ED2 - Estudo Dirigido

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Bioquímica Médica

Disciplina: Bioquímica Ff I

Docente: Francisco Prosdocimi

Discentes: Carine Alves Jourdan

Eliane Paiva dos Santos

Letícia Godinho de Menezes

Louise Paloma Luz Alves

Vinicius Alves Moura

Conteúdo: ED2 – Estudo dirigido

Rio de Janeiro 2.2012

ED2 – Estudo Dirigido

1- As células vivas possuem biomoléculas altamente especializadas em determinadas funções celulares específicas.

a) Quais as funções celulares principais do DNA, do RNA e das proteínas?

DNA: É o material genético de todos os organismos celulares. Este material genético é responsável pela transmissão de características hereditárias entre os seres vivos e pelo transporte da informação necessária para dirigir a síntese de proteínas e sua replicação.

RNA: A função do RNA é produzir proteínas para exercer determinadas funções no organismo, basicamente o RNA é o “mensageiro” da informação genética presente no DNA. Ou seja, a informação genética contida no DNA codifica certa proteína, mas é o RNA que a partir do DNA vai fazer com que seja possível a realização desse processo. Além das funções de mensageiro entre DNA e os ribossomos, formador dos ribossomos, e transportador de aminoácidos, os RNA’s podem ainda desempenhar a função de catálise e de regulação gênica.

Proteínas: São macromoléculas compostas por polímeros de aminoácidos extremamente importantes para o funcionamento de um organismo. Elas atuam na construção de novos tecidos; atuam no transporte de substâncias, como o oxigênio; atuam no sistema de defesa do organismo, neutralizando vírus e bactérias e outros corpos estranhos (Anticorpos são compostos por proteínas); atuam na catalisação de reações químicas, como as enzimas; atuam na regulação de hormônios. As proteínas encontradas na membrana plasmática atuam como receptoras, emitindo sinais para que a célula possa desempenhar suas funções vitais.

b) Por que o DNA não faz tudo sozinho, já que ele contém as informações e “comanda” todo o metabolismo celular? Ou seja, por que ele precisa transformar suas informações em moléculas de proteínas?

Embora o DNA seja responsável pela existência da vida, isoladamente ele é inanimado, ou seja, não é reativo e é quimicamente inerte. O seu funcionamento depende de enzimas especiais que copiam suas mensagens biológicas e as transferem para moléculas muito mais ágeis conhecidas por RNA mensageiros.

2- O DNA é um polímero extremamente comprido que deve ser compactado para caber dentro do núcleo celular.

a) Como acontece a compactação do DNA no núcleo?

b) O que é um nucleossomo?

c) Quais são os diferentes graus de compactação do DNA dentro do núcleo?

Existem quatro níveis de compactação da cromatina:

1) Estrutura primária – Associação da dupla hélice do DNA com um grupo específico de histonas. Duas cópias de cada uma das quatro histonas (H2A, H2B, H3, H4) constituem um octâmero, em torno do qual um segmento de dupla hélice de DNA se enrola, como uma linha em torno de um carretel. O octâmero circundado por duas voltas de DNA constitui um nucleossomo. Cerca de 140 bases de DNA estão associadas a cada centro de histonas. Após um segmento de DNA curto (20 a 60 bases), forma-se o centro seguinte de complexo de DNA, e assim por diante, conferindo à cromatina a aparência de contas num cordão. Este primeiro nível de compactação reduz o tamanho da molécula de DNA em 6 a 7 vezes.

2) Solenóides – A histona H1 tem papel na organização da cromatina ocupando lugar na região entre os nucleossomos, forçando o material a outro tipo de compactação, em estruturas secundárias

helicóides, denominadas solenóides. O solenóide corresponde à compactação de 6 a 7 nucleossomos. Essa nova fibra é a unidade fundamental da organização da cromatina. O solenóide é capaz de condensar aproximadamente 1200 bases de DNA.

3) Alças – Com a formação do solenóide, tem lugar a ação de proteínas não-histônicas, que formam estruturas em alças ou domínios. As alças podem ser o início de espessamentos parecidos com nós, denominados cromômeros. À medida que os cromossomos se condensam mais, os cromômeros adjacentes fundem-se em estruturas maiores, que depois se tornam as bandas cromossômicas.

