·344· 《实用器官移植电子杂志》  2018 年 9 月第 6 卷第 5 期  Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， September 2018，Vol.6，No.5

·述评·

异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立

刘琪帅 1，2，李小平 1，王可品 1，葛维凯 1，2，赖良学 1（1. 中国科学院广州生物医药与

健康研究院再生生物学重点实验室，广东 广州 510530；2. 中国科学院大学存济学院，

北京 100049）

    DOI：10.3969/j.issn.2095-5332.2018.05.002

    基金项目：广东省省级科技计划项目（2014B020225003）

    通讯作者：赖良学，Email：lai_liangxue@gibh.ac.cn

随着临床上器官衰竭及功能缺陷等疾病的日益

增多，器官移植一直是医生及科学家们努力尝试解

决的问题，包括肝脏、肾脏、心脏等重要器官的移

植和重建，因此合适的移植供体就显得尤为重要。

由于人与人之间移植供体资源匮乏，且找到同型合

适匹配的脏器来源更为稀缺，异种器官移植就成为

解决供体来源最重要的方法。由于猪的器官大小、

解剖结构、生理代谢和免疫系统等与人类非常相似，

因此被认为是最理想的异种器官移植供体。相比

于同种器官移植， 异种器官移植存在的障碍更多， 

包括更为复杂的免疫排斥反应、内源性逆转录病毒

感染、异种功能蛋白在人体发挥的功能及安全性问

题等。从目前的研究进展来看，世界上大部分异种

器官移植实验室特别关注前两种障碍，因此构建出

数十种基因修饰猪模型用于研究。但对于异种功能蛋

白在人体的功能及安全性问题，目前还很少涉及。本

实验室是最早进行猪功能蛋白人源化研究的实验室，

在此领域也取得了一定的进展，本文将对异种移植

相关功能蛋白人源化的基因修饰猪的建立进行综述。 

1 胰岛素人源化点突变基因修饰猪

    1 型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，临床 

上的治疗方法是胰岛素注射或胰岛移植。目前， 

胰岛素注射是 1 型糖尿病主要的临床治疗方法， 

但存在很多问题 ：① 胰岛素用量难以精确控制，

血糖波动幅度较大，胰岛素注射后可能会出现低

血糖昏迷或引起其他一些相关并发症 ；② 长期注

射胰岛素易引起患者皮下结节，增加后期注射难

度 ；③ 1 型糖尿病患者需终身注射胰岛素，治标 

不治本，患者需承受巨大的身体痛苦和经济压力。 

除了胰岛素注射外，不断在尝试新的治疗方法， 

其中胰岛移植被认为是最有希望代替胰岛素注射成

为 1 型糖尿病临床治疗的方法。但胰岛供体的短缺

极大地限制了胰岛移植的临床应用，一些课题组利

用猪胰岛进行异种胰岛移植治疗 1 型糖尿病患者，

如 Elliott 等［1］将猪胰岛移植到 1 型糖尿病患者体

内，可显著降低患者血糖水平，移植后九年半仍能

发现腹膜组织中存在大量具有分泌功能的猪胰岛细 

胞。在中国，中南大学湘雅三医院王维博士科研团

队在国际上首次建立了移植供体培养 - 猪胰岛提

取 - 临床应用的完整技术体系，取得了目前世界

上最佳异种胰岛移植疗效，基本达到与移植人体胰

岛相似的效果［2］。

    尽管猪胰岛素与人胰岛素非常相似，只存在一

个氨基酸的差异（B 链的 30 位上，人胰岛素为苏

氨酸，而猪为丙氨酸）［3］，但是在使用猪胰岛素临

床治疗人类 1 型糖尿病时发现，猪胰岛素存在免

疫原性较高、生物活性低、吸收速率慢等问题［4］。

2016 年，中科院广州生物医药与健康研究院赖良学

研究员实验组将 TALENs 及 CRISPR 技术与单链寡核

苷酸（ssODNs）结合，建立了猪基因组无痕定点编

辑技术，利用该技术在体细胞中将猪胰岛素基因编

码 B 链第 30 位丙氨酸的密码子 GCC 修改为编码苏

氨酸的 ACG，并获得了纯合子细胞株。同时，研究 

·345·《实用器官移植电子杂志》  2018 年 9 月第 6 卷第 5 期  Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， September 2018，Vol.6，No.5

