EE-EP 1 937 281 B1

Tehnikavaldkond

Käesolev leiutis käsitleb ravimkoostisi, mis on kasutatavad ravimaks ja/või ennetamaks

haigusseisundeid, mis on seotud transientset retseptoripotentsiaali tekitava

vanilloidretseptor-1 (TRPV1) kõrge ekspressioonitaseme ja/või aktiivsusega. Teiste

haigusseisundite seas on leiutise eesmärgiks leevendada silma haigusseisundeid nagu 5

sarvkesta ebamugavustunne ja muutunud tundlikkus pärast refraktiivset operatsiooni,

kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad seisundid, silmade kuivus ja diabeetiline

retinopaatia.

Samuti pakutakse välja meetodid ja ravimkoostised ravimaks ja/või ennetamaks

karvafolliikuli ja naha ebanormaalseid seisundeid, mis on vahendatud TRPV1 kõrge 10

ekspressioonitaseme ja/või aktiivsuse poolt, nagu alopeetsia. Leiutis pakub välja RNAi

tehnoloogia kasutamise TRPV1 ekspressiooni allareguleerimiseks.

Tehnika tase

RNA interferents viitab järjestusspetsiifilisele posttranskriptsioonilisele geenivaigistuse

protsessile, mis on vahendatud väikeste interfeerivate RNA-de (small interfering RNA, 15

siRNA) poolt. Pärast selle fenomeni avastamist taimedes 1990. aastate alguses

demonstreerisid Andy Fire ja Craig Mello, et kaheahelaline RNA (double-stranded RNA,

dsRNA) inhibeeris ülimalt tõhusalt spetsiifilisel ja selektiivsel viisil geeniekspressiooni

Caenorhabditis elegans’is (Fire jt, 1998, Potent and specific genetic interference by

double stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 391:806). Esimese ahela 20

järjestus (senss-RNA) kattus sellele vastava piirkonna järjestusega märklaud-mRNA-s

(matriits-RNA). Teine ahel (antisenss-RNA) oli komplementaarne mRNA-ga. Selline

dsRNA osutus mitme suurusjärgu võrra tõhusamaks, võrreldes vastavate üheahelaliste

RNA molekulidega (eriti võrreldes antisenss-RNA-ga).

RNAi protsess käivitub, kui ensüüm DICER, mis kuulub RNaas III nukleaaside 25

perekonda, puutub kokku dsRNA-ga ning lõikab selle tükkideks, mida nimetatakse

väikesteks interfeerivateks RNA-deks (siRNA). Need RNA osad seotakse valkude

kompleksi poolt, mis kasutab nende järjestust juhisena otsimaks ja hävitamaks vastava

järjestusega RNA-sid nagu märklaud-mRNA (vt Bosher & Labouesse, 2000, RNA

interference: genetic wand and genetic watchdog. Nat Cell Biol, 2000, 2(2):E31, and 30

Akashi jt, 2001, Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant

cells. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 11(6):359).

EE-EP 1 937 281 B1 2

Katsetes kasutada RNAi-d geeniekspressiooni allareguleerimiseks selgus, et

imetajarakkudel on arenenud mitmed viirusinfektsioonide vastased kaitsemehanismid, mis

võivad selle lähenemise kasutamist takistada. Viraalse dsRNA esinemine rakus juba väga

madalal tasemel kutsub esile interferoonvastuse, põhjustades üldise ebaspetsiifilise

translatsiooni pärssimise, mis omakorda viib raku apoptoosi (Williams, 1997, Role of the 5

double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation. Biochem Soc

Trans, 25(2):509; Gil & Esteban, 2000, Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent

protein kinase (PKR): mechanism of action. Apoptosis, 5(2):107-14).

2000. aastal kirjeldati hiire ootsüüdis ja varajases embrüos 3 geeni spetsiifilist

inhibitsiooni, mis oli vahendatud dsRNA poolt. Translatsiooni aresti ning seega ka PKR 10

(proteiinkinaas R, kaheahelalise RNA poolt aktiveeritud proteiinkinaas) vastust ei

täheldatud ning embrüode areng jätkus (Wianny & Zernicka-Goetz, 2000, Specific

interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat

Cell Biol, 2(2):70). Firmas Ribopharma AG (Kulmbach, Germany) tehtud uuringud

demonstreerisid RNAi funktsionaalsust imetajarakkudes, kasutades lühikesi (20-24 15

aluspaari) dsRNA-sid lülitamaks välja geene inimrakkudes ilma akuutse faasi vastuse

tekkimiseta. Teiste uurimisrühmade poolt tehtud katsed kinnitasid neid tulemusi (Elbashir

jt, 2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev,

15(2):188; Caplen jt, 2001, Specific inhibition of gene expression by small double

stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 20

9742). Testid erinevates inimese ning hiire normaalsetes ja vähirakuliinides näitasid, et

lühikesed juuksenõelastruktuuriga RNA-d (short hairpin RNA, shRNA) on võimelised

geene vaigistama sarnase tõhususega kui vastavad siRNA-d (Paddison et al, 2002, Short

hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes

Dev, 16(8):948). Hiljuti on näidatud, et täiendav rühm väikesi RNA-sid (21-35 aluspaari) 25

võib vahendada geeniekspressiooni allareguleerimist. Need RNA-d ehk väikesed ajas

reguleeritud RNA-d (small temporally regulated RNA, stRNA) reguleerivad

geeniekspressiooni ajastatust Caenorhabditis elegans’i arengu käigus (ülevaated: RNAs: a

paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression. Bioessays, 2002, 24(2): 119-

29 ja Grosshans & Slack, 2002, Micro-RNAs: small is plentiful. J Cell Biol, 156(1):17). 30

Teadlased on RNAi-d kasutanud mitmetes süsteemides, sealhulgas Caenorhabditis

elegans’is, Drosophila’s, trüpanosoomides ja teistes selgrootutes. Mitmed uurimisrühmad

on hiljuti saavutanud spetsiifilise valgu biosünteesi pärsituse erinevates

EE-EP 1 937 281 B1 3

imetajarakuliinides (iseäranis HeLa rakkudes), näidates, et RNAi on laialdaselt rakendatav

meetod geenivaigistuseks in vitro. Nendele tulemustele tuginevalt on RNAi-st kiiresti

saanud laialdaselt tunnustatud vahend geeni funktsiooni valideerimiseks (funktsiooni

identifitseerimiseks ja funktsiooni omistamiseks kindlale geenile). Lühikesi dsRNA

oligonukleotiide kasutades võimaldab RNAi mõista ka selliste geenide funktsiooni, mis on 5

vaid osaliselt sekveneeritud.

Transientset retseptoripotentsiaali tekitava vanilloidretseptor-1 (transient receptor

potential vanilloid-1, TRPV1), mida tuntakse ka vanilloidretseptor-1 (VR-1) nime all, on

kapsaitsiinitundlik ligand-sõltuv katiooni kanal, mida kirjeldati esmakordselt 1997. aastal

(Caterina jt The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. 10

Nature. 1997 Oct 23;389(6653):816-24). TRPV1 ekspresseerub peamiselt sensoorsetel

neuronitel ning on soojuse, kapsaitsiini, prootonite ja endovanilloidide molekulaarseks

detektoriks (Caterina MJ & Julius D. The vanilloid receptor: a molecular gateway to the

pain pathway. Annu Rev Neurosci., 2001;24:487-517; Montell jt Short hairpin RNAs

(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev., 2002, 15

16(8):948-58.; Baumann TK & Martenson ME. Extracellular protons both increase the

activity and reduce the conductance of capsaicin-gated channels. J Neurosci.

2000;20:RC80).

Kui agonistid nagu kapsaitsiin ja teised tegurid nagu soojus, atsidoos, lipoksügenaasi

produktid või anandamiid aktiveerivad TRPV1, siseneb kaltsium rakku ning käivitub valu 20

signaleerimine. Kanali aktivatsioon indutseerib neuropeptiidide vabanemise tsentraalsete

ja perifeersete sensoorsete närvide terminalidest, mille tulemuseks on valutunne,

neurogeenne põletik ning mõnikord silelihaste kokkutõmme ja köha. On näidatud, et

TRPV1 on seotud valu, köha, astma ja kusepidamatusega (Jia jt, TRPV1 receptor: a target

for the treatment of pain, cough, airway disease and urinary incontinence. Drug News 25

Perspect. 2005 Apr;18(3):165-71).

Et nii TRPV1 tundlikkus kui ekspressioonitihedus on põletikuliste haigusseisundite korral

kõrgendatud (Di Marzo jt, Endovanilloid signaling in pain. Curr Opin Neurobiol. 2002

Aug;12(4):372-9), kätkeb TRPV1 ekspressiooni ja/või aktiivsuse allareguleerimine endas

paljulubavat terapeutilist strateegiat uute analgeetiliste ravimite loomiseks. Nii on 30

näidatud, et selektiivsete TRPV1 blokaatorite intraperitonaalne manustamine vähendab

keemilist ja temperatuurilist valutundlikkust ja hüperalgeesiat (Garcia-Martinez jt,

EE-EP 1 937 281 B1 4

Attenuation of thermal nociception and hyperalgesia by VR1 blockers. Proc Natl Acad Sci

USA. 2002 Feb 19;99(4):2374-9).

TRPV1 kanali funktsioon on ülesreguleeritud mitme endogeense põletikuvahendaja poolt,

mille tulemusena alaneb kanali aktivatsioonilävi. Hiljuti on näidatud, et kõrgendatud

ioontugevuse poolt põhjustatud akuutse valuga seotud käitumist ei esine hiirtes, mille 5

genoomis puudub funktsionaalne TRPV1 alleel (TRPV1-null mice), ning seda inhibeerib

jodoresiniferatoksiin, tõhus TRPV1 antagonist (Ahern jt, Extracellular cations sensitize

and gate capsaicin receptor TRPV1 modulating pain signaling. J Neurosci. 2005 May

25;25(21):5109-16). Samuti on tõestatud, et prostaglandiin E2 (PGE2) ja prostaglandiin I2

(PGI2) suurendavad või sensitiseerivad TRPV1 vastuseid vastavate retseptorite EP1 ja IP 10

kaudu (Moriyama jt, Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive

mechanism of prostaglandins. Mol Pain. 2005 Jan 17;1(1):3), näidates esmakordselt, et

PGE2 või PGI2 perifeerne notsiseptiivne toime võib ühe olulise mehanismina põhineda

TRPV1 aktiivsuse sensitiseerimisel EP1 või IP aktivatsiooni kaudu. WO 2004/042046

näitab, et VR1 vastu suunatud siRNA on kasutatav kroonilise valu, VR1 retseptoriga 15

seotud ülitundlikkuse ja VR-ga seotud põletiku, kasvajate, kusepidamatuse ja sügeluse

raviks.

Polümodaalsed notsiretseptorid on levinuimat tüüpi notsiretseptorid sarvkestas.

Farmakoloogilised tõendid näitavad, et need valuretseptorid ekspresseerivad TRPV1

retseptorit, sest vastavad kapsaitsiinile, kuumusele ja happele. Täiendavalt inaktiveerib 20

kapsaitsiin kõrgetes annustes sarvkesta polümodaalsed retseptorid kuumuse ja happe

suhtes, mõjutamata samas nende tundlikkust mehaanilistele stiimulitele. See annab alust

arvata, et sarvkesta polümodaalsete närvilõpmete TRPV1 retseptorid olid selektiivselt

inaktiveeritud. Seega on tõenöoline, et suur osa sarvkesta vigastuste poolt esile kutsutud

akuutsest valureaktsioonist ja põletikuliste ning ärrituslike protsessidega kaasnevast 25

kestvast valutundest selles koes on vahendatud TRPV1 aktivatsiooni poolt.