4) Cromossomos – Encontramos essas formas na metáfase, quando há a maior condensação da cromatina. É o enrolamento final, do qual participa a topoisomerase II. Os diferentes graus de compactação do DNA dentro do núcleo são Cadeia dupla de DNA, Filamento de cromatina e cromossomo.

3- O ciclo celular consiste em um processo altamente coordenado através do qual uma célula entra em divisão.

a) Quais são as etapas do ciclo celular?

Intérfase – A interfase corresponde ao período entre o final de uma divisão celular e o início da outra. Geralmente a célula encontra-se nesta fase durante a maior parte da sua vida.

A interfase divide-se em três fases:

Fase G1 – Nesta fase sintetizam-se muitas proteínas, enzimas e RNA, verifica-se também a formação de organelas celulares e, consequentemente, a célula cresce.

Fase S – É nesta fase que ocorre a auto-replicação das moléculas de DNA (diz-se no plural porque para cada cromossomo existe uma molécula de DNA). A partir deste momento os cromossomos passam a possuir dois cromatídeos ligados por um centrómero.

Fase G2 – Neste período dá-se a sintese de moléculas necessárias à divisão celular (como os centríolos).

As fases G e S possuem estas denominações em decorrência de abreviações do inglês – G para gap (intervalo) e S para synthesis (síntese).

b) Em qual etapa do ciclo celular o DNA deve se replicar?

Na fase S da Interfase.

c) Explique o que são as ciclinas e o que são os oncogenes e como eles devem funcionar regulados para que a célula se divida de forma organizada.

Ciclinas são proteínas reguladoras, elas atuam no ciclo celular, fazendo com que o fator promotor de maturação se ative. Elas formam o complexo de proteínas com a p34cdc2, a subunidade catalítica do fator promotor e molda as funções da proteína quinase. As ciclinas ocorrem durante o ciclo celular, elas são sintetizadas e se ligam a p34, dessa forma ativando esta quinase. A síntese da ciclina oscila durante o ciclo celular, chegando em níveis altos durante a transição de G1, S, G2 e M.

Oncogene é a denominação dada aos genes relacionados com o surgimento de tumores, sejam malignos ou benignos, bem como genes que quando deixam de funcionar normalmente, transformam uma célula normal numa célula cancerosa. As versões de função normal de oncogenes, os proto-oncogenes, são genes responsáveis pelo controle da divisão celular (mitose), da diferenciação celular e da tradução proteica. Após sofrer uma mutação gênica somática, por exemplo, uma translocação, amplificação ou mutação pontual um proto-oncogene torna-se eventualmente um oncogene.

Durante a divisão celular, é usual ocorrer erros genéticos durante a replicação do DNA. Erros esses que são normalmente corrigidos pela maquinaria de reparo de DNA. Quando a maquinaria de reparo de DNA falha em consertar um erro na sequência de DNA que corresponde ao proto-oncogene, esse erro é mantido, ou seja, ocorre uma mutação. Duas situações poderiam ocorrer, considerando tal mutação:

O produto proteico de um proto-oncogene continua ativo e funcional - como em uma mutação silenciosa, onde a troca da base azotada permite manter o mesmo aminoácido.

A mutação confere características oncogênicas às proteínas que antes controlavam a divisão celular. O produto proteico do que era um proto-oncogene passa a apresentar ação deficiente ou fica inativado – por exemplo, por mutação que insere códon de parada ou altera a fase de leitura do mRNA – deixando de existir qualquer controle da divisão celular. Quando isto ocorre diz-se que o oncogene foi ativado.

4- A replicação do DNA é um processo bastante complexo onde estão envolvidas diversas enzimas.

a) Cite todas as enzimas conhecidas que estão envolvidas no processo e a função de cada uma.

DNA Polimerase, Endonuclease, Helicase, Topoisomerase, Primase, Telomerase.

DNA Polimerase – responsável pela adição de nucleotídeos e reparo.

Endonuclease – degrada o DNA, clivando-o em pedaços menores.

Helicase – Separação da dupla fita.

Topoisomerase – Ela catalisa uma quebra nas moléculas de DNA, mas usa ligações covalentes para segurar as moléculas de DNA que foram quebradas.

