건조 혈반(Dried Blood Spots) 중의 아미노산 및 Acylcarnitines의 동시 분석

개요

Agilent Triple Quadrupole LC/MS 시스템을 사용하여 neutral loss 스캔, precursor

ion 스캔 및 MRM (multiple reaction monitoring) 데이터 수집 모드로 건조 혈반 중

37개의 acylcarnitines와 12개의 아미노산을 동시 검출하고 정량할 수 있는 빠른

분석법을 개발하였습니다. 본 에세이에서는 1.6분의 분석 시간으로 하루에

400~500개의 시료를 분석할 수 있었으며, 맞춤형 보고서를 통해 분석의 중요

항목을 신속하게 확인할 수 있었습니다.

저자

M.P. GeorgeAlere Toxicology ServicesGretna, LA USA

David PresserAgilent Technologies, IncSanta Clara, CA USA

Andre Szczesniewski Agilent Technologies, IncSchaumburg, IL USA

Chunli Yu, Kevin McCain, and Jinglan ZhangMount Sinai School of MedicineNew York, NY USA

본 자료는 연구용으로 제작된 임상 연구 자료입니다. 진단용으로 사용하지 마십시오.

응용 자료

2

실험

시약 및 표준물질

질병통제센터 (Centers for Disease Control, CDC)에서 혈액 목록에 대한 참조 표준물질을 확보하였고, 아미노산 및 acylcarnitines의 isotopic 내부 표준물질 혼합물은 Cambridge Isotope Laboratories(각 제품의 카탈로그 번호는 NSK-A 및 NSK-B)에서 구했습니다. 바이알의 내용물은 200 mL의 메탄올로 희석하여 실험용 isotopic 내부 표준물질 용액으로 만들었습니다. 표 1에는 20 °C 이하의 온도에서 보관된 isotopic 내부 표준물질의 실험용 용액(working solutions) 농도가 기술되어 있습니다. Fisher Scientific에서 메탄올과 이소프로필 알코올을 확보하였고 Regis Chemicals에서 butanol-HCl를 확보하였습니다.

장비

이 분석법은 Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS와 Agilent 1200 시리즈 G1367A Well-Plate 자동 시료 주입기가 함께 구성된 Agilent 1200 시리즈 LC 시스템을 사용하여 개발되었습니다. 장비 조건은 표 2에 나와 있습니다.

시료 전처리

적합한 isotopic 내부 표준물질이 포함된 100 µL의 메탄올을 사용하여 30 °C에서 30분간 혈반 시료(3.2 mm)를 추출했습니다. 그런 다음 0.45 µm Low-Binding Hydrophilic PTFE 필터

(Millipore, Cat # MSRLN0410)를 사용하여 추출한 시료를 각각 필터링하고 60 °C에서 건조시킨 후, butanol-HCl(100 µL)로 60 °C에서 30분간 유도체화하고, 40 °C에서 20분간 건조시켰습니다. 그리고 나서 주입 전에 메탄올과 물을 80:20으로 혼합한 100 µL 용액으로 희석 용매를 변경하였습니다.

개요

건조 혈반 (DBS) 분석은 1960년대에 Robert Guthrie가 페닐케톤뇨증 연구에 bacterial inhibition assay를 도입하면서 처음 시작되었습니다. 몇 년 후 DBS 분석은 아미노산과 acylcarnitines 분석에 bacterial inhibition assay와 기타 기술(면역조직화학법 및 전기영동)이 추가되면서 그 범위가 확대되었고, MS/MS 기법은 1990년대에 도입되었습니다. MS/MS는 여러 가지 기능으로 분석물을 동시에 측정할 수 있으므로, 현재 건조 혈반 분석 기술로 선호되고 있습니다.

본 응용 자료에서는 Agilent Triple Quadrupole LC/MS 시스템을 사용하여 neutral loss 스캔, precursor ion 스캔 및 MRM (multiple reaction monitoring) 데이터 수집 모드로 DBS 중의 아미노산과 acylcarnitines를 신속하게 측정하고 하루에 400~500개의 시료를 처리할 수 있는 애질런트만의 고유한 분석법에 대해 소개해 드립니다.1, 2

본 에세이에서는 스캔 데이터와 MRM 데이터를 함께 사용하여 모든 acylcarnitines와 대부분의 아미노산

(표 8)을 정량할 수 있습니다. 따라서 연구원들은 스캔 데이터를 사용하여 분석물을 정량한 후 이를 MRM 정량 분석 결과와 비교할 수 있으므로, 화학적 간섭으로 인한 데이터 해석 오류의 가능성을 없앨 수 있습니다.