Samuti on hiljuti näidatud, et nii insuliin kui ka IGF-I võimendavad TRPV1-vahendatud

membraani voolu heteroloogsetes ekspressioonisüsteemides ja kultiveeritud dorsaalse

juure ganglioni neuronites (Van Buren jt, Sensitization and translocation of TRPV1 by

insulin and IGF-I. Mol Pain. 2005 Apr 27;1(1):17). Membraani voolude võimendumine 30

tuleneb nii retseptori suurenenud tundlikkusest kui ka TRPV1 translokeerumisest

tsütosoolist plasmamembraanile. IGF-1 taseme tõusu on täheldatud seerumis (Merimee jt,

Insulin-like growth factors. Studies in diabetics with and without retinopathy. N. Engl. J.

EE-EP 1 937 281 B1 5

Med., 1983; 309:527-530; Grant jt, Insulin-like growth factors in vitreous. Studies in

control and diabetic subjects with neovascularization. Diabetes, 1986; 35:416-420),

klaaskehas ja intraokulaarses vedelikus (Grant jt, 1986; Inokuchi jt, Vitreous levels of

insulin-like growth factor-I in patients with proliferative diabetic retinopathy. Curr. Eye

Res., 2001; 23:368-371) diabeetilise retinopaatiaga patsientidel. Lisaks korrelleerub IGF-I 5

tase klaaskehas isheemiaga seotud diabeetilise võrkkesta neovaskularisatsiooni esinemise

ja tõsidusega (Meyer-Schwickerath jt, Vitreous levels of the insulin-like growth factors I

and II, and the insulin-like growth factor binding proteins 2 and 3, increase in neovascular

eye disease. Studies in nondiabetic and diabetic subjects. J Clin Invest., 1993;92(6):2620-

5). Samas on IGF-I taseme tõusu päritolu retinopaatia korral vastuoluline ning endogeense 10

IGF-I ja seerumi IGF-I suhteline panus sellesse on teadmata (Ruberte jt, Increased ocular

levels of IGF-1 in transgenic mice lead to diabetes-like eye disease. J Clin Invest. 2004

Apr;113(8):1149-57). TRPV1 taseme modulatsioon võib aidata kontrollida IGF-I poolt

vahendatud diabeetilist retinopaatiat.

Olgugi, et esmalt kirjeldati TRPV1 sensoorsetes neuronites, on TRPV1 detekteeritud 15

mitmetes inimese naharakupopulatsioonides ja inimese karvafolliikuli (hair follicle, HF)

epiteliaalsetes osades, peamiselt välimises juuretupes (outer root sheath, ORS) ja karva

põhiaines (Bodo jt, A hot new twist to hair biology: involvement of vanilloid receptor-1

(VR1/TRPV1) signaling in human hair growth control. Am J Pathol. 2005

Apr;166(4):985-98). TRPV1 stimulatsioon organkultuuris ja kultiveeritud inimese ORS 20

keratinotsüütides inhibeerib proliferatsiooni, indutseerib apoptoosi, tõstab rakusisese

kaltsiumi kontsentratsiooni, ülesreguleerib tuntud endogeenseid karvakasvu inhibiitoreid

ja allareguleerib tuntud karvakasvu soodustajaid, kinnitades TRPV1 rolli inimese

karvakasvu regulatsioonis (Bodo jt, 2005).

Eeltoodud tõendid osutavad TRPV1 inhibitsioonile kui olulisele ravimeetoditele 25

silmahaiguste korral, mis on vahendatud TRPV1 ülemäärase ekspressiooni ja/või

aktiivsuse poolt, nagu ebamugavustunne ja sarvkesta muutunud tundlikkus pärast

refraktiivset operatsiooni, kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad seisundid ja silmade

kuivus. TRPV1 ja IGF-I funktsionaalne seotus viitavad TRPV1 allaregulatsiooni

olulisusele diabeetilise retinopaatia, mis on vahendatud IGF-I kõrge taseme poolt, ravis. 30

TRPV1 roll inimese karvafolliikuli kasvus ja keratinotsüütides teeb sellest olulise

ravimimärklaua, mille inhibitsioon võimaldab ravida karvafolliikuli ja naha

ebanormaalseid seisundeid nagu alopeetsia.

EE-EP 1 937 281 B1 6

Leiutise olemus

Käesolev leiutis kirjeldab TRPV1 vastu suunatud siNA kasutamist valmistamaks ravimit

vastavalt nõudluspunktile 1. Kasutamine põhineb ühe või enama TRPV1 geeni

splaissvariandi ekspressiooni allareguleerimist. Inhibitsiooni (allaregulatsiooni) võib

teostada kaheahelaliste nukleiinhappefragmentide abil, mida tuntakse väikeste 5

interfeerivate nukleiinhapete (small interfering nucleic acids, siNA) nime all, mis on

suunatud mõjutama ühe või mitme TRPV1 geeni splaissvariandi mRNA ekspressiooni.

Eelistatult on siNA-deks siRNA-d, kuid leiutis hõlmab ka modifitseeritud nukleiinhappeid

või sarnaseid keemiliselt sünteesitud üksusi.

TRPV1 retseptor sünteesitakse sarnaselt teiste membraanivalkude ja –kanalitega raku 10

sisemuses ning transporditakse seejärel raku perifeeriasse tsentrifugaalse aksonaalse

transpordi teel. Siiski pole välistatud, et TRPV1 sünteesitakse ka sensoorsete närvide

terminalides ning sisestatakse lokaalselt signaali üle kandva terminali membraani. Seega,

soovimata piirneda ühegi konkreetse teooriaga, arvatakse, et TRPV1 lokaalse sünteesi

blokeerimine spetsiifiliselt TRPV1 ekspressiooni eest vastutava geeni vaigistamiseks 15

suunatud siNA-ga võib kaasa tuua sarvkesta polümodaalsete valuretseptorite närvikiudude

inaktivatsiooni eksogeensete või endogeensete keemiliste stiimulite suhtes ning nende

vigastuste ja põletikuga seotud närviimpulsside vähenemise või lakkamise.

Esimeses aspektis käsitleb käesolev leiutis siNa kasutamist valmistamaks ravimit, mis on

näidustatud kasutamiseks meetodis ravimaks silma ja/või karvafolliikuli ebanormaalset 20

seisundit, mida iseloomustab TRPV1 suurenenud ekspressioon ja/või aktiivsus vastavalt

nõudluspunktile 1.

Käesoleva leiutise teine aspekt käsitleb TRPV1 vastu suunatud siNA ühendit, mis sisaldab

nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne nukleotiidjärjestusega SEQ ID NO: 65.

Käesoleva leiutise täiendav aspekt käsitleb ravimkoostist, mis sisaldab TRPV1 vastu 25

suunatud siNA ühendit, mis sisaldab nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne

nukleotiidjärjestusega SEQ ID NO: 65.

Leiutisele vastavalt on seisundiks ebanormaalne silma seisund nagu sarvkesta muutunud

tundlikkus pärast refraktiivset operatsiooni, kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad

seisundid, silmade kuivus, diabeetiline retinopaatia ning teised silma patoloogiad. 30

Jooniste kirjeldus

EE-EP 1 937 281 B1 7

Joonisel fig 1 on toodud alternatiivse splaissingu tulemusel tekkinud nelja TRPV1

transkripti GenBank ligipääsunumbrid.

Joonis fig 2 kujutab lühikesi DNA-fragmente märklaud-geenijärjestusest, mis on

leiutisekohase siNA eelistatud märklaudjärjestusteks.

Joonis fig 3 kujutab eelistatud leiutisekohaseid siNA molekule. 5

Joonis fig 4. 10 µl 0,1 mM kapsaitsiinilahuse tilga paikne manustamine merisigade

paremasse silma ja 10 µl steriilse isotoonilise soolalahuse manustamine merisigade

vasakusse silma. Analüüsiti kratsimis- ja pühkimisliigutusi (A), pisarate eritust (B) ja

konjunktiivset hüpereemiat (C).

Joonis fig 5. ON3 nõrgendav toime 0,1 mM paikse kapsaitsiini käitumuslikule toimele. 10

Analüüsiti kratsimis- ja pühkimisliigutusi (A), pisarate eritust (B) ja konjunktiivset

hüpereemiat (C).

Joonis fig 6. Keskmine kratsimis-/pühkimisliigutuse vähenemine kõikides uuritud

loomades, avaldatuna absoluutväärtustena (ülemine graafik) ja protsentuaalse

vähenemisena ravitud poolel võrreldes kontrollpoolega erinevatel päevadel pärast ravi. 15

Joonis fig 7. Salvestuskambri konfiguratsioon.

Leiutise üksikasjalik kirjeldus

Esimeses aspektis käsitleb leiutis siNA kasutamist valmistamaks ravimit, mis on ette

nähtud ebanormaalsete silma seisundite raviks, mida iseloomustab suurenenud TRPV1

ekspressioon ja/või aktiivsus vastavalt nõudluspunktile 1. Kasutamine võib hõlmata 20

TRPV1 ekspressiooni inhibeerimist patsiendis. Mõistet inhibitsioon kasutatakse viitamaks

ekspressiooni või aktiivsuse vähendamisele või allareguleerimisele. Eelistatult on silma

seisund valitud rühmast, millesse kuuluvad sarvkesta ebamugavustunne ja muutunud

tundlikkus pärast refraktiivset operatsiooni, kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad

seisundid, silmade kuivus, diabeetiline retinopaatia ning teised silma patoloogiad. 25

Käesolevale leiutisele vastavalt on siNA mingile geenile “suunatud”, kui see siNA

molekul näiteks vähendab või inhibeerib selektiivselt selle geeni ekspressiooni.

Siinkasutatuna hõlmab väljend “selektiivselt vähendama või inhibeerima” siNA-sid, mis

mõjutavad ühe geeni ekspressiooni. Teise võimalusena mõistetakse siNA suunamise all

konkreetsele geenile olukorda, kui siNA hübridiseerub rangetel tingimustel geeni 30

transkriptiga.

EE-EP 1 937 281 B1 8

Ühes leiutisekohases teostusvariandis on siNA-ks siRNA.

TRPV1-le vastavaid transkriptsioonivariante on identifitseeritud 4.

Neljale alternatiivse splaissingu tulemusena tekkinud TRPV1 transkriptile vastavad

GenBank ligipääsunumbrid on toodud joonisel fig 1. Eelistatult on siNA suunatud TRPV1

splaissvariandile, mis on valitud rühmast GenBank ligipääsunumbritega 5

NM_080704, NM_018727, NM_080706, NM_080705.

