(면역조직학적 연구) - Yonsei University · 2019-06-28 · 국문요약 Hyaluronan이TMJ synoviocyte에서 Nitric oxide 의 생성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)

Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서

Nitric oxide 의 생성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)

연세대학교 대학원

치 의 학 과

한 국 진

Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서

Nitric oxide 의 생성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)

지도 정한성 조교수

이 논문을 박사 학위논문으로 제출함

2004년 6월 일


치 의 학 과

한 국 진

한국진의 박사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인


20004년 6월 일

감사의 글

논문의 시작부터 완성되기까지 부족한 저에게 시종 간곡하신 지도와 편

달을 하여주신 정한성 교수님께 진심으로 감사 드립니다. 아울러 많은 조언

과 격려를 아끼지 않으신 이승일 교수님, 서정택 교수님, 최형준 교수님, 그

리고 김의성 교수님께도 감사 드립니다. 그리고 교합학과 악관절학을 지도

해 주신 김인권 교수님, 송영복 교수님께도 이 지면을 빌어 감사의 말씀을

드립니다.

또한 처음부터 끝까지 실험을 맡아 도와준 이민정 선생님, 조성원 선생

님 그 외 구강 조직학 교실원 여러 선생님들에게 고마움을 전합니다.

오늘이 있기까지 항상 헌신적인 사랑으로 저를 키워 주신 아버님, 어머

니 그리고 장인어른, 장모님께도 깊은 감사를 드립니다. 항상 논문에 전념할

수 있도록 내조해 준 사랑하는 아내와 사랑스런 딸 주예, 주현이에게 이 논

문을 바칩니다. 그 외 병원 시작부터 항상 열심히 나를 도와주고 있는 행미

씨 외 병원 직원들에게 고마움을 전합니다.

2004년 6월

저자 씀

차례

표, 그림차례 …………………………………………………..ii

국문요약……………………………………………………..iii

I. 서론…………………………………………………………..1

II. 연구재료 및 방법

가) 연구재료……………………………………………………………….5

나) 연구방법……………………………………………………………. 6

III. 연구결과……………………………………………………11

IV. 총괄 및 고찰……………………………………………….22

V. 결론…………………………………………………………..36

참고 문헌……………………………………………………..37

영문 요약………………………………………………………54

i

표, 그림차례

Table 1: Grouping of experimental rats

Table 2: Semiquantative scoring of iNOS & NF-κB expression in the synovial

membrane

Figure 1: Molecular structure of sodium hyaluronate

Figure 2: Schematic drawings of injection into the TMJ

Figure 3: Sagittal section of rat TMJ (H-E staining)

Figure 4: Immunoreactivity of iNOS at synovial membrane of upper joint cavity

Figure 5: Immunoreactivity of iNOS at synovial membrane of lower joint cavity

Figure 6: Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of upper joint cavity

Figure 7: Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of lower joint cavity

Figure 8: Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of upper joint cavity

Figure 9: Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of lower joint cavity

Figure 10: Activity of cell apoptosis (programmed cell death) at synovial membrane

of lower joint cavity

ii

국문요약

Hyaluronan 이 TMJ synoviocyte 에서 Nitric oxide

의 생성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)

Hyaluronan 과 nitric oxide 와의 관련성에 대한 실험동물연구가 슬관절 (knee

joint) 에서 Takahashi (2000, 2001) 와 kobayashi (2002) 등에 의해서 시행 되었으나 측

두하악관절 (TMJ) 에서 연구는 Alpaslan (2000) 의 임상적 연구가 있었으나 조직학적

표본을 이용한 연구는 없는 실정이다. 물론 hyaluronan 이 TMJ 에서의 임상적 효능

에 대한 연구가 많이 이루어졌으나 nitric oxide 와의 관련성에 대한 연구는 부족한

실정이다. 이에 이 연구는 hyaluronan 이 실험동물 내에서 nitric oxide 생성에 미치

는 영향을 알아보고자 인위적으로 carrageenan 으로 유도된 TMJ synovitis 를 가진

rat 에서 고분자 (high molecular weight) 인 exogeneous hyaluronan 을 주입하여 nitric

oxide 의 생성에 관여하는 iNOS (inducible nitric oxide synthetase) 의 발현과 이의 생

성을 signalling 하는 NF-κB pathway 의 발현을 synoviocyte 에서

immunohistochemistry 로 관찰하고 이 외에 부가적으로 세포증식 (cell proliferation)

과 세포사멸 (cell apoptosis) 에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위함이다.

실험동물 중 아무 조작을 시행하지 않은 I 군과 saline 을 주입한 II 군 그리고

carrageenan 으로 인위적 synovitis 을 유도한 후 hyaluronan 을 관절 내에 주입하지

않은 III 군과 synovitis 유도 후 hyaluronan 을 주입한 IV 군으로 나누었다. III 군 과 IV

군 사이에 iNOS, NF-κB 의 발현을 면역조직학적 소견을 비교하여 hyaluronan 이

nitric oxide 의 생성에 어떠한 영향을 미치는 지와 세포증식 정도를 면역조직학적

방법으로 관찰하고 세포사멸 정도를 TUNEL staining 으로 관찰하여 다음과 같은 결

과를 얻었다.

iii

Carrageenan 으로 유도된 III 군이 아무런 조작을 하지 않은 I 군이나 saline 만

을 주입한 II군에 비해서 iNOS 와 NF-κB, PCNA immunoreactivity 가 증가된 양상

을 나타내었으나 TUNEL staining 에서는 차이가 없었다. Carrageenan 으로 유도된 III

군과 IV군사이의 비교에서 hyaluronan 을 주입한 IV군이 주입하지 않은 III군에 비해

서 iNOS immunoreactivity, NF-κB immunoreactivity, PCNA immunoreactivity 가 감

소되는 양상을 보였다. Carrageenan 으로 유도된 III군과 IV군사이의 비교에서

hyaluronan 을 주입한 IV군과 주입하지 않은 III군 사이에 tunnel staining 의 차이는

보이지 않았다.

이상의 결과로 hyaluronan 을 주입하는 것이 carrageenan 으로 유도된 synovitis

가 있는 활막에서 관여되는 여러 염증전구물질중의 하나인 nitric oxide 의 생성과

세포 증식을 조절함에 영향을 미치며 세포사멸에는 큰 영향을 보이지 않는 것으로

사료된다. 이와 같이 염증성 질환에서의 hyaluronan 의 주입은 nitric oxide 의 감소

와 세포증식의 감소를 통하여 염증반응을 억제하여 관절기능의 회복에 중요 역할

을 한다.

핵심 되는 말: Carrageenan, Hyaluronan, TMJ (temporomandibular joint), Synovitis,

NO (nitric oxide), iNOS (inducible nitric oxide synthetase), NF-κB (nucleo factor

involved in the transcription of the k-light-chain gene in B lymphocyte),

immunohistochemistry, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), TUNEL staining, Cell

proliferation, Cell apoptosis

iv

Hyaluronan이 TMJ synoviocyte에서 Nitric oxide의 생

성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)

연세대학교 대학원 치의학과

(지도 정 한 성 조교수)

한 국 진

I. 서론

측두하악관절 (TMJ) 의 염증성 장애는 관절부위의 지속적인 통증을 야기하거나

기능시 종종 심해지며 주기적인 근육경련, 통각과민, 연관통등의 이차적인 중추성

흥분효과도 나타낼 수 있는 중요한 측두하악관절장애증이다. 이러한 염증성장애는

크게 활막 (synovial membrane, synovium), 관절낭 (capsule), 원판후조직 (retrodiscal

tissue) 등 연조직의 염증성 장애와 하악과두를 구성하는 골, 연골과 같은 경조직 내

의 세포외 간질 (extracellular matrix) 내의 변화를 일으키는 염증성 질환으로 크게

대별된다. 초기 염증성 질환은 대부분 활막염 (synovitis) 의 형태로 시작되어서 만성

화되면 골관절염 (osteoarthritis; OA) 과 synovitis 을 동반한 관절염 (arthritis) 을 유

발한다. 이러한 arthritis 의 원인은 크게 감염성, 외상성, 염증성, 퇴행성, 대사성의 원

인 인자가 관련된다.