2

내부 표준물질 농도 (nmol/mL)

Glycine-D3 12.5Alanine-D4 2.5Valine-D8 2.5Leucine-D3 2.5Methionine-D3 2.5Phenylalanine-D6 2.5Tyrosine-D6 2.5Aspartate-D3 2.5Glutamate-D3 2.5Ornithine-D2 2.5Citrulline-D2 2.5Arginine-D5 2.5C0-Carnitine 0.76C2-Carnitine 0.19C3-Carnitine 0.04C4-Carnitine 0.04C5-Carnitine 0.04C8-Carnitine 0.04C14-Carnitine 0.04C16-Carnitine 0.08

표 1. 실험용 내부 표준물질의 농도

3

분석 파라미터

질량 분석기는 neutral loss 스캔, precursor ion 스캔, MRM의 세 가지 모드에서 실행되었습니다. 주입 프로그램을 사용하여 Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS에서 세 가지 모드를 순차적으로 실행했습니다. 이 주입 프로그램에서는 각 시료를 세 번 주입하고 세 가지 acquisition 모드에 따라 acquisition 파라미터를 자동으로 변경했습니다. 그림 1은 동일한 DBS 시료에 대해 세 가지 스캔을 연속적으로 실행한 representative reconstructed total ion current chromatograms (RTICCs)를 보여 주고 있습니다.

3

LC 분석 조건컬럼 None주입량 5 µL자동 시료 주입기 온도 6 °C니들 세척 Flush port (50:25:25 H2O, IPA:MeOH:H2O, 5초)이동상 A = H2O + 0.1% formic acid

B = methanol + 0.1% formic acid분석 시간 1.8 min유속 0.5 mL/minIsocratic 분석 A = 20%, B = 80%MS 분석 조건 (6460)이온 모드 Positive, ESI 건조 가스 온도 300 oC Sheath Gas 온도 300 oC건조 가스 유속 5 L/minNnebulizer 압력 60 psiCapillary voltage 4000 VCharging voltage 2000 VMRM acquisition Q1 peak 및 Q2 peak widths = 0.7 m/z Delta EMV 200 V

표 2. LC 및 MS 분석 조건

x105

00.250.5

0.751

1.251.5

1.752

2.252.5

2.753

3.253.5

3.754

4.254.5

4.755

5.255.5

5.756

6.256.5

6.757

7.257.5 1 1 2 2 3 3

Counts vs. Acquisition Time (min)0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55

Precursor Ion Scan Neutral Loss Scan MRM

Precursor Ion 스캔, Neutral Loss 스캔 및 MRM을 이용한 DBS 분석

그림 1. 동일한 건조 혈반 시료에 대한 세 가지 순차적인 스캔을 보여주는 Reconstructed Total Ion Current Chromatogram (RTICC).

4

Nitrogen gas

Scanning 140 to 270 m/z

MS1 MS2Collision

Cell

Scanning 38-168 m/z

PrecursorProducts

102 m/z의 neutral loss 스캔을 이용해 시료 중 8개의 아미노산을 분석했습니다(그림 2). 이들 8개의 아미노산을 MS/MS할 경우, precursor ion m/z값과 product ion m/z값 간에는 동일하게 102 Da 차이가 납니다. 첫 번째 quadrupole에서는 140~270의 m/z 범위를 스캔하였습니다. 세 번째 quadrupole(두 번째 quadrupole은 fragmentation 수행)에서는 첫 번째 quadrupole과의 m/z 차이가 고정값

(102 Da)으로 설정되었으며, 38~168의 m/z 범위를 스캔하였습니다. 특정 precursor m/z와 product ion의 알려진 neutral loss m/z (102)를 이용하여 각 아미노산을 확인할 수 있습니다.사용된 분석 파라미터는 표 3에서 볼 수 있으며, 대표적인 스캔은 그림 3에 나와 있습니다.

Neutral Loss (m/z)

MS1 From (m/z)

MS1 To (m/z)

Scan Time (ms)

Frag Mode

Fragmentor Voltage

Collision Energy (EV)

102.1 140 270 300 Fixed 100 9

Neutral Loss 스캔 모드의 구조도

그림 2. 첫 번째 quadrupole 질량 분석기(MS1)와 세 번째 quadrupole(MS2)는 m/z (질량 대 전하 비)의 차이가 고정값(102 Da)으로 설정되었고, 둘 다 사용자가 정의한 질량 측정 범위(MS1: 140~270, MS2: 38~168)에서 스캔되었습니다.

