강황이 LPS로 유도된 폐손상에 미치는 영향 (89-102).pdf · 89 강황이 LPS로 유도된 폐손상에 미치는 영향 오지석1, 양수영 1, 김민희2, 남궁욱2,

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강황이 LPS로 유도된 폐손상에 미치는 영향

오지석1, 양수영1, 김민희2, 남궁욱2, 박양춘1

1대전대학교 한의과대학 폐계내과학교실, 2대전대학교 한의과대학 신경생리학교실

Original Article

Effects of Root of Curcumin longa on LPS-induced Lung Injury

Ji-Seok1, Su-Young Yang1, Min-Hee Kim2, Uk Namgung2, Yang-Chun Park11Division of Respiratory System, Dept. of Internal Medicine, College of Oriental Medicine, Daejeon University

2Dept. of Neurophysiology, College of Oriental Medicine, Daejeon University

Objectives: This study aimed to evaluate the effects of root of Curcumin longa (RCL) on LPS-induced COPD (chronic obstructive pulmonary disease) model.Materials and Methods: Extract of RCL was treated to RAW 264.7 cells and LPS-induced COPD mouse model. Then, various parameters such as cell-based protective activity, airflow limitation, accumulation of immune cells and histopathological finding were analyzed.Results: RCL showed a protective effect on LPS-induced cytotoxicity in RAW 264.7 cells. RCL treatment also revealed a protective effect on LPS-induced lung injury in a COPD mouse model. This effect was demonstrated via the reduction of accumulation of immune cells and pathophysiological regulation of caspase 3, elastin and collagen in lung tissue. Conclusions: These data suggest that RCL has a pharmaceutical property on lung injury. This study provides scientific evidence for the efficacy of RCL for clinical application to COPD patients.

Key Words : Root of Curcumin longa, chronic obstructive pulmonary disease, emphysema, RAW 264.7 cells

⋅Received：17 August 2012 ⋅Revised：31 October 2012 ⋅Accepted：31 October 2012⋅Correspondence to：박양춘(Yang-Chun Park)

대전광역시 중구 대흥동 22-5 대전대학교대전한방병원 호흡기내과Tel：+82-42-229-6919, Fax：+82-42-254-3403, E-mail：[email protected]

서 론

만성폐쇄성폐질환 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 세계 사망원인 4위를 차지하고 있으면서 지속적인 사망률의 증가가 예측되는 주요

질병이다1). COPD의 주된 원인은 흡연이며2,3) 이 밖에 분진, 가스, 증기, 연무 등에 대한 직업적 또는 환경적 노출, 영양 결핍, 유소아 시기의 감염, 유전적 성향, 기도 과민성의 증가, 천식 등이 발병의 위험 요소로 작용한다4).

진행된 COPD의 병리적 특징은 흡연 등의 자극

에 의해 반복적으로 손상 받은 폐조직에서 호중구, CD8+ 세포, B 세포, 대식세포, 수지상세포 등의 축적과 염증 관련 cytokine의 작용으로 만성 염증이 기도 개형으로 이어져 기도 저항의 증가와 폐실질의

파괴를 가져오는 것이다5,6). 폐실질의 파괴는 탄성반동 (elastic recoil)의 감소를 가져와 폐유순도 (lung compliance)의 증가를 초래하며 이는 기도 저항의 증가와 함께 COPD에서 기류제한을 나타나게 하는 가장 중요한 기전으로 작용한다7,8). 아직까지 기존의 치료는 COPD에서의 기류제한에 대하여 부분적으로만 가역적으로 작용하며 지속적으로 진행하는

대한한의학회지 제34권 제1호(2013년 3월)J Korean Oriental Med 2013;34(1):89-102

(90) 대한한의학회지 제34권 제1호 (2013년 3월)

90

COPD를 늦추거나 소기도나 폐실질의 염증을 억제할 수 있는 근본적인 치료방법은 없는 실정이다9,10).

본 연구에서는 만성폐쇄성폐질환의 실험적 병태

모델로 그람 음성균의 세포벽 구성성분인 lipopolysaccharide (LPS)를 기관지내에 투여하는 방식을 이용하였다. LPS는 호중구, 대식세포 등의 면역세포를 자극하여 TNF-α, IL-1β 등 염증성 cytokine들을 분비시켜 염증반응을 일으킴으로써 폐손상을 유도

하며 이러한 반응은 특히 COPD의 급성 악화와 유사하다11).