Primases – A primase do DNA atua no início da replicação, sintetizando o primer necessário para começar a síntese da cadeia leading, e também, durante todo o processo, sintetizando os primers necessários para o início da síntese de cada fragmento de Okazaki.

Ligases – Conectam fragmentos de fitas menores.

5- A replicação do DNA nas chamadas forquilhas de replicação.

a) Explique como se dá essa replicação e por que este procedimento ocorre de forma diferenciada nas fitas líder e retardada.

A replicação de DNA sempre tem início num ponto único na molécula, caracterizado por uma sequencia de bases específicas denominado origem da replicação, a partir de onde a dupla fita se abre. As terminações destes são pontos dinâmicos, chamados de forquilhas de replicação, onde as fitas de DNA são separadas e replicadas. A replicação tem início na origem de replicação e a partir dela continua bidirecionalmente. A replicação do DNA é dita semi-consertiva, pois as 2 fitas são antiparalelas. Como a abertura da dupla fita é gradual a partir da forquilha de replicação e o sentido de leitura é obrigatoriamente na direção 5´-----3´, a síntese das duas fitas ocorre em sentidos opostos, não sendo possível que elas fossem sintetizadas continuamente. Desta forma, uma das fitas é sintetizada continuamente, sendo denominada de fita líder, enquanto a outra se faz em pequenos fragmentos, sendo chamada de fita retardada.

b) O que significa dizer que a DNA polimerase apresenta atividade exonucleásica 3’->5’?

Significa dizer que essa atividade exonucleásica da DNA Polimerase permite que logo após serem adicionados, os nucleotídeos sejam retirados e é conferido se o seu pareamento está correto (A com T e C com G). Esta atividade é chamada atividade Editorial. Ou seja, essa atividade exonucleásica tem função no mecanismo de reparação do DNA, evitando possíveis mutações.

6- .

a) Como é formada a estrutura de um gene no DNA?

b) Além da região codificadora que conterá o código para a produção da proteína, o gene tem várias outras regiões importantes para que ele seja corretamente transcrito e traduzido. Quais são essas regiões? (Fale sobre promotores, acentuadores, sítios de ligação ao ribossomo, etc.)

Inicialmente convém estabelecer o que entendemos por gene. Numa concepção simplista podemos admitir que um gene é o segmento de DNA que codifica uma certa proteína. Embora esta definiçao possa ser útil e válida, ela encontra dificuldades de aplicação quando o segmento de DNA contém introns. Por outro lado, convém em muitos casos considerar as regiões controladoras da expressão do gene como partes integrantes dele. Assim, a definição molecular de gene deve compreender um segmento de DNA bem maior do que o mínimo necessário para codificar os aminoácidos que fazem parte da sequência polipeptídica. Vamos começar o caminho na direção da definição molecular de um gene pela análise da estrutura típica de um gene procarioto. Embora em muitos casos vários genes estejam sob o controle de um único sistema, formando o chamado operon, vamos aqui considerar que um único gene está em jogo. A figura abaixo mostra um gene típico de um procarioto.

Figura: Estrutura típica de um gene procarioto. RBS = sítio ligador de ribossomo; ATG = códon de iniciação da síntese protéica; Cds ou ORF = quadro aberto de leitura; stop = qualquer um dos três códons de finalização da síntese protéica; terminador = região

terminadora da transcrição

O trecho compreendido entre o códon de iniciação da síntese proteíca (usualmente ATG ou TTG) e um dos três códons para terminação da síntese protéica (designados aqui por stop) determina a sequência de aminoácidos do polipeptídeo final, produto do gene. Este trecho é frequentemente designado como

quadro aberto de leitura (ORF = open reading frame) ou sequência codificadora (Cds = coding sequence). Antes dele (diz-se 5' dele) estão o promotor (onde vai se ligar a RNA polimerase) e o sítio ligador de ribossomo (RBS = ribosome binding site ou rrs = ribosome recognition site), uma sequência que, quando transcrita para o mRNA, irá permitir o pareamento deste com um trecho complementar do RNA 16 S da sub-unidade menor do ribossoma. Após a ORF (3' dela, como se diz no jargão de biologia molecular), há o sinal de parada da transcrição, que é formado por uma sequência diádica acompanhada de um poliT (na fita 5'-3', que é sempre a de cima, salvo quando especificado na figura). A transcrição da região do terminador provoca a formação de um grampo no RNA mensageiro nascente, seguido de um poli-U, que interrompe a síntese de RNA.