표 3. Neutral Loss Scan Acquisition Parameters

00.10.2

0.30.40.50.6

0.70.80.91

1.11.21.31.4

1.51.61.71.8x104

228.2

260.2191.2

172.2146.2

244.2222.2

162.1150.2 209.1238.2182.2

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270

+ESI Neutral Loss: 1 (0.5-0.6 min, 15 scans) Frag=100.0V CID@9.0 -[102.1] NBS02.d

Ala

D4-Ala

ValD8-Val

Leu

D3-Leu

Met

D3-Met

Phe

13C6-Phe

Tyr

13C6-Tyr

Asp

Glu

D3-Glu

아미노산의 일반적인 neutral loss 스캔

그림 3. 102 m/z 값을 갖는 아미노산의 Neutral Loss 스캔

5

Nitrogen gas

Scanning 200 to 510 m/z

MS1 MS2Collision

Cell

Static m/z 85

PrecursorProducts

Product Ion(m/z)

MS1 From(m/z)

MS1 To(m/z)

Scan Time(ms)

Frag Mode

FragmentorVoltage

Collision Energy (EV)

85 85 200 510 Fixed 500 25

Precursor Ion 스캔 모드의 구조도

그림 4. 첫 번째 quadrupole 질량 분석기(MS1)가 정의된 질량 범위인 85~200을 스캔하고, 두 번째 quadrupole(MS2)은 m/z 85의 product ions만 검출하도록 고정되었습니다. 특정 precursor m/z와 product ion m/z 85가 결합된 것이 각 acylcarnitine의 특징입니다.

표 4. Precursor Ion Scan Acquisition Parameters

Precursor ion 스캔을 사용하여 시료 중 37개의 acylcarnitines를 분석했습니다

(그림 4). 첫 번째 quadrupole 질량 분석기에서 정해진 m/z 200~510 범위를 스캔하고, 세 번째 quadrupole에서는 m/z 85의 product ions만 검출하도록 고정되었습니다. 특정precursor m/z와 production m/z 85가 결합된 것이 각 acylcarnitine의 특징입니다. 사용된 분석 파라미터는 표 4에 나와 있으며 전형적인 스캔은 그림 5에 나와 있습니다.

x103

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

22.22.42.62.8

33.23.43.63.8

44.24.44.64.8

55.25.4

+ESI Precursor Ion:1 (0.1-0.1 min, 6 scans) Frag=100.0V CID@25.0 (** -> 85.00) NBS02.d

260.30

459.60

311.40227.10437.60

291.40 482.60218.00 347.30

277.40374.10204.00

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

C0

D9-C0

C2

D3-C2

C3

D3-C3

D3-C4

D9-C5

D3-C8

C4-DC

D9-C14

D3-C16

C18-1

C18C16

Acylcarnitines에 대한 일반적인 precursor 스캔

그림 5. Acylcarnitines의 스펙트럼 프로파일

6

Multiple Reaction Monitoring을 사용하여 12개의 아미노산과 37개의 acylcarnitines를 정량 분석했습니다

(그림 6). 첫 번째와 세 번째 quadrupole은 특정 아미노산 또는 acylcarnitines 각각의 precursor ion과 가장 많이 생성된 product ion의 m/z값으로 고정됩니다. 사용된 분석 파라미터는 표 5에 나와 있으며 leucine에 대한 대표적인 MRM transition이 그림 7에 나와 있습니다.

MassHunter Universal integrator를 사용하여 데이터를 분석했으며, 정량 분석에 피크 높이를 사용했습니다.

Nitrogen gas

Static (m/z 188.1)

MS1 MS2Collision

Cell

Static (m/z 86.1)

PrecursorProducts

MRM 모드의 구조도

그림 6. 첫 번째(MS1)와 세 번째 quadrupole(MS2)은 특정 아미노산 또는 acylcarnitines 각각의 precursor ion과 가장 많이 생성된 products ion의 m/z (mass-to-charge ratio)값으로 고정됩니다.

x104

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7+ MRM (191.2000 -> 89.1000) NBS02.d

Counts vs. Acquisition Time (min)0.85 0.9 0.95 1 1.05 1.1 1.15 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 1.5 1.55

Leucine -D3 (IS):192.1>89.1 m/z

Leucine: 188.1> 86.1 m/z

아미노산의 일반적인 MRM 분석

그림 7. Leucine 및 leucine-d3 내부 표준물질 (IS)에 대한 MRM

7

표 5. MRM Acquisition Parameters

Compounds Segment Precursor Ion MS/MS IS IS Conc. (nmol/mL)