관절 내 염증성 병변에는 여러 염증전구 물질이 관련이 되며 여기에는 1.

cytokine (Interleukine; IL, Tumor necrosis factor; TNF), 2. Eicosanoid (Prostaglandin,

1

Leukotriene; LT, Thromboxane; TX), 3. Biogenic amines (histamine, Epinephrene), 4.

Neuropeptide (calcitonine gene related protein; CGRP, Neurokinin A, Substance P), 5.

Chemokine (MIP-1, MCP-1, lymphotactin), 6. Interferon gamma, 7. NGF (serotonin,

dopamine), 8. Nitric oxide (NO), 9. Growth factor (PDGF, EGF, FGF, TGF-beta) 와 그

외 protease 등의 효소, coagulation pathway, kinin system, complement pathway,

fibrinolytic reaction 등이 중요하게 작용한다.

이중 nitric oxide (NO) 는 Moncada (1991) 에 의하면 iNOS (inducible nitric oxide

synthetase) 에 의해서 L-arginine 에서 생성된다. NO 는 immunological &

inflammatory function 에 중요한 인자임이 규명되었다. (Nussler, 1993) 이 외에도 여

러 선학들의 연구에 의해서 collagen 의 합성억제, Proteoglycan 의 합성억제,

Inhibition of IL-1 receptor antagonist, Interference with integrin signalling, Induction

of chondrocyte apoptosis, Stimulation of MMP (matrix metalloproteinase protein)

production 에 중요한 작용을 함이 알려졌다.

Feldmann (2002) 와 Yamasaki (2001) 는 NF-κB 가 inflammation 과 immunity

를 조절하는 중요 transcription factor 라고 하였다. Collantes (1998) 와 Marok (1996)

는 NF-κB 가 arthritis 에 중요하게 작용함을 보고하였다. Makarov (2001) 은 또한

NF-κB 가 fibroblast like synovial cell 에서 inflammation, 증식 (proliferation), 사멸

(apoptosis) 에 중요하게 작용하며 Singh (2002) 은 NF-κB 가 NO 와 관련성이 있음

을 보고 하였다.

Joint 에서의 NO 의 역할은 Farrell (1992) 에 의해서 NO 의 산물인 nitrite 가 류

마토이드 관절염 (rhematoid arthritis; RA) 과 OA 에서 관절활액 (synovial fluid) 과

serum 에서 발견된 이후 Pelletier (1999) 가 arthritis 에서 iNOS 의 활성이 중요하다

고 했다. Grabowski (1996), Moilanen (1997), Abramson (2001) 등에 의해서도 상관관

계가 규명되었다. 그 외 NO 와 슬관절 (knee joint) 에서의 관련성은 Takahashi (2000,

2001), Kobayashi (2002) 등에 의해 입증되었다.

2

한편 TMJ 에서는 Takahashi (1996) 가 측두하악관절장애 환자에서 synovial fluid

에서의 증가된 nitrite 를 규명한 이후 Homma (2001) 가 악관절 내장증 (internal

derangement; ID) 이 있는 TMJ 의 synovial tissue 에서 iNOS 가 발현됨을 규명하였

다. Yamaza (2003) 는 rat 에서 기계적으로 synovitis 을 유도한 후 iNOS 발현증가를

면역조직학적으로 입증하였으며 Takahashi (2003) 는 ID 와 arthritis 가 있는 TMJ 의

synovial membrane 에서의 iNOS 발현을 밝혔다.

이러한 TMJ 내 염증성 병변의 치료 중 보존적 치료법 후 필요에 따라 비가역

적 치료 시행하기 전에 관절구조 내의 침습적이나 가역적 치료법의 하나인 관절강

내 약물 투여를 시행할 수 있다. Kopp (1981), Agus (1984), Danzig (1991) 등이 측두

하악관절강 내에 스테로이드와 국소마취제를 혼합 주입한 임상결과를 보고하였다.

Nitzan 과 Dolwick (1991) 은 관절세척술 (arthrocentesis) 과 관절강 내 약물투여와 함

께 소개하여 임상에서 시행되고 있다. 한편 스테로이드의 관절 내 약물투여의 대

체 약물로 synovial fluid 내의 중요성분 중의 하나인 hyaluronan 을 인공 합성 생산

하여 치료에 응용하고 있다.

생체 hyaluronan 은 약 2500 개의 이당류가 반복적으로 결합된 linear chain 을

형성하며 평균 분자량이 5-6 백만 Dalton 의 고분자 생체물질이다. 이 hyaluronan 은

관절강 내 투여시 phagocytosis 의 억제, neutrophil 과 lymphocyte 의 chemotaxis 의

억제, cytokine 의 작용 억제을 통한 항 염증작용이 있다, matrix 의 분해방지 그리

고 chondrocyte 의 단백질 합성증가, proteoglycan aggregate 의 생성증가를 통한 연

골손상 보호효과가 있다. 또한 synovial fluid 에서 PGE2 와 bradykinin level 의 감소

를 통한 analgesic 효과와 synoviocyte 의 hyaluronan 의 합성증가, synovial fluid 에

서 hyaluronan 증가를 통한 관절기능의 회복을 도모한다.

Hyaluronan 은 1934 년 Meyer 가 발견한 후 sodium hyaluronate 의 형태로 1960

년대부터 Hruby 에 의해 안과수술시의 보조 약물로 사용된 이래로 1970 년대에는

Balaz , Peyron 등에 의해 arthrit i s 가 있는 슬관절에서 이용되고 최근에는

3

Kopp (1987, 1991) 등에 의해서 측두하악관절 장애 환자에서 활발히 응용되고 있다.

이러한 Hyaluronan 의 임상적 효능은 슬관절에서 Matsuno (1993), Lussier (1996),

Altman (1998), Marshall (1998), Frizziro (1998), Huskisson (1999), Simon (1999), Srejice

(1999) 등에 의해서 입증되었고 TMJ 에서는 Kopp (1985, 87, 91), McCain (1989), Fader

(1993), Bertolami (1993), Yustin (1995), Sato (1997), Hirota (1998) 등에 의해서 입증

되고 있다. 위의 연구결과 hyaluronan 은 조직의 수분유지, 윤활작용, 생리물질이동,

세포이동, 세포기능 및 분화 같은 기능 등에 중요역할을 함이 밝혀졌다. 즉

hyaluronan 은 생리화학적 기능 (physicochemical function) 과 세포상호작용 (cellular

interaction) 에 관여함을 알 수 있다. Hyaluronan 이 관절염증에서의 여러 염증과정

에 연관된 요소들을 조절하고 있으며 이러한 작용이 관절내의 염증성 병변을 완화

시켜준다고 할 수 있다. Arthritis 에서의 cytokine 이나 neuropeptide 와 hyaluronan 과

의 관련성은 많은 연구가 진행되었으나 NO 와의 관련성에 대한 연구는 상대적으로

많이 시행되진 않았다.

Hyaluronan 과 NO 와의 관련성에 대한 실험동물연구가 슬관절에서 Takahashi

(2000,2001) 와 Kobayashi (2002) 등에 의해서 시행되었으며 TMJ 에서의 연구는

Alpaslan (2000) 의 임상적 연구가 있었으나 조직학적 표본을 이용한 연구는 없는 실

정이다. 물론 hyaluronan 의 TMJ 에서의 임상적 효능에 대한 clinical study 와

experimental study 가 많이 이루어졌으나 NO 와의 관련성에 대한 연구는 부족한 실

정이다. 이에 이 연구는 hyaluronan 이 실험동물 내에서 NO 에 미치는 영향을 알

아보고자 하였다. 인위적으로 carrageenan 으로 유도된 TMJ synovitis 를 가진 실험

동물에서 고분자의 exogeneous hyaluronan 을 주입하여 NO 의 생성에 관여하는

iNOS 의 발현과 이의 생성을 cell signalling 하는 NF-κB pathway 의 발현을

synoviocyte 에서 immunohistochemistry 로 관찰하였다. 이 외에 부가적으로 세포증

식과 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는가를 알아보기 위함이다.

4

II. 연구재료와 방법

가) 연구 재료

1. 실험동물

6 주된 wistar rat 20 마리을 아래와 같이 4 개의 군으로 분류하였다.