Valitud oligonukleotiidsed järjestused, mille vastu RNAi on suunatud vastavalt leiutise

esimesele aspektile, on toodud joonisel fig 2. Joonisel kujutatud järjestused on DNA-

järjestused, millele siNA suunatud on. Järelikult rakendab leiutis NA duplekse, mille

järjestused on toodud DNA-järjestustega komplementaarsed. Seega on leiutise esimesele 10

aspektile vastavalt siNA suunatud järjestusele, mis on valitud järjestuste SEQ ID NO 1

kuni SEQ ID NO 81 hulgast või järjestusele, mis sisaldab järjestust, mis on valitud

järjestuste SEQ ID NO 1 kuni SEQ ID NO 81 hulgast. Järelikult on siNA

komplementaarne järjestusega, mis on valitud järjestuste SEQ ID NO 1 kuni SEQ ID NO

81 hulgast või järjestusega, mis sisaldab järjestusi, mis on valitud järjestuste SEQ ID NO 1 15

kuni SEQ ID NO 81 hulgast.

Vastavalt käesolevale leiutisele võib kasutada mitmeid erinevaid siNA-sid. Ühes

teostusvariandis võivad erinevad siNA-d olla suunatud ühesuguste mRNA-de vastu, teises

teostuvariandis võivad need olla suunatud erinevate mRNA-de vastu.

Joonisel fig 2 toodud järjestused on mittepiiravad. Leiutisele vastavalt ei pea märklaud-20

DNA-le tingimata eelnema AA või AC. Samuti võib märklaud-DNA koosneda joonisel

fig 2 toodud järjestustest, mis külgnevad mistahes pideva järjestusega.

Samuti kirjeldab käesolev leiutis siNA ühendeid, mis on suunatud TRPV1-le ning mis

sisaldavad nukleotiidjärjestust, mis on valitud joonisel fig 2 toodud järjestuste SEQ ID NO

1 kuni 44 või SEQ ID NO 46 kuni 81 hulgast. 25

Samuti kirjeldatakse siNA ühendit, mis on suunatud TRPV1-le ning mis sisaldab

nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne nukleotiidjärjestusega, mis on valitud

joonisel fig 2 toodud järjestuste SEQ ID NO 1 kuni 44 või SEQ ID NO 46 kuni 81 hulgast.

Ühes teostusvariandis on eelistatud järjestuseks SEQ ID NO 65.

Samuti kirjeldatakse siNA ühendit, mis on suunatud TRPV1-le, mis sisaldab 30

nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne nukleotiidjärjestusega, mis on valitud

EE-EP 1 937 281 B1 9

järjestuste SEQ ID NO 1 kuni 44 või SEQ ID NO 46 kuni 81 hulgast, ning on ette nähtud

ravimaks haigust, mida iseloomustab TRPV1 suurenenud ekspressioon ja/või aktiivsus, ja

siNA ühendit, mis sisalab nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne

nukleotiidjärjestusele, mis on valitud järjestuste SEQ ID NO 1 kuni 44 või SEQ ID NO 46

kuni 81 hulgast. 5

Samuti kirjeldatakse ravimkoostist, mis sisaldab nukleotiidjärjestust, mis on

komplementaarne nukleotiidjärjestusega, mis on valitud järjestuste SEQ ID NO 1 kuni 44

või SEQ ID NO 46 kuni 81 hulgast.

Näitena võivad siNA molekulid sisaldada nukleotiidjärjestusi, mis on valitud rühmast

järjestustega SEQ ID NO 82 kuni 162. Näiteks võivad siNA molekulid sisaldada 10

nukleotiidjärjestusi, mis on valitud rühmast järjestustega SEQ ID NO 82 kuni 122 või 123

kuni 162.

Näitena võivad siNA molekulid sisaldada üleulatuvaid nukleotiide.

Samuti kirjeldatakse meetodit inhibeerimaks TRPV1 ekspressiooni ja/või aktiivsust ex

vivo rakkudes või koes, mis hõlmab nimetatud rakkude või koe ravi ühendiga, mis 15

sisaldab nukleotiidjärjestust, mis on komplementaarne nukleotiidjärjestusega, mis on

valitud SEQ ID NO 1 kuni 44 või SEQ ID NO 46 kuni 81 hulgast nii, et TRPV1

ekspressioon oleks inhibeeritud.

Samuti kirjeldatakse meetodit ravimaks haigust, mida iseloomustab suurenenud TRPV1

ekspressioon ja/või aktiivsus, mis hõlmab siNA manustamist inhibeerimaks TRPV1 geeni 20

ekspressiooni patsiendis, mille korral haigusseisund on valitud rühmast, millesse kuuluvad

ebanormaalne silma seisund nagu sarvkesta muutunud tundlikkus pärast refraktiivset

operatsiooni, kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad seisundid, silmade kuivus,

diabeetiline retinopaatia ja teised silma patoloogiad nagu ka karvafolliikuli ebanormaalsed

seisundid nagu alopeetsia. 25

Mõisted “ravima” või “ravi” kirjeldavad siinkasutatuna patsiendi hooldust eesmärgiga

võidelda haigusega ning hõlmavad toimeaine manustamist sümptomitega subjektidele,

näiteks sümptomite või tüsistuste avaldumise vältimiseks, s.o profülaktika eesmärgil.

- siNA-de disain.

Leiutisekohase siNA märklaudjärjestuseks valitakse lühike fragment märklaudgeeni 30

järjestusest (näiteks 19-40 nukleotiidi pikkune). Ühes teostusvariandis on siNA-ks siRNA.

EE-EP 1 937 281 B1 10

Sellistes teostusvariantides on märklaudgeeni järjestuse lühikeseks fragmendiks fragment

märklaudgeeni mRNA-st. Eelistatud teostusvariantides on kriteeriumiteks, mille alusel

järjestusfragment märklaudgeeni mRNA-st valitakse siRNA molekuli kandidaadiks, 1)

järjestus märklaudgeeni mRNA-st, mis on vähemalt 50-100 nukleotiidi kaugusel natiivse

mRNA molekuli 5’- või 3’-otsast, 2) järjestus märklaudgeeni mRNA-st, mille G/C 5

sisaldus jääb vahemikku 30 kuni 70%, eelistatumalt on ligikaudu 50%, 3) järjestus

märklaudgeeni mRNA-st, mis ei sisalda kordusjärjestusi (nagu AAA, CCC, GGG, TTT,

AAAA, CCCC, GGGG, TTTT), 4) järjestus märklaudgeeni mRNA-st, mis on mRNA

kontekstis ligipääsetav ja 5) järjestus märklaudgeeni mRNA-st, mis on ainuomane antud

märklaudgeenile. Järjestusfragment märklaudgeeni mRNA-st võib vastata ühele või 10

mitmele eelmainitud kriteeriumile. Teostusvariantides, milles fragment märklaudgeeni

mRNA-st vastab vähemale kui kõigile ülalmainitud kriteeriumitele, võib muuta natiivset

järjestust viisil, et siRNA vastaks rohkematele kriteeriumitele kui fragment märklaudgeeni

mRNA-st. Eelistatud teostusvariantides jääb siRNA G/C sisaldus alla 60% või/ega sisalda

kordusjärjestusi. 15

Praktikas sisestatakse valitud geen nukleotiidjärjestusena ennustusprogrammi, mis

arvestab optimaalsete oligonukleotiidide disainil kõigi ülalkirjeldatud muutujatega. See

programm skaneerib mistahes mRNA nukleotiidjärjestust leidmaks piirkondi, mis sobivad

siRNA-de märklauaks. Analüüsi väljundiks on hinnatud võimalike siRNA

oligonukleotiide kogu. Kõrgeimate hinnetega oligonukleotiididest sünteesitakse 20

kaheahelalised RNA oligonukleotiidid (tüüpiliselt 21 aluspaari pikkused, kuid ka teised

pikkused on võimalikud), mis valmistatakse tavaliselt keemilise sünteesi abil.

Lisaks siNA-le, mis on komplementaarne mRNA märklaudpiirkonnaga, võib leiutisele

vastavalt kasutada “kõdunenud” (degenerate) siNA järjestusi, mille märklaudadeks on

homoloogsed piirkonnad. WO2005/045037 kirjeldab siNA molekulide disaini, mis on 25

suunatud sellistele homoloogsetele järjestustele, näiteks mittekanooniliste (nagu valesti

paarduvate ja/või “loperdavate”) aluspaaride sisestamise teel, mille tulemusel saab

võimalikuks paardumine täiendavate märklaudjärjestustega. Valestipaardumiste

tuvastamine võimaldab mittekanooniliste aluspaaride (nagu valestipaardumised ja/või

“loperdavad” aluspaarid) kasutamist genereerimaks siNA molekule, mille märklauaks on 30

enam kui üks geenijärjestust. Mittepiirava näitena kasutatakse mittekanoonilisi aluspaare

nagu UU ja CC genereerimaks siNA molekule, mille märklauaks võivad olla erinevad

märklauad, mille järjestustes esineb homoloogia.

EE-EP 1 937 281 B1 11

Eelistatud teostusvariantides on leiutisekohaselt kasutatavad siNA molekulid suunatud

järjestusele, mis on valitud järjestuste SEQ ID NOS: 1-81 (joonis fig 2) hulgast.

Eelistatult on leiutisekohaselt kasutatavad siNA molekulid kaheahelalised. Ühes

teostusvariandis sisaldavad kaheahelalised siNA molekulid tömpe otsi. Teises

teostusvariandis sisaldavad kaheahelalised siNA molekulid üleulatuvaid nukleotiide 5

(näiteks 1- kuni 5-nukleotiidilised üleulatuvad otsad, eelistatult 2-nukleotiidilised

üleulatuvad otsad). Konkreetses teostusvariandis asuvad üleulatuvad otsad 3’-otsas. Teises

konkreetses teostusvariandis asuvad üleulatuvad otsad 5’-otsas. Üleulatuvates otstes

võivad esineda mistahes nukleotiidid. Ühes teostusvariandis on üleulatuva(te)ks

nukleotiidi(de)ks ribonukleiinhapped. Teises teostusvariandis on üleulatuva(te)ks 10

nukleotiidi(de)ks desoksüribonukleiinhaped. Eelistatud teostusvariandis on

üleulatuva(te)ks nukleotiidi(de)ks tümidiin(id). Teises teostusvariandis on üleulatuva(te)ks

nukleotiidi(de)ks modifitseeritud või mitteklassikalised nukleotiidid. Üleulatuva(te)l

nukleotiidi(de)l võivad olla mitteklassikalised nukleotiidide vahelised sidemed (näiteks

teised sidemed peale fosfodiestersideme). 15

Eelistatud teostusvariantides sisaldavad leiutisekohaselt kasutatavad siNA molekulid

nukleotiidjärjestusi, mis on valitud järjestuste SEQ ID NOS: 82-162 (joonis fig 3) hulgast.

Teises eelistatud teostusvariandis koosnevad leiutisekohased dsRNA-d mistahes

järjestustest SEQ ID NOS: 82-162. Samuti käsitleb leiutis siNA-de kasutamist, mis

koosnevad kuni 40 nukleotiidist ning sisaldavad nukleotiidjärjestust mistahes järjestusega 20

SEQ ID NOS: 82-162 nagu ka dsRNA-sid, mis koosnevad kuni 40 nukleotiidist ja

sisaldavad mistahes nukleotiidjärjestust SEQ ID NOS: 82-162, mis on hübridiseerunud

vastava komplementaarse järjestusega. Ühes teostusvariandis koosneb siNA 21-30

nukleotiidist ning sisaldab mistahes järjestust SEQ ID NOS: 82-162.