Collision Energy (EV)

Alanine 3 146.1 -> 44.0 MRM Alanine-D4 2.5 9Alanine-D4 3 150.1 -> 48.0 MRM <None> 2.5 9Arginine 3 231.2 -> 70.1 MRM Arginine-D4-5C13 2.5 9Arginine-D4-5C-13 3 236.2 -> 75.1 MRM <None> 2.5 9Aspartic Acid 3 246.2 -> 144.1 MRM Aspartic Acid-D3 2.5 9Aspartic Acid-D3 3 249.2 -> 147.1 MRM <None> 2.5 9C0 3 218.2 -> 103.0 MRM C0-D9 0.76 16C0-D9 3 227.2 -> 103.0 MRM <None> 0.76 25C10:1 3 370.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C10:2 3 368.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C10 3 372.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C12:1 3 398.3 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C12:1-OH 3 414.5 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C12 3 400.3 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C12-OH 3 416.5 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C14:1 3 426.4 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C14:1-OH 3 442.5 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C14:2 3 424.3 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C14 3 428.4 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C14-D9 3 437.4 -> 85.0 MRM <None> 0.04 25C14-OH 3 444.4 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C16:1 3 454.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C16:1-OH 3 470.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C16 3 456.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C16-D3 3 459.4 -> 85.0 MRM <None> 0.08 25C16-OH 3 472.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18:1 3 482.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18:1-OH 3 498.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18:2 3 480.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18:2-OH 3 496.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18 3 484.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C18-OH 3 500.4 -> 85.0 MRM C16-D3 0.08 25C2 3 260.2 -> 85.0 MRM C2-D3 0.19 25C2-D3 3 263.2 -> 85.0 MRM <None> 0.19 25C3 3 274.2 -> 85.0 MRM C3-D3 0.04 25C3-D3 3 277.2 -> 85.0 MRM <None> 0.04 25C3-DC 3 360.4 -> 85.0 MRM C3-D3 0.04 25C4 3 288.2 -> 85.0 MRM C4-D3 0.04 25C4-D3 3 291.2 -> 85.0 MRM <None> 0.04 25C4-DC 3 374.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C4-OH 3 304.4 -> 85.0 MRM C4-D3 0.04 25C5:1 3 300.3 -> 85.0 MRM C5-D9 0.04 25C5 3 302.2 -> 85.0 MRM C5-D9 0.04 25C5-D9 3 311.3 -> 85.0 MRM <None> 0.04 25C5-DC 3 388.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C5-OH 3 318.4 -> 85.0 MRM C5-D9 0.04 25C6 3 316.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C6-DC 3 402.3 -> 85.0 MRM C14-D9 0.04 25C8:1 3 342.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C8 3 344.3 -> 85.0 MRM C8-D3 0.04 25C8-D3 3 347.3 -> 85.0 MRM <None> 0.19 25Citrulline 3 232.2 -> 113.1 MRM Citrulline-D2 2.5 9Citrulline-D2 3 234.2 -> 115.1 MRM <None> 2.5 9Glutamic Acid 3 260.2 -> 158.1 MRM Glutamic Acid-D3 2.5 9Glutamic Acid-D3 3 263.2 -> 161.2 MRM <None> 2.5 9Glycine 3 132.1 -> 76.1 MRM Glycine-N15-2C13 12.5 4Glycine-N-15-2C-13 3 134.1 -> 78.1 MRM <None> 12.5 4Leucine 3 188.1 -> 86.0 MRM Leucine-D3 2.5 9Leucine-D3 3 191.2 -> 89.1 MRM <None> 2.5 9Methionine 3 206.2 -> 104.1 MRM Methionine-D3 2.5 9Methionine-D3 3 209.2 -> 107.1 MRM <None> 2.5 9Ornithine 3 189.2 -> 70.1 MRM Ornithine-D2 2.5 14Ornithine-D2 3 191.2 -> 72.1 MRM <None> 2.5 14Phenylalanine 3 222.2 -> 120.1 MRM Phenylalanine-6C13 2.5 9Phenylalanine-6C-13 3 228.2 -> 126.1 MRM <None> 2.5 9Tyrosine 3 238.2 -> 136.1 MRM Tyrosine-6C13 2.5 9Tyrosine-6C-13 3 244.2 -> 142.1 MRM <None> 2.5 9Valine 3 174.2 -> 72.1 MRM Valine-D8 2.5 9Valine-D8 3 182.2 -> 80.1 MRM <None> 2.5 9