Group 1 은 아무 조작도 하지 않은 대조군이며 Group 2 은 saline 을 주입한 군

Group 3 은 carrageenan 을 주입 하고서 1 주일 후 hyaluronan 을 주입하지 않은 군

이며 Group 4 은 carrageenan 을 주입 1 주일 후 hyaluronan 을 주입한 군으로 설정

하였다.

Table 1: Grouping of experimental rats

5

Group1

무조작 control

5 마리 ( 10 joints)

Group2

Saline injection


Group3

Carrageenan injection+ No hyaluroan

injection


Group4

Carrageenan injection+ hyaluronan injection


나) 연구방법

1. 실험약물

인위적 관절내 염증유발을 위해서 3% carrageenan 0.01ml 을 양쪽 측두하악관절

강에 32G needle 을 이용하여 주입하였다. Hyaluronan 을 kg 당 0.04ml 의 용량으

로 동일한 방법으로 주입하였다. 성분 함량은 1ml 중 주성분인 히알우론산 나트륨

(sodium hyaluronate) 이 10mg, 등장완화제로 염화나트륨이 8.5mg, 완충제로 인산일

수소나트륨과 인산이수소나트륨이 소량 함유되어 있다.

Fig. 1: Molecular structure of sodium hyaluronate

2. 관절강내 주입방법

비barbiturate 계인 동물용 속효성 전신마취제인 유한케타민을 복강내에 30mg 을

주입하여 마취시켰다. 인슐린 주사기를 이용하여 실험약물을 아래의 그림과 같이

외이도와 안와하방 부위를 연결하는 선상에서 외이도 전방 2mm, 상방 1mm 지점을

전내상방의 자입 각도로 주입하였다. (Fig 2)

6

Fig. 2: Schematic drawings of injection into the TMJ 3. 실험동물의 조직처리

이 실험에서 조직 고정은 관류고정 (perfusion fixation) 을 이용하였다. ether 흡

입마취제로 희생시켰으며 고정액으로는 4% paraformaldehyde 을 사용하였다. 실험

동물의 복부를 가위로 횡으로 절개한 다음 흉강을 노출시킨 후 심장의 좌심실로

주사침을 찌른 다음 우심방귀 (right auricle) 을 가위로 절개하여 혈액이 흘러 나오

게 하였다. 다음에 peristaltic pump 을 이용하여 분당 30-40 ml 의 속도로 0.05 M

phosphate-buffered saline (PBS) 을 관류시켰다. 우심방귀를 보아 맑은 물이 나오기

시작하면 고정액으로 관류액을 바꾸어 5-10 분간 관류시겼다. 고정 후 두부를 적출

한다. 적출한 조직을 관류고정액과 동일한 고정액에서 4-8 시간 고정 한 후 10%

EDTA 로 4 주간 탈회 후 고정된 조직을 물로 수세하여 탈수과정을 거친 후 투명화

과정을 거쳤다. 염색을 위해 먼저 조직을 7.5% gelatin in 15% sucrose 을 이용하여

gelatin block 을 제작하였다.

7

4. Tissue preparation for H-E staining, immunohistochemistry and TUNEL

staining

포매된 조직을 cryostat 절편기을 사용하여 20 ㎛ 의 두께로 잘랐다. 자른 조직은

젤라틴 코오팅 된 슬라이드에 붙인후 조직 슬라이드 표본은 박스에 담아서 상온에

보관하였다.

면역조직화학염색을 위해서 sample 을 cryostat protection 을 위한 30% sucrose

용액에 equilibration 한 후 OCT compound (Sakura fintek Inc California, USA) 에 포

매하였다. serial sagittal section 을 20 ㎛ 의 두께로 자른 후 silane 으로 코팅된 슬

라이드 글라스에 mount 하였다. (Muto pure chemicals, CO, Japan)

5. Immunohistochemistry for iNOS antibody and NF-κB antibody

고정된 조직이 붙어 있는 슬라이드를 완충액으로 세척하여 고정액을 제거하였

다. slide 의 gelatin 을 제거하기 위해 염색 전에 37℃로 pre-warming 된 PBS 에 30

분간 담가두었다. 증류수로 5 분씩 2 번 washing 후에 blocking solution 에 10 분간 담

가두었다. 그 조직이 원래 가지고 있는 페록시다제의 활성을 없애기 위해서 과산화

수소가 포함된 완충액 속에서 잠시 처리한 다음 다시 완충액으로 세척하였다. 결합

항체의 비특이적인 결합을 방지하기 위해서 이차항체를 만든 동물의 정상혈청으로

5-10% 농도로 완충액에 타서 실온에서 약 1 시간 동안 반응시킨 다음 다시 완충액

으로 세척하였다. 그 후 primary antibody 를 4℃ 에서 overnight 로 반응시켰다. 검

출하려는 물질에 대한 일차항체를 적당한 농도로 희석하여 조직 위에 점적 한 후

상온에서 1-2 시간 반응시키거나 4 도에서 하룻밤 동안 반응 시켰다. 일차항체 반응

후에 완충액으로 일차항체를 세척한 다음 바이오틴 표지된 이차항체를 떨어뜨려

상온에서 1-2 시간 정도 반응 시켰다. 다음으로 avidin-biotin enzyme complex (ABC)

8

를 완충액에 희석하여 상온에서 1 시간 반응 시킨 후 완충액으로 세척하였다. 발색

반응은 과산화 수소와 발색제를 희석한 용액에서 조직을 3-5 분간 반응 시킨 후 완

충액으로 세척한다. 면역조직화학으로 발색된 조직의 전체적인 형태를 관찰하기 위

해 대조 염색을 한 후 광학현미경 하에서 관찰하였다.

사용한 primary antibody 는 rabbit anti-NF-κB IgG (1:400, Santa Cruz, CA, USA),

rabbit anti-iNOS IgG (1:100, Santa Cruz, CA, USA) 그리고 rabbit anti-PCNA IgG (1:200,

Neomarkers InC, CA, USA) 이다. 이후, 이차항체를 10 분간 처리하고 sterptavidin-HRP

로 역시 10 분간 처리하였다. 마지막으로 DAB kit (Zymed, CA, USA) 를 이용하여 발

색을 관찰하였다. 그 후 Mayor hematoxylin 으로 대조염색을 시행하였다. 사용한

detection kit 은 NF-κB 와 iNOS 의 경우 histostain-plus rabbit Kit (Zymed, CA, USA)

이고 PCNA 의 경우는 ultravision mouse tissue detection system (Neomarkers Inc, CA,

USA) 사용하였다.

6. Immunohistochemistry for cell proliferation

Deparaffined 된 specimen 는 내재된 peroxidase activity 를 방지하기 위해서

absolute methanol 내 0.3% hydrogen peroxide 로 처리하였다. 세포증식 정도를 관찰

하기 위해서 specimen 을 monoclonal anti proliferating cell nuclear antigen (PCNA)

antibody (1:200, noemarkers Inc, USA) 로 4 도에서 overnight 로 incubate 하였다.

PBS 로 세척 후 specimen 은 실온에서 secondary antibody (Zymed Laboratories Inc,

USA) 와 HRP-conjugated 효소 용액에 재처리 후 DAB reagent Kit (Zymed

Laboratories Inc, USA) 를 이용하여 visualizing 하였다. 면역 염색된 section 은 전체

적인 조직의 구조를 관찰하기 위해 보통 핵을 염색하는 대조염색을 하는데

hematoxyline 용액으로 counter staining 하였다.

9

7. TUNEL staining for cell apoptosis

세포사멸을 관찰하기 위해서 in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics

GmbH, Germany) 가 사용되었다. 세포사멸 동안 genomic DNA 는 이중나선 DNA

fragment 와 마찬가지로 single 나선 breaks (nicks) 을 생산하면서 쪼개진다 말단

deoxynucleotidyl transferase (TdT) 이 fluoroscein coorporated nucleotide 를 가진 DNA

strand breaks 을 표식하기 위해서 사용되었다. Fluoroscein 은 horseradish peroxidase

(POD) 와 접합된 anti-fluorescein antibody Fab fragments 을 이용하여 detection 되

었다. subtrate reaction 후 염색된 세포는 광학현미경으로 분석하였다.