7- Como acontece o mecanismo de transcrição do DNA em RNA? (Fale sobre os fatores de transcrição e sobre o fator sigma.)

Transcrição – é o processo de formação de uma molécula de RNA a partir de uma molécula molde de DNA. Neste processo, as fitas do DNA se separam e uma serve de molde para o RNA, enquanto a outra fica inativa. Ao fim da transcrição, as fitas que foram separadas voltam a se unir. A transcrição é um processo altamente seletivo, pois apenas pequenas porções da fita de DNA é molde é copiada. Isso é muito importante, pois é o primeiro passo da regulação de um gene. O processo é iniciado quando a polimerase do DNA se liga a uma das extremidades do DNA. Essa extremidade é muito específica, possuindo uma seqüência especial de bases, e é chamada de promotor. Neste local, existe um sítio de iniciação, com a primeira base a ter transcrita. A polimerase do RNA segue pela extensão da cadeia, transcrevendo o DNA em RNA até encontrar a seqüência de terminalização, que contém bases específicas que determinam o fim da transcrição.

Etapas da transcrição

1 – Reconhecimento da fita molde de DNA

O DNA e as polimerases do RNA (enzimas catalizadoras da reação) estão livres na célula e podem se encontrar ao acaso, porém a transcrição só tem início quando a enzima encontra e liga-se fortemente ao sítio promotor. Quando isso acontece, a dupla-hélice é desenrolada e as fitas são separadas.

2 – Início da transcrição

A polimerase ligada à região promotora inicia o processo de transcrição, adicionando os primeiro nove nucleotídeos da seqüência de RNA. Essa fase é chamada de fase de iniciação.

3 – Elongação

Após a produção de aproximadamente nove nucleotídeos, a polimerase do RNA passa a se deslocar pela molécula de DNA, desenrolando sua hélice e produzindo uma molécula de RNA, cada vez mais alongada. O DNA já transcrito volta a ser enrolado, quase que imediatamente, recompondo a sua dupla-hélice. Esse processo é chamado de fase de elongação. A fita de RNA produzida é simples e livre. Cerca de 40 nucleotídeos podem ser produzidos por segundo, a uma temperatura de 37°C em bactérias.

4 – Término

Quando a polimerase do RNA encontra a seqüência de terminalização, o RNA para de ser transcrito. A partir desse momento, nenhuma outra base nitrogenada é incorporada ao RNA. Neste momento, a bolha de transcrição se desprende, liberando uma molécula de RNA e imediatamente a molécula de DNA se enrola completamente. A seqüência de DNA que contém os genes sinalizadores do término é chamada de região terminalizadora.

O fator sigma da RNA-polimerase é responsável pelo reconhecimento da região do promotor, local onde se inicia a síntese. Foram convencionados números para a identificação deste local.

8- Nos organismos eucarióticos, o RNA mensageiro é produzido no núcleo, processado e então enviado ao citoplasma para ser traduzido em moléculas de proteínas.

a) Quais são as modificações que um transcrito primário de mRNA deve sofrer até que forme o chamado MRNA maduro, que irá ao citoplasma servir de molde para a síntese de proteínas?

b) Por que elas acontecem?

No genoma humano os introns iniciam sempre com GU e terminam em AG. Há um número maior de bases relativamente conservadas nas duas extremidades e elas participam no reconhecimento do intron pelo spliceossomo ou encadeassomo, complexo enzimático responsável pela retirada dos introns e emenda dos exons adjacentes. A figura abaixo mostra esquematicamente a retirada os introns, assim como duas outras modificações importantes do transcrito primário de RNA: o capeamento e o caudeamento. No capeamento, uma base diferente das demais que compõem o RNA, a 7-metil-guanosina, é adicionada na extremidade 5' do mRNA, com sua hidroxila da posição 3' voltada para fora do RNA. Na outra extremidade, a partir de um sinal de poli-adenilação (uma sequência no mRNA), uma enzima específica cliva o RNA, descarta a porção final e adiciona à extremidade 3' um número variável de adeninas (de 15 a 300). Com isto, o trecho que vai deste sinal até o fim do mRNA fica perdido. este fenômeno dificulta imensamente o estudo do mecanismo de terminação da transcrição em eucariotos, que ainda não é bem compreendido.