한의학에서 COPD의 만성기관지염 양상은 咳嗽,

痰飮의 범주에 해당하고, 폐기종 양상은 肺脹, 喘證의 범주에 속하는 것으로 宣肺祛邪, 健脾益腎하거나 益氣定喘, 補腎陰, 補腎陽하는 치법을 응용하고 있다12).

강황 (Root of Curcumin longa: RCL)은 생강과에 속하는 다년생 초본식물인 강황의 뿌리줄기를 건조

한 것으로13), 전통적으로는 破血行氣, 通經止痛의 목적으로 사용되어 왔으나14), 최근 강황을 대상으로 천식 동물모델에서의 면역조절 효과15)와 다양한 균

주를 대상으로 한 항염증 및 항산화 효과16)에 대한

보고가 있었고, 강황 유래 성분인 curcumin의 호흡기질환을 포함한 다양한 효과에 대한 연구들17-25)이

있었다. 한편 COPD에 대한 한약의 효과를 평가한 연구

는 지속적으로 증가하여 金銀花와 봉독이 LPS로 유도된 COPD 동물모형에서 염증매개세포들과 염증 사이토카인의 발현 및 폐조직의 손상을 억제한다는

보고가 있었으며26,27), elastase로 유도된 COPD 모형에서의 폐손상 보호효과에 대한 수종 처방들의 효과

를 평가한 연구들28-32)이 있었다.본 연구에서는 폐손상에 대한 강황의 보호효과를

조사하기 위하여 LPS로 폐손상을 유도한 동물모델을 이용하였다33). 먼저 대식세포에서 유래된 RAW264.7 세포에서 항염증 효과를 평가하였으며 LPS의 기도흡입 동물모델에서 기도과민성, 염증관련 세포의 발현, 폐조직을 구성하거나 세포의 사멸에 관련된 단백질 인자들의 생성수준에 대한 영향을

각각 기도저항 측정, 유세포분석 및 면역형광염색

분석을 통하여 조사하였다. 본 실험결과 강황은 LPS로 유도한 폐손상에 대하여 염증억제 및 보호효과를 나타냄을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.

연구재료와 방법

1. 재료

1) RAW 264.7 세포실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 mouse

macrophage로 한국세포주 은행 (Korea)에서 구입하였다.

2) ICR 수컷 생쥐실험동물은 대전대학교 동물실험윤리위원회 규정

에 따라 취급하였다 (승인번호: DJU-2011-021). Albino ICR 계열의 수컷 생쥐를 구입하여 고형 사료와 물을 어떠한 제약 없이 섭취하도록 하였으며, 온도는 22-24oC, 습도는 50±10 %가 유지되도록 하고, 조명은 밤낮 주기 (12시간 주/야)가 조절되는 실험실 환경에서 사육하였다.

3) 약재 추출강황 (Root of Curcumin longa: RCL) (lot no.

K370910, cultivated at Sichuan province in China in 2009)은 (주) 휴먼허브 (Kyeongbuk, Korea)에서 지원받아 실험에 사용하였다. 강황 50 g에 70% EtOH 500 ㎖를 가하여 환류 추출기에서 3시간 동안 가열하여 얻은 액을 여과하였다. 이를 감압 증류장치 (Buchi B-480, Switzerland)로 농축하고, 다시 동결 건조기 (Eyela FDU-540, Japan)를 이용하여 완전 건조한 추출물을 냉동 (-84oC) 보관하면서 생리식염수에 적당한 농도로 희석하여 사용하였다. 최종적으로 강황의 초기 약재 180 g으로부터 6.6 g의 추출물을 얻어 3.7%의 수율을 나타내었다.

4) 시약본 실험에 사용한 lipopolysaccharide (LPS)는

Sigma에서 구입하였으며, 1 ㎎/㎖의 농도로 증류수

(91)오지석 외 4명 : 강황이 LPS로 유도된 폐손상에 미치는 영향

91

세포 생존율 (%) =시료처리군의 흡광도

× 100정상군의 흡광도

Penh = Pause ×PEP

Pause =TE - TR

PIP TRPEP: peak expiratory pressure, PIP: peak inspiratory pressureTE: expiratory time, TR: relaxation time

에 녹여 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. 그 밖에 anti-elastin rabbit polyclonal antibody (Calbiochem, USA), monoclonal anti-collagen (Sigma, USA), cleaved caspase 3 (Cell Signaling, USA), fluorescein goat anti-mouse IgG (Invitrogen, USA), Rhodamine Red-X goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, USA), Hoechst 33258 (Sigma, USA) 등을 사용하였다.