Specimens 는 cryosection 후 PBS 로 세척하였다. 그리고 하루 동안 4%

paraformaldehyde / PBS solution (pH 7.4) 에서 고정하였다. 고정된 specimen 은 내

재성 peroxidase 를 억제하기 위해서 30 분 동안 100% MEOH 내 0.3% hydrogen

peroxide 에 처치 후 PBS 로 세척하였다. 그리고 나서 실온에서 15 분동안 proteinase

K 용액 (20 ㎍ /ml) 에 incubation 하였다. 다시 TdT 효소를 포함하고 있는 reaction

mixture 에 incubation 된 후 37 도 humidified chamber 에서 1 시간동안 fluorescein

label 되었다. 반응을 중단한 후 37 도 humidified chamber 에서 30 분 동안

fluorescein-labelled nucleotide 를 detection 하기 위해서 peroxydase conjugated

anti-fluorescein antibody 가 사용되었다. signal 은 color substrate 로서 DAB 를 사

용하여 detection 하였다. Section 은 희석한 hematoxylin 으로 counter staining 하였

다.

10

III. 연구 결과

1. Immunoreactivity of iNOS by iNOS immunohistochemistry

상관절강내의 활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을 주입하지 않은 III 군의

iNOS immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서의

iNOS immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보였다.

I 군과 II 군에서는 모두 iNOS immunoreactivity 가 거의 나타나지 않았으나

carrageenan 주입한 III 군에서는 활막에서의 iNOS immunoreactivity 가 증가됨이 관

찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군 에서는 III 군에서 보다 감소되었다. (Fig 4)

하관절강내의 활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을 주입하지 않은 III 군

의 iNOS immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서

의 iNOS immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보였다.

I 군과 II 군에서 모두 iNOS immunoreactivity 가 나타났으며 carrageenan 주입한

III 군에서는 활막에서의 iNOS immunoreactivity 가 보다 증가된 양상이 관찰되었으

며 hyaluronan 주입한 IV 군 에서는 다시 감소되었다. (Fig 5)

2. Immunoreactivity of NF-κB by NF-κB immunohistochemistry

상관절강내의 활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을 주입하지 않은 III 군

의 NF-κB immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에

서의 NF-κB immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보였다.

I 군에서는 NF-κB immunoreactivity 가 거의 나타나지 않았으나 saline 주입 군

에서 NF-κB immunoreactivity 가 조금 나타났다. carrageenan 주입한 III 군에서는 활

막에서의 NF-κB immunoreactivity 가 I 군과 II 군에 비해 증가됨이 관찰되었으며

11

hyaluronan 주입한 IV 군 에서는 다시 감소되었다. (Fig 6)


의 NF-κB immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에

서의 NF-κB immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보인다.

I 군에서는 NF-κB immunoreactivity 가 거의 나타나지 않았으나 saline 주입 군

에서 NF-κB immunoreactivity 가 조금 나타났으며 carrageenan 주입한 III 군에서는

활막에서의 NF-κB immunoreactivity 가 I 군과 II 군에 비해 증가됨이 관찰되었으며

hyaluronan 주입한 IV 군 에서는 다시 감소되었다. (Fig 7)

3. Activity of Cell proliferation by PCNA immunoreactivity

상관절강내의 활막에서 carrageenan 주입후 hyaluronan 을 주입하지 않은 III 군

의 PCNA immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에서

의 PCNA immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보였다.

I 군과 II 군에서 모두 PCNA immunoreactivity 가 나타났으며 carrageenan 주입

한 III 군에서는 활막에서의 PCNA immunoreactivity 가 증가됨이 관찰되었으며

hyaluronan 주입한 IV 군에서는 조금 감소되었으나 그 차이가 명확히 나타나지 않았

다. (Fig 8)


의 PCNA immunoreactivity 가 아무 조작을 하지 않은 I 군과 saline 주입한 II 군에

서의 PCNA immunoreactivity 보다 증가된 양상을 보였다.

I 군과 II 군에서는 모두 PCNA immunoreactivity 가 거의 나타나지 않았으나

carrageenan 주입한 III 군에서는 활막에서의 PCNA immunoreactivity 가 증가됨이 관

찰되었으며 hyaluronan 주입한 IV 군 에서는 다시 감소되었다. (Fig 9)

12

4. Activity of Cell Apoptosis by TUNEL staining

모든 군에서 activity 가 나타나지 않았으며 각 군간의 비교에서 모두 activity 의

차이가 없었으며 carrageenan 주입한 III 군과 hyaluronan 주입한 IV 군 에서의 비교

에서도 차이는 나타나지 않았다. (Fig 10)

iNOS IHC NF-κB IHC

무조작 control -+ -+

Saline -+ -+

Carrageenan+ No hyaluronan

+++ +++

Carrageenan+ hyaluronan

+ +

Table 2: Semiquantative scoring of iNOS & NF-κB expressions in the synovial

membrane

The intensity of immunohistochemical staining was scored semiquantatively as

previously reported with modification (Yoshida, 1997)

- : negative, +: slight, ++: Moderate, +++: severe

13

Fig. 3 Sagittal section of rat TMJ (H-E staining)

C: condyle, D: disc, UJC: upper joint cavity, LJC: lower joint cavity

Original magnification: 3-A, B (X 100)

14

A

C LJC

UJC

D

B

C

LJC

UJC D

Fig. 4 Immunoreactivity of iNOS at synovial membrane of upper joint cavity

Strong iNOS expression is seen in synovial lining cell of G. iNOS immunoreactivity is

decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that

of G III. Yellow boxes (Fig-4E), blue boxes (Fig-4F), red boxes (Fig-4G), green boxes

(Fig-4H) are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity

LJC: lower joint cavity Original magnification: 4A-D (X 200), 4E-H (X 400) 15

UJC

A

UJC

E

UJC

LJC B

UJC

F

UJC

C

UJC

G

UJC

D UJC

H

G I

G II

G III

G IV

Fig. 5 Immunoreactivity of iNOS at synovial membrane of lower joint cavity

Yellow boxes (Fig-5E), blue boxes (Fig-5F), red boxes (Fig-5G), green boxes (Fig-5H)

are higher magnification photos of each color boxes. UJC: upper joint cavity LJC: lower

joint cavity C: condyle. Original magnification: 5A-D (X 200), 5E-H (X 400)

16

LJC

C A

LJC

C

B

LJC C

LJC

D

LJC

E

LJC

F

LJC G

LJC

H

G I

G II

G III

G IV

Fig. 6 Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of upper joint cavity Strong NF-κB expression is seen in synovial lining cell (G). NF-κB immunoreactivity

is decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that



LJC: lower joint cavity. Original magnification: 6A-D (X 200), 6E-H (X 400) 17

UJC

A

UJC

B

UJC

C

UJC

D

UJC

E

UJC

F

UJC

G

UJC

H

G I

G II

G III

G IV

Fig. 7 Immunoreactivity of NF-κB at synovial membrane of lower joint cavity




18

LJC

A

LJC

B

LJC

C

LJC

D

LJC

E

LJC

F

LJC

G

LJC H

C

C

C

C

G I

G II

G III

G IV

Fig. 8 Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of upper joint cavity

Strong PCNA expression is seen in synovial lining cell (G). PCNA immunoreactivity is

decreased in the cytoplasm of the synovial lining cell in the G IV compared to that



LJC: lower joint cavity. Original magnification: 8A-D (X 200), 8E-H (X 400)

19

UJC

A

UJC

LJC C

B

UJC

C

UJC

D

UJC

E

UJC

F

UJC

G

UJC

H

G I

G II

G III

G IV

Fig. 9 Immunoreactivity of PCNA at synovial membrane of lower joint cavity




20

LJC

A

LJC

B

C

LJC

C C

LJC

D C

LJC

E

LJC

F

LJC G

LJC H

C

G I

G II

G III

G IV

Fig. 10 Activity of cell apoptosis at synovial membrane of lower joint cavity

There is no difference between each group. Yellow boxes (Fig-10E), blue boxes

(Fig-10F), red boxes (Fig-10G), green boxes (Fig-10H) are higher magnification photos

of each color boxes. UJC: upper joint cavity LJC: lower joint cavity. Original

magnification: 10A-D (X 200), 10E-H (X 400)

21

LJC

A

LJC

B

LJC

C

LJC

D

C

C

C

C

LJC E

LJC

F

LJC

G

H

G I

G II

G III

G IV

IV. 총괄 및 고찰

Carrageenan 은 동물실험에서 관절내의 인위적 염증성 반응을 일으키는 약물로

널리 사용되고 있다. Carrageenan 는 chondrus crispus 라는 irish moss 에서 추출되

는 sulfated polysaccharide 의 복합체이다. Carrageenan 의 구조는 kappa, iota, lambda

의 3 가지 subtype 으로 구분되며 이 실험에서는 lambda carrageenan 의 nongelly

form 이다. 강한 알칼리 환경에서 lambda 구조는 몇몇 sulfate group 의 nucleophilic

displacement 로 kappa 나 iota 로 전환된다. Carrageenan 은 실온에서 매우 viscous

하고 pseudoplastic 하며 온도와 PH 에 따라서 gelation 과정을 거친다.