Figura: Diagrama do processamento do transcrito primário até o mRNA maduro. Os introns formam laços (denominados lariats) na presença do splicesossomo (1), sendo retirados. Ao mesmo tempo, a parte final (3') do RNA é clivada (2) e uma cauda poli-A adicionada. Por fim, uma resíduo de 7-metil-guanosina é adicionado à extremidade 5' do RNA, criando o boné, ou cap (3).

O mRNA pronto passa pelo poro nuclear para o citoplasma, onde será traduzido. Por este poro passam também as duas sub-unidades do ribossomo (separadamente). Dependendo dos sinais que o mRNA tiver nas regiões 5'-UTR e 3'-UTR, ele poderá ser exportado para uma organela (mitocôndria ou cloroplasto), transportado para determinadas regiões da célula (botões sinápticos, por exemplo) ou ainda formar parte do pool de mRNAs não traduzidos. As duas regiões UTR têm, na verdade, um importante papel na regulação pós-transcricional da expressão gênica que muitos eucariotos empregam este mecanismo com frequência e, em alguns casos, quase exclusivamente (como é o caso da Leishmania e do Trypanosoma).

9- Os mecanismos de transcrição são regulados através da presença de determinados metabólitos na célula, que indicam a ela se determinado conjunto de genes deve ou não ser transcrito em determinado momento. As bactérias realizam a regulação da transcrição em conjuntos de genes chamados de operons, que podem ser indutíveis ou repressíveis.

a) Explique o mecanismo de funcionamento do operon LAC ou do operon do triptofano em bactérias.

Operon LAC é um operon requerido para o transporte e metabolismo da lactose.

O operon LAC utiliza um mecanismo de controle duplo para assegurar que a célula produza enzimas somente quando haja lactose no meio. Isso é conseguido com o repressor LAC que paralisa a produção de enzimas na ausência de lactose, e com a proteína ativadora catabólica (CAP), que auxilia na produção, no caso de ausência de glicose. Esse controle duplo faz com que a glicose seja metabolizada pelas bactérias antes que a lactose, o que se conhece pelo nome de diauxia.

10- .

a) Como se dá o mecanismo de tradução da informação do DNA em proteínas?

Após a transcrição da informação genética contida no DNA em RNA, ocorre a tradução, processo ao qual é processo de leitura do mRNA que ocorre no citoplasma pelos ribossomos para formar uma proteína. Após a formação do mRNA maduro, no processo de transcrição, ele sai do núcleo da célula e vai em direção ao ribossomos no citoplasma para ser traduzido. A ação dos ribossomos é dividida em três etapas: iniciação, alongamento e finalização:

Iniciação: O mRNA migra para o citoplasma e fixa-se na subunidade pequena do ribossoma, nomeadamente na região de AUG, o codão de iniciação. O tRNA funciona como “intérprete” dessa mensagem, transportando o aminoácido metionina ligando-se ao códon de iniciação. A subunidade grande do ribossoma liga-se à pequena subunidade. O ribossoma está então funcional.

Alongamento: O anticódon de um novo tRNA transporta um segundo aminoácido na extremidade 3' e liga-se ao segundo códon por complementaridade. Estabelece-se então uma ligação peptídica entre o aminoácido que ele transporta e a metionina. Estas ligações implicam transferências de energia sendo catalisadas por enzimas. Como o código é degenerado, pode existir mais de um tRNA para o mesmo aminoácido. O ribossoma avança três bases e o processo repete-se ao longo do mRNA.

Finalização: Assim que ao ribossoma chega um códon de finalização, termina a síntese. A cadeia polipeptídica destaca-se. Os componentes do complexo de tradução separam-se, mas as subunidades ribossomais podem ser novamente utilizadas. No final da tradução resulta uma sequência de aminoácidos que, depois de sofrer transformações em diferentes organelas celulares (RER e complexo de Golgi), se torna numa proteína funcional capaz de desempenhar as suas funções, conferindo à célula que a produziu uma determinada característica.

b) O que são e pra que servem as enzimas tRNA aminoacil sintetases?

tRNA aminoacil sintetase é uma enzima que catalisa a esterificação (reação química reversível na qual um ácido carboxílico reage com um álcool produzindo éster e água) de um específico aminoácido em um dos possíveis tRNA correspondentes, com vista a formar um aminoacil-tRNA.

