud eelnevalt selektsiooniprotsessile. 20

Fluorestsentselt märgistatud antikehad võivad olla kasutatud rikastamiseks suure

produktiivsusega rakkudega, mis on tuletatud rakkude ühisvarust, mis on transfekteeritud

IgG-konstruktidega (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol meetods 277, 141-155). FACS-

sorteerimise eeliseks on see, et selles meetodis on kombineeritud üksiku raku

kloneerimine (üksikute rakkude sorteerimisel süvikutesse) samaaegse informatsiooni 25

saamisega iga üksiku raku ekspressioonitasemest. Et veelgi parandada seda

sorteerimismetoodikat, võib olla söötmesse sisse viidud värv, mis näitab raku elujõulisust

nii, et surnud ja surevad rakud saavad olema eemaldatud. FACS-metoodika puhul

sorteeritavad rakud puutuvad kokku küllaltki karmide tingimustega, kaasaarvatud

tangentsiaalpinge. See tähendab, et rakud selekteeritakse kaudselt ka vastupidavuse suhtes 30

sellistes tingimustes. Lisaks sellele, see FACS-metoodika on automatiseeritud, mis

võimaldab sorteerida suurt arvu üksikuid rakke.

EE-EP 2 152 872 B1 32

See FACS meetod võib olla samuti kasutatud, rakkude sorteerimiseks, mis ekspresseerivad

samasuguseid tasemeid immunoglobuliini, moodustades produktiivsuse suhtes

homogeense rakupopulatsiooni. FACS-meetoditega võivad olla välja selekteeritud rakud,

millel on ühesugused proliferatsioonikiirused, ka kasutades märgistamist fluorestsentse

värviga, 5,6-karboksüülfluorestseiindiatsetaadi suktsiinimidüülestriga (CFSE - 5,6-5

carboxylfluorescein diacetate succinimidyl ester).

Käesoleva leiutise tähtsaks teostusviisiks on ühe või enama kloneeritud rakuliini

genereerimine polüklonaalse antikeha iga liikme kohta. Üksikute rakukloonide

genereerimine võib olla läbi viidud, kasutades ükskõik millist ühte suurest hulgast

meetoditest. Kuigi, tuli välja, et FACS-rakkude sorteerimine, kus rakud valitakse 10

elujõulisuse ja IgG tasemete järgi, ning sorteeritakse individuaalsetesse süvikutesse,

osutus samavõrd stabiilseks kloonide saamisel, mis sobivad polüklonaalsete baasrakkude

panga (Master Cell Bank) ja seejärel polüklonaalse töörakkude panga (Working Cell Bank)

valmistamiseks. Selektsiooni surve, näiteks Mtx poolt, võib olla kõrvaldatud enne FACS-

sorteerimist või selle kestel, kuid pidev selektsioonisurve, näiteks, kultiveerimisel 15

nukleosiidivabas söötmes, eelistatavalt säilitatakse. Individuaalsed kloonid on eelistatavalt

valitud pärast teatud päevade arvu kestnud kultiveerimist selektsioonisurve all, mis leidis

aset pärast rakkude sorteerimist. Kuna kloonid on valitud samal päeval pärast sorteerimist,

siis nende kloonide kasvu kiirus on suhteliselt ühtlane. Lisaks sellele, neid kolooniaid

kontrolliti visuaalselt, et eemaldada kloonid, milles on suured morfoloogilised muutused 20

ja madalad kasvu kiirused võrreldes algse transfekteerimata rakuliiniga. Ja lõpuks,

antikeha ekspressioonitase võib olla hinnatud, kasutades, näiteks, ELISA-testi või teist

analüütilist meetodit, ja nende abil võivad olla välja valitud kloonid, millel on kõrge ja

suhteliselt ühtlane ekspressiooni tase.

Isegi kui proliferatsioonikiiruse poolt indutseeritud nihe ei arene, siis individuaalsete 25

liikmete kadu või üleekspressioon võib olla mittekriitiline, sõltuvalt nõuetest lõpliku

rekombinantse polüklonaalse valguprodukti mitmekesisuse ja selle mitmekesisuse

stabiilsuse suhtes pika aja jooksul.

Peremeesrakk

Peremeesrakud võivad olla genereeritud ükskõik millistest rakkudest, mis võivad 30

integreerida DNA nende kromosoomidesse või säilida selle sellistes kromosoomivälistes

elementides, nagu minikromosoomid, YAC-d (pärmi kunstlikud kromosoomid), MAC-d

EE-EP 2 152 872 B1 33

(hiire kunstlikud kromosoomid) või HAC-d (inime kunstlikud kromosoomid). MAC-e ja

HAC-e on detailselt kirjeldatud publikatsioonis WO 97/40183. Eelistatavalt on

imetajarakkudena kasutatud selliseid rakke, nagu CHO rakke, COS rakke, BHK rakke,

müeloomi rakke (nt, Sp2/0, YB2/0 või NS0 rakke), selliseid fibroblastid, nagu NIH 3T3 ja

selliseid immortaliseeritud inimese rakke, nagu HeLa rakud, HEK 293 rakud, või PER.C6. 5

Kuid kasutatud võivad olla ka sellised mitteimetaja eukarüootsed või prokarüootsed rakud,

nagu taimerakud, putukarakud, pärmirakud, seened, E. coli jne.

Ühes käesoleva leiutise teostusviisis algmaterjalina kasutatav rakuliin alakloneeriti,

teostades rakuliini niinimetatud piiratud lahjendust kuni üksiku raku tasemeni, millele

järgneb iga üksiku raku kultiveerimine uueks rakupopulatsiooniks enne transfektsiooni 10

huvipakkuvate vektorite raamatukoguga. Soovi korral selline alakloneerimine võib olla

teostatud ka hiljem, õige rakuliini selekteerimise protsessis. Teiste, üksiku raku

kloneerimise meetodite hulka kuuluvad: FACS kloneerimine (Brezinsky et al. J. 2003.

Immunol Methods 277, 141-155), LEAP™ tehnoloogia (Cyntellect, San Diego, California,

USA), ja ClonePix (Genetix, UK). 15

Integreerimiseks vajalik vektor

Alljärgnev kirjeldus keskendub imetaja ekspressioonisüsteemide kasutamisele. Kuigi,

käesoleva leiutise kohaseid meetodeid on võimalik kasutada ka ekspressiooniks bakterites,

kasutades sobivaid modifikatsioone.

Sobiv vektor sisaldab sobivat selektsioonigeeni. Selektsioonigeenide hulka, mis sobivad 20

kasutamiseks imetajaraku ekspressioonil, kuuluvad, kuid ei ole nendega piiratud, sellised

geenid, mis võimaldavad läbi viia toitumisega seotud selektsiooni, nagu tümidiinkinaasi

geen (TK), glutamiinsüntetaasi geen (GS), trüptofaansüntetaasi geen (trpB) või

histidinooldehüdrogenaasi geen (hisD). Järgmisteks selektsiooni markeriteks on sellised

antimetaboliitide resistentsusegeenid, mis teevad rakud ravimiresistentseks, nagu 25

dihüdrofolaatreduktaasi geen (dhfr), mis võib olla välja selekteeritud, kasutades

hüpoksantiini ja tümidiinidefitsiitset söödet ja edasi selekteeritud, kasutades metotreksaati;

ksantiin-guaniinfosforibosüültransferaasi geeni (gpt), mis võib olla selekteeritud,

kasutades mükofenoolhapet, neomütsiini fosfotransferaasi geeni (neo), mis võib olla

selekteeritud kasutades G418, eukarüootsetes rakus, ja neomütsiini või kanamütsiini 30

prokarüootsetes rakkudes; hügromütsiini B fosfotransferaasi (hyg, hph, hpt) geen, mis

võib olla selekteeritud kasutadesc hügromütsiini; puromütsiin N-atsetüültransferaasi geen

EE-EP 2 152 872 B1 34

(pac), mis võib olla selekteeritud, kasutades puromütsiini; või blastitsidiin S deaminaasi

geeni (Bsd), mis võib olla selekteeritud, kasutades blastitsidiini; seotsiiniresistentsuse geen

(Sh ble), mis vahendab resistentsust zeotsiini ja bleomütsiini vastu. Ja lõpuks, geenid, mis

kodeerivad valke, mis võimaldavad sorteerimist, näiteks, läbivoolutsütomeetriaga, võivad

samuti olla kasutatud kui selektsioonimarkerid, mille hulka kuuluvad selliseid nagu 5

roheline fluorestseeruv valk (GFP - green fluorescent protein), närvikasvufaktori retseptor

(NGFR - nerve growth factor receptor) või teised membraanivalgud, või

beetagalactosidaas (LacZ).

See selektsioonimarker võib paikneda eraldi ekspressioonivektoril, seega

kaastransfektsioon teostatakse ekspressioonivektoriga, mis kodeerib selektsioonimarkerit 10

ja ühte või enamat ekspressioonivektor(it), mis kodeerib huvipakkuvat valku või

huvipakkuva valgu subühikut. See selektsioonimarker võib samuti paikneda

ekspressioonivektoril, mis kodeerib huvipakkuvat valku. Viimasel juhul see

selektsioonimarker paikneb eelistatavalt transkriptil, mis kodeerib ka huvipakkuvat valku

või selle ühte subühikut. See võib olla tehtud, näiteks, kasutades IRES-konstrukti. 15

Multimeerse valgu, nagu näiteks antikeha puhul, see selektsioonimarker paikneb

eelistatavalt transkriptil, mis kodeerib suurimat subühikut, näiteks sellist nagu antikeha

raske ahel.

Vektor, mis on ette nähtud huvipakkuva geeni integreerimiseks, sisaldab lisaks DNA-d,

mis kodeerib huvipakkuva rekombinantse polüklonaalse valgu ühte liige, millele eelneb 20

oma, imetaja promootor, mis suunab selle valgu ekspressiooni. Kui huvipakkuva

rekombinantse polüklonaalse valgu liige sisaldab enam, kui ühte valguahelat, näiteks, kui

see liige on antikeha, või T-raku retseptor, siis see DNA, mis kodeerib selle valgu ahelaid,

võib sisaldada eelnevalt oma, imetaja promootorit, mis suunab iga selle ahela

kõrgetasemelist ekspressiooni (kahesuunalist või ühesuunalist). Kahesuunalise 25

ekspressiooni puhul võib ekspressioonivektoris olla kasutatud head-to-head promootori

konfiguratsiooni, ja ühesuunalisel ekspressioonil võib ekspressioonil olla kasutatud kaks

promootorit või üks promootor, mis on kombineeritud, näiteks, IRES järjestusega. Samuti

on mõeldav kahetsistroniline ekspressioonivektor, milles on kodeeritud kaks erinevat

subühikut samas transkriptis, mis on eraldatud IRES-järjestusega. 30

Sobivateks head-to-head promootori konfiguratsioonideks on näiteks AdMLP promootor

hiire metallotioneiin-1 promootoriga kummaski orientatsioonis, kus see AdMLP

promootor koos elongatsioonifaktori-1 promootoriga kummaski orientatsioonis või CMV

EE-EP 2 152 872 B1 35

promootor koos MPSV promootoriga kummaski orientatsioonis, või nimetatud CMV

promootor, kasutatna kummaski orientations, kuid ei ole nendega piiratud.

Juhul, kui tegemist on antikehadega, siis kogemused on näidanud, et raske ahela kogused,

mida ekspresseerib rakk, ei või ületada kerge ahela koguseid. Seetõttu, promootor, mis

juhib kerge ahela ekspressiooni, on eelistatavalt vähemalt sama tugev, kui promootor, mis 5

suunab raske ahela ekspressiooni.

Nukleiinhappejärjestus, mis kodeerib funktsionaalset liiderjärjestust või

translokatsioonisignaali või olla sisse lülitatud ekspressioonivektorisse, et suunata seda

geeniprodukti endoplasmaatilisse retiikulumi või sellisesse konkreetsesse paika rakus,

nagu organell. Tugev polüadenülatsioonisignaal võib asetseda valku kodeeriva DNA 10

järjestuse 3'-otsas. See polüadenülatsioonisignaal tagab tekkiva RNA transkripti

terminatsiooni ja polüadenülatsiooni ja on korrelatsioonis selle signaali stabiilsusega.