- siNA-de süntees. 25

Leiutisekohaselt kasutatavad siNA-d võivad olla sünteesitud mistahes erialaselt tuntud

meetodil. Eelistatult kasutatakse RNA-de keemiliseks sünteesiks sobivalt kaitstud

ribonukleosiidfosforamidiite ja konventsionaalset DNA/RNA süntesaatorit. Teise

võimalusena võib siRNA-d omandada kaubanduslikelt RNA oligonukleotiidide tootjatelt,

sealhulgas mittepiiravalt firmadelt Proligo (Hamburg, Saksamaa), Dharmacon Research 30

(Lafayette, CO, USA), Glen Research (Sterling, VA, USA), ChemGenes (Ashland, MA,

USA) ja Cruachem (Glasgow, UK), Qiagen (Saksamaa), Ambion (USA) ja Invitrogen

EE-EP 1 937 281 B1 12

(Šotimaa). Alternatiivse võimalusena võib leiutisekohaseid siNA molekule ekspresseerida

rakkudes, transfekteerides rakud vektoritega, mis sisaldavad promootori kontrolli all

soovitud järjestust, mis on siNA-le pöördkomplementaarne. Pärast ekspressiooni saab

siNA rakkudest eraldada erialaselt tuntud meetoditel.

Teostusvariantides, milles siRNA-ks on dsRNA, on vajalik üheahelaliste RNA molekulide 5

anniilingu etapp. Selleks kombineeritakse 30 µl kumbagi RNA oligonukleotiidi 50 µM

lahust 100 mM kaaliumatsetaadi, 30 mM HEPES-KOH pH 7,4 ja 2 mM

magneesiumatsetaadi lahuses. Seejärel inkubeeritakse lahust 1 minut 90 °C juures,

tsentrifuugitakse 15 sekundit ning inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures.

Teostusvariantides, milles siRNA on lühike juuksenõelastruktuuriga RNA (shRNA), võib 10

siRNA molekuli kaks ahelat olla ühendatud linkerpiirkonna vahendusel (nagu

nukleotiidne linker või mittenukleotiidne linker).

- siNA-de keemilised modifikatsioonid.

Leiutisekohaselt kasutatavad siNA-d võivad sisaldada ühte või enamat modifitseeritud

nukleotiidi ja/või mitte-fosfodiestersidet. Erialaselt hästi tuntud keemilised 15

modifikatsioonid võimaldavad suurendada siNA stabiilsust, kättesaadavust ja/või selle

vastuvõtmist rakkudesse. Erialaspetsialistid on teadlikud teist tüüpi keemilistest

modifikatsioonidest, mida võib RNA molekulidesse sisestada (ülevaateks erinevat tüüpi

modifikatsioonidest vt WO03/070744 ja WO2005/045037). Ühes teostusvariandis

kasutatakse modifikatsioone tagamaks paremat resistentsust lagundamise suhtes või 20

paremat vastuvõtmist rakkude poolt. Näidete hulka sellistest modifikatsioonidest kuuluvad

fosforotioaatsidemed nukleotiidide vahel, 2’-O-metüülribonukleotiidid (iseäranis

kaksikahelalise siRNA senss-ahelas), 2’-desoksüfluororibonukleotiidid, 2’-

desoksüribonukleotiidid, “universaalse alusega” nukleotiidid, 5-C-metüülnukleotiidid ja

inverteeritud desoksüalusega jäägi sisestamine (üldiselt vt GB2406568). 25

Teises teostusvariandis võimaldab modifikatsioonide kasutamine tõsta siRNA stabiilsust

ning suurendada selle märklaudjärjestusega seondumise tõhusust. Sellisel otstarbel

kasutatavad modifikatsioonid hõlmavad siRNA kahe komplementaarse ahela keemilist

ristsidumist, siRNA ahela 3’- või 5’-terminuse keemilist modifitseerimist, suhkrute

modifikatsioone, lämmastikaluse modifikatsioone ja/või oligonukleotiidahela selgroo 30

modifikatsioone, 2’-fluoromodifitseeritud ribonukleotiide ja 2’-desoksüribonukleotiide

(üldiselt vt rahvusvahelist patenditaotlust W02004/029212).

EE-EP 1 937 281 B1 13

Teises teostusvariandis võimaldavad modifikatsioonid suurendada või vähendada afiinsust

komplementaarsete nukleotiidide vahel märklaud-mRNA-s ja/või komplementaarses siNA

ahelas (üldiselt vt rahvusvahelist patenditaotlust WO2005/044976). Näiteks

modifitseerimata pürimidiin-nukleotiid võib olla asendatud 2-tio-, 5-alkünüül-, 5-metüül-

või 5-propünüülpürimidiiniga. Samuti võib modifitseerimata puriin-nukleotiid olla 5

asendatud 7-deasa-, 7-alküül- või 7-alkenüülpuriiniga.

Teises teostusvariandis, kui siNA-ks on kaheahelaline siRNA, on 3’-terminuse

üleulatuvad nukleotiidid asendatud desoksüribonukleotiididega (üldiselt vt Elbashir jt,

2001, Genes Dev, 15:188).

- Preparaadid ja manustamisteed. 10

Leiutisekohaselt kasutatavad siNA molekulid ja vastavad preparaadid või ravimkoostised

manustatakse toopiliselt (st paikselt) silma; manustamine on okulaarne ning toimub

näiteks silmatilkade kujul.

Näiteks võib siNA subjektile manustamiseks sisalduda toimeaine kohaletoimetamiseks

kasutatavas vehiiklis, sealhulgas liposoomides. Farmatseutiliselt vastuvõetavad 15

preparaadid võivad sisaldada kandjaid, lahusteid ning nende sooli. Nukleiinhapete

manustamine rakkudele võib toimuda erinevatel erialaspetsialistidele teada olevatel

meetoditel, sealhulgas mittepiiravalt liposoomidesse kapseldunult, ioontoforeesi teel,

teiste vehiiklite nagu biolagunevate polümeeride, hüdrogeelide, tsüklodektstriinide,

polü(laktiid-ko-glükoliidhappe) (PLGA) ja PLCA mikrokuulides või valguliste vektorite 20

abil. Teises teostusvariandis võib leiutisekohaseid nukleiinhappe molekule formuleerida

kompleksis polüetüleenimiini või selle derivaatidega nagu

polüetüleenimiinpolüetüleenglükool-N-atsetüülgalaktoosamiin (PEI-PEG-GAL) või

polüetüleenimiin-polüetüleenglükool-tri-N-atsetüülgalaktoosamiini (PEI-PEG-triGAL)

derivaatidega. 25

Leiutisekohaselt kasutatav siNA molekul võib esineda kompleksis membraani lõhkuvate

ainetega ja/või katioonsete lipiidide või abistavate lipiididega.

Siinkirjeldatud toimeaine kohaletoimetamise süsteemid hõlmavad näiteks veepõhiseid ja

mitte-veepõhiseid geele, kreeme, erinevaid emulsioone, mikroemulsioone, liposoome,

salve, vesilahuseid ja mitte-vesilahuseid, losjoone, aerosoole, süsivesinikest koosnevaid 30

baase ja pulbreid ning võivad sisaldada abiaineid nagu solubilisaatorid, permeaabluse

suurendajaid (nagu rasvhapped, rasvhapete estrid, rasvalkoholid ja aminohapped) ja

EE-EP 1 937 281 B1 14

hüdrofiilseid polümeere (nagu polükarbofiil ja polüvinüülpürolidoon). Ühes

teostusvariandis on farmatseutiliselt vastuvõetavaks kandjaks liposoom või transdermaalse

penetratsiooni võimendaja.

Siinkirjeldatud farmatseutiline preparaat esineb vormis, mis on sobiv manustamiseks,

näiteks süsteemseks või paikseks manustamiseks, manustamiseks rakule või subjektile, 5

sealhulgas inimesele. Sobiv vorm sõltub osaliselt kasutusest ning manustamisteest. Teised

tegurid on erialaselt tuntud ning hõlmavad omadusi nagu toksilisus ja ravimvormid, milles

ravimkoostise või preparaadi toime ei pääse esile.

Samuti kirjeldatakse säilitamise või manustamise eesmärgil valmistatud ravimkoostisi,

mis sisaldavad farmatseutiliselt tõhusat kogust soovitud ühendeid farmatseutiliselt 10

vastuvõetavas kandjas või lahustis. Terapeutiliseks kasutamiseks vastuvõetavad kandjad

või lahustid on erialaselt hästi tuntud. Näiteks võib kasutada säilitusaineid,

stabilisaatoreid, värvaineid ja maitseaineid. Nende hulka kuuluvad naatriumbensoaat,

sorbiinhape ja p-hüdroksübensoehappe estrid. Täiendavalt võib kasutada antioksüdante ja

suspendeerivaid aineid. 15

Farmatseutiliselt tõhus annus on annus, mis on vajalik ennetamaks või inhibeerimaks

haigusseisundi ilmnemist või ravimaks seda (leevendamaks mingil määral selle

sümptomeid, eelistatult kõiki sümptomeid). Farmatseutiliselt tõhus annus sõltub haiguse

tüübist, kasutatavast ravimkoostisest, manustamisteest, ravitava imetaja liigist, konkreetse

imetaja füüsilistest näitajatest, teistest tarvitavatest ravimitest ja teistest teguritest, mida 20

erialaspetsialistid tunnevad.

Üldiselt manustatakse toimeainet koguses 0,1 kuni 100 mg/kg kehakaalu kohta päevas.

Siinkirjeldatud preparaatide manustamine võib toimuda ühikuliste annustena, mis

sisaldavad konventsionaalseid mittetoksilisi farmatseutiliselt vastuvõetavaid kandjaid,

adjuvante ja/või vehiikleid. Samuti kirjeldab käesolev leiutis preparaate, mis esinevad 25

sobival kujul suukaudseks manustamiseks, näiteks tablettidena, lahustuvate tablettidena,

losengidena, vee- või õlipõhiste suspensioonidena, dispergeeruvate pulbrite või

graanulitena, emulsioonina, kõvade või pehmete kapslitena või siirupite või eliksiiridena.

Suukaudseks kasutamiseks näidustatud ravimkoostised on valmistatavad vastavalt

mistahes erialaselt tuntud meetodile ravimkoostiste tootmiseks ning sellised 30

ravimkoostised võivad sisaldada magustajaid, maitseaineid, värvaineid või säilitusaineid,

et tagada preparaatide korrektne välimus ning vastuvõetav maitse. Tabletid sisaldavad

EE-EP 1 937 281 B1 15

toimeainet kombinatsioonis mittetoksiliste farmatseutiliselt vastuvõetavate abiainetega,

mis sobivad tablettide valmistamiseks.

Abiaineteks võivad olla näiteks inertsed lahustid nagu kaltsiumkarbonaat,

naatriumkarbonaat, laktoos, kaltsiumfosfaat või naatriumfosfaat; granuleerivad ja

disintegreerivad ained nagu näiteks maisitärklis või algiinhape; sideained nagu näiteks 5

tärklis, želatiin või akaatsia ja libiained nagu näiteks magneesiumstearaat, steariinhape või

talk. Tabletid võivad olla katmata või kaetud tuntud meetoditel. Mõnedel juhtudel võib

katete valmistamine toimuda meetoditel, mis tingivad tableti aeglasema disintegratsiooni

ja toimeaine imendumise seedetraktis ning tagavad seega toime kestvuse pikema aja

vältel. Näiteks võib kasutada aeglustavat ainet nagu glütserüülmonostearaat või 10

glütserüüldistearaat.