Arai (1979) 가 rat 의 슬관절에 carrageenan 주입시 synovial membrane 에 염증

성 반응을 일으키며 prostaglandin 이 증가됨을 보고한 이래로 Aloe (1992) 는 rat 의

슬관절에 carrageenan 주입시 염증성 반응을 일으키며 NGF 가 증가됨을 보고하였

다. Tonussi (1999) 는 마찬가지로 carrageenan 의 주입시 TNF-alpha 와 kinin pathway

가 증가됨을 보고하였다. 그 외 Sedgwick (1985), Lam (1991), 이 (1998), Labuda (2001)

등이 carrageenan 으로 인위적 arthritis 반응을 이용하여 실험을 하였다. Lunderberg

(1996) 는 rat 의 TMJ 에 2% carrageenan 0.01ml 를 주입시 대조군에 비해서 관절내

의 substance-P, neurokinin A, calcitoine gene related peptide (CGRP), neuropeptide

Y 가 증가됨을 보고 했다. Egan (2002) 은 rat 의 슬관절에서 carrageenan 주입시

cyclooxygenase-2, iNOS, NO metabolite 를 측정하여 시간이 경과함에 따라 증가됨

을 보고 하였다. Hansra (2000) 은 rat 에서 carrageenan 으로 유도된 만성 염증성

arthritis 의 실험동물 model 을 정량적 histomorphometric 한 방법을 이용하여

document 하였으며 이로 인해서 carrageenan 으로 유도된 arthritis 변화는 다른 방

법으로 인한 실험동물의 artificial arthritis model 과 유사한 결과를 보임이 증명되었

다. Radhakrishnan (2003) 은 carrageenan 이 일반적으로 실험동물에서 acute

inflammation 을 유발하는데 이용되어 왔으나 chronic 한 염증유발효과도 있음을 보

고 하였다.

22

이와 같이 carrageenan 은 실험동물인 rat 에서 인위적 관절내 염증반응을 일으

키는 약물로 널리 사용 되어 져 오고 있으며 염증반응과 연관된 염증전구물질이

증가됨이 규명되었다. 그 외 carrageenan 이 세포증식에 대한 영향은 Glauert and

Bennink (1983), Calvert and Reicks (1988), Calvert (1992), Wilcox (1992) 가 carrageenan

이 rat colon 에서 세포증식에 영향을 미침을 규명하였다. Suzuk (2000) 는

carrageenan 이 cell proliferation 과 differentiation 의 homeostatic regulation 에 관

여하는 GJIC (Gap Junctional Intercellular Communication) 을 억제한다고 보고하였다.

이 실험에서도 carrageenan 을 주입 하였던 III 군이 아무 조작을 하지 않은 I

군이나 saline 을 주입 한 II 군에 비해서 염증 반응 중 subintimal layer 의 증식이나

염증세포의 침윤, capillary hyperplasia, vascularity 의 증가, endotherial hypertrophy

같은 소견이 관찰되었다 .그리고 group I 이나 II 군에 비해서 iNOS 의 발현과 NF-

κB, PCNA 에서 상대적으로 증가된 양상을 보아서 NO 가 증가되고 활막세포증식을

촉발한 것으로 생각된다.

NO 는 초기에는 peripheral vascular smooth muscle 의 relaxant 로서 알려졌으

며 signalling molecule 로서도 작용한다. 존재하는 장기의 종류에 따라서

neurotransmitter, vasodilator, bactericide 로서 다른 기능을 보인다. NO 의 구조는

nitrogen 과 oxygen 의 2 개의 원소가 이중결합을 이루는 free radical 로서 natural

form 은 gas 이다. NO 의 생성은 nitric oxide synthetase (NOS) 에 의해서 아미노산

의 일종인 L-arginine 에서 합성이 된다. NOS 는 3 종류로 구분 되며 Type I 은 nerve

cell 에 Type III 는 endotherial cell 에 존재하며 constitutive NOS 로서 homeostatic

cardiovascular & neuronal function 에 관여된다. 나머지 1 개는 type II 로서 inducible

NOS 이다. 후자는 cytokine (TNF-alpha, IL-1, IL-6) 이나 endotoxin 에 의해서 생성

이 되며 생성된 NO 는 cytotoxic & bacteriotoxic 한 효과를 나타낸다.

Palmer (1993), Melchiohic (1998), Tung (2002) 에 의하면 IL-1beta 와 TNF-alpa 가

NO 의 생성을 증가 시키며 Pelletier (1992) 에 의하면 IL-1beta 와 TNF-alpa 가 PGE2

23

를 활성화시키고 이어서 NO 의 생성을 촉진 시킨다고 하였다. Borderie (2002) 는

IL-1beta, TNF-alpa 등은 NO 을 증가시키고 IL-4, IL-10, IL-13 등은 NO 을 감소 시

킨다고 보고 하였다. 이와 같이 주요 cytokine 과 NO 의 상호 연관성이 입증되었다.

결국 carrageenan 이 cytokine 등에 영향을 주며 또한 NO 와 cytokine 상호간의 관련

성도 입증이 된 상태이다. 따라서 이 실험에서의 carrageenan 이 NO 의 발현을 증가

시킨 것이 직접적인 효과가 주효한 것인지 아니면 NO 와 깊은 관련성이 있는 다른

mediator 에 작용하여 간접적으로 효과가 나타났는지에 대해서는 좀더 많은 연구가

필요하리라 생각된다

NO 의 반감기가 매우 짧아서 vivo 상에서 NO 의 직접적인 측정은 어렵다. 따라

서 NO 의 metabolite 인 nitrite 나 nitrate 을 sirum 상에서 측정하여 NO 생성의 index

perameter 로 이용이 된다. 여기에는 많은 방법이 있으나 Griess 와 Green 의 방법이

나 gas chromatography mass spectrometry 법이 이용이 된다. 세포 단위에서는 iNOS

의 발현을 면역조직염색방법으로 vivo 나 vitro 상에서 측정이 가능하다. 그 외 생화

학적으로 radiolabelled arginine 이 radiolabelled citruline 의 변환된 양을 측정함으로

써 iNOS 의 activity 을 간접적으로 측정이 가능하며 그 외 immuno-blotting 방법인

western blotting 방법으로 측정 할 수 있다. 또한 iNOS messenger RNA expression 을

reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석법이 있다.

이 연구에서는 면역조직학적 방법을 이용 하여 iNOS 와 NF-κB 의

immunoreactivity 를 관찰하였으며 Immunohistochemical intensity 에 대한 scoring 은

Yoshida (1997) 방법을 변형 인용하였다.

Rat 실험동물에서 Stichtenoth (1994) 에 의하면 대조군에 비해서 arthritis 가 있

는 군에서 urinary nitrate 가 3 배 이상 증가됨을 규명하였다. 이때 urinary cGMP 배

출은 증가되지 않았으며 cGMP 는 constitutive NOS 의 증가와 비례함으로 iNOS 에 의

해서 NO 의 생성이 증가되었음을 입증하는 것이다. 그외 Lalenti (1993),

McCartney-Francic (1993) 등도 arthritis 가 있는 rat 에서 증가된 nitrite 생성을 규명

하였다.