DNA, mis kodeerib huvipakkuva rekombinantse polüklonaalse valgu liiget, võib, näiteks,

kodeerida nii antikeha rasket kui ka kerget ahelat või antikeha fragmente, kus iga geeni

järjestusele eelnevad valikuliselt nende oma imetaja promootori elemendid ja/või neile 15

järgnevad tugevad polü-A signaalid, mis suunavad kummagi kahe ahela kõrgetasemelist

ekspressiooni.

Integreerimiseks ette nähtud ekspressioonivektor võib kanda selliseid lisa

transkriptsionaalseid regulaatorelemente, nagu võimendusjärjestused, anti-repressoreid või

UCOE-d (ubiquitous chromatin opening elements - kõikjalolevad kromatiini avavad 20

elemendid), ekspressiooni ja ekspressiooni stabiilsuse suurendamiseks

integratsioonisaidis. Võimendusjärjestused on nukleiinhappejärjestused, mis

interageerivad spetsiifiliselt tuumavalkudega, mis on kaasatud transkriptsiooni. UCOE-d

avavad kromatiini või säilitavad kromatiini avatud olekus ja hõlbustavad toimivalt

sidestatud geeni reprodutseeritavat ekspressiooni (seda on detailsemalt kirjeldatud 25

publikatsioonides WO 00/05393 ja Benton et al, Cytotechnology 38:43-46, 2002). Lisa

võimendusjärjestuste või võimenduselementide hulka kuuluvad maatriksiga kinnitumise

piirkonnad (MARs - Matrix Attachment Regions), nagu on kirjeldanud, näiteks, Girod &

Mermod 2003 ("Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein

production", pp 359-379 In Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC 30

Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV). Antirepressor elementide hulka kuuluvad,

kuid ei ole nendega piiratud, STAR elemendid (Kwaks et al Nat Biotechnol. 2003 May;

21(5):553-8). Kui üks või enam eelpool kirjeldatud regulaatorelementi on integreeritud

EE-EP 2 152 872 B1 36

peremeesraku kromosoomi, siis neid nimetatakse heteroloogsseteks

regulaatorelementideks.

Polüklonaalsed tööraku pangad ja baasrakkude pangad

Käesoleva leiutise eelistatud teostusviisis kasutatakse polüklonaalste baasrakkude

pankasid (pMCB - polyclonal Master Cell Banks) ja polüklonaalseid töörakkude pankasid 5

Working Cell Banks (pWCB – polyclonal Working Cell Bank).

pMCB-d, mis võivad olla kasutatud polüklonaalse produtseeriva rakuliini loomiseks

üheainsa ampulli sisu ülessulatamise ja paljundamisega, võivad olla genereeritud

külmutatud varust, mis koosneb individuaalsetest rakuliinidest. Individuaalsed rakuliinid,

mida on kasutatud selliste pMCB genereerimiseks, on saadud kas i) üksikust kloonist 10

(nagu on kirjeldatud näites 2), ii) üksikute kloonide segust (nagu on kirjeldatud näites 2),

või iii) kloonide ühisvarust (üksikute selektsioonil saadud kolooniate ühisvarust). Need

kloonid saadi peremeesrakkudest, mis olid individuaalselt transfekteeritud, ja selekteeritud

polüklonaalse valgu individuaalse liikme stabiilse ekspressiooni suhtes. Selektsiooni

stabiilse ekspressiooni suhtes teostati sellel alal tuntud meetoditega, näiteks, kasutades 15

selektsiooni markergeene. Käesoleva leiutise eelistatud teostusviisis on individuaalsed

rakuliinid saadud rakkude kloonidest või alakloonidest, näiteks, kasutades punktides i) ii)

või iii) pärit rakuliini lahjendamist või üksiku raku FACS analüüsi ja selektsiooni, või

selekteerides kõrge ekspressiooniga kloone, näiteks kasutades sellist robotit, nagu

ClonePix FL (vaata allpool). Individuaalsed rakuliinid, mida on kasutatud pMCB 20

genereerimisks, nagu eelpool kirjeldatud, võivad olla eelnevalt säilitatud külmutatud

individualsetest rakuliinidest raamatukogu varuna, millest iga individuaalse rakuliini

ampull sulatatakse üles ja paljundatakse enne pMCB genereerimist. Eelistatavalt, need

individuaalsed rakuliinid ekspresseerivad täispikki antikehasid, mille omadused erinevad

nende antikehade omadustest, mis on produtseeritud pMCB teise liikme poolt, näiteks, 25

nad võivad erineda antigeeni spetsiifilisuse poolest, affiinsuse poolest, erinevate variaabel-

või CDR-piirkondade ja/või erinevte konstantsete piirkondade poolest.

Iga rakuliin, mida kasutati pMCB geenreerimiseks, produtseerib polüklonaalse valgu

erinevaid liikmeid. Eelistatavalt seostub polüklonaalse valgu erinev liige konkreetse

antigeeniga. Lisaks sellele on eelistatav, et igat erinevat liiget produtseeritakse mitmest 30

integrandist, mis paiknevad iga peremeesraku genoomi juhuslikes saitides. pMCB

genereeritakse segades kokku ettemääratud arv rakke igast individuaalsest rakuliinist.

EE-EP 2 152 872 B1 37

Eelistatavalt, segatakse need rakud kokku võrdsetes kogustes (suhtes 1:1), kuigi

soovitavad või olla ka teised suhted (vaata allpool). Rakkude segu, mis oli külmutatud

alikvootidena, millena nad on jaotatud suurde hulka viaalidesse, ettemääratud rakkude

arvuga igas viaalis. Need viaalid külmutati ja säilitati pMCB-na hilisemaks kasutamiseks.

Eelistatavalt on nende viaalide arv, mis moodustavad pMCB, suurem, kui 10, 25, 50, 75, 5

100, 200, 500 või 1000 viaali. Üksikud viaalid pMCB-s võivad olla üles sulatatud

erinevatel ajapunktidel, et genereerida erinevaid partiisid polüklonaalseid

produktsioonirakuliine, mis on võimelised produtseerima polüklonaalset valku partiilt

partiile praktiliselt sama kompositsiooniga.

Käesoleva leiutise alternatiivses lähenemisviisis võib polüklonaalne produtseeriv rakuliin 10

olla paljundatud pWCB-st, mis on tuletatud pMCB-st. pWCB genereeritakse sulatades

üksik viaal pMCB-st ja paljundades neid rakke mitmeks genereerimiseks, mis on piisav, et

produtseerida selline arv rakke, mis võib olla külmutatud uues alikvootide seerias

(leiutisekohane pWCB), ligikaudu sama arv rakke igas pWCB alikvoodis, nagu oli pMCB

viaalis, mida on algselt kasutatud pWCB genereerimiseks. Kui pWCB on ammendatud, on 15

võimalik pMCB alikvoodist geenreerida uus pWCB. See lähenemisviis on seetõttu

oluliselt väiksema töömahuga, kui võib vaja minna individuaalse rakuliini paljundamiseks

külmutatud raamatukogu varust ja uue pMCB kokkusegamist. Edasi, juhul, kui pWCB on

ammendatud, siis on suurem võimalus produtseerida järgmised partiid polüklonaalse

töörakuliini rakke, mis on võimeline produtseerima polüklonaalseid valke, ja mis on 20

partiilt partiile praktiliselt sama koostisega.

pMCB produtseerimisel üksikute individuaalse transfektsiooniga saadud rakuliinide

kokkusegamise teel on see eelis, et see annab võimaluse teostada individuaalselt

transfekteeritud rakuliini lisa analüüsi ja selektsiooni enne pMCB genereerimist. See võib

tagada stabiilsema polüklonaalse produktsioonirakuliini, vastab mitmekesisuse nõuetele, 25

mida on juba kirjeldatud. Lisaks polüklonaalne valk võib olla valmistamid enam

reprodutseeritaval teel.

Kõik mis on siin öeldud pMCB kohta, kehtib ka pWCB puhul.

Käesoleva leiutise lisateostusviisis on individuaalseid rakuliine, mis on valitud eelpool

kirjeldatud polüklonaalse valgu individuaalse liikme stabiilseks ekspressiooniks, edasi 30

iseloomustatud nende proliferatsioonikiiruste ja/või produktiivsuse suhtes enne pMCB

genereerimist. Eelistatud teostusviisis on pMCB genereerimiseks valitud rakuliinid, millel

EE-EP 2 152 872 B1 38

on samasugusd proliferatsioonikiirused või produktiivsus. Veelgi enam eelistatavalt,

pMCB genereerimiseks on valitud rakuliinid, millel on samasugune produktiivsus, aga ka

samasugused proliferatsioonikiirused. Eelistatavalt, need rakuliinid on kohandatud

kultiveerimiseks suspensioonina seerumivabas söötmes, enne, kui nende

proliferatsioonikiirusi ja/või produktiivsust iseloomustati. Alternatiivselt on 5

transfektsiooniks kasutatud emarakud kohandatud enne nende transfektsiooni,

kultiveerimisele suspensioonina, seerumivabas söötmes.

Proliferatsiooni kiirused võivad olla hinnatud sellel alal tuntud meetoditega. Imetaja

rakuliinide proliferatsioonikiirused peaksid olema 18 kuni 100 tundi, eelistatavalt 22 kuni

40 tundi ja enim eelistatavalt 24 kuni 32 tundi. Nende rakkude produktiivsus peaks olema 10

suurem, kui 0,5 pg valku raku kohta päevas (pg/(rakk*päev)), eelistatavalt peaks see

ületama 1, 1,5, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, või 100 pg/(rakk*päev). Edasi, see

rakuliin peaks koosnema ekspressiooni suhtes homogeensete rakkude populatsioonist,

hinnatuna rakusisese värvimismeetodiga. Kui soovitakse homogeensemat

rakupopulatsiooni igale individuaalsele rakuliinile, siis võib see olla saadud 15

kloneerimisega, näiteks, sorteerimisega siin kirjeldatud FACS-sorteerimise meetoditega.

Järgmises käesoleva leiutise teostusviisis sorteeritakse need individuaalsed rakuliinid

FACS-sorteerimismeetodiga, et identifitseerida homogeenne ekspressioonitasemega rakke,

pärast siin kirjeldatud transfektsiooni ja selektsiooni protsessi.

Fluorestsentselt märgistatud antikehasid võib kasutada rakkude sorteerimiseks, mis 20

ekspresseerivad kõrgel tasemel soovitavat valku, näiteks, antikeha või TcR-i, mis

võimaldab luua produktiivsuse suhtes homogeense rakupopulatsiooni. See tehnoloogia

põhineb tähelepanekul, et eritunud valgud võivad olla tuvastatud neid valke eritavate

rakkude pinnal, ja pinnavalgu kogus vastab nähtavasti individuaalse raku

ekspressioonitasemetele. Kõrge produktiivsusega rakkudeks võivad seega olla sorteeritud 25

üksikud märgistatud antikehadega värvitud rakud, millele järgneb analüüs FACS-

meetodiga. Kasutatud tehnoloogiat on kirjeldanud Brezinsky (Brezinsky et al. J. 2003.

Immunol Methods 277, 141-155).

Alternatiivne sorteerimismeetod põhineb rakkude poolt ekspresseeritava valgu suhtes

spetsiifilise ligandi sidestamisel rakkude pinnale. Näiteks Fc-vastane antikeha või 30

idiotüübivastane antikeha või olla sidestatud valku eritava raku pinnaga

rakupopulatsioonis, läbi biotiini. Antikehad, mis on eritatud individuaalsete rakkude poolt,

EE-EP 2 152 872 B1 39

püütakse seejärel kinni Fc-vastaste antikehadega selle raku pinnal. Pärast seda võivad

kõrge produktiivsusega rakud olla sorteeritud FACS abil märgistatud antikehade värvi

põhjal. Seda meetodit on kirjeldatud patendis EP 667 896.

Et saada rakuliinid, millel on homogeensed ja kõrged ekspressioonitasemed, üksikuid

rakke, millel on kõrge ekspressioonitase, analüüsiti põhinedes FACS profiilile, mis on 5

saadud ühe siin kirjeldatud tehnoloogiaga. Seejärel neid individualsete rakkude kloone

paljundati ja, võimalik, analüüsiti proliferatsiooni kiiruste ja produktiivsuse suhtes nii,

nagu on kirjeldatud eelpool. Alternatiivselt, sorteerimisega koguti rakkude alaühisvaru,

millel olid kõige kõrgemad FACS profiili abil identifitseeritud ekspressioonitasemed. See

rakkude alaühisvaru individuaalsest rakuliinist võib samuti soovi korral olla analüüsitud 10

proliferatsioonikiiruse ja produktiivsuse suhtes.