Suukaudseks kasutamiseks näidustatud preparaadid võivad esineda kõvade želatiinkapslite

kujul, milles toimeaine on segatud inertse tahke lahustiga nagu näiteks kaltsiumkarbonaat,

kaltsiumfosfaat või kaoliin, või pehmete želatiinkapslitena, milles toimeaine on segatud

vee- või õlikeskkonnaga nagu maapähkliõli, vedel parafiin või oliiviõli. 15

Vesisuspensioonid sisaldavad toimeained segatuna abiainetega, mis sobivad

vesisuspensioonide valmistamiseks. Sellisteks abiaineteks on suspendeerivad ained,

näiteks naatriumkarboksümetüültselluloos, metüültselluloos,

hüdropropüülmetüültselluloos, naatriumalginaat, polüvinüülpürolidoon, tragakantkummi

ja akaatsiakummi; dispergeerivateks või märgavateks aineteks võib olla looduslik fosfatiid 20

nagu näiteks letsitiin või alküleenoksiidi kondensatsiooniproduktid rasvhapetega nagu

näiteks polüoksüetüleenstearaat või etüleenoksiidi kondensatsiooniproduktid

pikaahelaliste alifaatsete alkoholidega nagu näiteks heptadekaetüleenoksütsetonool või

etüleenoksiidi kondensatsiooniproduktid rasvhapete ja heksitooli osaliste estritega nagu

polüoksüetüleensorbitoolmonooleaat või etüleenoksiidi kondensatsiooniproduktid 25

rasvhapete ja heksitooli anhüdriidide osaliste estritega nagu näiteks

polüetüleensorbitaanmonooleaat. Vesisuspensioonid võivad sisaldada ka ühte või enamat

säilitusainet nagu etüül- või n-propüül-p-hüdroksübensoaat või ühte või enamat värvainet,

ühte või enamat maitseainet ja ühte või enamat magustajat nagu sahharoos või sahhariin.

Õlisuspensioonid võivad olla valmistatud toimeainete suspendeerimisel taimses õlis nagu 30

arahiisiõli, oliiviõli, seesamiõli või kookosõli või mineraalõli nagu vedel parafiin.

Õlisuspensioonid võivad sisaldada paksendajat nagu mesilasvaha, tahke parafiin või

EE-EP 1 937 281 B1 16

tsetüülalkohol. Magustajate ja maitseainete kasutamine võimaldab tagada suukaudsete

preparaatide vastuvõetava maitse.

Nende ravimkoostiste säilitamiseks võib neile lisada antioksüdanti nagu askorbiinhape.

Vesisuspensiooni valmistamiseks sobivates dispergeeruvates pulbrites ja graanulites

esineb toimeaine segatuna dispergeeriva või märgava ainega, suspendeeriva ainega ning 5

ühe või enama säilitusainega. Sobivate dispergeerivate või märgavate ainete näited on

toodud eespool. Samuti võivad preparaadis esineda magustajad, maitse- ja värvained.

Siinkirjeldatud ravimkoostised võivad esineda ka õli-vees emulsiooni kujul. Õlifaasiks

võib olla taimne õli, mineraalõli või nende segu. Sobivateks emulgeerivateks aineteks

võivad olla looduslikud kummid nagu akaatsiakummi või tragakantkummi, looduslikud 10

fosfatiidid nagu näiteks sojauba, letsitiin ja rasvhapete ja heksitooli estrid või osalised

estrid, anhüdriidid nagu näiteks sorbitaanmonooleaat ja nimetatud osaliste estrite

kondensatsiooniproduktid etüleenoksiidiga nagu näiteks

polüoksüetüleensorbitaanmonooleaat. Emulsioonid võivad sisaldada magustajaid ja

maitseaineid. 15

Siirupite ja eliksiiride valmistamisel võib kasutada magustajaid nagu näiteks glütserool,

propüleenglükool, sorbitool, glükoos või sahharoos. Sellised preparaadid sisaldavad ka

pehmendavat ainet, säilitusainet ning maitse- ja värvaineid. Ravimkoostis võib esineda

steriilsete süstitavate vesi- või õlisuspensioonidena.

Suspensiooni formuleerimine võib toimuda vastavalt erialaselt tuntud meetoditele, 20

kasutades ülalmainitud sobivaid dispergeerivaid või märgavaid aineid ning

suspendeerivaid aineid.

Steriilne süstitav preparaat võib olla ka steriilne süstitav lahus või suspensioon

mittetoksilises parentaalselt vastuvõetavas diluendis või lahustis, näiteks 1,3-butaandiooli

lahuses. Vastuvõetavate vehiiklite ja lahustite hulka kuuluvad vesi, Ringeri lahus ja 25

isotooniline naatriumkloriidi lahus. Täiendavalt kasutatakse tavapäraselt lahusti või

suspensioonikeskkonnana steriilseid fikseeritud õlisid. Sel eesmärgil võib kasutada

mistahes magedat fikseeritud õli, sealhulgas sünteetilisi mono- või diglütseriide. Samuti

leiavad süstelahuste valmistamisel kasutust rasvhapped nagu oleiinhape.

Siinkirjeldatud nukleiinhapete manustamine võib toimuda ka suposiitide kujul ravimi 30

rektaalseks manustamiseks. Nende ravimkoostiste valmistamine võib toimuda toimeaine

EE-EP 1 937 281 B1 17

segamisel sobiva mitteärritava abiainega, mis on tahke tavatemperatuuril, kuid vedel

rektaaltemperatuuril ning sulab seega rektumis, vabastades toimeaine. Sellised materjalid

hõlmavad kakaovõid ja polüetüleenglükoole.

Siinkirjeldatud nukleiinhapete molekulide manustamine võib toimuda parenteraalselt

steriilses kandjas. Raviaine võib vastavalt kasutatavale vehiiklile ja kontsentratsioonile 5

olla vehiiklis suspendeeritud või lahustatud. Samuti võivad vehiiklis olla lahustatud

adjuvandid nagu paiksed anesteetikumid, säilitusained ja puhverdavad ained.

On mõistetav, et iga konkreetse subjekti korral sõltub spetsiifiline annuse suurus teguritest

nagu kasutatava ühendi aktiivsus, subjekti vanus, kehakaal, üldine tervis, sugu, toitumine,

manustamise aeg, manustamistee ja eritamise kiirus, ravimikombinatsioonid ning ravitava 10

haiguse tõsidus.

Loomadele manustamisel võib ravimkoostise lisada loomasöödale või joogiveele. Sobiv

on formuleerida loomasööt ja joogivesi nii, et loom omastab terapeutiliselt sobiva koguse

ravimkoostist koos sööda ja/või joogiveega. Samuti võib olla sobiv kasutada ravimkoostist

kujul, mis võimaldab selle lisamist eelseguna söödale või joogiveele. 15

Samuti võib siinkirjeldatud nukleiinhapete molekule subjektile manustada kombnatsioonis

teiste terapeutiliste ühenditega tõstmaks üldist terapeutilist toimet. Mitmete ühendite

kasutamine ühe näidustuse raviks võib suurendada kasulikke toimeid ning vähendada

kõrvaltoimete esinemist.

Alternatiivina on võimalik teatud siinkirjeldatud siNA molekulide ekspressioon rakkudes, 20

kasutades eukarüootseid promootoreid. Vektorid, mis on võimelised ekspresseerima

soovitud siNA molekule, võib viia rakkudesse ning need võivad seal ka püsida.

Alternatiivina on võimalik kasutada vektoreid, mis tagavad nukleiinhapete molekulide

transientse ekspressiooni. Selliseid vektoreid võib vajadusel manustada korduvalt. Pärast

ekspressiooni interakteerub siNA molekul märklaud-mRNA-ga ning kutsub esile RNAi 25

vastuse. SiNA molekule ekspresseerivate vektorite kohaletoimetamine võib olla

süsteemne nagu näiteks intravenoosne või intramuskulaarne manustamine või võib

manustamine olla suunatud kindlatele organismist eemaldatud rakkudele, millele järgneb

nende rakkude tagasiviimine subjekti, või mistahes teisel viisil, mis võimaldab vektori

sisenemist soovitud märklaudrakku. 30

Eksperimentaalse töö käik

EE-EP 1 937 281 B1 18

SiNA süntees

Üheahelaliste RNA molekulidega töötades on vajalik anniilingu etapp. Ülimalt oluline on,

et käsitsemise kõik etapid toimuksid steriilsetel Rnaasi vabadel tingimustel. RNA-de

anniilimiseks tuleb oligonukleotiidid esmalt kvantifitseerida, mõõtes UV neeldumist 260

nanomeetri (nm) juures. Seejärel kasutatakse anniilimiseks Elbashir jt tööl (2001) 5

põhinevat protokolli:

• Iga RNA oligonukleotiid villitakse ja lahjendatakse kontsentratsioonini 50 µM.

• Kombineeritakse 30 µl iga RNA oligonukleotiidi lahusest ja 15 µl 5X

aniilingpuhvrit. Puhvri lõppkontsentratsioon on: 100 mM kaaliumatsetaat, 30 mM

HEPES-KOH pH 7,4, 2 mM magneesiumatsetaat. Reaktsiooni lõppmaht on 75 µl. 10

• Lahust inkubeeritakse 1 minut 90 °C juures, tsentrifuugitakse 15 sekundit ning

inkubeeritakse 1 tund 37 °C juures, seejärel toatemperatuuril. Lahust võib säilitada

-20 °C juures ning sulatada 5 korral. SiRNA dupleksi lõppkontsentratsioon on

enamasti 20 µM.

Alternatiivse võimalusenda võib juba anniilitud dsRNA osta tootjatelt. 15

Samuti võib kasutada keemiliselt modifitseeritud nukleiinhappeid. Näiteks on ülevaade

erinevat tüüpi modifikatsioonidest toodud taotluses WO03/070744, mille teave sisaldub

siin viitena. Erilist tähelepanu pööratakse selle väljaande lehekülgedele 11 kuni 21. Teisi

võimalikke modifikatsioone kirjeldatakse eespool käesolevas dokumendis. Vastava

erialaspetsialist on teadlik teist tüüpi keemilistest modifikatsioonidest, mida võib RNA 20

molekulidesse sisestada.

In vitro süsteem

TRPV1 ekspressiooni on immunoreaktiivsusmeetodil tuvastatud naha sensoorsetes

närvikiududes, nuumrakkudes, epidermaalsetes keratinotsüütides, dermaalsetes

veresoontes, karvafolliikulite juuretupe siseküljel ja infundibulumi piirkonnas, 25

diferentseerunud rasunäärme rakkudes, higinäärme juhades ning ekriinsete higinäärmete

sekretoorses osas (Stander jt, 2004). Pöördtranskriptaas polümeraasi ahelreaktsiooni ning

Western blot analüüsiga on TRPV1 detekteeritud nuumrakkudes ja inimese naha

keratinotsüütides (Stander jt, 2004). Hiljuti näidati, et ka dendriitrakud ekspresseerivad

TRPV1 (Basu & Srivastava, 2005) ning on välja töötatud neuronaalsete rakkude mudelid, 30

mis ekspresseerivad TRPV1 (Lilja & Forsby, 2004).