2. 방법

1) 세포 배양RAW 264.7 cell은 10% fetal bovine serum

(FBS)과 penicillin (100 units/㎖)/streptomycin (100 ㎍/㎖)이 첨가된 DMEM media (Lonza, USA)로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. Cell은 100 ㎜ culture dish (SPL, Korea)에서 충분히 증식시킨 후, 3일 간격으로 계대 배양하였다.

2) 세포 생존율MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetr

azolium bromide] 환원법34)을 이용하여 측정하였다. 먼저 96 well plate에 1 × 105 개의 RAW 264.7 cell을 분주하고, (i) 정상군 (생리식염수), (ii) LPS (1 ㎍/㎕) 처리 대조군, (iii) LPS (1 ㎍/㎕)와 강황 추출물을 각각 농도별 (10 ㎍/㎕ - 3000 ㎍/㎕)로 처리한 실험군으로 나누어, 37℃, 5% CO2 incubator에서 각각 18시간동안 배양하였다. 각 well에 MTT solution을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후, 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

세포의 생존율은 다음과 같이 계산하였다.

3) LPS 폐손상 모델33)

LPS 유발 폐손상 모델은 Vernooy 등33)의 방법을 일부 수정하여 사용하였다. 7주령 ICR계 수컷 생쥐에 대해 LPS를 기도에 1 ㎍/㎕의 농도로 100 ㎕ 흡

입시킨 후 2일 동안 경과를 지켜본 후 폐조직 손상을 확인하였다. LPS는 마취를 약간만 시킨 후 움직임이 없을 때 생쥐의 앞니를 고정시킨 상태에서 코

에 LPS를 흡입시켰다. 실험군은 (i) 아무런 처리를 하지 않은 정상군 (Intact), (ii) LPS (1 ㎍/㎕, 100 ㎕) 처리한 대조군 (LPS), (ⅲ) LPS 처리 후 dexamethasone 0.5 ㎎/㎏ 투여한 대조군 (PC), (ⅳ) LPS 처리 후 강황 추출물 (20, 40 ㎎/㎏) 투여군 (RCL20, RCL40)으로 나누었다. 정상군과 대조군은 14일간 멸균 증류수를 경구 투여하였으며, 각각의 실험군은 14일간 약물을 경구 투여하였다. 실험이 끝난 후 각 군 생쥐의 폐조직을 분리하였다.

4) Enhanced pause (Penh) 값 측정기도과민성의 측정은 whole body plethysmograph

s인 Biosystem XA (Buxco Research system, USA) 장비를 사용하여 Finotto 등35)의 방법에 따라 실시하였다. 기도저항 수치인 Penh 값은 다음과 같으며 Biosystem XA software (Buxco Research System, USA)를 이용하여 계산하였다.

실험동물에 methacholine (MCH) 수용액을 6.25, 12.5, 25 ㎎/㎖의 농도로 분무 흡입시키고, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성은 10분 동안 연속적으로 검사하였다.

5) 폐세포 분리폐조직을 잘게 절편한 후 DMEM 배지 3 ㎖에

collagenase 35 ㎕를 넣은 뒤, 37℃, shaking 배양기에서 40분 동안 2회 이상 조직을 분해하여 폐세포를 분리하였다. 분리된 폐세포는 cell strainer에 통과시켜 세포이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제

거하였다. 폐조직에서 분리한 세포 및 혈액은 ACK 용액 (8.3 g NH4Cl, 1 g KHCO3, in 1 ℓ of


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demineralized water + 0.1 mM EDTA)을 3분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시 1% FBS가 첨가된 인산완충용액 (phosphate buffered saline; PBS)로 세척한 후, 총 세포수를 측정하였다.

6) 유세포분석 분리한 말초혈액 단핵세포 (peripheral blood mon

onuclear cell: PBMC)와 폐조직에서 추출한 세포들을 대상으로 4℃에서 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 하였다. 각각에 anti-Neutrophil -FITC, anti-Gr-1-PE, anti-CD8-FITC, anti-CD4-PE 등을 넣고, 30분간 4℃에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 neutrophil+Gr-1+, CD8+ 및 CD4+ 세포수를 백분율 (%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대

세포수 (absolute number)를 산출하였다.

