クライオ電顕による構造解析に基づくドラグレスキュー戦略

創薬基盤技術開発SGDD

教育や環境が人を作る機構

個性や能力を分子レベルから理解したい

構造生理学

遠くを見る望遠鏡

Drug Rescuing

創薬

2000年；平成12から

Structure-Guided Drug Development

藤吉好則 株式会社CeSPIA 東京医科歯科大学 高等研究院 卓越研究部門

膜タンパク質 12th September, 2019; 45 minutes

以下author名が無いのは藤吉等の論文

2

神経筋接合部

見ること（目）と認識すること（脳）

動くこと （筋肉）

PNAS, 99, 5982-7 (2002)

Nature, 423, 949-55 (2003)

観て、考えて行動する分子機構； ロドプシン・電位感受性Na+チャネル・アセチルコリン受容体を例示

2 ロドプシン

アセチルコリン受容体

--- +++

--- +++

oo oo

神経細胞

イオンチャネル

Nature Comms, 3, 793 (20012)

イオンチャネル

PDE→cGMP⇣→Na, Ca→GC→ｃGMP

helium stageを開発

T4 phage

脂質膜中での構造解析 厚さ50Å程度と薄い試料からの構造情報取得に電子線は最適

膜タンパク質の構造解析のために

Chemica Scripta., 14, 47-61 (1978/79)

Proc. Jpn. Acad. Ser B, 91, 1447-68 (2015)

Nature, 285, 95-97 (1980)

MDS開発 銀・TCNQ複合体観察

3 50Å 電子顕微鏡で分子

像観察に挑戦

生物試料は電子線損傷が激しい

要helium stage

８K以下で室温の20倍の電子線照射が可能

クライオ電子顕微鏡の開発と改良 それでも

電子線損傷の温度依存性

原子レベルの分解能での分子像観察に成功 損傷軽減が必要

膜タンパク質

クライオ電顕の威力を示す例１：プロトンポンプの構造解析

Henderson R, Unwin PNT, Nature, 257, 28-32 (1975)

ヘリウムステージのクライオ電子顕微鏡の威力

光駆動プロトン Bacteriorhodopsin

+

Nature, 389, 206-211 (1997)

７Åから３Åへ分解能向上

プロトンは負に帯電した表面を速く遠達的に伝搬 細胞内側は負に帯電（赤色）

細胞外側は逆

細胞内

細胞外

プロトンは水分子の水素結合を伝搬する

4

7Å分解能 3Å分解能

ハロバクテリア

Historically important analysis by pioneers

Richard Henderson

Nigel Unwin

米国では新薬の６割程度が、アカデミアやベンチャーとの共同研究で創られている

M$ More than 1000 M$ 創薬の効率向上

TMDU CeSPLの研究能力を活用 Business Venture

製薬企業のゴミ箱

60% Robert Kneller, Nature reviews, 9, 867-882 (2010)

USA Japan UK

Germany Switzerland

France

year

B Agnew, Science, 287, 1952-3 (2000) 創薬の成功確率

タンパク質の生理条件下における機能構造を解析

創薬標的分子の探索と創薬戦略の決定

構造を基により良い候補化合物を設計する

副作用 臨床試験

副作用

前臨床試験

製薬企業 のゴミ箱

Structure-Guided Drug Development (SGDD)

新規創薬戦略の必要性

候補 化合物

候補化合物

First-in-class Best-in-class Drug Repositioning 最近認可される50％

＝

化学合成（中分子を含む）

In silico screening, 有機合成・設計支援

6

成功確率が極めて低い 例 バイアグラ←狭心症治療薬 サリドマイド疼痛←睡眠薬 ミノキシジル育毛←高血圧薬

＝ タンパク質の生理条件下における機能構造を解析

創薬標的分子の探索と創薬戦略の決定

構造を基により良い候補化合物を設計する

副作用 臨床試験

副作用

化学合成（中分子を含む）

Base camp として再挑戦

In silico screening, 有機合成・設計支援

前臨床試験

First-in-class Best-in-class Drug Repositioning 枯渇の恐れ

Drug Rescuing Dru

g R

escu

ing

新創薬戦略：Drug Rescuing

製薬企業 のゴミ箱

再設計

創薬標的の拡張

Structure-Guided Drug Development (SGDD)