EE-EP 1 937 281 B1 19

SiRNA interferentsi spetsiifilisuse esmaseks testimiseks kasutatakse märklaudgeen

TRPV1 ekspresseerivaid rakukultuure.

Rakke inkubeeritakse vastavate siRNA dupleksidega ning teostatakse märklaudgeeni

ekspressiooni allaregulatsiooni analüüs. Sidumaks siRNA poolt vahendatud

geeniekspressiooni allaregulatsiooni spetsiifilise fenotüübiga kultiveeritud rakkudes, on 5

vajalik demonstreerida märklaudvalgu ekspressioonitaseme alanemist või vähemalt

demonstreerida märklaud-mRNA taseme alanemist.

Märklaudgeeni mRNA tasemeid saab kvantifitseerida reaalaja kvantitatiivsel PCR (Real-

time quantitative PCR, qRT-PCR) meetodil. Täiendavalt on valgu tase määratav mitme

erialaselt tuntud meetodiga nagu Western blot analüüs märklaua suhtes spetsiifiliste 10

antikehadega, mis võimaldab märklaudvalgu vähenemist otseselt jälgida.

SiRNA duplekside transfektsioon rakukultuurides

Erialaselt on hästi tuntud näited mitmetest meetoditest: siRNA dupleksi transfektsiooni

võib teostada katioonse lipiidi nagu RNAiFect transfektsioonireagendi (Qiagen) ja

Lipofectamine 2000 reagendi (Invitrogen) abil ning testida vaigistamist 24, 48 ja 72 tunni 15

möödumisel transfektsioonist.

Tüüpilise transfektsiooni võib teostada järgmiselt: 6-kaevuse plaadi ühe kaevu

tranfekteerimiseks kasutatakse siRNA-d lõppkontsentratsioonis 100 nM. Järgides

RNAiFect protokolli, külvatakse transfektsioonile eelneval päeval kaevu 2-4 x 105 rakku 3

ml-s sobivas kasvusöötmes, mis sisaldab DMEM-i, 10% seerumit, antibiootikume ja 20

glutamiini, ning inkubeeritakse rakke tavalistel kasvutingimustel (37 °C ja 5% CO2).

Transfektsiooni päeval peab rakkude konfluentsus olema 30-50%. 15 µl 20 µM siRNA

dupleksi (vastab lõppkontsentratsioonile 100 nM) lahjendatakse 85 µl-s EC-R puhvris,

saades lõppmahuks 100 µl ning segatakse vorteksil. Kompleksi moodustamiseks lisatakse

19 µl RNAiFect transfektsioonireagenti lahjendatud siRNA-le ning segatakse pipeteerides 25

ja vorteksi abil. Pärast 10-15 minutit inkubeerimist toatemperatuuril, mis on vajalik

transfektsioonikomplekside tekkimiseks, lisatakse kompleksid tilkhaaval rakkudele, mis

on kaetud 2,9 ml värske kasvusöötmega, mille antibiootikumisisaldus on madal. Pärast

plaatide sujuvat liigutamist tagamaks transfektsioonikomplekside ühtlast jaotumist

inkubeeritakse rakke nende normaalsetel kasvutingimustel. Järgmisel päeval kompleksid 30

eemaldatakse ning lisatakse värsket täissöödet. Geenivaigistuse jälgimiseks kogutakse

rakud 24, 48 ja 72 tundi pärast transfektsiooni. Lipofectamine 2000 reagendi protokoll on

EE-EP 1 937 281 B1 20

küllaltki sarnane. Transfektsioonile eelneval päeval külvatakse kaevu 2-4 x 105 rakku 3

ml-s sobivas kasvusöötmes, mis sisaldab DMEM-i, 10% seerumit, antibiootikume ja

glutamiini, ning inkubeeritakse rakke tavalistel kasvutingimustel (37°C ja 5% CO2).

Transfektsiooni päeval peab rakkude konfluentsus olema 30-50%.

12,5 µl 20 µM siRNA dupleksi (vastab lõppkontsentratsioonile 100 nM) lahjendatakse 5

250 µl DMEMs, saades lõppmahuks 262,5 µl ja segatakse. Samuti lahustatakse 250 µl

DMEM-s 6 µl Lipofectamine 2000 reagenti ja segatakse. Pärast 5 minutit inkubatsiooni

toatemperatuuril kombineeritakse lahjendatud oligomeer ning lahjendatud Lipofectamine

reagent ning lastakse moodustuda kompleksil, inkubeerides segu 20 minutit

toatemperatuuril. Seejärel lisatakse kompleksid tilkhaaval rakkudele, mis on kaetud 2 ml 10

värske madala antibiootikumisisaldusega kasvusöötmega, ning loksutatakse plaate edasi-

tagasi tagamaks transfektsioonikomplekside ühtlast jaotumist. Rakke inkubeeritakse nende

normaalsetel kasvutingimustel ning järgmisel päeval eemaldatakse kompleksid ning

lisatakse värsket täissöödet. Geenivaigistuse jälgimiseks kogutakse rakud 24, 48 ja 72

tundi pärast transfektsiooni. 15

Transfektsiooni efektiivsus võib sõltuda rakutüübist, passeerimiste arvust ja rakkude

konfluentsusest. Samuti on määrava tähtsusega siRNA-liposoomi komplekside

moodustumise viis (nagu tuubi ümberpööramine võrreldes vorteksi kasutamisega). Madal

transfektsiooni efektiivsus on geenivaigistuse ebaedukuse sagedaseimaks põhjuseks. Hea

transfektsiooni efektiivsuse saavutamine on oluline ning seda tuleb uurida iga uue 20

rakuliini puhul. Transfektsiooni efektiivsust on võimalik kontrollida reportergeenide

transfektsiooniga, kasutades näiteks CMV promootoriga EGFP ekspressiooni plasmiidi

(näiteks firmalt Clontech) või B-Gal ekspressiooniplasmiidi, kontrollides transfektsiooni

taset järgmisel päeval faaskontrast- ja/või fluorestsentsmikroskoopia abil.

SiRNA duplekside testimine 25

Sõltuvalt märklaudvalgu ekspressioonitasemest ja elueast (turnover) võib allareguleeritud

ekspressiooniga fenotüüp ilmneda 1 kuni 3 päeva jooksul või isegi hiljem. Juhtudel, kui

fenotüüp ei ole täheldatav, võib valgu kadumist jälgida immunofluorestsentsi või Western

blot analüüsiga.

Pärast transfektsioone eraldati DNaas I-ga eeltöödeldud rakkudest kogu RNA fraktsioon 30

ning teostati pöördtranskriptaasi reaktsioon juhusliku praimeriga. PCR amplifikatsioon

viiakse läbi spetsiifilise praimeriga, mis katab vähemalt ühte ekson-ekson üleminekut

EE-EP 1 937 281 B1 21

kontrollimaks pre-mRNA-de amplifikatsiooni. Mitte-märklaudgeeni mRNA TR/PCR

kasutatakse kontrollina. Oluline mRNA vähenemine, mis ühtib täheldamatu

märklaudvalgu vähenemisega, võib olla märk sellest, et rakus säilib suur stabiilse valgu

reserv. Alternatiivse võimalusena võib RT PCR amplifikatsiooni kasutada testimaks

mRNA vähenemist või kadumist spetsiifilisemal viisil. Reaalaja pöördtranskriptaasi PCR 5

kvantiseerib matriitsi esialgset kogust kõige spetsiifilisemal, tundlikumal ja korratavamal

viisil. Reaalaja PCR-s jälgitakse reaktsiooni käigus emiteeritava fluorestsentsi hulka kui

amplikoni tootmise indikaatorit iga PCR-i tsükli käigus Light Cycler seadme abil.

Fluorestsentssignaal tugevneb otseses vastavuses PCR-i produkti kogusega reaktsioonis.

Fluorestsentsi emissiooni salvestamine igas tsüklis võimaldab jälgida PCR-i reaktsiooni 10

eksponentsiaalset faasi, milles PCR-i produkti kogus korrelleerub märklaudmatriitsi

esialgse kogusega.

Kontrollimaks TRPV1 geeni interferentsi mustrit rakukultuurides teostatakse qRT-PCR

vastavalt tootja protokollile. Kvantitatiivses qRT-PCR reaktsioonis kasutatakse ligikaudu

250-500 ng totaalset RNA-d pöördtranskriptsiooniks, millelel järgneb PCR 15

amplifikatsioon TRPV1-spetsiifiliste praimeritega reaktsioonisegus, mis sisaldab Master

SYBR Geen I. Üldised PCR tingimused hõlmavad esmast etappi 30 minutit 91 °C juures,

millele järgneb 40 tsüklit 5 sekundit 95 °C juures, 10 sekundit 62 °C juures ja 15 sekundit

72 °C juures. Andmete normaliseerimiseks võib kasutada b-aktiini mRNA

kvantifitseerimist. Geeniekspresiooni suhteline võrdlemine toimub kõige paremini juhul, 20

kui valitud endogeense/sisemise kontrolli geeniekspressioon on kõrgem ning püsib

konstantse osakaaluna totaalses RNA-s erinevates proovides. Kasutades muutumatut

endogeenset kontrolli aktiivse võrdlusena, saab märklaud-mRNA kvantifitseerimist

normaliseerida igas reaktsioonis kasutatud totaalse RNA koguse suhtes. Light Cycler

seadme abil saadud amplifikatsioonikõveraid analüüsitakse kombinatsioonis 25

kontrollkomplektis sisalduva RNA-ga, mis on suunatud in vitro transkribeeritud tsütokiini

RNA matriitsile vastavalt tootja protokollile. Hindamaks amplifitseeritud PCR-i produkti

spetsiifilisust teostatakse sulamiskõvera analüüs. Saadud sulamiskõverad võimaldavad

eristada praimerite dimeere spetsiifilistest PCR-i produktidest.

Loomkatsed 30

SiNA molekulide TRPV1 ekspressioonitaset vaigistavat toimet in vivo saab testida

merisea sarvkesta mudelil, nagu on kirjeldanud Brock jt Tetrodotoxin-resistant impulses in

EE-EP 1 937 281 B1 22

single nociceptor nerve terminals in guinea-pig cornea. J Physiol. 1998 Oct 1;512 (Pt

1):211-7.

Üldine protseduur seisneb väikeses koguses sisalduvate testitavate siNA molekulide

instillatsioonis merisea sarvkesta pinnale. Teist silma töödeldakse vaid vehiikliga ning

seda saab kasutada kontrollina, juhul kui silmade vahel ei eksisteeri nn sümpaatia 5

fenomeni. Välistada tuleks mitmete katsete läbiviimine ühel ja samal loomal.

SiNA-ga ravitud või kontrolliks oleva merisea sarvkesta sensoorsete aksonite elektrilise

aktiivsuse rakuvälist salvestamist saab läbi viia nagu on kirjeldanud Brock jt 1998. a.

Üldiselt seatakse merisigadelt eemaldatud silmad (merisigade kaal 150-300 g, tapetud 100

mg kg-1 pentobarbitooni intraperitonaalse süstimisega) salvestuskambrisse ning valatakse 10

üle füsioloogilise soolalahusega, mille koostis on järgmine (mM): Na+, 151; K+, 47; Ca2+,

2; Mg2+, 1,2; Cl-, 144; H2PO3-, 1,3; HCO3

-, 16,3; glükoos, 9,8. Sellest lahusest juhiti läbi

gaasi koostisega 95% O2-5% CO2 (kuni pH väärtuseni 7,4) ning säilitati 31-33 °C juures.