7) Hemotoxylin & Eosin (H-E) 염색폐조직은 -20°C에서 냉동시킨 후 저온유지장치를

이용하여 20 ㎛의 두께로 잘라 슬라이드에 붙였다. H & E staining을 실시하기 위하여 슬라이드를 hematoxylin에 1분 동안 담가 둔 후 흐르는 증류수에 여러 번 세척 후 eosin에 30초간 담그고 흐르는 증류수로 여러 번 세척하였다. 그 다음 70% → 95% → 100% ethanol에 여러 번 씻으며 염색을 적당히 제거한 후 xylene에 1분간 담가두었다. 마지막으로 mounting medium xylene을 이용하여 cover-slide를 영구 부착하였으며, 이러한 샘플들은 광학현미경 (Nikon, Japan)을 통해 관찰하였다.

8) 면역형광염색 생쥐 폐조직은 -20°C에서 냉동시킨 후 저온유지

장치를 이용하여 20 ㎛의 두께로 잘라 슬라이드에 부착시켰다. 이중 면역형광 염색법을 수행하기 위해, 4% paraformaldehyde, 4% sucrose가 혼합된 PBS에 45분 동안 슬라이드를 넣어 조직을 고정하였다. 비특이적 결합을 막기 위해 blocking buffer에

담근 후 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 1차 항체는 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 정해진 비율로 혼합하여 처리한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 후 PBST (PBS plus 0.1% triton X-100)로 조직을 씻어내고, 2.5% BSA, 2.5% horse serum을 함유하고 있는 blocking buffer에 Fluorescein-goat anti-mouse antibody (green)와 Rhodamine-goat anti-rabbit antibody (red)를 1:400으로 혼합하여 암실에서 1시간 30분 동안 2차 항체 처리를 수행하였다. 2차 항체 처리 후 3회에 걸쳐 PBST로 세척을 수행하였다. Hoechst 핵 염색을 수행하는 경우 1회 세척 후 0.25% Hoechst 33258 형광염료를 함유한 PBST 용액으로 처리 후 다시 PBST 용액으로 세척하였다. 2차 항체는 빛에 민감하기 때문에 반응시간 동안 암실에서 수행하였다. 마지막으로 gel mount medium을 이용하여 cover-slide를 영구 부착하였으며, 염색된 세포들은 형광현미경 (Zeiss fluorescent microscope)을 통해 관찰하였고, 디지털 카메라로 찍은 모든 images는 Adobe Photoshop (version 7.0)을 이용하여 녹색과 적색의 밝기와 강도를 같은 비

율로 조절하여 관찰하였다. 그리고 Photoshop program의 Layer blending mode options를 이용하여 images를 중복시켜 관찰함으로써 각 단백질의 발현 위치를 관찰하였다. 본 실험에 사용한 1차 항체는 anti-elastin rabbit polyclonal antibody (1:500, Calbiochem, Germany), monoclonal anti-collagen (1:400, Sigma, USA), 그리고 cleaved caspase-3 antibody (1:500, Cell Signaling, USA) 등 이었다.

9) 조직 sample의 현미경 분석면역형광조직 및 H & E 염색조직은 Nikon 형광

현미경을 이용하여 분석한 후 현미경에 부착된 디지

털 카메라로 이미지를 포착하여 ACT-1 software를 이용하여 분석하였다. 중첩이미지는 Photoshop 프로그램 상의 image blend 모드를 이용하여 분석하였다.

10) 통계분석


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Fig. 1. MTT assay of RAW 264.7 cells to

determine cell viability.

(A) RAW 264.7 cells were treated with different concentrations of

RCL for 16 hr and harvested for MTT assay. (B) RAW 264.7 cells were treated with LPS (1 ㎍/㎕) alone or in the presence of 10 - 30 ㎍/㎖ of RCL. Values represent the mean ± SEM (n=3).

***: p


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Fig. 2. Effect of RCL on airway hyperresponsiveness byMCH in LPS-induced mice. Mice were

inhaled with LPS once, and then treated withPC (dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL (20, 40㎎/㎏) for 14 days. MCH : methacholine.

Values represent the mean ± SEM (n=4).