人员利用该细胞株作为核供体，通过体细胞核移植

技术成功构建了人源化胰岛素克隆猪，利用高分辨

率液相色谱串联质谱仪检测证实，从该基因修饰猪

胰腺中提取的胰岛素完全为人胰岛素，而不含猪胰

岛素，成功获得了能产生人胰岛素的基因修饰猪［5］。

该研究获得的人源化胰岛素基因修饰猪将为糖尿病

的治疗提供人胰岛素，同时也将为临床异种胰岛移

植治疗提供更为理想的供体来源。

2 人源化血清白蛋白（humanized serum albumin，

HSA）基因修饰猪

    血清白蛋白是由肝脏合成的 585 个氨基酸组成

的单链、非糖基化蛋白质，占肝脏合成蛋白总量的

25％和分泌蛋白总量的 50％，在血浆中含量也极为

丰富，约占血浆总蛋白含量的 60%［6］。血清白蛋白

在体内起着维持血浆胶体渗透压、营养运输、抗凝

血、清除自由基和保护其他重要生物物质的作用［7］。

猪血清白蛋白与人血清白蛋白氨基酸序列同源性为

76%，在结构和功能上存在一些差异，如果完全按

照猪血清白蛋白作为临床上的替代物可能会造成一

些未知的不良反应，其安全性不能保障。为了提供

更为理想的异种肝脏移植供体，不但需要解决免疫

排斥反应，还需要对猪血清白蛋白基因进行人源化。

2015 年，第三军医大学魏泓教授和军事医学科学

院张普民教授课题组通过受精卵注射 CRISPR/Cas9

和 DNA 打靶载体将人血清白蛋白 cDNA 序列插入到

巴马小型猪白蛋白基因位点，获得了纯合的 HSA 巴

马猪，但是人血清白蛋白在血清内的表达量也仅仅

是人血清的 1/30［8］。这样通过受精卵注射的方法

获得的后代多为嵌合体，特别是在肝脏组织，致使

许多含有人血清白蛋白基因的仔猪血清内根本检测

不到人血清白蛋白的表达。2014 年，本实验室采

用体细胞基因打靶和体细胞克隆技术，将人血清白

蛋白 cDNA 定点整合到猪白蛋白基因内源性启动子

下游，将猪的白蛋白基因替换为人白蛋白基因，获

得了世界上第一头 HSA 基因修饰杂合子猪，经过两

年多的繁育，目前我们成功获得了纯合子 HSA 基因

修饰猪，在基因组、mRNA 以及蛋白质三个水平对

人血清白蛋白和猪血清白蛋白进行了全面分析，结

果显示我们获得的纯合子人源化血清白蛋白基因

修饰猪完全表达人血清白蛋白，没有猪源血清白

蛋白的遗漏。目前我们已经获得 40 头纯合子 HSA

基因修饰猪，100 头杂合子 HSA 基因修饰猪。对 

50 天龄的纯合子 HSA 基因修饰猪进行了全面的血

液生化检测，结果显示其血清中人血清白蛋白的含

量为 16.2 g/L。获得的人源化血清白蛋白基因修饰

克隆猪不仅可以为临床上大量提供人血清白蛋白，

而且还可以为临床异种肝脏移植提供更为理想的供

体来源。

3 人源化凝血因子基因修饰猪

    目前将 α-1，3- 半乳糖基转移酶（α-1，

3-galactosyltransferase，GGTA1）功能缺失的猪器官

作为供体移植到非人灵长类动物上，异种肾脏移植

最长存活时间为 83 天［9］，异种心脏移植最长存活

时间为 179 天［10-11］，而异种肝脏移植的移植物最

长存活时间仅为 9 天［12］，很多情况下只存活几个

小时。与其他实体器官（如肾脏和心脏）移植相

比，异种肝脏移植后不仅存在超急性排斥反应、急

性排斥反应和慢性排斥反应等障碍，还存在凝血功

能调节障碍。凝血功能调节障碍中猪的凝血调节分

子与灵长类凝血系统不兼容相关。因此，将猪的凝

血调节因子人源化，解决异种间凝血功能调节障碍， 

是当前异种肝脏移植研究的重点和热点问题［13］。

    凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组

分，按其被发现的先后次序，世界卫生组织为其用

罗马数字统一命名，有凝血因子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、

Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ、   等。目前我们正在进

行凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅶ和Ⅷ人源化，构

建完全表达人凝血因子的基因修饰克隆猪模型。此

模型不但可以为临床上提供人凝血因子，也可以解

决异种间凝血功能调节障碍，为临床异种肝脏移植

提供理想的肝脏供体。另外，将凝血因子人源化猪

和血清白蛋白人源化猪杂交，获得人源化程度更高

的基因修饰猪模型，为异种肝脏移植提供更理想的

肝脏供体。

4 人源化免疫系统基因修饰猪

异种器官移植所面临最大的问题就是免疫排

ⅫⅠ

·346· 《实用器官移植电子杂志》  2018 年 9 月第 6 卷第 5 期  Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， September 2018，Vol.6，No.5