Optiline närv ja sellega seotud laugude närvid tõmmati imitoruga varustatud

stimulatsioonielektroodi. Stiimuli parameetreid muudetakse eksperimendi käigus vastavalt 15

vajadusele (impulsi ulatus 0,1-0,5 ms, 5-30 V). Klaasist salvestuselektrood (otsa välimine

diameeter 50 µm), mis on täidetud füsioloogilise soolalahusega, asetatakse sarvkesta

epiteelile kerge imemisega. Elektriline aktiivsus salvestatakse AC võimendi (Neurolog

NL104, Digitimer Ltd, Welwyn Garden City, UK; võimendus 2000; kõrgepääsfilter seatud

0,1 Hz) vahendusel ning väljund digiteeriti 44 kHz juures ning salvestati magnetlindile, 20

kasutades PCM salvestit (A. R. Vetter Co. Inc., Rebersburg, PA, USA). Salvestusi tehakse

vaid kohtades, kus närviimpulsid on mürast selgesti eristatavad (10 µV piigist piigini, kui

madal käik filtreeritakse 3-5 kHz). Mitmetes sarvkesta piirkondades ei ole esile kutsutud

või spontaanne elektriline aktiivsus salvestatav või on signaalid analüüsimiseks liiga

väikesed. Salvestuselektroodi sisemine perfusioon saavutatakse peene plastiktoru 25

sisestamisega 200 µm kaugusele elektroodi otsast (vt Brock & Cunnane, 1995, Effects of

Ca2+ and K+ channel blockers on nerve impulses recorded from postganglionic

sympathetic nerve terminals. The Journal of Physiology 489, 389-402). MacLab

andmehõivesüsteemi (ADInstruments Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australia) kasutatakse

digiteerimaks (proovisagedused 10-20 kHz) eelnevalt lindile salvestatud 30

elektrofüsioloogilisi signaale. Enne digiteerimist filtreeritakse signaalid madalpääsfiltri

abil (piirsagedus 3-5 kHz). Järgnev analüüs teostati arvutiprogrammiga Igor Pro

(Wavemetrics, Lake Oswego, OR, USA). TRPV1 mRNA on kvantifitseeritav reaalaja

EE-EP 1 937 281 B1 23

kvantitatiivse PCR-i (qRT-PCR) abil ning valgu taseme vähenemine on otseselt jälgitav

mitmetel erialaselt tuntud meetoditel nagu Western blot analüüs märklaudvalgu suhtes

spetsiifiliste antikehadega.

TRPV1 ekspressiooni allareguleerimist siNA poolt karvafolliikulis saab jälgida järgmiste

esindavate mudelite abil, välistamata teisi erialaselt tuntud loommudeleid: 5

• In vivo hiire karvafolliikuli transfektsioon. Üldanesteesias 50-päevaste Balb/c

hiirte seljanahalt karvad taandatakse ning töödeldakse piirkonda

depilatsioonikreemi või raseerijaga (Neet; Premier Consumer Products, Inc.,

Englewood, NJ) 5 minuti vältel. Erinevatel ajahetkedel pärast depilatsiooni

manustatakse paikselt 1 cm2 seljanahale 5 ml alikvootidena mikropipeti abil 90 10

minuti jooksul 50 ml lipopleksi, mis sisaldas 50 mg lipiide ja erinevas koguses

siRNA-sid koos 10 mg pCMV-b-gal-ga. DNA kogused on sarnased eelnevalt

avaldatud uuringutele. Kontrollnahka töödeldakse segatud siRNA ning 10 mg

kontrollplasmiidi või ainult lipiidiga. Transfekteeritud nahk kogutakse 24 kuni 48

tundi pärast transfektsiooni ning värvitakse b-gal aktiivsusega. 15

• Ksenogeense siiriku mudel. 4 nädala vanuseid CB-17 Icr-scid/scid isaseid hiiri

(Charles River, Wilmington, MA) hoitakse patogeenivabadel tingimustel. Inimese

looteline peanahk (20. rasedusnädalast firmalt Advanced Bioscience Resources,

Alameda, CA) või täiskasvanu peanahk (saadud plastilise kirurgia käigus)

siirdatakse 24 tunni jooksul pärast kogumist. Siirdamisoperatsioon teostatakse 20

laminaarse õhuvooluga tõmbekapis steriilseid võtteid kasutades. Hiired

anesteseeritakse ketamiini ja ksülasiini seguga ning seejärel taandatakse karvad

seljapiirkonnas. 1x1 cm nahatükid siirdatakse sarnase suurusega pesadesse, mis on

valmistatud hiire naha eemaldamisega kuni sidekirmeni. Inimese nahasiirikud

(tavaliselt 2 hiire kohta) kinnitatakse 6-0 mitteresorbeeruva monofilamentse 25

haavaõmblusniidiga. Siirikud kaetakse vaseliini ning Tegadermiga (3M Health

Care Ltd. (St. Paul, MN)) ning steriilsete sidemetega. Sidemed eemaldatakse kahe

või kolme nädala möödudes ning siirikutel lastakse täiendavalt kaks või kolm

nädalat paraneda enne eksperimentide jätkamist.

• Inimpäritolu ksenogeensete siirikute in vivo transfektsioon. Enne transfektsiooni 30

depileeritakse ksenogeensed siirikud. Mõnesid siirikuid töödeldakse nädala jooksul

ülepäeva 0,05% retiinhappe kreemiga (Retin-A, Johnson & Johnson, Raritan, NJ).

EE-EP 1 937 281 B1 24

Transfektsiooni päeval anesteseeritakse hiired ning ksenogeenseid siirikuid

niisutatakse PBS-ga 15 minutit. Segatakse 75 mg pFx-1 lipiidi ja 30 mg pCMV-b-

gal koos või ilma individuaalsete siRNA-dega OPTI-MEM-s ning saadud segu

(kokku 75 ml) pipeteeritakse 5 ml alikvootidena paikselt siirdatud nahale ülepäeva

kolme päeva jooksul. Inimnaha transfektsiooniks kasutatakse hiire nahaga 5

võrreldes kõrgemaid annuseid DNA-d ja liposoome paksema sarvkihi tõttu, mis

võib potentsiaalselt lipopleksi absorbeerida ning takistada selle adekvaatset

kohaletoimetamist folliikulisse. Nahk kogutakse 48 tundi pärast transfektsiooni ja

testitakse b-gal aktiivsuse suhtes.

• Histokeemilised katsed. Hiire ja inimese koeproovid fikseeritakse värskelt 10

valmistatud 2% formaldehüüdi/0,2% glutaaraldehüüdi lahusega PBS-s 4 °C juures

2-4 tunni jooksul ning pestakse siis 1 tund toatemperatuuril, vahetades PBS-i

kolmel korral. Fikseeritud kude inkubeeritakse 1 mg ml-1 X-gal lahuses PBS-s

37 °C juures üleöö. Seejärel pestakse kude PBS-ga, fikseeritakse formaliinis ja

sisestatakse parafiini. 5 mm paksused lõigud vastuvärvitakse värviga nuclear fast 15

red. Samuti võib fikseeritud biopsiaid värvida spetsiifiliste antikehadega testimaks

TRPV1 ekspressiooni inhibitsiooni. Värvimine teostatakse nii nagu eelnevalt on

kirjeldatud. Mõned biopsialõigud säilitatakse RNAlater lahuses (Ambion) ning

töödeldakse RNA puhastamiseks. Totaalset RNA-d analüüsitakse, kasutades

spetsiifilisi proove/praimereid spetsiifilise interferentsi uurimiseks pärast erinevaid 20

siRNA töötlusi.

NÄITED

Näide 1

Määramaks, kas eeltöötlus merisea TRPV1 vastu suunatud siRNA-ga muutis 25

käitumuslikku vastust TRPV1 agonisti kapsaitsiini paiksele manustamisele, teostati katsed

täiskasvanud isaste merisigadega.

1 - Paikse kapsaitsiini toime.

Kahele meriseale manustati paremasse silma 10 µl tilk 0,1 mM kapsaitsiini lahust ning

vasemasse silma 10 µl steriilset isotoonilist soolalahust. 30

Paiksele manustamisele järgneva 5 minuti jooksul mõõdeti järgmisi parameetreid:

EE-EP 1 937 281 B1 25

• Pilgutamissagedus

• Aeg, mil laud on suletud

• Kratsimisliigutused (tagakäpaga) ning pühkimisliigutused (esikäpaga), mis on

suunatud ravi saanud silmadele.

Pärast selle 5-minutilise perioodi möödumist hinnati järgmisi parameetreid: 5

• Konjunktiivne hüpereemia ja silmalaugude paistetus

• Pisarate sekretsioon (Schrimeri riba hoiti 3 min alalau konjunktiivil).

Katsed teostati kell 9.00 hommikul 4 järjestikusel päeval. Mõlemasse silma manustati

vastav lahus samaaegselt ning kummagi silma parameetreid mõõdeti samuti samaaegselt 10

kahe erineva vaatleja poolt. Kõikide mõõdetud parameetrite väärtus oli kapsaitsiiniga

töödeldud silmas kõrgem võrreldes kontrolliga (soolalahusega töödeldud). Parameetriteks,

mille muutumine oli kõige järjekindlam, olid sooritatud kratsimis- ja pühkimisliigutuste

arv, hüpereemia ja lakrimatsioon.

Joonisel fig 4 võetakse kokku kahel katseloomal saadud tulemused. On ilmne, et 15

kapsaitsiini manustamine põhjustas kratsimis- ja pühkimisliigutusi, konjunktiivset

hüpereemiat ja lakrimatsiooni, mida soolalahusega töödeldud poolel ei täheldatud. Samuti

ei täheldatud järjestikustel päevade korduva manustamisega kaasnevat desensitisatsiooni.

2 - Oligonukleotiid 3 (ON3), mis vastab järjestusele SEQ ID NO 146 ning omab TdT

üleulatuvaid otsi kummaski 3'-terminuses, mõju kapsaitsiini vastusele. 20

ON3 alandavat toimet käitumusliku vastuse suhtes, mis kaasneb kapsaitsiini paikse

manustamisega, uuriti esmalt 4 meriseast koosnevas rühmas. Kaks 15 µl ON3 sisaldava

lahuse annust manustati toopiliselt paremasse silma (nn ravitud silm) kell 9.00 hommikul

päevadel 0, 1 ja 2. Kell 15.00 päevadel 1, 2, 3, 4, 7, 8 ja 9 manustati kumbagi silma 10 µl

0,1 mM kapsaitsiini lahust ning kummagi silma puhul mõõdeti käitumuslikku vastust 25

ravimile vastavalt ülalkirjeldatud meetoditele.

Nagu näidatud joonisel fig 5, põhjustas ON3 käitumusliku vastuse (kratsimis- ja

pühkimisliigutuste arv) alanemise kapsaitsiini manustamise suhtes, võrreldes loomadega,

kes ravi ei saanud. Selline vähenemine saavutati järk-järgult alates päevast 2 ning see

süvenes järgmistel päevadel. Seitse päeva pärast ravi saamist olid erinevused ON3-30

EE-EP 1 937 281 B1 26

töödeldud ja –töötlemata silmade osas veel täheldatavad. Vastandina sellele ei esinenud

pisarate eritamises silmade vahel erinevusi.