24

Human joint 에서의 NO 의 역할은 Farrell (1992) 에 의해서 NO 의 산물인 nitrite

가 RA 과 OA 에서 synovial fluid 와 serum 에서 발견된 이후 Pelletier (1999) 가

inflammatory arthritis 에서 iNOS 의 활성이 중요하다고 했다. Grabowski (1996), Ueki

(1996), van (1994) 등은 RA 가 있는 환자에서 3 배 이상의 urinary nitrate 증가를 보고

하였다. 그 외 Moilanen (1997), Abramson SB (2001) 등에 의해서 상관관계가 규명되

었다. 그 외 NO 와 슬관절에서의 관련성은 Takahashi (2000,2001), Kobayashi (2002),

Cannon (1996) 등에 의해서 입증되었다.

한편 TMJ 에서는 Takahashi (1996) 가 측두하악관절장애 환자에서 synovial fluid

에서의 증가된 nitrite 를 규명하였다. 이후 Homma (2001) 가 12 명의 ID 가 있는 TMJ

와 4 명의 대조군 환자에서 arthroscopic biopsy 를 시행한 후 synovial lining cell 에서

iNOS 가 ID 환자에서 대조군에 비해 높게 발현됨을 규명하였다. Agarwal (2001) 이

cyclic tensile strain 이 iNOS 와 COX-2 의 작용을 통해서 NO 와 PGE2 의 생성이 증

가 된다고 보고 하였으며 Suenaga (2001) 는 임상적인 악관절 통증과 MRI 상의 joint

effusion, NO 농도와의 사이에 상관관계가 있음을 관찰하였다. Yamaza (2003) 는 rat 에

서 mechanically inducing synovitis 에서의 iNOS 발현과 NF-κB 활성을 면역조직학적

으로 입증하였다. Takahashi (2003) 는 ID 와 arthritis 가 있는 18 개 관절의 synovial

membrane 과 8 개의 정상관절을 arthroscopic biopsy 하여 iNOS 의 발현을 비교하여

정상관절에 비해서 발현이 증가됨을 보고하였다. Gassner (2000) 는 TMJ 내에 연속적

인 수동운동에 의해서 iNOS 의 발현이 증가된다고 하였다. 이와 같이 NO 는 관절내

염증에 중요한 인자로 작용함이 규명되었으며 이 실험에서도 NO 의 발현증가가

carrageenan 으로 유도된 염증반응에 의한 것으로 생각할수 있다. 물론 앞에서도 언

급했듯이 carrageenan 과 cytokine, NO 간의 상호작용과 생성의 밀접한 연관성이 입

증되어 있으며 따라서 NO 의 생성이 carrageenan 의 직접적인 영향에 의한 것인지

다른 cytokine 에 의한 이차적, 간접적 영향이 주효 한것인지에 관한 좀 더 많은 연구

가 필요하리라 생각된다.

25

이러한 NO 의 생성은 Mclnnes (1996), Sakurai (1995), Clair (1996) 등에 의하면

synoviocyte 나 chondrocyte 에서 생성된다고 보고 하였다. Grabowski (1997) 는

synovial lining layer 에 있는 macrophage 가 fibroblast 보다 synovium 내의 주요한

iNOS 의 source 라고 보고 하였다. 또한 Grabowski (1996) 는 fibroblast 와 chondrocyte

는 최소 2개 이상의 cytokine 의 존재 하에 NO 가 생성된다고 하였으며 synovial fluid

내의 leukocyte 에서는 생성이 되지 않는다고 하였다. 한편 Cedergren (2002) 는

synovial fluid 내 leukocyte 중 granulocyte 에서 NO 의 생성이 이루어 진다고 보고 하

였다.

이 실험에서도 iNOS 의 발현과 NF-κB 발현이 주로 synovial membrane 중 가장

바깥층인 intimal layer 내에 존재하는 synoviocyte 인 fibroblast 나 macrophage 의

cytoplasm 에서 강한 immunoreactivity 를 보였으며 간혹 subintimal layer 내에서도 약

한 반응을 보인 부분이 있는 것으로 관찰되었다. 그러나 주로 NO 의 생성은 intimal

layer 를 구성하는 macrophage 와 fibroblast 에서 이루어 지는 것으로 보여진다.

Fletcher (1998) 은 iNOS 는 initial stage 에서는 중요하나 chronic stage 에서는 중

요하지 않다고 했으며 Veihelmann (2002) 또한 NO 가 chronic 에서는 그 역할이 주요

하지 않다고 보고하였다. 이 실험에서도 carrageenan 주입 1주일 후 hyaluronan 을 주

입하였으며 다시 1 주일 후 실험동물을 희생하여 면역조직반응을 관찰 하여 주로

acute 한 염증반응에서의 결과라고 할 수 있다. 희생하는 기간을 좀 더 길게 다양하

게 하여 NO 의 생성을 비교하는 연구가 차후에 필요하리라 생각된다.

Min (1996) 에 의하면 동물실험에서 old animal 이 young animal 보다 NO 에 대

해 보다 sensitive 하며 정상관절에서는 old animal 이 young animal 보다 NO 의 basal

level 이 7 배 많으며 interleukin-1 을 투입하여 유발 된 OA 에서는 old animal 이

young animal 보다 NO 생성이 저하 된다고 보고 하였다. 따라서 성장이 어느 정도 이

루어진 6 주된 실험동물을 사용하였다.

26

NF-κB 는 protein kinase C 에 의해 활성이 시작되며 cytoplasm 내에서 비활성

상태에서는 NF-κB protein 이 I-kB (inhibitory subunit) 와 결합이 되어 있다. I-kB

kinase 에 의해서 I-kB 가 인산화 (phophorylation) 되면 26s proteasome 에 의해서

I-kB 가 파괴되면서 free 한 NF-κB heterodimer 와 pI-kB 로 분리된다. 유전자 발

현을 위해서 NF-κB heterodimer 가 핵내로 이동하게 된다. Lawrence (2001) 는 NF-

κB 가 proinflammatory gene expression 에 중요한 역할을 하나 inflammation 이

resolution 되는 단계에서도 anti-inflammatory gene expression 에도 관여된다고 하

였다. Crofford (1997) 은 NF-κB 가 cyclooxygenase-2 (COX-2) 도 조절한다고

Shalom-Barak (1998) 은 interleukin-17 이 NF-κB 와 MAP kinase 을 활성화 하며 다

시 이것이 NO 와 IL-6 의 증가와 COX-2 을 활성화 시킨다고 보고하였다. Geng

(1998) 은 c-GMP 가 IL-1 induced NO 합성에 필요하며 intercellular ca2 의 증가가

iNOS 의 감소 이어서 IL-1 induced NO 합성을 감소 시킨다고 하였다. 또한 Geng

(1995) 은 NO 의 생성에 tyrosin kinase 에 의존하나 PKC, PKA 등은 요구되지 않는

다고 하였다. Mendes (2002)는 IL-1 iduced NF-κB activation 과 iNOS 발현에 PTK

pathway 가 중요하게 작용하며 MAPK 중 P38 MAPK 는 iNOS 발현에 관여하나 P42

MAPK 는 관여되지 않는다고 보고 하였다. 따라서 NF-κB pathway 와 P38 MAPK 가

iNOS 발현에 중요하다고 보고 하였다. 한편 Inoue (2001) 에 의하면 NF-κB 는 세포

증식에 중요 역활을 Miagkov (1998) 에 의하면 NF-κB 가 Fas ligand cytotoxicity (cell

apoptosis) 를 증가 시킨다고 보고 하였다.

관절내의 염증성 병변의 치료에는 대부분 초기치료로 보존적 치료법인 약물요

법, 물리요법으로 동통이나 관절내 염증을 조절하면서 장기적으로 관절내 가해지는

기계적인 자극이나 부하를 조절하기 위한 교합안정장치로 일상적인 무통성 부하가

가능하게 끔 적응시키는 치료를 한다 (Mejersjo, 1983; Wright, 1986; Clark, 1990;

DeLeeuw, 1995). Kamelchuk (1995) 에 의하면 이러한 적응성 변화의 과정이 때로는

비적응성 과정으로 진행되어서 관절면의 퇴행성 변화를 유발하게 되며 Stegenza

27

(1998) 는 여기에 여러가지 염증전구물질이 관련이 된다고 하였다. 보존적 치료법 후

필요에 따라 비가역적 치료 시행하기 전에 관절구조내에 약물 투여를 시행할 수있

다. Kopp (1981), Agus (1984), Danzig (1991) 등이 측두하악관절강내의 스테로이드와

국소마취제를 혼합 주입한 임상결과를 보고한 이래로 Nitzan과 Dolwick (1991) 에 의

해 관절세척술 (arthrocentesis) 등의 치료법이 관절강 내 약물투여와 함께 소개되어

시행되고 있다. 한편 스테로이드의 관절 내 약물투여의 대체 약물로 관절활액내의

중요성분 중의 하나인 hyaluronan 를 인공 합성 생산하여 치료에 응용되고 있다. 이

러한 약제가 초기에는 탯줄이나 닭벼슬에서 추출 채취하였으며 최근에는 세균피막

에서 생합성되어 이용하고 있다.