Käesoleva leiutise alternatiivses teostusviisis kasutatakse sellist robotit nagu ClonePixFL

robot (Genetix, UK), et valida kloone, millel on kõrged ekspressioonitasemed ja/või

samasugused kasvuomadused. Seda tehakse järgmiselt: kolooniad, mis on saadud pärast

transfektsiooni ja selektsiooni, kasvatati pooltahkes söötmes, mis võimaldas tuvastada 15

kõrge produktiivsusega kolooniaid, püüdes eritatud valguprodukti koloonia vahetus

läheduses. Iga koloonia produktsioonitase määratakse rakkude poolt ekspresseeritud valgu

immunofluorestsentsmärgistuse abil, millele järgnes parimate kloonide selektsioon,

kasutades kujutise tarkvara selliste ettemääratud kriteeriumide põhjal, nagu ekspressiooni

tase ja kasvuomadused. Lisaks sellele, iga koloonia suurus (mis peegeldab selle raku 20

proliferatsioonikiirust) võib olla hinnatud selle robotiga, kasutades valgusega tuvastatavat

visualiseerimist (light detection imaging). Seejärel, kolooniad, millel on soovitavad

produktiivsuse ja/või kasvuomadused, eraldatakse robotiga ja kantakse üle 96-

süvikulistele plaatidele nende eadasiseks paljundamiseks.

Eelistatavalt, valitakse pMCB genereerimiseks välja samasuguse produktiivsusega 25

individuaalsed rakuliinid. Eelistatud teostusviisis, individuaalsed rakuliinid, mis

moodustavad pMCB, genereeritakse kloneeritud rakkudest, näiteks nendest, mis on

saadud üksiku raku kaupa sorteerimisega, piiratud lahjendamise või robotiga

väljanoppimisega, kõrge ekspressioonitasemega rakkudest või kõrge

ekspressioonitasemega rakkude ühisvarust. 30

Käesolevas leiutises, nii individuaalsed rakuliinid, mis saadi üksikust rakkude kolooniast,

mis eraldati pärast transfektsiooni ja selektsiooni, kui ka individuaalsed rakuliinid, mis on

EE-EP 2 152 872 B1 40

saadi kloonist, mis on saadud, näiteks, ühe raku kaupa FACS-sorteerimisel, nimetatakse

kloneeritud rakuliinideks. Eelistatud teostusviisis selliseid kloneeritud rakuliine

kasutatakse pMCB genereerimiseks.

Käesoleva leiutise järgmises teostusviisis, pMCB genereerimisel need individuaalsed

rakuliinid segatakse kokku erinevates proportsioonides. Need üksikud rakuliinid võivad 5

olla segatud vastavalt ettemääratud kriteeriumidele, mis põhinevad üksikute rakuliinide

omadustel ja/või sõltuvalt nimetatud rakuliini poolt ekspresseeritud individuaalse

valguprodukti omadustest, näiteks, spetsiifilisest produktiivsusest või seostumise

afiinsusest.Näiteks, eraldi rakuliinid, mis ekspresseerivad teatud antikehasid, mis

seostuvad eriti tähtsate antigeenide või epitoopidega, võivad olla varutud liiaga, võrreldes 10

teiste pMCB rakuliini liikmetega, näiteks, 2-kordselt, 3-kordselt, 5- kordselt või 10-

kordselt suuremates kogustes. Üks rakuliini liige võib olla näiteks lisatud suhtes 2:1

võrreldes kõigi teiste liikmetega, näiteks 1. liikme rakke on 4 x 106 ja igast ülejäänud

liikme rakuliinist 2 x 106 rakku.

See lähenemisviis diferentseeritud individuaalsete rakuliinide proportsioonidega pMCB-s 15

võib samuti olla tarvitusele võetud, et vältida erinevusi individuaalsete rakuliinide

proliferatsioonikiirustes ja produktiivsustes, eriti, kui nad ei olnud välja valitud just nende

tunnusjoonte põhjal. Järelikult, kui üks või enam individuaalset rakuliini on madalama

proliferatsioonikiirusega, s.o pikema kahekordistumise ajaga, võrreldes teiste

polüklonaalse tööraku panga liikmetega, mida iseloomustab suurem proliferatsioonikiirus, 20

kuid see madalam proliferatsioonikiirus ei ole seotud konkreetse kõrge produktiivsusega,

see (need) konkreetne(sed) liige(kmed) või(vad) olla lisatud pMCB-le suuremates

kogustes, kompenseerimaks nende aeglast kasvu. Näiteks, rakuliin

proliferatsioonikiirusega 50 tundi, võib olla lisatud proportsioonides 2:1, kui ülejäänud

rakuliinide, mis moodustavad pMCB, proliferatsioonikiirused jäävad vahemikku 22 ja 30 25

tundi. Peale selle, lühikeste kahekordistumise aegadega rakuliinide suhe võib olla

vähendatud, et tagada, et need ei saaks prevaleerima tootmise käigus. Peale selle, erinevate

individuaalsete rakuliinide suhe pMCB-s võib olla korrigeeritud pMCB-st genereeritud

polüklonaalsete tootmisrakuliinide poolt produtseertavate polüklonaalsete valguproduktide

analüüsil. Selline korrigeerimine võib, näiteks, olla tehtud, põhinedes IEX profiilidele või 30

ekvivalentsetele iseloomustamise vahenditele. Kui selline analüüs näitab, et ühte või

enamat konkreetset valguliiget produtseeritakse suurendatud kogustes võrreldes ülejäänud

liikmetega, siis võib olla genereeritud uus pMCB, milles nende, liigset valku

EE-EP 2 152 872 B1 41

produtseerivate rakuliinides, osa võib olla vähendatud. Ja vastupidi, kui see või teine

konkreetne liige produtseeritakse väikestes kogustes, siis võib olla genereeritud pMCB,

milles on seda liiget produtseeriva rakuliini osa on suurendatud.

Kultiveerimise süsteemid

Käesoleva leiutise kohane rekombinantne polüklonaalne valk võib olla valmistatud 5

kasutades ükskõik millist sobivat kultivatsiooniviisi, mille hulka kuuluvad, kuid ei ole

nendega piiratud partii kaupa teostatavad (bach), poolpidevad (fed-batch-) ja

perfusiooniprotsessid.

Ekspressioonisüsteemi loomine kõrgetasemeliseks valkude ekspressiooniks

Meetodid nukleiinhappejärjestuse sisestamiseks rakku on teada. Need meetodid sisaldavad 10

tüüpiliselt DNA vektori kasutamist huvipakkuva järjestuse sisestamiseks rakku, selle

genoomi või kromosoomivälisesse elementi. Rakkude transfektsioon võib olla teostatud

suure hulga selle ala spetsialistile teada olevate meetoditega, kaasaarvatud lipofektsioon,

keemiliselt vahendatud transfektsioon, sadestamine kaltsiumfosfaadiga, elektroporatsioon,

mikroinjektsioon, liposoomi fusioon, punaste vererakkude varjude fusioon (RBC ghost 15

fusion), protoplasti fusioon, viiruse transduktsioon ja muu taoline.

Peremeesrakuliini transfektsiooniks kasutatakse huvipakkuvate vektorite raamatukogu,

milles iga vektor sisaldab ainult ühte nukleiinhappe järjestuse koopiat, mis kodeerib

huvipakkuva rekombinantse polüklonaalse valgu ühte liiget. See huvipakkuvate

ekspressioonivektorite raamatukogu kodeerib kollektiivselt huvipakkuvat rekombinantset 20

polüklonaalset valku. Integratsiooniks sobivaid vektoreid on kirjeldatud eelmises lõigus.

Rekombinantse polüklonaalse produtseeriva rakuliini genereerimine ja rekombinantse

polüklonaalse valgu produktsioon sellisest rakuliinist võib olla saadud mitmete erinevate

transfektsiooni ja valmistamise strateegiatega.

Eelistatud transfektsiooniviis, mida illustreerib joonis fig 1, on suure jõudlusega meetod, 25

milles peremeesrakud transfekteeritakse eraldi, kasutades individuaalseid vektoreid, mis

moodustavad huvipakkuvate vektorite raamatukogu. Seda meetodit nimetatakse

individuaalseks transfektsiooniks. Need individuaalselt transfekteeritud peremeesrakud on

eelistatavalt eraldi valitud. Kuid nad võivad olla ka kogutud varuks enne selektsiooni.

Individuaalsete rakkude kloonid, mis genereeritakse selektsiooni käigus, võivad olla 30

analüüsitud ekspressioonitaseme, proliferatsioonikiiruse ja integratsioonipildi suhtes, ja

eelistatavalt need ühesuguste kasvu kiirustega, ühesuguse koopiate arvuga, ühesuguse

EE-EP 2 152 872 B1 42

ekspressiooni ja/või ühesuguse töökindluse tasemetega kloonid võivad olla kasutatud

polüklonaalse GOI raamatukogude varu geenreerimiseks. Individuaalsed rakukloonid

võivad olla kokku segatud, et saada soovitav polüklonaalne rakuliin enne varu

genereerimist, vahetult pärast seda, nad saadakse varust, või pärast lühikest

proliferatsiooni ja adaptatsiooniperioodi. See lähenemisviis võib veelgi parandada 5

kompositsioonilist stabiilsust.

Transfektsiooni asjaloudes, mis võimaldavad enam, kui ühe koopia integratsiooni igasse

rakku, võib olla teostatud kõigi rakkude transfektsioon, kasutades ekspressioonivektorite

segusid, kui selleks polüklonaalseks valguks on monomer. Multimeersevalgu puhul,

selline kõigi rakkude transfektsioon, mis võimaldab mitmekordset integratsiooni 10

peremeesraku genoomi, põhjustab subühikute ”segipaiskamist”. Paljudel juhtudel, nagu

näiteks rekombinantse polüklonaalse antikeha valmistamisel farmatseutiliseks

kasutamiseks, peab selline ”segipaiskamine” olema välistatud. Multimeersete valkude

puhul võib kõigi rakkude transfektsioon olla teostatud, kui ”segipaiskamine” on

vastuvõetav, või kui transfektsioon on läbi viidud tingimustes, mis tagavad ainult ühe 15

koopia integratsiooni peremeesraku genoomi. Selliste meetodite näidete hulka kuuluvad

retroviiruslik transduktsioon ja sferoblasti fusioon. Individuaalsed vektorid, mis

moodustavad huvipakkuvate variantnukleiinhappejärjestuste raamatukogu, võib olla

kokku segatud ühte ainsasse kompositsiooni, või eelistatavalt, võivad individuaalsed

vektorid, mis kodeerivad iga raamatukogu liiget, olla hoitud eraldi kompositsioonides, või 20

segus, mis koosneb ligikaudu 5 kuni 50 selle raamatukogu individuaalsest vektorist.

Teiseks mooduseks on vektorite raamatukogu fraktsioonideks jaotamise kasutamine, kus

need fraktsioonid sisaldavad transfektsioonis ligikaudu 5 kuni 50 individuaalset

raamatukogusse kuuluvat vektorit. Eelistatavalt sisaldab see raamatukogu fraktsioon 10

kuni 20 individuaalset vektorit. Iga kompositsioon transfekteeritakse seejärel 25

peremeesrakkude alikvootidesse. Seda meetodit nimetatakse semi-bulk transfektsiooniks.

Transfekteeritud alikvootide arv sõltub raamatukogu suurusest ja individuaalsete vektorite

arvust igas fraktsioonis. Näiteks, kui see raamatukogu koosneb 100 erinevast

variantliikmest, mis on jagatud fraktsioonideks, mis sisaldavad kompositsioonis 20

erinevat variantliiget, siis on vaja, et 5 alikvooti peremeesrakke oleks transfekteeritud 30

raamatukogu kompositsioonga, mis on moodustatud algse raamatukogu erinevatest

frakstioonidest. Peremeesrakkude alikvoodid on valitud pärast transfektsiooni.