11- Depois que as proteínas são produzidas, elas podem sofrer as chamadas modificações pós-traducionais.

a) Para que servem estas modificações?

Para adquirir sua conformação final biologicamente ativa.

b) Cite pelo menos dois tipos de modificações pós-traducionais conhecidas em proteínas e a função dessas modificações na regulação da atividade protéica.

Adição de grupos prostéticos: muitas proteínas requerem, para sua atividade, grupos prostéticos ligados covalentemente.

Formação de pontes de dissulfeto: Após se dobrarem nas suas conformações reativas, algumas proteínas formam pontes de dissulfeto entre resíduos de CYS presentes em uma mesma cadeia ou em cadeia diferentes.

Para as questões de 12 e 13 utilize a sequência abaixo, obtida de um DNA bacteriano:

> Sequência 1GCCTTCAATGGCAAGCGGTCTGGAATCCTACTTCTTGAATCGGCACGGTGTCATTACGGGCGGGGGCCAGAACAACGTCCCTGGACATCACACCTAGCCCGTGCGACGGCGGAAACCTTCGCCGGCGCAGGCTTCGACGTGACCCTCATCGCGGAACCCTCCCCCACCCCAGTGTTGGCGTGGCTGGTGCGCTCACGGCGAATGGACGTGGGCGTGCAGATCACCGCCTCGCACAATCGAATTCAGGACAACGGCTACAAGCTGTACCTGGACGGCGGCTCTCAGCTGGTCTCCCCCGCCGACCGGCAGATCGAGGAGCACATTGCCGCCCAGCCAACTGACGCGGCGAAGATCCCCCGCTCCGAGGCGAAGTCTGTAGACCTGTCCGTAGTCTCCGGCTATGTCACCGAGCTAAGTACCCTGGTGGCCACCGGCCGCCAATCCGAGCTGGCGCCGCGGCGGAACCTGAAGATCCTCTACACCCCCATGCACGGCGTGGGCGGCAATGCCCTGGAGTGGGCCTTACGTGAATTCGGCTTCGGCAACGTGCACGCGGTGGCCTCGCAGCGCTGGCCGGACCCGACCTTCCCGACTGTGGACTTCCCCAACCCTGAGGAGCCGGGTGCCACCGACGCGCTGCTGGAAGAAGCCCGCGCCATCGATGCGGACCTGCTGATCGCCCTGGATCCGGATGCGGACC

Enzima de restrição EcoRI

Enzima de restrição inventada

12- Suponha que a sequência acima tenha sido amplificada por PCR de um extrato bacteriano.

a) Quais são os reagentes que o pesquisador colocou no tubo para fazer a reação, além do DNA extraído, em solução?

Coloca-se no tubo de PCR, o extrato de DNA coletado, o primeiro primer, o segundo primer, Solução de desoxinucleotídeos, cofator Mg2+, e a enzima DNA Polimerase termo-estável em solução tampão.

b) A PCR é uma reação de amplificação que acontece em ciclos. Descreva sucintamente as três etapas do ciclo da PCR e diga o que acontece em cada um deles.

Etapa 1: _Desnaturação do DNA______________________________ Temp: _ 95 _ °C

Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias.

Etapa 2: _Anelamento dos primers _ ___________________________ Temp: _50_°C

Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar).

Etapa 3: _Extensão dos iniciadores____________________________ Temp: _72_°C

Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC).

c) Por que a utilização da polimerase de uma bactéria hipertermofílica (Thermus aquaticus) permitiu a automação da técnica? Qual a função da máquina conhecida como termociclador?

Um grande número de DNA polimerases de seres termófilos e hipertermófilos têm sido isoladas e caracterizadas de archaea e eubacterias termófilas. Estas enzimas têm atividade a uma temperatura ótima elevada e têm uma estabilidade térmica que corresponde aos ambientes térmicos extremos onde os organimos vivem. Apesar do fato de a estabilidade térmica das proteínas nativas variar entre as diversas enzimas, existe uma temperatura ótima de polimerização comum entre os 70 e os 80°C. Isto sugere que a

estabilidade do template, contrastando com a estabilidade intrínseca das enzimas, determina a temperatura da polimerização. Devido à termoestabilidade destas enzimas, as relações entre a estrutura e função, e as potenciais aplicações biotecnológicas de muitas destas enzimas termoestáveis, tal como as DNA polimerases, são de grande interesse para a investigação científica.