Quinn (1989) 에 의하면 관절내의 과부하가 관절액내의 cathepsin 과 collagenase

유출이 증가하고 활막혈관투과도가 증가해서 synoval fluid 점도 (viscosity) 가 감소

되면서 전구염증 동통 매개물이 증가하고 결과적으로 연골연화증 (chondromalasia)

을 유발한다고 하였다. Roth (1984) 에 의하면 동물실험에서 안정시 악관절내압이

3.8mmHg 였다가 개구시 관절내압은 약간 하강하고 저작이나 이악물기 시에는 증가

한다고 보고하였으며 Nitzan (1992) 에 의하면 이악물기 시에는 관절내압이

63.4mmHg 정도로 높으며 이 상태에서는 정상 모세혈관의 유체정력압 (hydrostatic

pressure) 이 30mmHg 임을 감안할 때 일시적인 저산소증 (hypoxia) 이 일어난다. 다

시 휴식 상태에서는 관절내압이 감소되며 reperfusion 이 일어 난다. 최대 개구시에

는 54mmHg 까지 떨어지는데 더욱 더 perfusion 을 일으키고 이것이 산소유리기를

생성시키며 이것이 관절내의 병변에 관련된다. Fukuda (1997), Cortivo (1996) 에 의

하면 hyaluronan 은 이러한 자유기 (free radical) 에 대한 항산화 (antioxidant) 작용

을 나타낸다고 보고하고 있다. Hirota (1998) 의 연구에 의하면 hyaluronan 주입 후

leukotriene-beta, 6-keto prostaglandin, interleukin-1-beta 가 감소됨을 보였으며 이

것은 hyaluronan 의 항 염증 작용에 의한 것으로 보고 하였다.

이 연구에 사용된 hyaluronan 는 약 5백만-7백만 Dalton 의 고분자로서 다당류

28

로 존재하며 neuropeptide, growth factor, cytokine 등의 매개체에 의해 조절 된다. 이

것은 synovial fluid 내에서는 점탄성용질 (viscoelastic solution) 로 존재하나 연골에

서는 복잡성 구성 세포외간질의 성분으로 존재한다. 특히 proteoglycan 의 곁가지인

glycosaminoglycan 의 일종으로서 link protein 으로 결합되면서 proteoglycan 의 복

합체를 형성하는데 중요하며 이러한 복합체 형성은 수분항상성 (water homeostasis)

작용으로 압축력에 저항할 수 있는 1-2 ㎛ 의 점탄성 보호층 (viscoelastic &

viscoprotective layer) 을 구성한다. 이것에 의한 관절면의 유동성 분자체

(hydrodynamic molecular volume) 가 충격흡수제역할을 한다. 이 외에도 hyaluronan

복합체내의 hydrogen bonded water bridge 를 통한 분자결합이 연골구조의 견고성

과 연골안정화, 관절액 점도을 유지시켜 정상윤활작용이 되게 한다. 또한 조직 재생

과정에서의 반흔조직과 육아조직생성을 억제하여 유착의 예방에 관여하며 세포외

간질 특히 proteoglycan 의 형성을 촉진하여 조직재생, 재형성을 촉진한다. 그리고

자유기를 제거하는 항산화 작용이 있으며 이외에도 특정 세포 수용기 (etc CD 44,

RHAMM, ICAM-1; intercellular adhesion molecule-1) 에 결합하여서 세포 이동이나 분

화등의 세포기능을 조절하는데 Yasui (1992) 은 전구염증매개물 특히 proteoglycan

E2 의 기능을 억제하는 항염증작용에도 관여 한다고 보고하였다. Neumann (1999) 은

고분자 hyaluronan이 NF-κB pathway 에 의해서 IL-1alpa, IL-6, TNF-alpa 을 낮추

어 준다고 하였다. 그 외에도 관절 내의 유해수용자극민감도를 감소시켜 준다.

Gotoh (1993), Yamashita (1995) 에 의하면 bradykinin 과 관련된 관절통을 감소 시키

는 항외상수용 (antinociceptive), 진통효과가 있으며 동통역치을 회복시키기도 한다.

(Punzi, 1989; Partsch, 1989; Saari, 1991; Gaughan, 1991; Aihara, 1992; Hagberg, 1992;

Tobetto, 1992; Ghosh, 1993; Ghosh, 1994; Mapp, 1995; Kikuchi, 1996; Engstrom, 1997;

Simon, 1999)

이 연구에서 사용 된 hyaluronan 이 Carbalo 의 보고에 의하면 6-24시간의 반감

기를 가지며 대부분은 림프관에 의해서 20-30% 는 국소대사에 의해서 제거된다. 약

29

물 투여 후 수일간 적용부위에 저류되어 효과를 나타내는 것은 아니지만 특정 세

포 수용기와의 작용이라던지 생체역학적 (biomechanical), 생체생리적

(biophysiologic) 인 작용에 의해서 그 임상적 효능이 나타난다고 보여진다. 이러한

hyaluronan 의 작용에는 분자량, 농도, 활액 점도 등이 중요하게 작용한다.

Hyaluronan 의 임상적 효능에 대한 연구는 이미 많이 시행되었다. Huskisson

(1999) 은 골관절염이 있는 슬관절에서 hyaluronan 인 hyalgan 제재를 주입 6개월 후

결과를 보고하였으며 Matsuno (1999) 은 RA 가 있는 13명의 슬관절에서 관절강내 주

입 후 임상개선의 결과를 보고하였다. Altman (1998) 은 495명의 특발성 (idiopathic)

arthritis 환자에서 관절내 약물주입 후 위약군과 비교한 연구 결과를 Wu (1997) 는

90명의 arthritis 환자에서 hyaluronan 제재인 ARTZ 를 관절내 주입 후 6개월 후 임

상평가를 보고하였다.

TMJ 에서의 임상연구를 보면 Kopp (1985) 가 보존적 치료에 반응하지 않는 33

명의 RA 환자에서 관절 내 hyaluronan 에 대한 치료 결과를 보고한 이래로 Kopp

(1987,1991) 가 다시 최소 6개월 이상의 증상발현기간을 가지고 보존적 치료법에 반

응하지 않는 24명의 측두하악관절염 환자에서의 임상결과를 보고 하였다. McCain

(1989) 은 악관절경 수술에서 hyaluronan 을 사용하는 군과 사용하지 않는 군간의

수술술식에서의 유용성차이를 Fader (1993) 는 비정복성 악관절장애 (closed lock) 환

자에서의 임상보고를 하였다. Bertolami (1993) 는 비수술적 방법에 반응하지 않는 환

자에서의 임상시험결과를 보고한 바 있다. Yustin (1995) 은 측두하악관절염에서의

hyaluronan 을 이용한 viscosupplementation therapy 의 개념을 보고하면서

hyaluronan 의 정상 분자, 중량과 농도를 회복시켜 준다고 하였다. Sato (1997) 는 비

정복성 악관절원판변위 환자에서 세정술식과 동시에 hyaluronan 을 주입 후 임상결

과를 보고했다. Neo (1997) 은 6마리 양의 측두하악관절에서 실험적으로 arthritis 을

유발시킨 다음 한쪽에 hyaluronan 을 투여 후 반대측과의 변화을 비교한 바 있다.

Hirota (1998) 는 방사선상 과두 변성이 없는 15명의 ID 환자에서 hyaluronan 주입 전

30

후의 synovial fluid 성분의 변화와 임상증상개선의 유용성을 보고한 바 있다. 그 외

Miyamoto (1998), 최 (1994) 가 악관절기능장애 환자 중 보존적 치료에 효과가 없거

나 또는 관절의 퇴행성 변화가 진행된 14명의 환자를 4주간의 효과를 평가한 바

있다.