Fig. 3. Effect of RCL on Neutorphil+Gr-1+ cell rate ofPBMC in LPS-induced mice. Mice wereinhaled with LPS once, and then treatedwith PC (dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL

(20, 40 ㎎/㎏) for 14 days. TheNeutorphil+Gr-1+ dual positive cells incircle were calculated as a percentage of

positive cells.

에 비해 기도과민성이 유의하게 증가하였다

(p


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Fig. 4. Effect of RCL on CD4+ and CD8+ cell rateof PBMC in LPS-induced mice. Micewere inhaled with LPS once, and thentreated with PC (dexamethasone, 0.5㎎/㎏), RCL (20, 40 ㎎/㎏) for 14 days.The CD4+ cells in right lower quadrantwere calculated as a percentage ofpositive cells. The CD8+ cells in leftupper quadrant were calculated as a

percentage of positive cells.

Fig. 5. Effect of RCL on Neutorphil+Gr-1+ cell rateof lung tissue in LPS-induced mice. Micewere inhaled with LPS once, and thentreated with PC (dexamethasone, 0.5㎎/㎏), RCL (20, 40 ㎎/㎏) for 14 days.The Neutorphil+Gr-1+ dual positive cellsin circle were calculated as a percentage

of positive cells.

Fig. 6. Effect of RCL on CD4+ and CD8+ cellrate of lung tissue in LPS-inducedmice. Mice were inhaled with LPSonce, and then treated with PC

(dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL (20,40 ㎎/㎏) for 14 days. The CD4+ cellsin right lower quadrant were

calculated as a percentage of positivecells. The CD8+ cells in left upperquadrant were calculated as a

percentage of positive cells.

㎎/㎏ 처리군에서 각각 27.8%, 25.1%로 나타나 LPS 처리군에 비하여 감소하였다 (Fig. 5).

6. 폐조직 내 CD4+ 세포와 CD8+ 세포 함량에

미치는 영향

폐조직 내 CD4+ 세포 함량은 정상군에서 12.6%, LPS 처리군에서 24.7%로 나타나 LPS 처리

군이 정상군에 비해 증가하였으며, dexamethasone을 처리한 양성대조군에서 13.3%, 강황 20, 40 ㎎/㎏ 처리군에서 각각 14.2%, 10.1%로 나타나 LPS 처리군에 비하여 감소하였다. 폐조직 내 CD8+ 세포 함량은 정상군에서 2.32%, LPS 처리군에서 3.24%로 나타나 LPS 처리군이 정상군에 비해 증가하였으며, dexamethasone을 처리한 양성대조군에서 2.30%, 강황 20, 40 ㎎/㎏ 처리군에서 각각 2.86%, 1.64%로 나타나 LPS 처리군에 비하여 감소하였다 (Fig. 6).

7. 조직학적 변화

정상 폐조직과 LPS, LPS와 dexamethasone 그리고 LPS와 강황을 농도를 달리하여 처리한 폐조직을 H&E 염색을 통해 비교하였다. 정상 폐조직에서는 작은 크기의 폐포가 균일하게 관찰되었으

나, LPS를 처리한 경우 폐포의 형태 및 크기가 균일하지 않고, 확장된 형태가 관찰되었다. LPS와 dexamethasone, LPS와 강황을 처리한 경우 폐포 부분의 면적은 정상 조직과 비슷하거나 약간 확

장된 형태이나 LPS만 처리한 경우보다는 다소 크


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Fig. 7. Histological analysis of lung tissues. Micewere inhaled with LPS once, and thentreated with PC (dexamethasone, 0.5㎎/㎏), RCL (20, 40 ㎎/㎏) for 14 days.Lung tissues were examined under brightfield microscope (A: 200 × magnification,B: 400 × magnification) after H&E

staining.

Fig. 8. Histological analysis of lung tissues afterHoechst nuclear staining. Mice wereinhaled with LPS once, and then treatedwith PC (dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL(20, 40 ㎎/㎏) for 14 days. Lung tissueswere examined under fluorescencemicroscope (A: 200 × magnification, B:400 × magnification) after Hoechst

nuclear staining. Asterisks denote alveoli.

Fig. 9. Immunofluorescence analysis for caspase 3in lung tissue. Mice were inhaled withLPS once, and then treated with PC(dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL (20, 40㎎/㎏) for 14 days. Lung tissues wereexamined under microscope (A: 200 ×magnification, B: 400 × magnification)after immunofluorescence stainingagainst caspase 3. Asterisks denote

alveoli.