A Taq DNA polimerase é proveniente da bactéria termófila Thermus aquaticus, sendo a enzima de eleição para a maioria das aplicações de PCR (Polymerase Chain Reaction). A Taq DNA polimerase consiste numa cadeia polipeptídica simples, com um peso molecular de aproximadamente 95 kD e com uma temperatura óptima de atividade de 75°C. Esta DNA polimerase catalisa a síntese do DNA de 5'-3'. Por outro lado, de 3'-5' não tem atividade exonucleásica e de 5'-3' esta é baixa. A enzima é obtida a partir de células de Escherichia coli nas quais está clonado o gene poI de Thermus aquaticus. Através da técnica de PCR, a Taq polimerase é usada para amplificar fragmentos de DNA tão grandes como 5 Kb e apresenta uma taxa de erro de 2,2x10-5 nucleótidos por ciclo.

O Termociclador funciona a partir de ciclos alternantes de aquecimento e resfriamento da mistura juntamente com a DNA polimerase, com a função de copiar um fragmento de DNA. Esses fragmentos, ou primers, indicam qual parte do DNA está sendo copiado. Esse método torna possível produzir inúmeras cópias de determinada parte do DNA. Ele auxilia na ampliação do DNA de inúmeras fontes. Ele é pré-programado com protocolos de PCR que podem ser facilmente selecionados através do display. As amostras recolhidas pelo termociclador podem ser visualidasas através de eletroforese.

13- Uma vez amplificada a sequência deste gene, queremos agora cloná-lo em um vetor de clonagem. Para isso precisamos primeiro cortá-la com enzimas de restrição. Sabe-se que a enzima de restrição EcoRI corta um DNA fita dula do seguinte modo e no seguinte sítio (veja figura). Responda:

Figura: Corte com a enzima EcoRI

a) Quantos sítios de restrição existem na nossa sequência? Sublinhe-os

Existem 2 sítios de restrição para a enzima EcoRI conforme sequencia abaixo.

> Sequência 1GCCTTCAATGGCAAGCGGTCTGGAATCCTACTTCTTGAATCGGCACGGTGTCATTACGGGCGGGGGCCAGAACAACGTCCCTGGACATCACACCTAGCCCGTGCGACGGCGGAAACCTTCGCCGGCGCAGGCTTCGACGTGACCCTCATCGCGGAACCCTCCCCCACCCCAGTGTTGGCGTGGCTGGTGCGCTCACGGCGAATGGACGTGGGCGTGCAGATCACCGCCTCGCACAATCGAATTCAGGACAACGGCTACAAGCTGTACCTGGACGGCGGCTCTCAGCTGGTCTCCCCCGCCGACCGGCAGATCGAGGAGCACATTGCCGCCCAGCCAACTGACGCGGCGAAGATCCCCCGCTCCGAGGCGAAGTCTGTAGACCTGTCCGTAGTCTCCGGCTATGTCACCGAGCTAAGTACCCTGGTGGCCACCGGCCGCCAATCCGAGCTGGCGCCGCGGCGGAACCTGAAGATCCTCTACACCCCCATGCACGGCGTGGGCGGCAATGCCCTGGAGTGGGCCTTACGTGAATTCGGCTTCGGCAACGTGCACGCGGTGGCCTCGCAGCGCTGGCCGGACCCGACCTTCCCGACTGTGGACTTCCCCAACCCTGAGGAGCCGGGTGCCACCGACGCGCTGCTGGAAGAAGCCCGCGCCATCGATGCGGACCTGCTGATCGCCCTGGATCCGGATGCGGACC

b) O gel abaixo apresenta, na canaleta 1, um padrão de peso molecular onde as bandas representam sequências com 10bp, 50bp, 80bp, 200bp e 1kb. Suponha que seu DNA acima tenha

sido digerido pela enzima EcoRI e represente, na canaleta 2, os fragmentos resultantes do corte (dica: cada linha da sequência apresenta 70 nucleotídeos).