Eelistatavalt, need erinevad alikvoodid valitakse eraldi. Kuigi, nad võivad olla ühisvarusse

EE-EP 2 152 872 B1 43

kogutud ka enne selektsiooni. Nimetatudd alikvoodid võivad olla analüüsitud nende

klonaalse mitmekesisuse suhtes ja polüklonaalse GOI raamatukogu varu genereerimiseks

kasutatakse ainult neid alikvoote, millele on omane piisav mitmekesisus.

Külmutatud polüklonaalse rakuliini varu või olla genereeritud enne rekombinantse

polüklonaalse valgu valmistamise initsieerimist. Et saada produtseerimiseks soovitav 5

polüklonaal rakuliin, need kloonid võivad olla enne külmutatud varu genereerimist

segatud, vahetult pärast seda, kui olid välja võetud varust, või pärast lühikest

proliferatsiooni ja adaptatsiooniaega.

Ühiseks tunnusjooneks eelpool kirjeldatud tootmisstrateegiatel on see, et kõik

individuaalsed liikmed, mis moodustavad rekombinantse polüklonaalse valgu, võivad olla 10

produtseeritud ühes või piiratud koguses konteinerites, näiteks bioreaktoris, mida on

maksimaalselt ligikaudu 10.

Kui ekspressioonitasemeid on vaja suurendada, siis geeni amplifikatsioon või olla

teostatud, kasutades selektsiooni DHFR geeni suhtes või glutamiinsüntetaasi (GS) geeni

suhtes, hprt (hüpoksantiinfosfooribosüültransferaasi) või trüptofaansntetaasi geeni suhtes. 15

See vajab niisuguste vektorite kasutamist, mis sisaldavad sellist selektsioonimarkerit.

Üheks käesoleva leiutise konkreetseks tunnusjooneks on see, et rakkude stabiilsuse

hoidmiseks kõrgel tasemel on vaja koopiate arvu hoida suhteliselt madalana. Seetõttu viidi

eelistatavalt läbi rakkude üks selektsioonitsükkel suhteliselt tagasihoidliku

selektsioonisurve all nukleosiidivabas söötmes, mis sisaldas madalat MTX (nt, 1-10 nM) 20

kontsentratsiooni konstrukti tüübi puhul, mida kasutati lisatud näidetes. Arvatakse, et

suhteliselt madala arvu koopiate põhjuseks on selline tagasihoidlik selektsioonirõhk.

Arvatakse, et mõõdukas selektsioonisurve põhjustab balanseeritud koopiate arvu, mis

annab tulemusena kõrge ekspressioonitaseme, hoides ära nende rakkude ebastabiilsuse,

millel on väga suur koopiate arv. 25

Selleks, et saavutada kõrgemaid ekspressioonitasemeid, ekspressiooniks kasutatav rakuliin

sisaldab eelistatavalt heteroloogset transaktivaatorit, mis on võimeline tõstma

polüklonaalse valgu promootoriga kontrollitavat ekspressiooni. Sobivate transaktivaatori

ja promootori kombinatsioonide näiteid on mainitud järgnevas tabelis (tabel 2).

30

EE-EP 2 152 872 B1 44

Tabel 2. Näited transaktivaatori/promootori paaridest

Transaktivaator Promootori näited Kommentaarid

lentiviirus Tat pikk lõpukordus (LTR)

adenoviirus E1A HCMV peamine IE

võimendusjärjestus/promootor

herpes simpleksi viirus VP16 herpes simpleksi viiruse geeni

promootoriks on IE175

US 6635478

hepatiidi B viiruse X valk (HBx) SV40 varajane

Sünteetilise Zn-sõrme valgud Sünteetiline Sangamo inc

SV40 suur antigeen SV40 hiline promootor

tetratsükliiniga-kontrollitavad

transaktivaatorid (tTA)

Sünteetiline Sünteetilised

fusioonid

inimese tsütomegaloviirus IE2p86 HCMV peamine IE


inimese tsütomegaloviirus IE1p72 HCMV peamine IE


Epstein-Barri viiruse R

transaktivaator (Rta)

EBV promootor

kilpnäärme hormooni retseptorid kasvuhormooni promootor

glükokortikoidhormooni retseptorid piimanäärme tuumori viiruse

(MMTV) promootor

Eelistatavalt on rakuliin transfekteeritud ekspressioonikonstruktiga, mis kodeerib

transaktivaatorit, ja kloonid on valitud, kasutades piiratud lahjendust või teist meetodit

üksiku raku kloneerimiseks. Ekspressioonivektor võib sisaldada selliseid elemente, nagu 5

promootor, selektsioonimarker jne, nii nagu seda on siin kirjeldatud seoses

EE-EP 2 152 872 B1 45

ekspressioonivektoritega. Eelistatavalt on promootor, mis kontrollib transaktivaatori

ekspressiooni, selline konstitutiivne promootor, nagu elongatsioonifaktori 1 promootor,

CMV promootor, metallotioneiin-1 promootor või analoogne sellega. Eelistatud

teostusviisis on selleks promootoriks CMV promootor.

Eriti eelistatud on kasutada adenoviiruse E1A transaktivaatorit, mis paistab stabiliseerivat 5

rakke iseenesest, lisaks CMV promootori transaktiveerimisele, mis kontrollib huvipakkuva

geeni ekspressiooni. Nagu on juba märgitud, E1A ekspressioon ei olnud tuvastatav

esimese produtseeriva rakuliini, ECHO puhul. Seetõttu side E1A ja rakkude

stabilisastiooni vahel ei ole käesolevates eksperimentides tõestatud.

Polüklonaalse valgu valmistamiseks, kus valgu iga liige sisaldab enam, kui kahte 10

polüpeptiidahelat, nende ahelate kombinatsioon võib olla tähtis selle valgu afiinsuse,

spetsiifilisuse ja aktiivsuse seisukohalt, mille nad moodustavad. Seda võib näha, näiteks

antikehade ja TcR-de peal. Näiteks, on teada, et antikeha raske ahela variaabelpiirkonna ja

kerge ahela variaabelpiirkonna kombinatsioon mõjutab nende ahelate poolt moodustatud

antikeha afiinsust ja spetsiifilisust. Seega, kui antikeha raamatukogu, mis kodeerib 15

järjestusi, on valitud nende võime järgi produtseerida antikehi, afiinsusega teatud

märklaua suhtes, siis on soovitav tagada, et see raske ahela variaabelpiirkonna ja kerge

ahela variaabelpiirkonna kombinatsioon lõpp-produktis ka vastab sellele. Sel põjusel on

polüpeptiidahelad, mis moodustavad polüklonaalse valgu individuaalse liikme,

eelistatavalt paigutatud samasse vektorisse, mida on kasutatud integratsiooniks, tagades 20

sellega, et nad saavad olema koos kogu protsessi jooksul. Alternatiivselt, peremeesrakud

võivad olla transfekteeritud ekspressioonivektorite paaridega, mis kodeerivad raske ja

kerge ahela suguluspaare.

Järgmine kirjeldus on üheks näiteks sellest, kuidas saada rekombinantset polüklonaalset

antikeha ekspresseeriv rakuliin. 25

Võib olla konstrueeritud universaalne promootorikassett, mis on ette nähtud

konstitutiivseks ekspressiooniks, milles on kaks promootorit, mis on paigutatud

vastupidistesse transkriptsiooni suundadesse, näiteks pea-pea(head-to-head)-

konstruktsioonina, mis on ümbritsetud raske ahela variaabelpiirkonna ja terve kappa või

lambda kerge ahelaga, võimaldades kogu konstrukti ülekannet vektorisse, mis sisaldab 30

selektsioonimarkerit ja raske ahela konstantset piirkonda. On kaalutud, kas

indutseeritavaks ekspressiooniks võib olla kasutatud ka promootorkassett. Lisaks sellele,

EE-EP 2 152 872 B1 46

need promootorid võivad olla paigutatud saba-saba (tall-to-tall) orientatsioonis, mis

põhjustab transkriptsiooni vastassuundades, või saba-pea (tall-to-head) orientatsioonis,

ühesuunaliseks transkriptsiooniks. Ekspressiooni kontrolliks võib olla kasutatud ka

indutseeritav promootor. Pärast transfektsiooni, neid rakke kultiveeriti eelistatavalt

selektiivsetes tingimustes, et välja valida stabiilseid tranformante. 5

Rakud, mis jäävad ellu nendes tingimustes, võivad järgnevalt kasvada erinevates

kultuurisüsteemides, näiteks sellistes, nagu traditsionaalsed väikesed kultuurikolvid,

Nunci mitmekihilised rakuvabrikud, väikesed, suure saagisega bioreaktorid (MiniPerm,

INTEGRA-CELLLine), loksutajad, ja segurkolvidest kuni kiud- ja bioreaktorite WAVE

kottideni (Wave Biotech, Tagelswangen, Switzerland) või teiste ühekordsete 10

nõude/konteineriteni. Need rakud võivad olla testitud antikeha produktsiooni suhtes,

kasutades ELISA-testi. Eelistatavalt valitakse polüklonaalsed rakuliinid, mis on

elujõulisused kultiveerimisel suspensioonis, seerumivabas söötmes, selektsiooni survel,

pikendatud ajavahemike jooksul.

Polüklonaalsuse säilitamise hindamine ekspressioonisüsteemis. 15

Vastavalt käesolevale leiutisele on sageli tähtis kindlustada, et polüklonaalsus

ekspressioonisüsteemis ei muutuks tõsiselt produktsiooni kestel nii, et oleks võimalik

peatada produktsioon, kui polüklonaalsus tõepoolest on muutunud. Seda tehakse vastavalt

käesolevale leiutisele jälgides variantnukleiinhappe järjestuste suhtelisi

ekspressioonitasemeid. Neid ekspressioonitasemeid võib, näiteks, jälgida mRNA tasemete 20

kaudu, kasutades näiteks RFLP- analüüsi, maatriks- või reaalaja PCR-i, või valgu taseme

kaudu, kasutades, näiteks, kahedimensionaalset polüakrüülamiidgeelelektroforeesi, mass-

spektromeetriat või erinevaid kromatograafiameetodeid. Nende meetoditega on võimalik

kindlaks teha kõikide individuaalsete ekspressioonitasemete baasväärtused ja seejärel

võtta välja proovid kultuurist produktsiooni kestel selleks, et hinnata, kas 25

ekspressioonitasemed on muutunud (nii üldine, kui ka suhteline). Käesoleva leiutise

tavalises praktikas võib baasväärtustele lähedaste väärtuste diapasoon olla fikseeritud, ja

kui on leitud, et suhtelised ekspressioonitasemed väljuvad nendest piiridest, siis

produktsioon lõpetatakse.

Rakkude kultivatsioon ja rekombinantse polüklonaalse antikeha produtseerimine 30

Leiutisekohane polüklonaalne rakuliin valmistati nii, nagu eelpool kirjeldatud, ja see või

olla kultiveeritud sobivas söötmes ning tingimustes, mis sobivad huvipakkuva, rakkude

EE-EP 2 152 872 B1 47

genoomi sisestatud variantnukleiinhappe järjestuses kodeeritud polüklonaalse valgu

ekspresseerimiseks. Nende rakkude kultiveerimine võib olla teostatud mitmes etapis. Kui

kasutatakse imetajarakke, siis valitud rakud on eelistatavalt adapteeritud kultiveerimiseks

suspensioonis, aga ka seerumivabades tingimustes. Adaptatsioon kultiveerimiseks

seerumivabas söötmes võib eelistatavalt olla teostatud ka enne kloneeritud rakuliinide 5

segamist polüklonaalse rakuliini saamiseks. Adaptatsioon või olla teostatud ühes või kahes

etapis ja selektsiooni survel või ilma selleta. Eelistatavalt kasutatakse sellist

selektsioonisüsteemi, mis võimaldab teostada selektsiooni kogu produktsiooniperioodi

vältel, kahjustamata valmistava raviprodukti puhtust. Üldiselt, farmatseutiliseks

kasutamiseks ette nähtud rekombinantsete valkude valmistamisel on eelistatud mitte 10

kasutada selektsioonisurveks, näiteks, antibiootikume või teisi madalmolekulaarseid

ravimeid, kuna siis on tarvis kinnitust, et lõpp-produkt ei sisalda mis tahes antibiootikumi

jälgi.