斥的存在。通过对猪免疫系统的发育和免疫应答

发生机制的研究发现，其免疫系统与人类更为相 

似［14-15］，免疫相关基因与人类同源比例很高［16］，

被认为是研究人类免疫与疾病的良好模型。通过

转基因的方式获得将人免疫调节机制相关的补体调

节蛋白基因转入猪来获得对异种移植有利的模型猪

已经被很多实验室构建，如将 CD46［17］、CD47［18］、

CD55［19］等补体调节蛋白基因转入小型猪获得的转

基因小猪已经在肝脏移植方面获得了一定的成果。

另外，Miwa 等［20］将人的血栓调节蛋白 TM 基因转

入猪的动脉内皮细胞，并发现其产生大量的蛋白 C，

其含量与人动脉内皮细胞相近，这表明猪体内表达

人的 TM 基因对于解决异种移植后的免疫系统凝血

功能调节具有很好的作用。

    在肾脏异种器官移植的免疫系统中，研究人员

将人的 CD39 基因转到 GTKO（GGTA1 基因敲除猪）

的小猪获得肾脏移植的模型，CD39 是一种重要的

外核酸酶，在抗血栓的形成和抑制炎症反应方面起

着重要的作用。Spiezia 等［21］研究人员也获得转

人的衰变加速因子（DAF）/Gal 小型猪、转人 DAF/

GTKO 小型猪和人的 CD39/CD55/CD59/ 岩藻糖基转

移酶 /GTKO 小型猪［22］，以此在提高抗免疫排斥方

面的异种移植提供更多的猪模型。2014 年，Lutz

等［23］通过锌指核酸酶 ZFN 技术成功获得 GGTA1

和 CMP-N- 乙酰神经氨酸羟化酶（CMP-N-acetyl 

neuraminic  acid  hydroxylase，CMAH） 双 敲 的 基

因编辑猪。另外通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术将

GGTA1、CMAH 和 β-1，4-N- 乙酰半乳糖胺基转移

酶（β-1,4-N-  acetylgalactoaminotransferase，

B4GalNT2）三基因同时修饰的猪模型也被相关

实验室获得［24］。细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原蛋

白 4（cytotoxic  T  lymphocyte  related  antigen 

protein 4，CTLA4-Ig） 是一个 T 细胞激活的抑制

剂，可与 B7 分子结合，阻断 CD28/B37 正性共刺激

信号通路，诱导 T 细胞免疫无反应。通过转基因技

术获得 CTLA4-Ig 基因编辑猪能更好的为异种器官

移植提供很好的大动物疾病模型。2015 年赖良学

研究员实验室通过转基因的方式获得 CTLA4-Ig 转

基因猪，并把猪的皮肤移植到大鼠上，发现皮肤细

胞能长时间存活并没有免疫排斥的现象［25］。

    免疫缺陷猪的成功构建也为异种移植中人源化

免疫系统的研究提供了更进一步的模型。2011 年，

Mendicino 等［26］就利用传统同源重组基因打靶技术

将猪免疫球蛋白重链 J 片段基因敲除，所获得的基

因敲除猪体内没有成熟的 B 细胞，也无法产生抗体。 

Suzukid 等［27］和 Watanabe 等［28］前后报道了通过

敲除白介素 2 受体 γ 亚基基因获得基因敲除猪，

由于该基因位于 X 染色体上，所以纯合敲除后小猪

胸腺发育不完全，且表现出明显的免疫缺陷症状。

另外，2014 年，包括本实验室在内的两个实验室

利用 TALEN 介导的基因靶向修饰技术相继获得了

重组激活基因 （recombination  activating gene， 