기가 작은 것으로 관찰되었다. 또한 LPS 처리시 폐포 주변으로 세포가 많이 몰려있는 것으로 관

찰되었다 (Fig. 7).

약물처리에 따른 세포수의 변화를 관찰하기 위

해 Hoechst 33258을 이용한 세포핵의 청색형광염색을 통해 분석하였다. 정상 조직의 경우 폐포 부분을 제외한 조직 부위의 핵들은 일정한 분포를

나타내는 반면, LPS를 처리한 경우 폐포 주변 부위에서 세포수가 부분적으로 높은 밀도를 나타내

었다. LPS와 dexamethasone, LPS와 강황을 처리한 경우 염색된 핵의 밀도는 LPS만 처리한 경우에 비해 핵의 밀도가 정상군과 유사한 수준으로

염색된 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 8).

8. Caspase 3 생성에 미치는 영향

LPS와 강황 처리에 의한 폐조직상에서 caspase 3 단백질 생성 및 분포를 면역형광염색 방법으로 조사하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상군에서는 단백질 신호가 관찰되지 않았으나 LPS를 처리한 경우 폐포 주변을 중심으로 뚜렷한 caspase 3 단백질 신호가 탐지되었으며 LPS와 dexamethasone, LPS와 강황을 처리한 경우 caspase 3 발현이 다소 약해지는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 9).

9. Elastin 및 Collagen 생성에 미치는 영향

LPS와 강황 처리에 의한 폐조직상의 elastin, collagen 단백질의 생성 및 분포를 면역형광염색방법에 의해 조사하였다. 정상 폐조직에서는 전체적으로 폐포 주변에 일정한 수준으로 elastin 및 collagen 단백질이 관찰되었고, LPS를 단독으로 처리한 경우 elastin 및 collagen 단백질 신호는 조금 약하게 관찰되었다. LPS와 dexamethasone, LPS와 강황을 처리한 경우 elastin 단백질의 생성수준은 정상군과 비슷한 형태로 조직 전체에 걸

쳐 고르게 관찰되었고, collagen 단백질의 생성수준은 폐포 주변에서 강하게 관찰되었다 (Fig. 10).


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Fig. 10. Immunofluorescence analysis for elastin andcollagen in lung tissue.

Mice were inhaled with LPS once, and then treatedwith PC (dexamethasone, 0.5 ㎎/㎏), RCL(20, 40 ㎎/㎏) for 14 days. Lung tissueswere examined under microscope (A: 200× magnification, B: 400 × magnification)after immunofluorescence staining

against elastin. Asterisks denote alveoli.

고 찰

COPD는 기침, 객담, 호흡곤란이 주증상으로 나타나고 기도의 변형과 폐실질의 파괴를 동반하여 한

의학에서는 呼吸促急한 喘證 및 肺傷證의 하나로 咳

而上氣하고 煩燥하는 肺脹證의 범주에 해당한다12). 이러한 호흡기질환에 대한 活血化瘀의 치법 적용은

일찍부터 제시되어왔는데 朱36)는 “肺脹而咳或左或右不得眠此痰與瘀血碍氣而病”이라고 肺脹의 병인을 痰과 瘀血로 보았고, 唐37)은 “盖人身氣道不可有壅滯內有瘀血則阻碍氣道不得升降是以壅而爲咳

…痰飮爲瘀血所阻則益冲犯肺經”하므로 祛瘀하면 痰水自消한다고 하였다. 강황은 活血祛瘀藥에 속하며 破血行氣, 通經止痛의 主治를 가지고 있으나 최근 연구에서 강황과 그 구성 성분이 천식을 비롯한

호흡기질환에 대한 효과15,17-20)도 가지고 있는 것으

로 나타나 본 연구에서 COPD 모델을 이용하여 폐손상에 대한 효과를 평가하고자 하였다.