1º fragmento: 239bp



c) Utilizaremos aqui um plasmídeo chamado pLADA contendo 900bp que apresenta um sítio para a enzima EcoRI dentro de seu sítio múltiplo de clonagem. O plasmídeo foi digerido com esta enzima de restrição e, assim, linearizado. Suponha que você tenha purificado do gel seu maior fragmento obtido na canaleta 2 e incubado este fragmento com o plasmídeo digerido, na presença de DNA ligase. Na canaleta 3, apresente as bandas resultantes deste experimento de ligação. Lembre-se que o plasmídeo pode ligar-se com ou sem o inserto. Explique porque as bandas têm o tamanho observado no gel

Plasmídeos são capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, por isso são utilizados como vetores de clonagem. Para isso, têm que possuir certas propriedades:

ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA que permite a replicação do vetor na célula hospedeira;

possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais constituem o sítio de inserção no vetor de clonagem;

conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir uma célula transformada de uma não transformada. Muitas vezes, são utilizados genes que conferem resistência a um antibiótico. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com antibiótico, enquanto que as restantes não sobrevivem.

Estes vetores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessária a atuação das enzimas de restrição para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vetor, através da produção de extremidades coesivas complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molécula híbrida resultante é inserida numa célula hospedeira, muitas vezes bactérias, por um processo denominado transformação. O vetor pode assim sofrer replicações e proceder à consequente amplificação do número de cópias. Como foi referido anteriormente, estas células são identificadas devido a novas características concedidas pelo plasmídeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um dado antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência).

d) Invente uma enzima de restrição que corte num sítio diferente da EcoRI. Lembre-se que as enzimas de restrição cortam em sítios palindrômicos (idênticos nas duas fitas; GAATTC é GAATTC também na fita complementar-reversa). Apresente o sítio de corte de sua enzima, dê um nome para ela, corte o DNA da sequência 1 com esta enzima em pelo menos um sítio e apresente, na canaleta 4, os fragmentos gerados por este ensaio de digestão, com seus respectivos tamanhos.

Enzima: _BqmFII__________________

Sítio de corte: _5’ GCGC- ___________

Número e tamanho dos fragmentos de restrição gerados:

7 fragmentos resultantes:


2º fragmento: 64bp



5º fragmento: 67bp

6º fragmento: 19bp

7º fragmento: 47bp

14- O que é um organismo transgênico? Você se considera contra ou a favor dos transgênicos? Por que?

Transgênicos ou organismos geneticamente modificados (OGM) – são organismos que mediante licenças de engenharia genética sofreram alterações no seu material genético.

Não sou contra e nem a favor. Uma vez que os organismos transgênicos possuem seus prós e contra.

Prós: Pode ter a função prevenir, reduzir ou evitar riscos de doença, reduzir o numero de agrotóxicos; dar resistência às plantas; aumento de produção de alimentos; entre outros.

Contra: Podem causar resultados inesperados ao organismos que se inserem; aumento do números de casos de pessoas alérgicas à determinados alimentos; riscos à saúde; riscos ambientais; aumento de resistência de pragas e doenças, entre outros.

15- Faça um crítica responsável à nossa disciplina. Quais os pontos fortes? Quais os pontos fracos? Você acha que conseguiu aprender? Você conseguiu se dedicar ao estudo? Como você sugere que o professor possa tornar esta disciplina melhor no próximo semestre?

O curso de Bioquímica se fez imensamente satisfatório e esclarecedor, apresentando como “pontos fortes” os slides bem preparados e resumidos que auxiliam nos estudos e poupam o tempo que seria gasto lendo capítulos inteiros (70-80 páginas) para identificar os tópicos mais importantes. Além disso, os vídeos mostrados em sala promoveu um maior enendimento acerca do conteúdo. Não há “pontos fracos” a serem destacados nessa crítica. Foi possível me dedicar à disciplina, embora não tenha sido possível, talvez, dar conta de reter todas as informações que nos foram dadas – uma vez que o conteúdo é bastante extenso. Sugiro que haja uma redução do conteúdo ou aumento na quantidade de aulas para que essas sejam melhor aproveitadas.

Documents

ED2 - Estudo Dirigido