8

결과 및 토의정량 및 정성 분석 결과 확인

이 분석법을 사용한 결과 정량 및 정성 데이터를 2분 이내에 획득할 수 있었습니다. 각 분석물의 농도는 isotopic 내부 표준물질의 농도를 이용한 MRM 데이터와 그림 8에 표시된 계산식을 사용했습니다. 더욱 정확한 정량을 위해 6개의 아미노산과 8개의 acylcarnitines에 대한 CDC 참조 표준물질 정량 시 MRM을 사용했으며, 계산된 농도를 해당 표준물질의 실제 농도와 비교하여 도표로 만들었습니다. 표 6과 7, 그림 9는 이러한 도표의 R² 값이 기울기와 마찬가지로 모두 1에 가깝다는 것을 보여 줍니다. 따라서 MRM 정량 분석법의 정확도가 매우 높다는 것을 알 수 있습니다.

타겟 물질의 정량

Canalyte = Ianalyte x Vex x CIS

VBS x IIS x RRF

각 기호의 의미

Canalyte= 타켓 물질의 농도 (mM)

Ianalyte =타켓 물질의 강도(counts per second)

Vex = Specimen 추출량 (mL)

CIS = 내부 표준물질 농도 (mM)

VBS =punch에 포함된 혈액량 (혈구 용적이 50%이고 punch 크기가 3.2 mm인 경우 3.1 µL)

IIS = 내부 표준물질 강도(counts per second)

RRF= 추출 효율성

그림 8. 타켓 물질의 농도 계산

Acylcarnitine Y-Intercept (nmol/mL) Slope R2

C0-Carnitine 2.9040 0.848 0.976

C2-Carnitine 0.7100 1.090 0.981

C3-Carnitine 0.2200 0.910 0.994

C4-Carnitine -0.0099 0.903 0.998

C5-Carnitine 0.0032 1.053 0.988

C6-Carnitine 0.0019 0.997 0.988

C8-Carnitine 0.0406 0.919 0.978

C10-Carnitine 0.0352 0.970 0.977

C14-Carnitine 0.0517 0.813 0.990

C16-Carnitine 0.0254 0.941 0.986

C18-Carninite 0.0598 0.812 0.995

Amino Acid Y-Intercept (nmol/mL) Slope R2

Phenylalanine 13.44 0.9917 0.987Tyrosine 25.99 0.9266 0.992Leucine 23.74 0.8950 0.989Methionine 5.80 0.9770 0.990Valine 15.90 0.8550 0.970Citrulline 4.30 0.9700 0.992

표 6. Acylcarnitines의 실제 농도와 계산된 농도를 비교한 통계 데이터

표 7. 아미노산의 실제 농도와 계산된 농도를 비교한 통계 데이터

9

2.52.01.51.00.50.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

S 0.0904959R-Sq 98.8%R-Sq(adj) 98.7%

S 27.3402R-Sq 98.7%R-Sq(adj) 98.7%

Fitted Line Plot (Concentration nmol/mL)

Fitted Line Plot (Concentration nmol/mL)

C6-Carnitine Target = 0.00186 + 0.9965 C6-Carnitine Achieved

C6-C

arni

tine

Targ

et

C6-Carnitine Achieved

7006005004003002001000

700

600

500

400

300

200

100

0

Phenylalanine Target = -13.44 + 0.9917 Phenylalanine Achieved

Phen

ylal

anin

e Ta

rget

Phenylalanine Achieved

Acylcarnitines와 아미노산의 실제 농도와 MRM에 의해 측정된 농도 간의 높은 상관관계

그림 9. C6-carnitine 에세이 성능(상단)과 phenylalanine 에세이 성능(하단) 통계 도표

10

정량 정보 외에도 아미노산과 acylcarnitines의 상대 농도에 대한 정성 정보가 필요할 수 있습니다. 이 정보는 precursor ion 및 neutral loss 스캔을 실행한 데이터(예: 그림 3과 5)에서 얻었습니다. 해당 데이터는 스캔 모드에서 모든 acylcarnitines와 8개의 아미노산을 분석하여 수집된 것입니다. 일반적으로 수집된 MRM 데이터를 정량 분석 및 맞춤형 보고서에 사용하지만, precursor ion 스캔 및 neutral loss 스캔 데이터를 이용하여 acylcarnitines와 아미노산을 정량할 수도 있습니다. 이러한 데이터는 옵션으로 제공되며, 화학적 간섭으로 인한 데이터의 해석 오류 가능성을 없애기 위해 사용됩니다(표 8).