본 연구에서는 COPD의 실험적 병태 모델로 그람 음성균의 세포벽 구성성분인 lipopolysaccharide

(LPS)를 기관지내로 흡인시키는 방식을 이용하였다. LPS는 선천적 면역력을 활성화시키는 신호로 작용하여 혈액 내의 LPS-결합단백질 (LPS-binding protein, LBP)과 결합한 후 대식세포막에 존재하는 CD14와 결합하게 되는데 이러한 경로를 통해 활성화된 대식세포는 TNF-α, IL-1β 등과 같은 초기 반응 사이토카인의 분비를 일으켜 다른 대식세포, 호중구, 폐포 상피세포, 혈관 내피세포, 섬유 모세포 등을 자극한다38,39).

먼저 대식세포 유래 RAW 264.7 세포를 이용하여 LPS의 직접 처리에 대한 세포의 생존력에 미치는 강황의 영향을 살펴보았고, 실험동물의 기도에 LPS를 흡인시켜 폐손상을 유발한 다음 기도저항, 폐조직의 형태적 변화, 폐조직 구성 및 세포자사와 관련된 단백질에 대한 강황의 효과를 생화학적 및

조직학적 분석을 통하여 평가하였다. RAW 264.7 세포에 LPS 처리 후 MTT assay를

통해 세포생존율을 조사한 결과, LPS만 단독으로 처리한 경우 생존율이 정상군에 비해 44%로 감소하였고, 강황을 10 ㎍/㎕과 30 ㎍/㎕을 처리한 경우에는 모두 생존율이 유의하게 증가하는 것을 확인함으

로써 LPS에 의한 자극에 보호 효과가 있다고 생각된다. 이에 세포 사멸에 있어서 세포의 apoptosis가 관여하는 여부를 알아보고자 apoptosis 과정에 주로 관여하는 단백질인 caspase 3를 면역형광염색을 통해 관찰한 결과, 정상 폐조직에서 관찰되지 않았던 caspase 3 발현이 LPS 단독 처리로 뚜렷하게 나타난 반면 강황의 농도별 처리로 감소하는 결과를 나

타낸 것과 일치하였다. 또한 LPS를 처리한 폐조직은 정상 폐조직의 작고 균일한 폐포와 달리 균일하

지 않고 확장된 형태의 폐포가 관찰되었으나 강황을

투여한 경우 폐포의 확장이 감소하였다. 따라서 강황이 LPS에 의한 폐조직 손상을 억제시킬 수 있다고 판단되며, 이러한 결과는 맥문동40)과 生脈淸肺飮41)의 실험 결과와 동일하였다.

COPD 환자에서 기류 제한은 말초 기도의 개형, 폐포 파괴로 인한 소기도 허탈 및 탄성반동의 감소

와 같은 비가역적 변화와 기도 평활근의 수축, 기도


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염증, 기도내 점액과 삼출물의 증가와 같은 가역적 요소에 기인한다44). 따라서 기도 저항의 측정은 COPD의 가역적 요소를 평가하는 중요한 항목이라고 할 수 있다. 현재 mouse 모델에서 사용하는 폐기능 측정방법 중 적출한 기관 평활근의 수축력을 전

기 혹은 MCH로 자극하여 생체 외에서 검사하는 방법은 다양한 병태생리 인자들의 영향을 반영하지 못

하는 단점이 있고, 마취한 mouse에 기도 삽관을 통해 기도 압력을 측정하는 방법은 기도의 손상과 복

잡한 과정이 필요하다는 단점이 있다45). 본 실험에서는 마취 없이 체적변동기록 상자 안의 mouse에서 호기 및 흡기 압력과 호기 시간 및 이완 시간을 바

탕으로 산출되는 수학적 매개변수로서 기도 폐색에

반응하는 Penh 값46)을 측정하였다. MCH를 이용한 기도 수축 평가에서 강황의 투여는 LPS만 단독으로 투여한 대조군보다 유의하게 기도 수축의 감소를 나

타내어 강황이 기류제한의 개선에 적용될 수 있음을

시사한다.활성화된 호중구는 혈류를 통해 혈관 내피세포로

부터 폐포 상피세포를 지나 폐포강내로 이동하게 되

고 이러한 호중구의 폐포내 침윤은 CXC- chemokines의 생성을 증가시키며 neutrophil elastase는 세포벽의 파괴와 점액 과분비를 유도한다47,48). 또한 CD4+ 세포 중 TH1 (T helper 1) 세포들이 주로 COPD 환자들의 기도에 축적되어 TC1 (T cytotoxic 1) 세포와 함께 CXCR3를 통하여 T 세포의 활성화에 작용한다49). CD8+ 세포 중에는 주로 TC1 세포가 perforin과 granzyme B를 분비하여 1형 폐포세포의 apoptosis를 유도하여 폐기종 형성에 관여한다50). 이에 강황이 호중구와 CD4+ 및 CD8+ 세포에 미치는 영향을 유세포분석을 통하여 평가한 결