RAG）敲除猪［29-30］。我们对 RAG1 或 RAG2 （RAG1 

or  RAG2， RAG1/2）纯合敲除猪分别进行了分析，

与对照的野生型猪相比，RAG 基因敲除猪的胸腺严

重发育不全，体积变得极小或消失 ；脾脏变薄，组

织切片观察，没有明显的淋巴细胞聚集区 ；外周

血、胸腺、骨髓和脾脏中未发现成熟的 T 细胞和 

B 细胞，V（D）J 重组也消失。RAG 基因敲除猪呈

现明显的重症联合免疫缺陷表型［30］。在肝脏异种

移植方面，研究人员利用嵌合腺相关病毒 DJ 血清

型（AAV-DJ）和同源重组技术靶向破坏猪富马酰

乙酰乙酸水解酶的基因（FAH），获得了杂合的 FAH

基因敲除（FAH+/-）猪［31］，并在 2014 年通过杂

合 FAH 基因敲除的猪配种的方式获得了纯合 FAH 基

因敲除的猪［32］，通过低剂量的 NTBC 给药缓解急

性肝衰的情况下，FAH-/- 猪表现出肝纤维化及门

静脉高压，可以成功模拟人 HT1 疾病的各种表征。 

如果将免疫缺陷猪和肝脏缺陷猪相结合，将人的肝

细胞移植到这种双器官缺陷猪体内，有望从猪体内

获得可用于药物测试的人肝细胞。所以目前最有效

的解决方法就是对供体猪进行基因修饰，降低免疫

排斥反应， 加强对人源化的免疫系统基因的修饰，

如补体调节蛋白和抗凝血基因，同时又不会影响猪

器官的发育与功能，通过异种移植人类的间充质干

细胞或造血干细胞让免疫缺陷猪产生人源化的抗

·347·《实用器官移植电子杂志》  2018 年 9 月第 6 卷第 5 期  Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， September 2018，Vol.6，No.5

体，进而为异种移植的免疫缺陷病进行更好的临床

前动物模型的治疗提供依据。

    综上所述，与异种移植相关的功能蛋白人源化

基因修饰猪的构建不仅限于在肝脏、胰岛、免疫等

方面的基因修饰，目前取得阶段性的成果也只是为

后续在其他组织器官的人源化改造做更好的铺垫，

未来在肾脏发育、心脏功能重建、血液系统抗体

人源化等方面也会更好地促进人源化大动物模型的

建立。例如肾脏缺陷型基因修饰猪的人源化构建、 

心肌细胞再生的人源化基因修饰猪的培育等方面，

加以干细胞生物学的组织器官再生作用，通过移植

干细胞让器官缺陷猪获得人源化的器官再生，使得

异种移植的基因修饰猪在发育生物学和干细胞生物

学领域发挥更大的作用。

参考文献

［1］ Elliott RB，Escobar L，Tan PL， et al. Live encapsulated

porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after

xenotransplantation［J］. Xenotransplantation， 2007，14（2）：

157-161.

［2］ Wang W, Mo Z, Ye B， et al. A clinical trial of xenotransplantation

of neonatal pig islets for diabetic patients［J］. Zhong Nan Da Xue

Xue Bao Yi Xue Ban， 2011，36（12）：1134-1140.

［3］ Sonnenberg GE，Berger M. Human insulin ： much ado about one

amino acid［J］. Diabetologia， 1983，25（6）：457-459.