Compound Segment Transition Scan Analyte Precurosor ProductAlanine 2 146.1 -[102.1] -> 44.0 Neutral Loss Target 146.1 44Alanine-D4 2 150.1 -[102.1] -> 48.0 Neutral Loss ISTD 150.1 48Valine (nl) 2 174.1 -[102.1] -> 72.0 Neutral Loss Target 174.1 72Valine-D8 (nl) 2 182.1 -[102.1] -> 80.0 Neutral Loss ISTD 182.1 80Leucine (nl) 2 188.1 -[102.1] -> 86.0 Neutral Loss Target 188.1 86Leucine-D3 (nl) 2 191.1 -[102.1] -> 89.0 Neutral Loss ISTD 191.1 89Methionine (nl) 2 206.2 -[102.1] -> 104.1 Neutral Loss Target 206.2 104.1Methionine-D3 (nl) 2 209.2 -[102.1] -> 107.1 Neutral Loss ISTD 209.2 107.1Phenylalanine (nl) 2 222.2 -[102.1] -> 120.1 Neutral Loss Target 222.2 120.1Phenylalanine-6C-13 (nl) 2 228.2 -[102.1] -> 126.1 Neutral Loss ISTD 228.2 126.1Glycine (nl) 2 132.1 -[56.0] -> 76.1 Neutral Loss Target 132.1 76.1Tyrosine (nl) 2 238.2 -[102.1] -> 136.1 Neutral Loss Target 238.2 136.1Tyrosine-6C-13 (nl) 2 244.2 -[102.1] -> 142.1 Neutral Loss ISTD 244.2 142.1Aspartic Acid (nl) 2 246.2 -[102.1] -> 144.1 Neutral Loss Target 246.2 144.1Aspartic Acid-D3 (nl) 2 249.2 -[102.1] -> 147.1 Neutral Loss ISTD 249.2 147.1Glutamic Acid (nl) 2 260.2 -[102.1] -> 158.1 Neutral Loss Target 260.2 158.1Glutamic Acid-D3 (nl) 2 263.2 -[102.0] -> 161.2 Neutral Loss ISTD 263.2 161.2Phenylalanine/Tyrosine (nl) 2 222.2 -[102.1] -> 120.1 Neutral Loss Target 222.2 120.1Methionine/Phenylalanine (nl) 2 206.2 -[102.1] -> 104.1 Neutral Loss Target 206.2 104.1Glycine-N-15-2C-13 (nl) 2 134.1 -[56.0] -> 78.1 Neutral Loss ISTD 134.1 78.1Leucine/Phenylalanine (nl) 2 188.1 -[102.1] -> 86.0 Neutral Loss Target 188.1 86Citrulline (nl) 2 232.2 -[119.1] -> 113.1 Neutral Loss Target 232.2 113.1Aspartic Acid/Arginine (nl) 2 246.2 -[102.1] -> 144.1 Neutral Loss Target 246.2 144.1Citrulline-ISTD (nl) 2 234.2 -[119.1] -> 115.1 Neutral Loss ISTD 234.2 115.1Ornithine (nl) 2 189.2 -[119.1] -> 70.1 Neutral Loss Target 189.2 70.1Ornithine-ISTD (nl) 2 191.2 -[119.1] -> 72.1 Neutral Loss ISTD 191.2 72.1Arginine (nl) 2 231.2 -[161.1] -> 70.1 Neutral Loss Target 231.2 70.1Arginine-ISTD (nl) 2 236.2 -[161.1] -> 75.1 Neutral Loss ISTD 236.2 75.1C0 (prec) 1 218.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 218.3 85C2 (prec) 1 260.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 260.3 85C3 (prec) 1 274.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 274.3 85C4 (prec) 1 288.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 288.3 85C5:1 (prec) 1 300.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 300.3 85C5 (prec) 1 302.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 302.3 85C4-OH (prec) 1 304.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 304.4 85C6 (prec) 1 316.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 316.4 85C5-OH (prec) 1 318.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 318.4 85C8:1 (prec) 1 342.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 342.4 85C8 (prec) 1 344.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 344.4 85C3-DC (prec) 1 360.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 360.4 85C10:2 (prec) 1 368.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 368.4 85C10:1 (prec) 1 370.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 370.4 85C10 (prec) 1 372.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 372.4 85C4-DC (prec) 1 374.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 374.4 85C5-DC (prec) 1 388.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 388.5 85C12:1 (prec) 1 398.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 398.5 85C12 (prec) 1 400.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 400.5 85C6-DC (prec) 1 402.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 402.5 85C12:1-OH (prec) 1 414.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 414.5 85C12-OH (prec) 1 416.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 416.5 85C14:2 (prec) 1 424.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 424.5 85C14:1 (prec) 1 426.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 426.5 85C14 (prec) 1 428.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 428.4 85C14:1-OH (prec) 1 442.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 442.5 85C14-OH (prec) 1 444.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 444.5 85C16:1 (prec) 1 454.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 454.6 85C16 (prec) 1 456.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 456.6 85C16:1-OH (prec) 1 470.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 470.6 85C16-OH (prec) 1 472.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 472.6 85C18:2 (prec) 1 480.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 480.6 85C18:1 (prec) 1 482.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 482.6 85C18 (prec) 1 484.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 484.6 85C18:2-OH (prec) 1 496.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 496.6 85C18:1-OH (prec) 1 498.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 498.6 85C18-OH (prec) 1 502.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 502.6 85C0-D9 (prec) 1 227.3 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 227.3 85C2-D3 (prec) 1 263.2 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 263.2 85C3-D3 (prec) 1 277.3 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 277.3 85C4-D3 (prec) 1 291.3 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 291.3 85C5-D9 (prec) 1 311.3 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 311.3 85C8-D3 (prec) 1 347.3 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 347.3 85C14-D9 (prec) 1 437.4 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 437.4 85C16-D3 (prec) 1 459.6 -> 85.0 Precursor Ion ISTD 459.6 85C14:1/C12:1 (prec) 1 426.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 426.5 85C14:1/C16 (prec) 1 426.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 426.5 85C14:1/C2 (prec) 1 426.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 426.5 85C16/C2 (prec) 1 456.6 -> 85.0 Precursor Ion Target 456.6 85C3/C0 (prec) 1 274.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 274.3 85C3/C2 (prec) 1 274.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 274.3 85C3-DC/C10 (prec) 1 360.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 360.4 85C4/C2 (prec) 1 288.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 288.3 85C4/C3 (prec) 1 288.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 288.3 85C5/C3 (prec) 1 302.3 -> 85.0 Precursor Ion Target 302.3 85C5-DC/C8 (prec) 1 388.5 -> 85.0 Precursor Ion Target 388.5 85C5-OH/C8 (prec) 1 318.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 318.4 85C8/C10 (prec) 1 344.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 344.4 85C8/C2 (prec) 1 344.4 -> 85.0 Precursor Ion Target 344.4 85Ornithine-ISTD (nl) 2 191.2 -[119.1] -> 72.1 Neutral Loss ISTD 191.2 72.1Arginine (nl) 2 231.2 -[161.1] -> 70.1 Neutral Loss Target 231.2 70.1