Parts for Pharmacologic action Nature, 537, 363-368 (2016)

7

１３種の水チャネルとそれらの機能

AQP2:ダイナミックな機構、心臓疾患 等多くの病気治療対象

AQP5:ドライアイ、唾液分泌

AQP6:水チャネルのファミリーながら、 陰イオンチャネル、脳での機能等

AQP3:水だけでなくグリセロール透過、 美容、怪我などに関係：結晶化に成功

AQP7:グリセロール透過、脂肪細胞、肥満

AQP8:消化管、膵臓、腺房、肝臓

AQP9:グリセロール、肝細胞

AQP10:グリセロール、消化管

AQP11:NPAがNPC腎性嚢胞症

AQP12:NPAがNPT、オルガネラに発現

AQP0:白内障、細胞接着

AQP4:細胞接着、躁鬱病や多発性硬化症等にも関連し高次の脳機能と関連

AQP1:腎臓はじめ多くの場所に発現

身体の７０％近くは水：多くの機能に関連

１秒間に３０億もの水分子を透過しながらプロトンをも透過しない機構は？

+

Domino toppling

8 イオンチャネル

AQP1の構造と機能 Nature, 387, 624-7 (1997) Nature, 407, 599-605 (2000)

NPA

Hydrated ion

HE

HB

NPA N

N

Ar/R

Water molecule 2.8 Å

Na+

8.0Å

N

N

共同研究者が ノーベル賞受賞

H-bond isolation mechanismを提唱

3Å

電子線結晶学でヒト由来の水チャネルの構造が解析された結果：複雑な構造

9

1.9Å 分解能でのAQP0の構造解析

N192

N76

Nature, 438, 633-638 (2005)

Lens fibre cells

related with cataract

Water molecules in the channel at closed state

Ciliary muscle

10

水チャネルAQP0の高分解能の構造解析の結果、AQP1の構造からH-bond isolation mechanismとして予測されたと同様の水分子の配置が確認された。 ただ、AQP0の構造はチャネルが閉じた状態であったので、速い水透過機構は理解されなかった。

観察された水分子の配置（左）はモデル（右）の水の位置とほとんど同じ 脂質分子の構造も解析

AQP0が発現

Cartoon of AQP1 channel in Nature, 407, 599-605 (2000)

Walzグループと共同研究

脳の水チャネル

Glial lamellae of Hypothalamus

脳の水チャネル 脈絡膜叢

Ependymal cells Choroid prexus

Endfoot of astrocyte

脳室上衣細胞

視床下部 グリアルラメラ

星状膠細胞

AQP4 AQP1

細胞膜

AQP4

AQP4

AQP4 AQP1

速い水透過 1秒間に３０億の水分子透過

脳の水含量は８５％

イオンチャネルの機能を支える

M.A. Moghaddam, O.P. Ottersen, Nature Rev. Neurosci., 4, 991-1001(2003)

11

JD Ho et al., PNAS 106, 7437-42 (2009) J. Mol. Biol., 389, 694-706 (2009)

at 2.8Å

NPA

ar/R ar/R

NPA

W1

W8

W2 W3 W4

W5

W6

W7

電子線結晶学

電子線結晶学の優位性

ぼけている 8 個の水分子が分離して観察される

at1.8Å X線結晶学

12

ε=80

ε=80

ε=2 3.9Å

3.8Å

脂質膜内での大きいへリックス双極子とカルボニル基の配置が重要

Helix dipole No helix dipole

電子線結晶学 X線結晶学

ε=80

ε=80

ε=2

脂質膜の比誘電率分布によりへリックス双極子が大きくなる

短いヘリックスは膜内では双極子が大 13

脂質膜がないとへリックス 双極子はほとんどゼロ

A B

C D

Durba Sengupta et al., Structure 13, 849-55 (2005)

