光合色素的色層分析

www.sciences.fundp.ac.be/. ../photosynthese.htm

http://www.sciences.fundp.ac.be/websciences/biologie/Fichesderevision/revision2 fonctionnement/photosynthese.htm

色層分析法(chromatography)

用來分離並確認化合物的技術

主要組成：

固定相 (stationary phase) 流動相 (mobile phase)

原理：

利用混合物中物質對固定相及流動相

親和力的不同，造成分離效果

與固定相親和力大者，易滯留原地

與流動相親和力大者，易隨流動相移動

種類

氣相色層分析

(GC , gas chromagraphy)薄層色層分析

(TLC , thin layer chromagraphy)濾紙色層分析

(PC , paper chromagraphy)

濾紙色層分析

最簡單的色層分析法

固定相－吸附在濾紙中的水(極性)移動相－一種或數種混合的有機溶劑

(非極性)石油醚：90%丙酮

9 ： 1

Rf值(retention factor value)

計算色素b的Rf值

Rf value =色素移動距離

展開液移動距離

Rf值＝ XcmYcm

鑑定未知物

單一化合物以同樣的層析法分離時，必有其特定的Rf值，所以鑑定一些未知化合物時，將測得的Rf值和標準物質的Rf值對照比較，即可初步確定此未知化合物的所屬類別和名稱。

Rf值的應用

光合色素

faculty.clintoncc.suny.edu/.../ photosyn.htm

http://faculty.clintoncc.suny.edu/faculty/Michael.Gregory/files/Bio 101/Bio 101 Lectures/Photosynthesis/photosyn.htm

葉綠素a主要光合色素

呈深綠色

分子式C55H72O5N4Mg

葉綠素b

主要光合色素

呈淡綠色

分子式C55H70O6N4Mg

胡蘿蔔素

厭水性

呈鉻黃色

分子式 C40H56

葉黃素

親水性

呈淡黃色

分子式C40H56O2

實驗步驟

配置展開液

展開液：

4.5ml石油醚＋0.5ml 90%丙酮(石油醚：90%丙酮＝9：1)

(★務必精準配置)置於100ml量筒中，量筒口以鋁箔密封

＊極性大小依序為：水 > 丙酮 > 石油醚

萃取光合色素

取適量烘乾菠菜葉

⇒ 捏碎後放入研缽中，研磨成粉末⇒ 加10 ml 90%丙酮充分研磨⇒ 以雙層紗布過濾，取濾液

層析取一長條濾紙，將前端剪成尖形，

並以鉛筆在離尖端3cm處畫一橫線⇒ 以毛細管吸取濾液(葉汁)，

點一滴在橫線上，重複數次

(★點的面積愈小愈好)⇒ 將濾紙放入含有展開液的量筒中⇒ 將濾紙固定好，以鋁箔封口

(★層析過程切勿晃動展開液)

結果與計算Rf值

展開液上升到濾紙全長的90%時，取出濾紙觀察

(★展開液上升高度切勿超過濾紙)

分別計算各種色素的Rf值

PC結果--石油醚：丙酮= 9：1胡蘿蔔素

葉黃素

葉綠素a

葉綠素b

脫鎂葉綠素a(氧化葉綠素)

脫鎂葉綠素a

www.aw-bc.com/mathews/ ch17/pheophyt.htm

http://www.aw-bc.com/mathews/ch17/pheophyt.htm

第1張展開液晃動致歪斜

第2張展開液晃動

色素呈雙峰

PC 結果(不佳)--石油醚：丙酮= 9：1

以不同比例配置展開液

探討改變展開液成分比例對濾紙色層分析(PC)結果的影響實驗設計：將展開液中90%丙酮和石油醚以不同的比例(體積比)調配，觀察色層分析的結果。

建中59th張育唐、莊淯全、郭英樹、陳建彰

PC結果討論1

光合色素的色層分析以丙酮、石油醚為展開溶劑(皆具揮發性，產生牽引力)這些溶劑均為非極性，因此愈是脂溶性的色素便會跑得愈前面

PC結果討論2

分辨葉綠素a和b，除了看顏色外，葉綠素a總是跑在葉綠素b前面分辨胡蘿蔔素和葉黃素，除了看顏色外，胡蘿蔔素總是跑在葉黃素前面

薄層色層分析法TLC(thin-layer chromatography)固定相附在金屬板上的一層矽膠薄膜探討不同比例的展開液在TLC片中對薄層色層分析(TLC)結果的影響。實驗設計：將90%丙酮與石油醚以不同的比例配成展開液，觀察在TLC片中色層分析的結果。

建中59th張育唐、莊淯全、郭英樹、陳建彰

TLC結果討論展開液為90%丙酮：石油醚＝5：5時的分層效果最好，可以看到十幾種色帶。

依Rf值由大至小排列應為：

胡蘿蔔素

葉綠素a

葉綠素b

葉黃素

色層分析法(chromatography)種類濾紙色層分析Rf值(retention factor value)光合色素葉綠素a葉綠素b胡蘿蔔素葉黃素實驗步驟配置展開液萃取光合色素層析結果與計算Rf值PC結果--石油醚：丙酮= 9：1PC 結果(不佳)--石油醚：丙酮= 9：1以不同比例配置展開液PC結果討論1PC結果討論2