표 8. Neutral Loss Scan 및 Precursor Ion Scan Acquisition Parameters

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맞춤형 결과 보고서

Agilent MassHunter 소프트웨어는 사용자 맞춤형 구성이 가능하므로 DBS 시료 중 아미노산과 acylcarnitines의 농도 및 스캔 스펙트럼을 표시하는 보고서를 생성할 수 있으며, 연구원들은 이를 통해 선천적 대사 작용 장애 여부를 확인할 수 있습니다 (그림 10). 스캔 스펙트럼은 아미노산과 acylcarnitines의 특징적인 패턴을 제공하며, 분석물에 대한 간섭과 비정상적인 상대 농도를 시각적으로 보여 줍니다. 또한 맞춤형 보고서에서는 비정상적인 분석물 농도가 플래그로 표시되고 연구원이 필요로 하는 분석물의 농도비가 계산됩니다.

Instrument Instrument 1 Sample Name NBS-1-96-AC

Position P1-A1 Acq Time 1/20/2010 16:08Dilution 1

Operator Data File NBS-1-961-AC.dInj. Volume Acq Method 100119-NBS-SCN-MRM-ALL-CB2.m

+ Precursor Ion (0.045-0.414 min, 44 scans) (** -> 85.0) NBS-1-961-AC.d

Mass-to-Charge (m/z)

Mass-to-Charge (m/z)