Kui polüklonaalne rakuliin on juba kohandatud vastavate tingimustega, siis võib alustada

produtseemimise mõõtkava suurendamisega. Selles punktis võib polüklonaalsete 15

töörakkude varu ( pWCB) ja/või polüklonaalne baasrakkude pank (pMCB) olla

külmutatud. Eelistatavalt võivad olla kasutatud bioreaktorid, mahuga 30 kuni 100 liitrit,

kuid väiksemad (5-10 liitrit) või suuremad (kuni 1000, 5000, 10000, 15000 liitrit, või

veelgi suuremad) bioreaktorid võivad samuti olla kasutatud. Sobiv produktsiooniaeg ja

bioreaktori suuruse valik sõltuvad valgu soovitavast saagisest partiis ja rakuliini 20

ekspressioonitasemetest. Ajad võivad varieerida paarist päevast kuni kolme kuuni.

Ekspresseeritud rekombinantne polüklonaalne valk võib olla kogutud kas rakkudest või

rakukultuuri supernatandist. See rekombinantne valk või olla puhastatud iseloomustatud

selle ala spetsialistile tuntud meetoditega. Näiteid puhastamise metoodikatest on loetletud

allpool. Näiteid iseloomustamise metoodikatest võib leida näiteks, publikatsioonis WO 25

2006/007853.

Rekombinantse polüklonaalse valgu eraldamine ja puhastamine kultuuri

supernatandist

Spetsiifiliste valkude eraldami kultuuri supernatantidest on võimalik, kasutades erinevaid

kromatograafiameetodeid, milles kasutatakse ära valkude erinevusi füüsikalis-keemilistes 30

omadustes, näiteks, erinevusi molekulkaaludes, summaarses laengus, hüdrofoobsuses või

afiinsuses spetsiifilise ligandi või valgu suhtes. Seega, valgud võivad olla eraldatud

vastavalt molekulkaaludele, kasutades geelfiltratsioonkromatograafiat, või vastavalt

EE-EP 2 152 872 B1 48

summaarsele laengule, kasutades ioonvahetus(katioon/anioon)kromatograafiat või

alternatiivselt, kasutades kromatofookustamist. Analoogselt sellele võivad valgud olla

eraldatud vastavalt nende hüdrofoobsusele, kasutades hüdrofoobseid interaktsioone või

laengu indutseerimisel põhinevat kromatograafiat või afiinsuskromatograafiat, milles

kasutatakse afiinsuse erinevusi spetsiifiliste immobiliseeritud ligandide või valkude 5

suhtes. Keeruliste valkude segude eraldamine võib seega olla saavutatud kasutades

järjestikku erinevate kromatograafiliste meetodite kombinatsiooni. Valkude segu võib

seega olla eraldatud algselt, näiteks, vastavalt selle molekulide summaarsele laengule

ioonvahetuskromatograafiaga, ja valgud, millel on ühesugune laeng, võivad olla edasi,

lahutatud vastavalt molekulkaalule, kasutades geelfiltratsioonkromatograafiat või 10

kasutades hüdrofoobsetel interaktsioonidel põhinevat kromatograafiat valitud

soolakontsentratsioonide juuresolekul.

Afiinsuskromatograafiat, kombinatsioonis selliste järgnevate puhastamisetappidega, nagu

ioonvahetuskromatograafia, hüdrofoobsed interaktsioonid ja geelfiltratsion, kasutatakse

sageli IgG (polüklonaalsete aga ka monoklonaalsete) ja TcR eraldamiseks ja 15

puhastamiseks erinevatest allikatest, näiteks, astsiidivedelikest, rakukultuuri

supernatantidest ja seerumist. Afiinne puhastamine, kus eraldamine põhineb valgu(kude)

ja kromatograafilisele maatriksile sidestatud spetsiifilise ligandi vahelisel pöörduval

interaktsioonil, on lihtne ja kiire meetod, mis võimaldab saavutada suurt selektiivsust,

tavaliselt suurt jõudlust ja kontsentratsiooni väiksemas mahus. Kahel bakteriaalse 20

rakupinna valgul, valgul A ja valgul G, on suur afiinsus antikehade Fc piirkonna suhtes, ja

seda kasutatakse immobiliseeritud kujul tavalistel, väga erinevatel rakendustel,

kaasaarvatud polüklonaalse IgG ja selle alaklasside puhastamine erinevatest molekulidest

ja immuunsete kompleksite absorptsioon ja puhastamine.

Afiinsuskromatograafiale järgnevad kromatograafiaetapid, milleks on näiteks ioonvahetus 25

ja/või hüdrofoobsetel interaktsioonidel põhinev kromatograafia, võivad olla teostatud

peremeesraku valkude, lekkinud valgu A ja DNA eemaldamiseks.

Geelfiltratsioon, kui lõplik puhastamise etapp, võib olla kasutatud selliste saastavate

lisandimolekulide, nagu dimeerid ja teised agregaadid, eemaldamiseks, ja proovi

ülekandeks säilituspuhvrisse. Sõltuvalt allikast ja ekspressioonitingimustest võib olla 30

vajalik sisse lülitada lisa puhastamise etappe, et saavutada antikeha nõutav puhtuse tase.

Seega terapeutiliseks kasutuseks ette nähtud antikehade puhastamisel on tihti

kasutatavateks meetoditeks, kombinatsioonis valgu A kromatograafia ja

EE-EP 2 152 872 B1 49

gelfiltratsioonkromatograafiaga, hüdrofoobsel interaktsioonil põhinev kromatograafia või

ioonvahetuskromatograafia.

Selleks, et lihtsustada puhastamist, on eelistatav, et kõigil polüklonaalse antikeha liikmetel

oleks sama raske ja/või kerge ahela konstantne piirkond.

Selleks, et puhastada teisi antikehade klasse, kasutatakse alternatiivseid 5

afiinsuskromatograafia meetodeid, kuna valgud A ja G ei seostu antikehadega IgA ja IgM.

Kasutatud võivad olla immunoaffiinsed puhastamismeetodid (tahke faasiga sidestatud

anti-IgA või anti-IgM monoklonaalsed antikehad) või, alternatiivselt võivad olla kasutatud

mitmeetapilise puhastamise strateegiad, kaasaarvatud ioonvahetus ja hüdrofoobsel

interaktsioonil põhinev kromatograafia. 10

Struktuurne iseloomustus

Selliste polüklonaalsete valkude, nagu antikehad ja TcR-d, struktuurne iseloomustus, vajab

suurt lahutusvõimet seoses nende segu keerukusega (klonaalne mitmekesisus ja

glükosüleerimine). Traditsioonilised lähenemisviisid, nagu näiteks geelfiltratsioon,

ioonvahetuskromatograafia või elektroforees, ei võimalda saavutada piisavat 15

lahutusvõimet, et eraldada teineteisest individuaalse antikehad. Komplekssete valgusegude

analüüsil on kasutatud kahedimensionaalset elektroforeesi polüakrüülamiidgeelis (2D-

PAGE), millele järgneb mass- spectromeetria (MS) või vedelikkromatograafia (LC)-MS

(näiteks, proteoomika). 2D-PAGE, milles on kombineeritud valgu lahutus algul selle

molekulide laengute põhjal, seejärel aga masside põhjal, on tõestanud oma kasulikkust 20

seerumiproovides sisalduvate polüklonaalsete, oligoklonaalsete ja monoklonaalsete

immunoglobuliinide diferentseerimisel. Kuigi, ka sellel meetodil on mõningad piirangud.

Üha enam leiavad keerukate peptiidisegude analüüsil rakendust kromatograafilised

meetodid, konkreetselt, kapillaar- ja vedelikkromatograafia, kombinatsioonis

elektrospreiionisataioon-MS-ga. LC-MS on kasutatud monoklonaalsete antikehade 25

iseloomustamiseks. Väga keerukate proovide analüüs vajab suurema lahutusvõimega

kromatograafilist süsteemi, mis võib olla saadud lahutamisel kahes (või enamas)

dimensioonis. Selline lähenemisviis võiks põhineda ioonvahetusel esimese mõõtmes ja

pöördfaasi kromatograafial (või hüdrofoobsel interaktsioonil) teises mõõtmes, valikuliselt

ühenduses MS-ga. 30

EE-EP 2 152 872 B1 50

Funktsionaalne iseloomustus

Polüklonaalne valk võib näiteks olla iseloomustatud funktsionaalselt, võrdlevates

uuringutes polüklonaalsete valkudega, millel on spetsiifilisus mõningate samasuguste

märklaudade suhtes, või millel on analoogne aktiivsus. Sellised uuringud võivad olla

teostatud in vitro, aga ka in vivo. 5

Polüklonaalse antikeha funktsionaalseks iseloomustamiseks in vitro võiks näiteks olla

kasutatud immunopretsipitatsioon, mis on väga spetsiifiline meetod märklaudantigeenide

analüütiliseks eraldamiseks töötlemata rakulüsaatidest. Kombineerides

immunopretsipitatsiooni teise, sellise meetodiga, nagu SDS-PAGE, millele järgneb valgu

värvimine (Coomassie Blue, värvimine hõbedaga või märgistamine biotiiniga) ja/või 10

immunoblotting, on võimalik tuvastada ja kvantifitseerida antigeene, näiteks, ja seega

hinnata antikehade mõningaid funktsionaalseid omadusi. Kuigi, see meetod ei anna hinnet

ei antikehamolekulide arvule ega nende seostumise afiinsusele, kuid annab võimaluse

visualiseerida märklaudvalke ja seega ka nende spetsiifilisust. See meetod võib samuti olla

kasutatud selleks, et jälgida antikehade potentiaalseid erinevusi antigeenivastastes 15

omadustes (klonaalse mitmekesisuse terviklikkust) ekspressiooniprotsessi kestel.

Polüklonaalse antikeha in vivo funktsionaalne iseloomustamine võiks olla läbi viidud

uurides infektsioone. Sellised eksperimentaalsed loomad, nagu hiir, võivad, näiteks, olla

nakatatud konkreetse viirusega, mille vastu polüklonaalne antikeha on välja töötatud.

Uuritava polüklonaalse antikeha funktsionaalsust näitab see, millisel määral nimetatud 20

infektsioon saab olema maha surutud.

Terapeutilised kompositsioonid

Farmatseutiline kompositsioon, mis on valmistatud vastavalt käesolevale leiutisele,

sisaldab rekombinantset polüklonaalset valku, mis on valitud immunoglobuliinide

sugukonnast, kuna see on toimeaine, mis on ette nähtud haiguse raviks või ärahoidmiseks 25

imetajas.

See farmatseutiline kompositsioon sisaldab toimeainena eelistatavalt rekombinantset

polüklonaalset antikeha või selle antikeha fragmenti, ja farmatseutiliselt vastuvõetavat

täidisainet.

Eelistatud on ka farmatseutiline kompositsioon, mis sisaldab toimeainena rekombinantset 30

polüklonaalset T-raku retseptorit või T-raku retseptori fragmenti ja farmatseutiliselt

vastuvõetavat täidisainet.

EE-EP 2 152 872 B1 51

Leiutisekohased farmatseutilised kompositsioonid valmistatakse tuntud viisil, näiteks,

kasutades traditsioonilise lahustamise, külmkuivatamise, segamise, granuleerimise või

kokkusegamise protsesse. See farmatseutiline kompositsioon võib olla formuleeritud

vastavalt traditsioonilisele farmatseutilisele praktikale (vaata, näiteks, käsiraamatus

Remington: The Science ja Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, 2000, 5

Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA ja Encyclopedia of Pharmaceutical

Technology, eds. J. Swarbrick ja J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York,

NY).

Lüofiliseeritud kompositsioonide valmistamisel, mis on ette nähtud toimeaine lahuste või

suspensioonide valmistmiseks vahetult enne nende kasutamist, kasutatakse eelistatavalt 10

selle toimeaine lahuseid ja suspensioone, ning eriti isotoonilisi vesilahuseid või

suspensioone, mis võivad sisaldadada peale toimeaine ka kandjat, näiteks mannitooli. See

farmatseutiline kompositsioon võib olla steriliseeritud ja/või võib sisaldada täidisaineid,

näiteks säilitusaineid, stabilisaatoreid, niiskusesäilitajaid ja/või emulgeerivaid agenseid,

solubilisaatoreid, soolasid osmootilise rõhu reguleerimiseks ja/või puhvreid ja 15

valmistatakse tuntud viisil, näiteks, kasutades traditsioonilisi lahustamise või

külmkuivatamise protsesse. Nimetatud lahused või suspensioonid võivad sisaldada

viskoossust suurendavaid aineid, näiteks selliseid nagu naatriumkarboksümetüültselluloos,

karboksümetüültselluloos, dekstraan, polüvinüülpürrolidoon või želatiin.