［4］ Clark AJ，Adeniyi-Jones RO，Knight G，et al. Biosynthetic human

insulin in the treatment of diabetes. A double-blind crossover trial

in established diabetic patients［J］. Lancet，1982，2（8294）：

354-357.

［5］ Yang Y, Wang K, Wu H， et al. Genetically humanized pigs

exclusively expressing human insulin are generated through custom

endonuclease-mediated seamless engineering［J］. J Mol Cell

Biol，2016，8（2）：174-177.

［6］ Mendez CM， McClain CJ，Marsano LS. Albumin therapy in

clinical practice［J］. Nutr Clin Pract，2005，20（3）：314-320.

［7］ Aramwit P， Kasettratat N. Evaluation of serum albumin utilization

in inpatient at a private hospital in Bangkok［J］. Yakugaku

Zasshi，2004，124（9）：631-634.

［8］ Peng J, Wang Y, Jiang J， et al. Production of human albumin in

pigs through CRISPR/Cas9-mediated knockin of human cDNA into

swine albumin locus in the zygotes［J］. Sci Rep，2015，5：16705.

［9］ Yamada K， Yazawa K， Shimizu A， et al. Marked prolongation

of porcine renal xenograft survival in baboons through the use of

alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout donors and the

cotransplantation of vascularized thymic tissue［J］. Nat Med，

2005，11（1）：32-34.

［10］ Tseng YL，Kuwaki K，Dor FJ，et al. alpha1，3-Galactosyltransferase

gene-knockout pig heart transplantation in baboons with survival

approaching 6 months［J］. Transplantation，2005，80（10）：

1493-1500.

［11］ Kuwaki K，Tseng YL，Dor FJ， et al. Heart transplantation in

baboons using alpha1，3-galactosyltransferase gene-knockout

pigs as donors ： initial experience［J］. Nat Med，2005，11（1）：

29-31.

［12］ Kim K， Schuetz C， Elias N， et al. Up to 9-day survival and

control of thrombocytopenia following alpha1，3-galactosyl

transferase knockout swine liver xenotransplantation in

baboons［J］. Xenotransplantation，2012，19（4）：256-264.

［13］ Ekser B， Burlak C， Waldman JP， et al.， Immunobiology of liver

xenotransplantation［J］. Expert Rev Clin Immunol， 2012，8（7）：

621-634.

［14］ Facci MR, Auray G, Buchanan R， et al. A comparison between

isolated blood dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells

in pigs［J］. Immunology，2010，129（3）：396-405.

［15］ Mair KH， Sedlak C， Käser T， et al. The porcine innate immune

system ： An update［J］. Dev Comp Immunol，2014，45（2）：

321-343.

［16］ Dawson HD， Loveland JE， Pascal G， et al. Structural and

functional annotation of the porcine immunome［J］. Bmc

Genomics，2013，14：332.

［17］ Loveland BE， Milland J， Kyriakou P， et al. Characterization of

a CD46 transgenic pig and protection of transgenic kidneys against

hyperacute rejection in non-immunosuppressed baboons［J］.

Xenotransplantation，2004，11（2）：171-183.

［18］ Tena A， Vallabhajosyula P， Hawley RJ， et al. Quantification

of baboon thymopoiesis in porcine thymokidney xenografts by

the signal-joining T-cell receptor excision circle assay［J］.

Transplantation，2011，91（6）：639-644.

［19］ Cozzi E， White DJ. The generation of transgenic pigs as potential

organ donors for humans［J］. Nat Med， 1995，1（9）： 964-966.

［20］ Miwa Y， Yamamoto K， Onishi A， et al. Potential value of human

thrombomodulin and DAF expression for coagulation control in

pig-to-human xenotransplantation［J］. Xenotransplantation，

2010，17（1）：26-37.

［21］ Spiezia L， Boldrin M， Radu C， et al. Thromboelastographic

evaluation of coagulative profiles in pig-to-monkey kidney

xenotransplantation［J］. Xenotransplantation，2013，20（2）：

89-99.