D Enhanced helix dipole

へリックス双極子が水分子を配向

Tight Junction:TJ

Blood Brain Barrier: BBB

BBB

TJ

Blood vessel

Science, 344, 304-7(2014)

TJ model JMB, 427, 291-7 (2015)

Science, 347, 775-8(2015) brain Cldn1, 5, 12, 25

esophagus Cldn3, 22

Stomach Intestine

Skin Cldn1

Cldn18 Cldn7

Mimic of C-CPE for drug development

血液脳関門BBB の制御はDrug Delivery System開発に重要

Brain side

Drug Vessel inside

BBB制御に鍵となる分子TJを形成するクローディン

14

C-CPEによるTJの崩壊制御

血液脳関門の制御

経皮吸収

Cldn3はCldn5と高い相同性 (類似性70%) Cldn3/C-CPE複合体の構造解析に成功

Cldn15 Cldn19/ C-CPE Cldn4/ C-CPE

Cldn3/ C-CPE

サブタイプ間の構造比較

Science, 347, 775-8 (2015)

Science, 34４、 304-7 (2014)

Shinoda et al Sci Rep, 6, 33632 (2016)

Tight Junctionの制御＝BBBの制御 Nature Comms, 10, 816 (2019)

Nature Comms, 10, 816 (2019)

P G A

Cldn3

Tight Junctionの形状を規定する因子

A：広い

P：狭い

P：狭い：直線的・疎

A：広い：曲がる・密

細胞接着性チャネル Tight Junctionの凍結割断像

点変異 点変異

15 Acta Cryst., F74, 150-5 (2018)

上皮細胞におけるET-1/ETBR結合 ↓ ICAM-1の発現減少 ↓ T細胞は結合する場所を認識できず 腫瘍細胞側への移動が抑制される

Endtheline receptor ETBR

癌関連で注目され始めた受容体

ETBR拮抗薬

ＩＣＡＭ発現

腫瘍細胞側へ移動、攻撃

ETARを介したシグナルは血管を収縮させる

ETBRを介したシグナルは、血管の収縮と弛緩の両方の作用がある。

肺動脈高血圧症には非常に良い効果が得られている。

Kohan DE, Physiol Rev 91: 1–77, 2011

16

Drug repositioningの典型例

浸透圧に応答した血圧調節と電解質恒常性維持に関わる

Actelionはantagonist (1977)

その他に血管新生に関わるとの報告もあり。

Kohan DE, Physiol Rev 91: 1–77 (2011)

ETBR related diseases

ETBR mutation; Hirschsprung disease

腸の肥大など重篤な症状が

ETBRの構造解析 Structure of ET-1 Nature, 537, 363-368 (2016)

Janes et al., NSB, 1, 311-9 (1994)

ET-1 structure in ETBR

Without ligand With ET-1

With ET-1

JMB, 428, 2265-2274 (2016)

Tate’s method shown by β1AR Thermo-stabilization of ETBR

MJ Serrano-Vega et al. PNAS 105, 877-82 (2008)

熱安定化変異体

Nature Struct. Mol. Biol. 24, 758-64 (2017)

Antagonists

17

創薬には複合体の構造解析が必須

Agonist

Activation of G protein

解析に18 年要した

Nature, 458, 597-602 (2009)

LHC 2,118 citations

Nature, 367, 614-21 (1994)

Nature, 389, 206-11 (1997)

Nature, 407, 599-605 (2000) bR 544 citations

Nature, 438, 633-638 (2005) Cx26 547 citations

Nature, 556, 214-8 (2018)