Leiutisekohased injektsiooniks ette nähtud kompositsioonid valmistatakse tavalisel viisil, 20

steriilsetes tingimustes; sama käib ka nende kompositsioonide ampullidesse või

viaalidesse sisestamise ja nende mahutite hemetiseerimise kohta.

Leiutisekohased farmatseutilised kompositsioonid võivad sisaldada alates ligikaudu 1%

kuni ligikaudu 95%, eelistatavalt alates ligikaudu 20% kuni ligikaudu 90% toimeainet.

Farmatseutilised kompositsioonid võivad olla, näiteks, ühikdoosi kujul, näiteks ampullide, 25

viaalide, suposiitide, dražeede, tablettide või kapslite kujul.

Leiutisekohaste kompositsioonide terapeutilised kasutused

Farmatseutiline kompositsioon, mis on valmistatud vastavalt käesolevale leiutisele, võib

olla kasutatud haiguse raviks, leevendamiseks või ärahoidmiseks imetajas. Haiguste hulka,

mis võivad olla ravitud käesoleva farmatseutilise kompositsiooniga, kuuluvad vähk, 30

nakkushaigused, põletikulised haigused, allergia, astma ja teised respiratoorsed haigused,

autoimmunsed haigused, kardiovaskulaarsed haigused, kesknärvisüsteemi haigused,

EE-EP 2 152 872 B1 52

metaboolsed ja endokriinsed haigused, transplantaadi hülgamisreaktsioon ja ebasoovitav

rasedus.

Leiutisekohased kompositsioonid võivad olla kasutatud meetodis, mis on ette nähtud

haiguse raviks, leevendamiseks või profülaktikaks loomal, mille puhul sellele

manustatakse efektiivne kogus rekombinantset polüklonaalset antikeha või selle antikeha 5

fragmenti, või milles manustatakse efektiivne kogus rekombinantset polüklonaalset T-raku

retseptorit või T-raku retseptori fragmenti.

Lisaks sellele võivad rekombinantne polüklonaalne antikeha või rekombinantne

polüklonaalne T-raku retseptor või antikehade, või T-raku retseptorite fragmendid olla

kasutatud kompositsiooni valmistamisel, mis on ette nähtud selliste haiguste raviks, mis 10

on valitud rühmast, millesse kuuluvad vähk, nakkushaigus, põletikulisne haigus, allergia,

astma ja teine respiratoorne haigus, immunoloogilised häired, autoimmuunne haigus,

kardiovaskulaarne haigus, kesknärvisüsteemi haigus, metaboolsed ja endokriinsed

haigused, transplantaadi hülgamisreaktsioon ja ebasoovitav rasedus.

Diagnostiline kasutamine ja kasutamine keskkonnauuringutes 15

Diagnostilised komplektid ja komplektid, mis on ette nähtud kasutamiseks

keskkonnauuringutes võivad sisaldada rekombinantset polüklonaalset valku, mis on

valmistatud vastavalt käesolevale leiutisele, kusjuure see valk võib olla märgistatud

tuvastatava märgisega või mittemärgistatud, märgiseta tuvastamiseks. Kui käesoleva

leiutise kohane rekombinantne polüklonaalne valk on märgistatud, siis võib see olla 20

lisatud proovidele, mis oletatavasti sisaldavad märklaudmolekule ja märgise olemasolu või

selle puudumine osutab märklaudmolekuli olemasolule või selle puudumisele. Testitav

proov võib olla võetud sellisest keha vedelikust, nagu veri, seerum, plasma, seljaaju

vedelik, lümf või uriin, või mitteimetajalt võetud proovist, näiteks sellisest, mis on võetud

keskkonna sellisest allikast, mida kahtlustatake märklaudsaasta sisaldamises. 25

Mitteimetajalt võetud proovideks võivad olla vesi, õhk või reostatud muld.

Mittemärgistatud detekteerimine hõlmab järskude muutuste mõõtmist BIAcore-s

seostamisel, milles rekombinantste polüklonaalset valku kasutatakse märklaudmolekuli

kinnihaaramiseks.

30

EE-EP 2 152 872 B1 53

NÄITED

NÄIDE 1

Antikehadega CHO rakukloonide tuletamine

Ekspressioonivektor

Kasutatud IgG ekspressioonivektor on toodud joonisel fig 2a. 5

E1A ekspressioonivektor on toodud joonisel fig 2b.

Rakuliin

Kasutatud rakuliin on DHFR-negatiivse CHO rakuliini DG44 derivaat, mis on saadud

Lawrence Chasin’ilt Columbia Ülikoolist (saadaval ka Gibco kategoorias # 12613-014).

DG44 rakke transfekteeriti cDNA-ga, et saada 13S versioon 5. tüübi adenoviiruse 10

transaktivaatorist E1A (NCBI kood AY339865, cDNA järjestus:

vektoris pcDNA3.1+ (Cat # V790-20, invitrogeen). Valitud transfektandid sisaldasid

genetitsiini (invitrogeeni) kontsentratsioonis 500 µg/ml. Pärast selekteerimist klooniti

rakke ükshaaval lahjendamise piiramise abil. Kloonidel kontrolliti katseliselt CMV 15

promootori transaktiveerimist (kõrgenenud ekspressiooni) lühiajalise transfektsiooniga

antikeha plasmiidiga (näidatud ülalpool). Üksikklooni ekspressioonitase lühiajalisel

analüüsil oli kõrgenenud faktoriga 3, võrreldes transfekteerimata DG44 rakuliiniga.

Kõrgenenud ekspressioonitase ei kujuta endast tõendit tegelikust transaktiveerimisest ning

seda võis põhjustada eriti kõrge ekspressiooniga alamklooni valik. Stabiilse 20

transfektsiooniga läbi viidud võrdluste korral oli valitud kogumites ekspressioonitase

looduslikku tüüpi DG44 rakuliiniga võrreldes 4-5 korda kõrgem. Seda klooni (nimega

ECHO) klooniti omakorda veel kaks korda, ning see näis olevat CMV promootori

transaktiveerimise (kõrgenenud ekspressiooni) osas stabiilne. CMV promootori tegelikku

transaktiveerimist ei mõõdetud, kuid klooni puhul väljendus sellegipoolest stabiilselt 25

EE-EP 2 152 872 B1 54

kõrge antikeha ekspressioon CMV promootori kontrolli all.

Antikeha ekspressiooni plasmiidid

Kasutatud antikeha ekspressiooni plasmiidid moodustati nii, nagu näidatud ülalpool.

Selleks valiti 6 erinevat antikeha, mis olid suunatud erinevate vaktsiiniaviiruse

pinnavalkude vastu. Need valiti põhjusel, et igaühel neist on ioonivahetuskromatograafias 5

väga iseloomulik profiil, mis võimaldab teostada identifitseerimist ja kvantifitseerimist

erinevate antikehade segudes. Antikehad (mida on kirjeldatud samuti vastust ootavas

taotluses PCT/DK2006/000686, esitatud 4. detsembril 2006, nimetusega "Orthopox-

viiruse vastane rekombinantne polüklonaalne antikeha", avaldatud koodiga WO

2007/065433) olid järgmised: 10

• Sym002-037 (kloon 002-037)

• Sym002-186 (kloon 002-186)

• Sym002-235 (kloon 002-235)

• Sym002-286 (kloon 002-286)

• Sym002-303 (kloon 002-303) 15

• Sym002-482 (kloon 002-482)

IgG ELISA

IgG mõõtmiseks kasutati kihttehnikal põhinevat ELISA katset. Lühidalt kirjeldades kaeti

96 avaga plaadid (Maxisorp, NUNC) kitse inimesevastase Fc-ga (Serotec, STAR106),

millele järgnes inkubeerimine proovide ja standardiga (puhastatud inimese kapa-tüüpi 20

monoklonaalne IgG1 antikeha). Tuvastamise teostamiseks konjugeeriti kitse

inimesevastaseid kapa-tüüpi ahelaid mädarõika peroksidaasiga (Serotec STAR100P).

ECHO rakkude transfektsioon

ECHO rakud külvati T80 kolbidesse tihedusega 0,30*106 rakku kolvi kohta MEM alfa

söötmes nukleosiididega (invitrogeen kat. nr. 32571) koos 10% vasika looteseerumiga 25

(FCS) (Invitrogeen). Tunni aja jooksul pärast külvi transfekteeriti rakke Fugene6-ga

(Roche):

• 10 µl Fugene6 segatakse 490 µl Dulbecco muudetud Eagle’i söötmega ja lastakse

5 minutit toatemperatuuril seista

EE-EP 2 152 872 B1 55

• Lisatskse 5 µg ekspressiooniplasmiidi ja segu inkubeeritakse veel 15 minutit

toatemperatuuril

• Segu lisatakse rakukultuuri kolbi

Järgmisel päeval transfektsioonireagente sisaldav sööde aspireeriti, iga kolbi pesti üks

kord 5 ml MEM alfa söötmega (ilma nukleosiidideta) koos 10% dialüüsitud FCS-iga 5

(Invitrogeen) (MEMalfa-) ning lisati 10 ml sama söödet koos metotreksaadiga

kontsentratsioonis 2 nM. Seejärel vahetati söödet kaks korda nädalas.

15 päeva pärast rakud trüpsineeriti ning kõik rakud viidi üle uutesse kolbidesse. Veel 2

päeva hiljem vahetati sööde ning järgmisel päeval sööde aspireeriti, rakud loendati ning

tootlikkust mõõdeti IgG ELISA katsega. Tulemused on toodud tabelis 3. Tootlikkus on 10

arvutatud pikogrammides raku kohta päevas, kasutades rakkude arvu korje ajal.

Tabel 3

Antikeha IgG conc.,

µg/ml

Kokku

IgG

Rakkude arv,

*106

Tootlikkus, pikogrammi raku

kohta päevas

Sym002-

037

3,65 36,5 3,0 12,2

Sym002-

186

8,15 81,5 6,0 13,6

Sym002-

235

5,71 57,1 3,3 17,3

Sym002-

286

1,39 13,9 0,8 17,4

Sym002-

303

11,4 114 9,4 12,1

Sym002-

482

17,0 170 12,5 13,6

15

EE-EP 2 152 872 B1 56

Rakkude arv, söötme IgG sisaldus ning konkreetsed rakkude tootlikkused

transfekteeritud vannides

Üherakuliste kloonide tootmiseks peitsiti vannides olevaid rakke pinnaga seotud antikeha

määramiseks ning sorteeriti üherakuliselt 96 avaga plaatidesse, mis sisaldasid 50%

ECHO-rakkudele kohandatud söödet (MEMalpha-) ning 50% sama söödet ilma 5

kohandamata. Lühidalt oli peitsimisprotokoll järgmine:

1. Rakud trüpsineeritakse ja loendatakse

2. Asetage pipetiga 1-5 x 106 rakku steriilsesse FACS torusse

3. Tsentrifuugige rakke 1 min 250 g 4 °C juures ja eemaldage supernatant

4. Peske rakke 2 ml steriilses FACS PBS-s (PBS + 2% FCS) (5ml) 10

5. Peitsige rakke (Kitse F(ab)2 fragmentne inimesevastane IgG H+L- PE (Beckman-

Coulter, IM1626) lahjendatud 1:20 100 µl lahjendatud Ab/106 rakkudesegus ja

inkubeerige 20 min (4 °C pimedas)

6. Peske rakke kaks korda 2 ml FACS PBS-s (5ml)

7. Suspendeerige uuesti tasemeni 1-5 x 106/ml FACS PBS-s (2ml) 15

8. Lisage propiidiumjodiid, 10 µg/ml 1:100

Loodi korrektne lüüs ja rakud sorteeriti üherakuliselt 96 avaga plaatidesse (5 plaati

antikeha kohta) FACS-Aria abil (Beckton-Dickinson).