Joonis fig 6 võtab kokku kratsimis- ja pühkimisliigutuste arvu vähenemise keskmise

kõikides uuritud loomades väljendatuna absoluutväärtustena (ülemine graafik) ja

vähenemise protsendina ravitud pooles kontrollpoolega võrreldes erinevatel päevadel 5

pärast ravi.

Näide 2

Tugevalt anesteseeritud merisigade silmad eemaldati silmakoobastest ning asetati

jaotustega salvestuskambrisse. Silma valati pidevalt üle järgmise koostisega füsioloogilise

lahusega (mM): Na+, 151; K+, 4,7; Ca2+, 2; Mg2+, 1,2; Cl-, 144,5; H2PO3-, 1,3; HCO3

-, 10

16,3; glükoos, 7,8. Lahusest juhiti läbi karbogeen (95% 02, 25% CO2) kuni pH väärtuseni

7,4 ning säilitati ligikaudu 34 °C juures Peltier’ seadme abil. Üksikute sarvkesta

närvikiudude aktiivsus salvestati silmalaugude närvide kaudu silma tagumisel poolel.

Salvestamiskambri konfiguratsioon on kujutatud joonisel fig 7.

Kontrollsilmad: neuraalne aktiivsus salvestati 20 polümodaalse närvikiu korral, mis 15

tulenesid kümnest merisea silmast ning mis olid identifitseeritud nende vastuse alusel

mehaanilisele stimulatsioonile ning gaasijoale, mis sisaldas CO2 (98%). Igale närvikiule

rakendati kindlas järjestuses stiimuleid: tilk 0,1 mM kapsaitsiini lahust, millele järgnes

pesu 30 sekundit hiljem. Soe soolalahus 45 °C 1 minuti jooksul, CO2 impulsi rakendamine

30 sekundi jooksul. Iga stiimuli vahele jäeti 5-minutiline paus. Ühele närvikiule rakendati 20

3 sellist järjestust; stimulatsioonitsüklite vahele jäi 15-minutiline intervall. Vastuse

kvantifitseerimine teostati, mõõtes iga stiimuli poolt algatatud närviimpulsside arvu

stimulatsiooniperioodi jooksul.

Ravitud silmad: 5 meriseal raviti mõlemat silma 15 µl ON3 sisaldava lahusega 9.00

hommikul iga päev kolmel järjestikusel päeval. Neljandal päeval eemaldati mõlemad 25

silmad ning uuriti in vitro, nagu eespool kirjeldatud.

Nendes silmades tuvastati üheksa polümodaalset notsiretseptori kiudu. Sama

stimulatsiooniprotokolli rakendati kontrollsilmadel, st rakendati järjestikuselt kapsaitsiini,

soojust ja CO2, jättes iga stiimuli vahele 5-minutilise pausi ning korrates protokolli kolmel

korral närvikiu kohta. Vastuse kvantifitseerimine iga stiimuli suhtes näitas, et ON3-ga 30

ravitud loomade puhul olid algatatud närviimpulside arv oluliselt madalam. Vastuse

EE-EP 1 937 281 B1 27

vähenemine võrreldes kontrollsilmadega oli 60% kapsaitsiini korral, 56% kuumuse korral

ning 40% happega stimuleerimise korral.

EE-EP 1 937 281 B1 28

Patendinõudlus

1. Farmatseutiliselt tõhusa annuse TRPV1 vastu suunatud siNA kasutamine ravimi

valmistamiseks, mis on ette nähtud silma seisundite raviks, mida iseloomustab TRPV1

suurenenud ekspressioon ja/või aktiivsus, milles ravim manustatakse paikselt sarvkesta 5

pinnale.

2. Kasutamine vastavalt nõudluspunktile 1, milles manustamine toimub silmatilkade

kasutamise teel.

3. Kasutamine vastavalt nõudluspunktile 1 või 2, milles silma seisund valitakse rühmast,

kuhu kuuluvad sarvkesta ebamugavustunne ja muutunud tundlikkus pärast refraktiivset 10

operatsiooni, kontaktläätsede kasutamisega kaasnevad seisundid, silmade kuivus,

diabeetiline retinopaatia ja teised silma patoloogiad.

4. Kasutamine vastavalt mistahes eelnevale nõudluspunktile, milles siNA-ks on siRNA.

5. Kasutamine vastavalt nõudluspunktile 4, milles siRNA-ks on dsRNA või shRNA.

6. Kasutamine vastavalt mistahes eelnevale nõudluspunktile, milles siNA sisaldab 15

modifitseeritud oligonukleotiidi, milles modifikatsioon on valitud järgmiste hulgast:

nukleotiidide vahelised fosforotioaatsidemed, 2’-O-metüülribonukleotiidid, 2’-

desoksüfluororibonukleotiidid, 2’-desoksüribonukleotiidid, “universaalse alusega”

nukleotiidid, 5-C-metüülnukleotiidid, inverteeritud desoksüalusega jäägi sisestamine,

siRNA kahe komplementaarse ahela keemiline ristsidumine, siRNA ahela 3’- või 5’-20

terminuse keemiline modifitseerimine, suhkrute modifikatsioonid, lämmastikaluse

modifikatsioonid ja/või oligonukleotiidahela selgroo modifikatsioonid, 2’-

fluoromodifitseeritud ribonukleotiidid ja 2’-desoksüribonukleotiidid, modifitseerimata

pürimidiinnukleotiidi asendamine 2-tio-, 5-alkünüül-, 5-metüül- või 5-

propünüülpürimidiiniga või modifitseerimata puriinnukleotiidi asendamine 7-deasa-, 7-25

alküül- või 7-alkenüülpuriiniga.

7. Kasutamine vastavalt mistahes eelnevale nõudluspunktile, milles kasutatakse mitut

erinevat siNA-d.

8. Kasutamine vastavalt nõudluspunktile 7, milles erinevad siNA-d on suunatud sama

märklaud-mRNA vastu. 30

EE-EP 1 937 281 B1 29

9. Kasutamine vastavalt mistahes eelnevale nõudluspunktile, milles siNA on suunatud

märklaudjärjestuse vastu, mis on valitud järjestuste SEQ ID NOS 1 kuni SEQ ID NOS 81

hulgast, või sellise järjestuse vastu, mis sisaldab järjestust, mis on valitud järjestuste SEQ

ID NOS 1 kuni SEQ ID NOS 81 hulgast.

10. Kasutamine vastavalt mistahes eelnevale nõudluspunktile, milles leiutisekohased siNA 5

molekulid sisaldavad nukleotiidjärjestusi, mis on valitud rühmast SEQ ID NOS 82 kuni

SEQ ID NOS 162.

11. Kasutamine vastavalt mõudluspunktile 10, milles siNA molekulid sisaldavad 3’-

terminuses üleulatuvaid otsi.

12. TRPV1 vastu suunatud siNA kasutamiseks silma seisundite ravis, mida iseloomustab 10

TRPV1 kõrgenenud ekspressioon ja/või aktiivsus, milles siNA manustatakse paikselt

sarvkesta pinnale.

13. TRPV1 vastu suunatud siNA ühend, mis sisaldab nukleotiidjärjestust, mis on

komplementaarne nukleotiidjärjestusega SEQ ID NO: 65.

14. siNA ühend vastavalt nõudluspunktile 13, mis sisaldab nukleotiidjärjestust, mida 15

kirjeldab SEQ ID NO: 146.

15. siNA ühend vastavalt nõudluspunktile 13, mis sisaldab järjestust SEQ ID NO 146,

mille mõlemas 3’-terminuses on üleulatuvad otsad ning nendeks on dTdT.

16. siNA nagu defineeritud nõudluspunktides 13 kuni 15, milles siNA-ks on siRNA.

17. siNA vastavalt nõudluspunktile 16, milles siRNA-ks on dsRNA või shRNA. 20

18. siNA vastavalt mistahes nõudluspunktile 13 kuni 17, milles siNA sisaldab

modifitseeritud oligonukleotiidi, milles modifikatsioon on valitud järgmiste hulgast:

nukleotiidide vahelised fosforotioaatsidemed, 2’-O-metüülribonukleotiidid, 2’-

desoksüfluororibonukleotiidid, 2’-desoksüribonukleotiidid, “universaalse alusega”

nukleotiidid, 5-C-metüülnukleotiidid, inverteeritud desoksüalusega jäägi sisestamine, 25

siRNA kahe komplementaarse ahela keemiline ristsidumine, siRNA ahela 3’- või 5’-

terminuse keemiline modifitseerimine, suhkrute modifikatsioonid, lämmastikaluse

modifikatsioonid ja/või oligonukleotiidahela selgroo modifikatsioonid, 2’-

fluoromodifitseeritud ribonukleotiidid ja 2’-desoksüribonukleotiidid, modifitseerimata

pürimidiinnukleotiidi asendamine 2-tio-, 5-alkünüül-, 5-metüül- või 5-30

EE-EP 1 937 281 B1 30

propünüülpürimidiiniga või modifitseerimata puriinnukleotiidi asendamine 7-deasa-, 7-

alküül- või 7-alkenüülpuriiniga.

19. siNA nagu defineeritud mistahes nõudluspunktis 13 kuni 18 kasutamiseks ravimina.

20. siNA nagu defineeritud mistahes nõudluspunktis 13 kuni 18 farmatseutiliselt tõhusa

annuse kasutamine ravimi valmistamiseks, mis on ette nähtud kasutamiseks meetodis 5

ravimaks silma seisundeid, mida iseloomustab TRPV1 kõrgenenud ekspressioon ja/või

aktiivsus, milles siNA manustatakse paikselt sarvkesta pinnale.

21. siNA nagu defineeritud mistahes nõudluspunktis 13 kuni 18 kasutamiseks silma

seisundite ravis, mida iseloomustab TRPV1 kõrgenenud ekspressioon ja/või aktiivsus,

milles siNA manustatakse paikselt sarvkesta pinnale. 10

22. Farmatseutiline kompositsioon, mis sisaldab mistahes nõudluspunktile 13 kuni 18

vastavat ühendit.

EE-EP 1 937 281 B1

1/11

5

Ligipääsunumbrid Definitsioon

NM_080704 Transientse retseptoripotentsiaali katiooni kanal, alamperekond V,

liige 1 (TRPV1), transkriptsioonivariant 1, mRNA

NM_018727 Transientse retseptoripotentsiaali katiooni kanal, alamperekond V,

liige 1 (TRPV1), transkriptsioonivariant 2, mRNA

NM_080706 Transientse retseptoripotentsiaali katiooni kanal, alamperekond V,

liige 1 (TRPV1), transkriptsioonivariant 3, mRNA

NM_080705 Transientse retseptoripotentsiaali katiooni kanal, alamperekond V,

liige 1 (TRPV1), transkriptsioonivariant 4, mRNA

FIG 1 10 15 20 25

EE-EP 1 937 281 B1

2/11

5

EE-EP 1 937 281 B1

3/11

EE-EP 1 937 281 B1

4/11

EE-EP 1 937 281 B1

5/11

5

EE-EP 1 937 281 B1

6/11

EE-EP 1 937 281 B1

7/11

EE-EP 1 937 281 B1

8/11

EE-EP 1 937 281 B1

9/11

FIG 5

EE-EP 1 937 281 B1

10/11

EE-EP 1 937 281 B1

11/11

5