HKATPase 18 citations AQP1 1,681 citations PNAS, 99, 5982-7 (2002) JMB, 360, 934-945 (2006)

MGST1 137 citations

JMB, 355, 628-639 (2006)

AQP4 401 citations

AQP0 615 citations

Science, 347, 775-8 (2015)

Claudin-CPE 93 citations

Claudin-15 196 citations

Science, 344, 304-7 (2014) Na channel 19 citations

Rhodopsin 790 citations

Nature, 423, 949-55 (2003)

AChR 1,429 citations

Nature, 537, 363-8 (2016)

ETBR-ET1 57 citations

結晶学による膜タンパク質の構造解析

18

ETBR-Agonists 20 citations

NSMB 24, 758-64 (2017) Nature C, 3, 793 (2012)

K2 Summit camera

Booth & Mooney M&M, 348, 13-21 (2013) 構造解析には長い期

間が必要であった

劇的変化

Claudin-3 1 citations

Nature C, 10, 816 (2019)

単粒子解析法

bR: Nature, 389, 206-211 (1997)

LHCII: Nature, 367, 614-621 (1994) AQP1: Nature, 407, 599-605 (2000)

AChR: Nature, 423, 949-955 (2003) AQP0: Nature, 438, 633-638 (2005)

bR: R Henderson, N Unwin, Nature, 257, 28-32 (1975)

bR: R Henderson et al., JMB, 213, 899-929 (1990)

2013年以前の膜タンパク質の電子線による高分解能解析は全て電子線結晶学による by Fujiyoshi’s lab

K2 Summitの開発Booth & Mooney M&M,

348, 13-21 (2013)

SPIDERの開発 J Frank et al., Science 214, 1353-5 (1981).

急速凍結氷包埋法の開発 M Adrian et al.,

Nature 308, 32-6 (1984)

RELIONの開発 SH Scheres, J. Struct. Biol.

180, 519-530 (2012)

TRPV1の構造解析 M Liao et al., Nature, 504,

107-112 (2013)

CryoEMの開発（藤吉） Ultramicroscopy 38,

241-251 (1991)

J Dobochet J Frank R Henderson

Atomic image（藤吉） Chemica Scripta., 14, 47-61 (1979)

塩化フタロシアニン銅

He stage

MRC 分解能向上

>1K analyses by CryoEM

19 構造解析数が単粒子解析法により飛躍的に増加：創薬への応用に期待

2003ノーベル化学賞

AQP1

2017ノーベル化学賞

Contributed people in Japan Yoshi Fujiyoshi

Yifan Cheng 藤吉氏のポスドクだった

N賞の記者会見で日本の貢献に言及

膜蛋白質等の構造解析：クライオ電顕による単粒子解析法

粒子拾い上げ・平均化

RELION（SH Scheres, J. Struct. Biol. 180, 519-530 (2012)）

立体密度図解析と構造モデル構築

急速凍結

ろ紙

液体エタン 氷包埋分子のCryoEM像

立体構造

クライオ電顕

立体構築

実例

EMAN（SJ Ludtke et al., J. Struct. Biol., 116, 82-97 (1999)）

GraDeR法; Structure 23, 1-7 (2015)で界面活性剤を除くのが望ましい

Nature Commun, 7, 13681 (2016)

電顕グリッドに２μlの標的分子分散液をのせ、ろ紙で余分な液を吸い取り液体エタンに落下させて非晶質の氷膜を作製

最適な厚さの氷部分の像を撮影

CryoEM像に写る標的分子（粒子）像の拾い上げ

EM grid

同じ粒子像の平均化計算

RELIONなどによる精密な画像分類と平均化計算；Innexinの解析例

粒子像の精密分類と平均化計算

投影像から立体構造を再構築する計算を行い立体密度マップを計算；Innexinの解析例

視野探しと高分解能像の同時撮影システム

20

LDHの解析例

JSB, 205, 11-21 (2019)