과, 특히 폐조직에서 이들 세포의 증가가 억제되었다. 이는 Hoechst 핵 염색 및 H&E 염색에서 LPS 단독 처리로 폐포 주변부에서 침윤된 세포의 증가를

강황의 처리로 정상군와 유사한 정도로 감소시킨 것

과 일치하는 결과로서 강황이 COPD에서 염증세포의 폐포 침윤을 억제하는 효과를 나타낼 수 있음을

시사한다고 사료된다.

단백분해효소의 증가와 항단백분해효소의 감소로

인한 결합조직의 손상은 COPD 발병기전에서 중요한 역할을 한다. 이때 결합조직의 손상은 폐포벽의 주된 구성성분인 elastin의 손상을 말하는데, elastin은 폐조직에서 탄성을 유지하는 물질로 elastin이 분해되면 폐조직의 탄성이 감소된다5). 단백분해효소에 의한 elastin의 분해가 COPD의 주요 병리기전이라는 것은 elastin이 분해될 때 분리되는 desmosine이 COPD 환자의 소변에서 증가하였다는 연구결과51,52)

를 통하여 알 수 있다. 따라서 본 연구에서는 LPS를 이용한 염증매개성 손상을 일으켜 대식세포와 호중

구에서 분비하는 proteinase에 의해 elastin이 분해되는지를 확인하여 이에 대한 강황의 영향을 평가하고

자 하였다. 면역형광염색을 통해 생쥐의 폐조직에서 elastin 단백질의 발현을 조사한 결과 LPS 처리에 의해 감소된 elastin의 발현이 강황의 투여로 일정하게 회복되는 양상을 보여 강황이 elastin의 분해를 억제하는 작용을 하는 것으로 생각된다.

COPD의 병리에서 단백분해효소의 불균형은 주로 elastin 분해효소에 초점이 맞추어져 있으나 collagenase에 의한 collagen 섬유의 분해반응도 역시 폐조직 손상에 관여하는 것으로 알려져 있다53). 본 연구의 면역형광염색 결과, LPS 처리가 collagen 생성수준을 정상군에 비해 감소시켰고, 강황의 처리는 collagen의 생성을 증가시켰다. 이러한 결과는 小靑龍湯, 麥門冬湯 및 宣肺定喘湯이 elsatin과 collagen의 감소를 억제하였던 결과와도 일치하는 것으로29,30,32) 강황이 collagen 합성과정 촉진 및 collagen 분해 억제를 통해 collagen의 생성을 증가시키는 작용을 나타내는 것으로 생각된다.

이상의 결과를 종합해보면 강황은 COPD 모델로서 설계한 LPS 처리를 통해 유발된 폐손상의 병리기전에서 세포의 생존력을 개선시키고, 기류제한을 완화시켜며, 관련 염증세포들의 증가를 감소시킴으로써 폐손상에 대한 보호효과를 나타내어 COPD의 치료약물로서 활용될 수 있을 것으로 사료되며 향후

세포 사멸과 염증세포의 증가를 억제시키는 기전에

대한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.


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결 론

COPD에 대한 강황의 효능을 평가하기 위해 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포 손상과 동물모델에서 염증세포의 증식, 조직학적 변화 및 관련된 단백질의 변화를 연구한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. 강황은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 세포독성을 감소시켰다.

2. 강황은 LPS로 유도된 폐손상 동물모델 폐포상피 세포의 중성구, CD4+ 세포, CD8+ 세포의 증가를 억제시켰다.

3. 강황은 LPS로 유도된 폐손상 동물모델에서 폐의 조직학적 손상을 감소시켰다.

4. 강황은 LPS로 유도된 폐손상 동물모델에서 elastin 및 collagen의 감소를 억제시켰다.

이상의 결과로 강황은 LPS로 유도된 폐의 손상을 억제시키고, 관련된 단백질의 발현과 염증세포의 증식을 조절함으로써 COPD에 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

감사의 글

이 논문은 2010년도 정부 (교육과학기술부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연

구사업임 (과제번호: 2010-0010960).

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