Ligikaudu 1 nädala pärast kontrolliti mikroskoobiga üksikkloonide olemasolu avades.

Ligikaudu 2 nädala pärast analüüsiti üksikklooniga avade supernatante eraldi lahustes 20

ELISA katse abil ning ELISA väärtuse ja avade visuaalse ülevaatuse põhjal valiti kultuuri

jätkamiseks 24 klooni, mis esindasid iga antikeha. Kloonide valimisel kasutati visuaalset

kontrolli rakkude arvu ja morfoloogia osas koos antikeha ekspressioonitaseme valikuga.

Valitud kloonidega viidi läbi täiendav ammendumisanalüüs: lühidalt kirjeldades külvati

rakud 24 avaga plaatidele ja lasti kasvada kuni enamiku rakkude surmani. Supernatante 25

analüüsiti ELISA katsega ning seerumivaba suspensioonikultuuri jaoks kohandamiseks

valiti välja peamised 10 klooni iga antikeha kohta.

Kohandamine seerumivaba suspensioonikultuuriga

Rakud trüpsineeriti ja loendati. 5*106 rakku tsentrifuugiti ja suspendeeriti uuesti 10 ml

EE-EP 2 152 872 B1 57

ProCHO4 seerumivabas söötmes (Cambrex). Rakud viidi üle 50 ml rakukultuuri torudesse

(TRP, Shveits) ja inkubeeriti loksutusseadmel 37°C juures. Rakutihedust mõõdeti kaks

korda nädalas ning iga kord lahjendati kultuurid tasemeni 0,5*106 rakku ml kohta

(esimesel 2 nädalal) või 0,3*106 rakku ml kohta (ülejäänud aja vältel). 4-5 nädala pärast

lähenes enamiku kloonide kahekordistumisaeg 30 tunnile, ning selles ajapunktis loeti nad 5

seerumivaba kultuuri jaoks kohanenuks.

Kohanemisperioodi lõpus teostati rakkudega ELISA katse, külmutati nad kultuurisöötmes

10% DMSO-ga ning neid kasutati ekspressioonikatseteks (vt Näide 2 allpool).

NÄIDE 2

Ekspressioonikatsed 10

Segakultuuride koostise püsivuse kontrollimiseks pika aja vältel valmistati mitu

kloonisegu. Kohanemisajal tehtud loenduste alusel võeti võimaluse korral arvesse

kahekordistumisaega. Omavahel püüti sobitada sarnase kahekordistumisajaga kloone.

Kokku valmistati 9 segu:

• Segud 1-5: igaühes neist kasutati üht klooni iga antikeha kohta 15

• Segu 6: kasutati kaht klooni iga antikeha kohta

• Segu 7: kasutati viit klooni iga antikeha kohta

• Segu 8: kasutati 3 klooni iga antikeha kohta

• Segu 9: kasutati kõiki saadaval olevaid kloone, 5-7 klooni iga antikeha kohta

Kloonid segati nii, et iga antikeha esindav rakkude arv (1-7 klooni iga antikeha 20

kohta) moodustas 1/6 rakkude koguarvust segus.

Katse viidi läbi 50 ml kultuuritorudes nii, nagu kirjeldatud näites 1. Kasutatud söötmeks

oli ProCHO4 ja kultuuri kogumaht 10 ml. Katset alustati kontsentratsiooniga 0,3*106

rakku ml kohta. Kultuurid lahjendati tasemeni 0,3*106 rakku kaks korda nädalas 3- ja 4-

päevase intervalliga. Kord nädalas võeti proove ELISA ja ioonivahetuskromatograafia 25

analüüsi jaoks. Esimesed proovid võeti 4. päeval ja viimased 35. päeval.

9 segu ELISA väärtused on toodud joonisel fig 3.

Arvutatud rakkude jagunemise arv algusest lõpuni erines segudes umbes 25-st kuni umbes

27-ni. See tähendab, et kui kultuure oleks lahjendatud kaks korda nädalas nii, nagu

kirjeldatud, kuid hoides kogumahu igas punktis sama, oleks kogumaht lõpuks varieerunud 30

EE-EP 2 152 872 B1 58

43 000 liitrist 152 000 liitrini. Suurte tööstuslike imetajate rakkude kultuuride maht on

tavaliselt kuni 15 000 liitrit, mis tähendab, et siinkirjeldatud segamiskatsed kujutavad

katseaja ning generatsioonide arvu poolest endast kultuuri tõepärast simulatsiooni

tööstuslikus mastaabis.

Rakkude tootlikkus näib olevat 5 nädala pikkuse perioodi vältel suhteliselt konstantne, 5

kaldudes mõnedes segudes langema.

IgG koostise analüüs

5-10 ml 0,22 µm filtreeritud söötme supernatanti viidi 1 ml MabSelect Sure kolonni (GE

Healthcare). Kolonni pesti 10 ml PBS pH 7,4-ga ja elueeriti 0.1 M glütsiiniga pH 2,7 nii,

nagu tootja poolt kirjeldatud. Vanni paigutatud valgumaterjali dialüüsiti kaks korda 40 10

mM NaCl, 50 mM Na-atsetaadi pH 5,0 suhtes, ja IgG üldkontsentratsioon määrati

kindlaks absorptsiooni mõõtmisega 280 nm juures.

60 µg IgG segu viidi nõrga katioonivahetusega kolonni PolyCat A (100x4, 6 mm, 3 µm,

1500 Å) firmalt PolyLC. Valgu elueerimiseks rakendati gradienti 150 kuni 500 mM NaCl

Na-atsetaadi pH 5,0 puhvris vooluhulgaga 1 ml/min 72 minuti vältel. Jälgiti eluaadi 215 15

nm absorptsiooni ja eraldi IgG-de suhtelised kogused määrati kindlaks signaali

integratsiooni abil.

Joonisel fig 3 on toodud segu 8 esimese ja viimase saagi IgG koostise katioonivahetuse

analüüsi kromatogrammid pärast MabSelect puhastust. Nagu näha, on eraldi Ab-d

korralikult eraldatud, algstaadiumis võib näha nelja eraldust. Seetõttu võimaldab UV 20

signaali integratsioon proovi suhtelisi IgG kontsentratsioone väga täpselt määrata.

Kõiki segusid analüüsiti nii, nagu kirjeldatud ülalpool, ning arvutati iga antikeha sisaldus

igas segus.

Algproovides võib näha üsna ühtset jaotust 6 erineva antikeha lõikes. Nähtud erinevused

võivad kajastada erinevat ekspressioonitaset segudes kasutatud kloonide vahel. Iga proovi 25

antikeha sisaldus on toodud graafiliselt joonisel fig 5. Üllataval moel saab kõiki antikehi

kõikides viimastes provides selgelt tuvastada. Samuti võib näha, et segudes, kus iga

antikeha esindas rohkem kui üks kloon (segud 6-9), esineb viimastes proovides kalduvus

ühtlasema antikehade jaotuse suunas.

30

EE-EP 2 152 872 B1 59

NÄIDE 3, E1A ekspressioon ECHO-s

Et uurida E1A ekspressiooni ECHO-s, määrati E1A mRNA tase kindlaks kvantitatiivse

pöördtranskribeeritud reaalajas PCR (qRT-PCR) meetodiga SYBR rohelise abil. qRT-PCR

meetod põhineb sihtjärjestuse PCR võimendusel. PCR teostatakse DNA siduva pigmendi,

SYBR rohelise abil, mis eritab kaheahelalise DNA-ga sidumisel rohelist valgust. See 5

võimaldab kaheahelalise DNA reaalajas kvantifitseerimist iga võimendusvooru järel.

Kui kaheahelalise DNA kogus on väike, pole PCR algusjärgus seotud SYBR rohelise

pigmendi signaali võimalik taustamürast eristada. Kuid võimendusprotsessis tugevneb

signaal mürast tugevamaks ning kaheahelalise DNA tootmist on võimalik jälgida. Nii saab

määrata proovides algselt sisalduva sihtaine suhtelise koguse, võttes aluseks tsüklite arvu, 10

mida vajab SYBR rohelise signaal konkreetse piiri ületamiseks. Täpne punkt, milles piir

ületatakse, on Ct väärtus, mida võib kasutada algse sihtkoguse suhtelise võrdluse jaoks.

Materjalid ja meetodid

Üldine RNA ekstraheeriti 3.0E+06 ECHO ja Hek293 rakkudest, kasutades vahendit

RNeasy Mini Kit, kat. nr. 74104, firmalt Qiagen vastavalt tootja juhistele. RNA proovide 15

kontsentratsioonide ja terviklikkuse määramiseks kasutati firma Agilent 2100

bioanalüsaatorit koos Eukaryote üldise RNA nanoseeria II analüüsiga. Terviklikkus on

määratud RNA terviklikkuse numbrina (RIN) vahemikus 1-10, kus 1 on degradeerunud ja

10 puutumatu RNA. ECHO RNA RIN oli 9,5 ja HEK293 RIN oli 8,9. Iga proovi cDNA

mõõtmiseks kasutati QuantiTect pöördtranskriptsiooni komplekti, kat. nr. 205311, firmalt 20

Qiagen, kasutades algmaterjalina 800 ng RNA-d. Hek293 cDNA lahjendati 25x, ECHO

cDNA aga lahjendati kaks korda. qRT-PCR viidi läbi seadmega Stratagene Mx3005P,

kasutades segu Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix, kat. nr. 600548, firmalt

Stratagene. Termotsükli tingimused: 10 min seisuaega 95 °C juures; 40 tsüklit 15s

denatureerimisega 95 °C juures, 1 min kaksikahelaks seondamise aega 60 °C juures ja 30s 25

pikendusaega 72 °C juures; sulamiskõvera analüüs temperatuuril 55-95 °C. Kasutatud

praimerid (E1A-696bpF: 5'-TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-'3, E1A-772bpR: 5'-

TCACGGCAACTGGTTTAATGG-'3) on suunatud 77bp fragmendile E1A geeni 3' otsas.

Tulemused

E1A ekspressiooni analüüsimiseks ECHO rakkudes kasutati qRT-PCR katset ning see 30

näitas, et E1A mRNA-d ei saa antud analüüsis võimendada ja tuvastada, viidates oluliselt

võimalusele, et ECHO rakuliinil E1A valku ei väljendu. Positiivse kontrollivahendina

EE-EP 2 152 872 B1 60

kasutati inimese 293 rakuliini, mis muteerub adenoviiruse DNA fragmendi mõjul ja

väljendab teadaolevalt E1A-d suhteliselt kõrgel tasemel.

qRT-PCR näitab võimendust Hek293 proovis, positiivne kontrolltulemus Ct = 18.74, kuid

NTC (aluskontrollita) ega ECHO proovis võimendust ei täheldatud.

Proov Ct

Hek293 18.74

ECHO Ct puudus

NTC Ct puudus

5

Näide 4. Rakupankade koostamine bioreaktori katsete jaoks

Koostise stabiilsuse uurimiseks vajalike bioreaktori katsete teostamiseks koostati pea- ja

töörakupangad. Katse jaoks kasutati 6 erineva antikehaga ECHO raku kloone, nagu

kirjeldatud näites 1. Kasutatud kloonid olid kohandatud seerumivaba suspensioonikultuuri

jaoks kultuursöötmes ProCHO4. 10

Pearakupank

Kloonid sulatati üles ja neil lasti suspensioonikultuuris ühe perioodi jooksul taastuda.

Eksponentsiaalse kasvuga rakkudest koostati 4 erinevat pearakupanka vastavalt

järgmistele spetsifikatsioonidele:

• Rakud külmutati logaritmilise kasvu olekusse 15

• Igas rakupangas oli esindatud kõik 6 antikeha

• Omavahel segati võrdsel arvul iga antikeha esindavaid rakke

• Segud 1 A -3 A sisaldasid üht klooni antikeha kohta

• Segu 4 A sisaldas 3 klooni antikeha kohta

• Segu kohta külmutati 10 ampulli, igaühes 20*106 rakku 20

• Külmutussööde: kultuursööde (ProCHO4), 10% DMSO

EE-EP 2 152 872 B1 61

Töörakupank

Üks külmutatud ampull segu kohta sulatati üles. Segusid hoiti kultuuris 8-10 päeva enne

töörakupanga koostamist:

• Rakud külmutati logaritmilise kasvu olekusse

• Segu kohta külmutati 10 ampulli, igaühes 20*106 rakku 5

• Külmutussööde: kultuursööde (ProCHO4), 10% DMSO

Näide 5: Koostise stabiilsus bioreaktoris

Üks külmutatud ampull töörakupanga segu kohta sulatati üles ning rakke hoiti kultuuris

külvijadana 14 päeva, mille möödumise ajahetkel pandi algus bioreaktori kultuurile:

Iga külvijada kasutades inokuleeriti kaks bioreaktorit 0,6*106 rakuga/ml 250 ml 10

algsöötmes (ProCHO4 + 5mM glutamiini + 1/100 asendatavaid aminohappeid).