180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540

Coun

tsCo

unts

x105

0

0.5

1

1.5

2

2.5260.2 459.5

227.3

437.5 482.5347.3311.4

277.2202.2 374.2419.3 504.7

Compound Result Normal Flag Response ISTD ISTD Range ResponseC3 0.0 nmol/mL 0-0.98 Low 277341 C3-D3 387052C4 0.0 nmol/mL 0-0.16 Low 119872 C4-D3 635182C5:1 0.0 nmol/mL 0-1.3 Low 2810 C5-D9 868554C4-OH 0.0 nmol/mL 0.0-1.0 Low 23665 C4-D3 635182C6 1.0 nmol/mL 0-0.08 High 50651 C8-D3 990593C5-OH 0.0 nmol/mL 0-0.7 Low 285403 C5-D9 868554

Compound Result Normal Flag Response ISTD ISTD Range ResponseMethionine 0.3 nmol/mL 0.3-15.0 Low 135296 Methionine-D3 1218973Arginine 18.0 nmol/mL 0.3-15.0 High 50716 Arginine-D4-5C13 1752101

Compound Result Normal Flag Response ISTD ISTD Range ResponseLeucine/ 2.4 0.3-1.5 HighPhenylalanineCitrulline/Arginine 4.7 0.3-1.5 High

Batch Data PathC:\MassHunter\data\QQQ\Mt Sinai\100120\QuantResults\NBS003 One Sample.batch.bin

Instrument Instrument 1 Sample Name NBS-1-96-AC

Position P1-A1 Acq Time 1/20/2010 16:08Dilution 1 SampleInformation

Operator Data File NBS-1-961-AC.dInj. Volume Acq Method 100119-NBS-SCN-MRM-ALL-CB2.m

+ Neutral Loss (0.547-0.826 min, 33 scans) NL NBS-1-961-AC.d

130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280

x105

00.20.40.60.8

11.21.41.61.8

2172.1 228.1

191.1260.1146.1

244.1222.0209.1182.1162.1

238.1203.0 217.1

정량 정보 및 정확한 정성 정보를 제공하는 맞춤형 보고서

그림 10. DBS acylcarnitines(상단) 및 아미노산(하단)에 대한 맞춤형 보고서. 이러한 보고서에는 12개의 아미노산과 37개의 acylcarnitines에 대한 스펙트럼 프로파일과

정량 결과가 제공됩니다. 연구원들은 정상 범위를 정하고 MassHunter Quantification Method에 정상값을 입력합니다. 맞춤형 보고서에서는 이에 따라 각 결과가 normal로 표시되거나 low 또는 high로 플래그 표시됩니다. 각 피크의 정량값은 스펙트럼 프로파일에 표시됩니다.

www.agilent.com/chem/qqq

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애질런트 테크놀로지스는 본 발간물에 포함된 오류 또는 비치(furnishing), 성능, 이 자료의 사용 등으로 인한 우연적이거나 필연적인 손상에 대한 책임을 지지 않습니다.

© Agilent Technologies, Inc. 20102010년 11월 20일 한국에서 발행

5990-6036KO

결론

지금까지 건조 혈반 중의 아미노산과 acylcarnitines을 정확하게 검출하고 정량할 수 있는 분석법에 대해 설명했습니다. 본 분석법을 사용하면 1.6분의 분석 시간으로 하루에 400~500개의 시료를 분석할 수 있습니다. 맞춤형 보고서에는 모든 정보가 포함되므로 관련 데이터를 빠르고 간단하게 확인할 수 있습니다. 본 분석법은 선택 사항으로, MRM에 의해 확인된 모든 acylcarnitines와 12개 중 8개의 아미노산(102 m/z를 갖는 neutral loss가 8개만 나타남)에 대해 수집한 스캔 데이터를 이용하여 선택한 시료에 대한 MRM 정량값을 증명할 수 있습니다. MassHunter 소프트웨어의 Universal Integrator는 아미노산과 acylcarnitines의 농도를 검출할 수 있으므로 위음성(false negative) 결과는 보고되지 않습니다. 실제로 이 분석법을 사용하여 1,000개가 넘는 DBS 시료를 분석하는 동안 위음성 결과가 관찰되지 않았습니다.

참조

1. P. A. Wayne, Newborn Screening by Tandem Mass Spectrometry; Proposed Guideline, I/LA32-P, Clinical and Laboratory Standards Institute, Standards@clsi.org.

2. D. H. Chase, J. C. DiPerna, B. L. Michell, B. Sgroi, L. F. Hoffman, E. W. Naylor, “Electrospray Tandem Mass Spectrometry for Analysis of Acylcarnitines in Unexplained Cause of Death,” Clin. Chem. 47:1166-1182, 2001.

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