電顕観察や画像解析結果によるフィー

ドバックが重要

Innexin: Octamer

JMB, 428, 1227-36(2016) N-terminal deleted mutant;10 Å resolution 2次元結晶での解析

栓：Plug

Connexin: hexamer

Nature, 458, 597-602 (2009)

PNAS, 104, 10034-9 (2007)

Innexin と Connexinは アミノ酸配列の相同性無

ＷＴの構造解析できず

単粒子解析の具体例：ギャップ結合チャネル 21 C C C

C C C C

C C

C C

C C

C connexin pannexin innexin

脊椎動物 相同性

無脊椎動物

発生制御、炎症、細胞死、免疫応答、筋収縮などに関わる

Electric synapse

速いgating

ギャップ結合チャネルは 複雑なgating機構,

膜電位, Ca2+, リン酸化, pHなどでgating制御

心筋の同期 相同性無

18Å

Nature Commun, 7, 13681 (2016)

hexamer

Nature, 458, 597-602 (2009)

14Å

Connexin

ギャッ結合の構造解析 22

全く新しい構造をDe novoで構造モデルを作製

Innexin

Connexinn by X-ray

3.3 Å

3.5 Å

Quality of analyzed maps Innexin

Opposed hemichannel

結晶学で解けなかった構造を2か月で解析

octamer

ロイシン脱水素酵素Leucine dehydrogenase (LDH) of Geobacillus stearothermophilus

0.0 0.0

0.5

1.0

0.4 0.1 0.3 0.2 0.5

Analysed map

Maps of LDH and NAD+

3rd generation cryoEMを用いた単粒子解析

JSB 205, 11-21 (2019)表紙

23

味の素の山口、中田、水越さんらとの共同研究

株式会社CeSPIAと味の素株式会社と共同で発表した論文は表紙として採用され、日経BPにも発表された

Apo & NAD+ bound

Thank you for having the patience to hear me out! Collaborators:

Cx26; A Oshima, K Tani, Y Hiroaki, S Maeda, T Tsukihara

Cryo-EM; Y. Aoki, I Ishikawa; JEOL

Inx6; A Oshima, Oshima’s group members

AQP1; K Murata, K Mitsuoka, T Hirai, T Walz, A Engel, P Agre,

Yoshi Fujiyoshi

24

AQP4; A Kamegawa, Y Hiroaki, K Tani, Y Tanimura, K Nishikawa, H Suzuki,

Structure determination service Business Venture CeSPIA inc

第８世代のクライオ電顕は今年度末に完成

a new strategy of SGDD: drug rescuing LDH; H Yamaguchi, A Kamegawa, K Nakata, T Kashiwagi, T Mizukoshi, K Tani, Ajinomoto, CeSPIA

AChR; N. Unwin, A Miyazawa

ETBR; T shihoya, T Nishizawa, A Okuta, K Tani N Dohmae, O Nureki, T Doi

Claudin; H Suzuki, T Nishizawa, K Tani, Y Saito, A Tamura, O Nureki, S Tsukita

スライド番号 1観て、考えて行動する分子機構；�ロドプシン・電位感受性Na+チャネル・アセチルコリン受容体を例示膜タンパク質の構造解析のためにクライオ電顕の威力を示す例１：プロトンポンプの構造解析創薬における問題スライド番号 6スライド番号 7１３種の水チャネルとそれらの機能AQP1の構造と機能1.9Å 分解能でのAQP0の構造解析脳の水チャネル電子線結晶学の優位性短いヘリックスは膜内では双極子が大Tight Junction:TJTight Junctionの制御＝BBBの制御スライド番号 16ETBRの構造解析結晶学による膜タンパク質の構造解析構造解析数が単粒子解析法により飛躍的に増加：創薬への応用に期待スライド番号 20単粒子解析の具体例：ギャップ結合チャネルギャッ結合の構造解析スライド番号 23Thank you for having the patience to hear me out!