Kultuure toideti alates 2. päevast kuni 14. päevani pärast inokulatsiooni toitesöötmega

(ProCHO4 + 6 g/L glükoosi + 5mM glutamiini + 1/100 asendatavaid aminohappeid), mille

tulemusena saadi koguseks ∼ 585 ml 16. korjepäeval.

DASGIP bioreaktorites kontrolliti järgnevaid parameetreid (üksused 1-8): 15

Tabel 4. Üldised bioreaktori protsessi parameetrid.

Kogus 250 ml pideva toitega, alates 2. päevast kuni 14. päevani

Temp. seadistuspunkt: 36.8 °C, üleminekuga 32,0 °C-le 120 tunni möödudes

pH seadistuspunkt: 6.95

pH kontroll: Kasutatakse steriilset filtreeritud 0,25 M Na2CO3.

Segamine: 80 p/min.

pO2 seadistuspunkt: 30 % (reguleeritakse gaasi O2 sisalduse kaudu)

Gaasivool: 0,1 sl/h

CO2 tase: Reguleeritakse DASGIP süsteemi poolt pH säilitamiseks

EE-EP 2 152 872 B1 62

Iga päev võeti 5 ml proove elujõulisuse, elusrakkude osakaalu, IgG toodangu ja

metaboliitide analüüsimiseks. Kõik kultuurid toimisid ootustepäraselt elujõulisuse ja

elusrakkude osakaalu osas, mis olid sarnased. Veel 10 ml võeti IgG koostise

analüüsimiseks ioonivahetuskromatograafia abil külvijadast (9. päeval ja 14. päeval) ning

igast bioreaktorist (üksus 1-8) 20., 24., 28. ja 30. päeval pärast ampullide ülessulatamist. 5

Läbi viidi IgG koostise analüüs nii, nagu kirjeldatud ülalpool näite 2 juures.

Kõiki segusid analüüsiti nii, nagu kirjeldatud ülalpool, ning välja arvutati iga antikeha

sisaldus 4 segu igas proovis. IgG kogusaagis kultuuridest jäi vahemikku ligikaudu 150

kuni 250 mg/L.

Iga proovi antikeha sisaldus on toodud graafiliselt joonisel fig 5. Üllataval moel on kõik 10

antikehad kõikides proovides selgelt tuvastatavad. Koostis näib olevat tugev, ükski kloon

pole kadunud ega asendunud 14 päeva kestnud külviahela kultiveerimisperioodi ning

sellele järgnenud 16-päevase bioreaktori tööperioodi vältel. Koostised on erinevad

sõltuvalt sisendkloonidest.

Samuti näib olevat võimalik määrata segu jaoks konkreetseid kloone valides kindlaks 15

individuaalsete antikehade suhteline jaotus lõppsaaduses.

EE-EP 2 152 872 B1 63

Patendinõudlus

1. Meetod polüklonaalse rakuliini genereerimiseks, mis suudab toota 2 kuni n erinevat

elementi sisaldavat polüklonaalset valku, kusjuures nimetatud meetod hõlmab järgmist:

a) ekspressioonivektorite komplekti moodustamine, kus iga nimetatud vektor sisaldab

vähemalt üht eraldiseisva nukleiinhappe eksemplari, milles on kodeeritud nimetatud 5

polüklonaalse valgu eraldiseisev element;

b) eraldi peremeesrakkude transfekteerimine iga nimetatud ekspressioonivektoriga

tingimustes, milles välditakse ekspressioonivektorite kohaspetsiifilist integreerimist

rakkude genoomi, mille tulemusena saadakse 2 kuni n rakusegu, millest igaüks annab ühe

eraldiseisva polüklonaalse valgu elemendi; 10

c) nimetatud 2 kuni n rakusegu segamine polüklonaalse rakuliini saamiseks.

2. Punktile 1 vastav meetod, kus ekspressioonivektorid on stabiilselt ja juhuslikkuse alusel

integreeritud ühte või mitmesse peremeesrakkude kromosoomi.

3. Punktile 1 või 2 vastav meetod, kus punktis b) saadud transfekteeritud rakud

kloonitakse, näiteks FACS kloonimise teel, ning kus eelistatavalt valitakse kloonid 15

vähemalt ühe kriteeriumi alusel, mis on valitud rühmast, kuhu kuuluvad kasvukiirus,

kahekordistumisaeg, ekspressioonitase, tootmistase, tootmise stabiilsus ajas, elujõulisus,

vastupidavus, tugevus, morfoloogia ja eksemplaride arv.

4. Punktile 3 vastav meetod, kus kloonid valitakse ühtlaselt vähemalt ühe kriteeriumi

alusel, näiteks kus kloonid valitakse ühtlaselt vastavalt kahekordistumisajale ja/või 20

ekspressioonitasemele, võimaliku variandina, kus rohkem kui üks kloon on valitud iga

erineva polüklonaalse valgu elemendi kohta.

5. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus nimetatud erinevaid eraldiseisvaid

elemente tootvad rakusegud segatakse vahekorras 1:1, või kus nimetatud rakusegud

segatakse muus vahekorras kui 1:1. 25

6. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus ekspressioonivektorid on identsed, välja

arvatud variatsioonide osas polüklonaalse valgu kodeerimisjärjestuses.

7. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus peremeesrakud saadakse ühest kloonist

enne transfekteerimist.

8. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus polüklonaalne valk on oligomeerne 30

valk, nt kus üks ekspressioonivektor kodeerib kõiki ühe eraldiseisva polüklonaalse valgu

EE-EP 2 152 872 B1 64

elemendi allüksusi, või kus ekspressioonivektorite komplekt punktis a) koosneb kahest või

enamast ekspressioonivektorite alamhulgast, millest esimene alamhulk sisaldab

varieeruvaid nukleiinhappe järgnevusi, mis kodeerivad üht valgu alamhulka, nt antikeha

raske ahel, ning teine alamhulk sisaldab varieeruvaid nukleiinhappe järgnevusi, mis

kodeerivad teist valgu alamhulka, nt antikeha kerge ahel, mille korral iga transfektsioon 5

teostatakse ekspressioonivektorite esimese alamhulga ühe elemendi ja teise alamhulga ühe

elemendiga.

9. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus ekspressioonivektor või täiendav

ekspressioonivektor kodeerib valitavat markerit, nt kus rakke kultiveeritakse pidevalt

tingimustes, mis soodustavad valitavat markerit tootvate rakkude kasvu, nt kus valitavaks 10

markeriks on geeniprodukt, milles peremeesrakk on puudulik, näiteks kus valitavat

markerit kodeerib transkribeering, mis kodeerib ühtlasi polüpeptiidset elementi või

nimetatud polüpeptiidse elemendi alamhulka, ning kus eelistatavalt kodeerib valitavat

markerit suurimat alamhulka kodeeriv transkribeering.

10. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus polüklonaalne valk on polüklonaalne 15

antikeha või polüklonaalse antikeha fragment; eelistatavalt, kus kõikidel polüklonaalse

antikeha elementidel on sama konstantne raske ja/või kerge ahela, eelistatavalt raske ahela

piirkond.

11. Mistahes eelnevale punktile vastav meetod, kus peremeesrakud on päristuumsed

rakud, eelistatavalt imetajarakud, nt imetajarakud, mis on valitud rühkast, kuhu kuuluvad 20

Hiina hamstri munarakud (CHO), COS rakud, BHK rakud, müeloomirakud (nt. Sp2/0

rakud, NSO, YB2/0), NIH 3T3 rakud, fibroblastsed või põlistatud inimese rakud, nagu

näiteks HeLa rakud, HEK293 rakud või PER.C6 rakud.

12. Punktile 11 vastav meetod, kus peremeesrakk annab rekombinantse transaktivaatori,

mis suudab transaktiveerida ergutava kodeeringu polüklonaalse valgu tootmiseks. 25

13. Meetod polüklonaalse valgu tootmiseks, mis hõlmab järgmist:

a) polüklonaalse rakuliini loomine, mille saamiseks on kasutatud mistahes punkti 1 kuni

12 meetodit;

b) polüklonaalse rakuliini kultiveerimine tingimustes, mis võimaldavad polüklonaalse

valgu tootmist; 30

c) polüklonaalse valgu taastamine ja võimalik puhastamine rakkudest või söötmest; ja,

lisavariandina,

EE-EP 2 152 872 B1 65

d) iga eraldiseisva elemendi olemasolu kontrollimine taastatud ja soovi korral puhastatud

polüklonaalses valgus.

14. Polüklonaalne rakuliin, mis koosneb 2 kuni n rakupopulatsioonist, kusjuures iga

populatsioon annab rekombinantse polüklonaalse valgu eraldiseisva elemendi, kus

rekombinantne polüklonaalne valk sisaldab erinevaid, kuid homoloogseid valgumolekule, 5

ning rakud sisaldavad vähemalt üht ekspressiooniskeemi, mis on integreeritud

juhuslikkuse põhimõttel genoomi nii, et integratsioonipaigad võivad polüklonaalse

rakuliini elementide vahel varieeruda.

15. Punkti 14 polüklonaalne rakuliin, kus vähemalt üks ekspressiooniskeem on

integreeritud ühte või mitmesse kromosoomi. 10

16. Punkti 14 või 15 polüklonaalne rakuliin, kus n on vähem kui 50, näiteks vähem kui 45,

näiteks vähem kui 40, näiteks vähem kui 35, näiteks vähem kui 30.

17. Mis tahes punkti 14-16 polüklonaalne rakuliin, kus rekombinantse polüklonaalse valgu

üht eraldiseisvat elementi tootvad rakud saadakse 2 või enamast kloonitud rakust ja kus

kloonitud rakkude arv on väiksem kui 50, näiteks vähem kui 20, näiteks vähem kui 15, 15

näiteks vähem kui 10.

18. Mis tahes punkti 14-17 polüklonaalne rakuliin, kus polüklonaalne valk on oligomeerne

valk, nt kus iga ekspressiooniskeem kodeerib oligomeerse valgu allüksusi, nt kus

allüksuste tootmine on samade või identsete promootorite kontrolli all.

19. Mistahes punkti 14-18 polüklonaalne rakuliin, kus ekspressiooniskeemid kodeerivad 20

valitavat markerit, kus valitav marker võidakse kodeerida transkribeeringuga, mis

kodeerib ühtlasi polüpeptiidset elementi või nimetatud polüpeptiidse elemendi allüksust.

20. Mis tahes punkti 14-19 polüklonaalne rakuliin, kus polüklonaalne valk on

polüklonaale antikeha või polüklonaalse antikeha fragment, kus eelistatavalt on kõik

polüklonaalse antikeha elemendid sama isotüübiga. 25

21. Mis tahes punkti 14-20 polüklonaalne rakuliin, kus peremeesrakud on päristuumsed

rakud, eelistatavalt imetajarakud.

22. Mis tahes punkti 14-21 polüklonaalne rakuliin, kus rakud sisaldavad stabiilselt

integreeritud ekspressiooniskeemi, kodeerides transaktivaatori, mis suudab

transaktiveerida ergutava kodeeringu polüklonaalse valgu elementide jaoks.30

EE-EP 2 152 872 B1

1/8

5

EE-EP 2 152 872 B1

2/8

EE-EP 2 152 872 B1

3/8

Fig. 4

(muudetud 230107 seguga 5

(muudetud 230207 seguga

EE-EP 2 152 872 B1

4/8

EE-EP 2 152 872 B1

5/8

EE-EP 2 152 872 B1

6/8

EE-EP 2 152 872 B1

7/8

EE-EP 2 152 872 B1

8/8

5

Documents

EE-EP 2 152 872 B1