·348· 《实用器官移植电子杂志》  2018 年 9 月第 6 卷第 5 期  Prac J Organ Transplant（Electronic Version）， September 2018，Vol.6，No.5

刘琪帅，李小平，王可品，葛维凯，赖良学 . 异种移植相关功能蛋白人源化基因修饰猪模型的建立［J/CD］. 实用器官移植电子

杂志，2018，6（5）：344-348.

［22］ Le Bas-Bernardet S，Tillou X，Poirier N， et al. Xenotransplantation

of galactosyl-transferase knockout， CD55， CD59， CD39， and

fucosyl-transferase transgenic pig kidneys into baboons［J］.

Transplant Proc，2011，43（9）：3426-3430.

［23］ Lutz AJ， Li P, Estrada JL， Sidner RA， et al. Double knockout pigs

deficient in N-glycolylneuraminic acid and galactose alpha-1，

3-galactose reduce the humoral barrier to xenotransplantation［J］ .

Xenotransplantation，2013，20（1）：27-35.

［24］ Estrada JL， Martens G， Li P， et al. Evaluation of human and

non-human primate antibody binding to pig cells lacking GGTA1/

CMAH/beta4GalNT2 genes［J］. Xenotransplantation， 2015，

22（3）：194-202.

［25］ Wang Y， Yang HQ， Jiang W， et al. Transgenic expression of

human cytoxic T-lymphocyte associated antigen4-immunoglobulin

（hCTLA4Ig） by porcine skin for xenogeneic skin grafting［J］.

Transgenic Res， 2015，24（2）：199-211.

［26］ Mendicino M， Ramsoondar J， Phelps C， et al. Generation of

antibody- and B cell-deficient pigs by targeted disruption of the

J-region gene segment of the heavy chain locus［J］. Transgenic

Research，2011，20（3）： 625-641.

［27］ Suzuki S，Iwamoto M， Saito Y， et al. Il2rg Gene-Targeted severe

combined immunodeficiency pigs［J］. Cell Stem Cell，2012，

10（6）：753-758.

［28］ Watanabe M， Nakano K， Matsunari H， et al.， Generation of

interleukin-2 receptor gamma gene knockout pigs from somatic

cells genetically modified by zinc finger nuclease-encoding

mRNA［J］. Plos One， 2013，8（10）：e76478.

［29］ Lee K， Kwon DN， Ezashi T， et al. Engraftment of human iPS cells

and allogeneic porcine cells into pigs with inactivated RAG2 and

accompanying severe combined immunodeficiency［J］. Proc Natl

Acad Sci U S A，2014，111（20）：7260-7265.

［30］ Huang J， Guo X， Fan N， et al.， RAG1/2 knockout pigs with

severe combined immunodeficiency ［J］. J Immunol，2014，

193（3）：1496-1503.

［31］ Hickey RD， Lillegard JB， Fisher JE， et al. Efficient production of

Fah-null heterozygote pigs by chimeric adeno-associated virus-

mediated gene knockout and somatic cell nuclear transfer［J］.

Hepatology， 2011，54（4）： 1351-1359.

［32］ Hickey RD， Mao SA， Glorioso J， et al. Fumarylacetoacetate

hydrolase deficient pigs are a novel large animal model of metabolic

liver disease［J］. Stem Cell Res，2014，13（1）：144-153.

（收稿日期：2018-06-15）

·国外医学之窗·猪内源性反转录病毒的全基因组失活

可供移植的器官短缺是治疗器官衰竭的主要障碍。尽管猪器官被认为是有望应用的，但对于猪内源性

反转录病毒（porcine endogenous retroviruses， PERVs）向人类传播的担忧阻碍了其应用。 本文作者描述了

如何清除猪肾上皮细胞系（PK15）中的所有 PERVs。首先确定 PK15 PERV 拷贝数为 62 ；使用 CRISPR-Cas9 技术，作者破坏了 PERV pol 基因的所有拷贝，并证明了使用该基因工程细胞后，PERV 向人类细

胞的传播减少超过 1 000 倍。作者的研究表明 CRISPR-Cas9 技术基因编辑的多重性可达 62，同时证明了

PERVs 可被灭活、为猪 - 人异种移植的临床应用提供了可能性。

郑卫萍，编译自 Science，2015，350（6264）：1101-1104.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26456528