한편 hyaluronan 과 NO 와의 관련성에 대한연구는 슬관절에서 Takahashi (2000)

가 실험적으로 유도된 arthritis 를 가진 36마리의 rabbit 에서 hyaluronan 주입시 과

두 (condyle) 에서의 chondrocyte apoptosis 를 줄이는 효과는 있으나 NO 에는 큰 영

향이 없는 것으로 보고하였다. Hyaluronan 이 Fas antigen 이 cell surface receptor 에

binding 하는 cell apoptosis 과정 중 Fas ligand 를 방해하여 cell apoptosis 를 줄여준

다고 한다. 이는 Fuji (2001) 등이 hyaluronan 의 cell receptor 인 CD 44끼리의 cross

liking 이 Fas 발현과 Fas mediated apoptosis 를 증가 시킨다고 보고 하였으며 이는

hyaluronan 이 CD44와 결합하여 CD44 cross linking 을 줄여준 결과로 이해할 수 있

다. 또한 Takahashi (2001) 는 동일한 실험동물모델에서 meniscus 와 synovium 에서

hyaluronan 이 NO 의 생성을 억제한다고 보고하였다. 즉 hyaluronan 이 연골에서의

NO 생성에는 영향이 없으나 disc 와 synovium 에서는 NO 생성에 영향을 준다고 보

고하였다. 이 연구에서는 주로 synovium 에서의 변화를 관찰하였으나 앞으로 디스크

와 과두에서의 영향도 연구되어야 할 것으로 본다. Kobayashi (2002) 는 partial

menisectomy 후 meiscus 의 중심부에서 hyaluronan 이 NO 의 생성과 cell apoptosis

에 영향을 준다고 보고하였다. 한편 Tung (2002) 은 chondrocyte 에서 hyaluronan 이

NO 의 생성에 영향을 주지 않는다고 보고 하였다.

TMJ 에서의 hyaluronan 과 NO 의 관련성에 대한 연구는 Alpaslan (2000) 이 ID 환

자에서 10명은 arthrocentesis 만 시행하고 15명은 arthrocentesis 와 hyaluronan 주입

을 병행한 후 각각의 환자에서 synovial fluid 을 sampling 하여 관절액내의 nitrite 와

nitrate 농도를 비교한 결과 hyaluronan 을 주입한 군이 nitrite 와 nitrate 농도가 유

의성 있게 감소하였음을 보고 하였으나 면역조직학적 방법으로 hyaluronan 과 NO

31

의 관계에 대한 연구는 없는 실정이다. 따라서 이 실험에서는 최초로 둘 간의 상관

관계를 면역조직학적 방법으로 관찰하여 NO 가 hyaluronan 의 주입으로 영향을 받

음을 입증하였다.

이외에 NO 의 생성에 영향을 주는 것에 대한 연구로는 Borderie (2001)

Sadowski (2001) 은 tetracycline 이 NO 의 생성을 줄이며 Hildehrandt (1998) 은 low

dose radiation 이 NO 를 줄인다고 하였다. 이 외에 NO inhibitor 인

N-monomethyl-L-arginine (L-NMMA) 와 reactive oxygene species (ROS) scavenger

인 N-acetylcysteine (NAC) 등의 항산화제가 NO 의 생성에 영향을 주며 hyaluronan

도 Fukuda (1997), Cortivo (1996) 에 의하면 항산화 작용이 있음을 보고하였다.

Group I 중 하관절강에서 iNOS 가 미약하게 발현되었는데 이는 substance-P 와

같이 iNOS 도 정상 rat TMJ 에서의 synovial linging 에서도 발현된다는 Yamaza (2003)

의 연구 결과와 동일하며 정상에서의 iNOS 가 TMJ 의 physiological condition 을 유

지하는 mediator 로서도 작용한다는 Masuda (2002) 의 보고도 있다.

NO 가 cell proliferation 이나 cell apoptosis 과의 관련성에 대한 연구는 Pelletier

(2001) 가 iNOS 와 COX-2 가 apoptosis 에 중요하다고 보고 하였으며 Pozza (2000) 는

NO 와 NGF 가 cell differentiation 과 apoptosis 에 작용한다고 하였다. Nishida (2001)

는 NO 가 chondrocyte 에서 hyperplasia 와 apoptosis 에 중요 작용을 한다고 보고 하

였다. Vant Hof (2000) 도 NO 가 apoptosis 의 mediator 라고 하였다. Cho (2003) 는

apoptosis 의 유발이 iNOS 와 MMPs 의 증가와 관련이 있으며 Henrotin (2003) 은

reactive oxygen species (ROS) 인 NO, peroxynitrite, superoxide anion radical 등이 세

포 apoptosis 와 연관되어 작용이 된다고 설명하였다. Schuerwegh (2003) 는 IL-1,

IL-6, TNF 가 NO 의 생성을 촉진하면서 세포의 viability (necrosis/ apoptosis) 와

proliferation 에 영향을 준다고 보고하였다. 또한 Lee (2003) 는 관절내의 기계적인

sheer stress 가 NO 의 생성을 유발하며 이것이 다시 apoptosis 에 영향이 있음을

Islam (2002) 도 human chondrocyte 에서 hydrostatic pressure 가 iNOS 의 발현을 증

32

가시키고 이것이 apoptosis 을 일으킨다고 하였다. Sharawy (2002) 는 rabbit TMJ 에

서 인위적으로 디스크를 변위 (displacement) 시킬때 chondrocyte 의 cell proliferation

이 증가됨을 보고하였으며 Kim (2003) 은 말의 chondrocyte apoptosis 가 NO 의 생

성과 상호 관련이 있음을 보고하였다. 상기의 결과는 모두 chondrocyte 에서의 결과

이며 synoviocyte 에서의 연구는 Jovanovic (2002) 이 human OA synoviocyte 에서 NO

에 의한 cell death 를 Kobayashi (2001) 는 partial menisectomy 후 meniscus 에서 증

가된 NO 와 apoptosis 를 보고하였으며 Migita (2001) 는 synovium 에서 NO 가 오히

려 cell death 를 방해하여 cell proliferation 을 유발한다고 설명하였다. TMJ 에서의

연구는 Nagai (2003) 가 31명의 ID 와 11명의 arthritis 가 있는 환자에서 arthroscopic

으로 specimen 을 sampling 하여 면역조직학적으로 관찰하여 본 결과 iNOS

immunoreactivity 가 synovial lining cell 과 subintimal layer 의 macrophage 에서 증

가되었으며 이러한 iNOS 와 NO 에 의해 oxidative stress 가 유발되며 Fas 발현이

iNOS-positive 한 군에서 보다 증가, 즉 cell apoptosis 가 증가됨을 보고 하였다.

Relic (2002) 은 TNF-alpa 가 NO-induced apoptosis 을 유발하는데 NF-κB 가 관

여함을 Yoon (2003) 는 NO 가 articular chondrocyte 의 apoptosis 와 dedifferentiation

을 유발하며 이 과정은 extracellular signal regulated kinase (ERK), P38 kinase, protein

kinase C (PKC) 등의 modulation 으로 일어나며 이러한 과정에 NSAID 가

cyclooxygenase 와 상관없이 NO-induced apoptosis 와 dedifferentiation 을 억제 한다

고 보고하였다. Helene (2004) 는 carrageenan 으로 유도된 acute synovitis 에서 NK-1,

B2 receptor 에 bradykinin 과 substance-P 가 관여해서 cell proliferation 을 일으킨

다고 설명하였다.

이 연구에서도 carrageenan 으로 염증이 촉발된 Group III 에서 cell proliferation

이 증가된 양상을 보였으며 이것이 NO 의 증가와 관련이 됨을 알수 있다. 그러나

cell apoptosis 을 보여 주는 TUNEL staining 에서는 여러 선학들의 연구와 달리 큰

차이를 보이지는 않았다. 이는 염증이 발생된 2주후에 실험동물을 희생하여서 보다

33

명확한 cell interaction 을 보여 주지는 않은 것인지 의문이 가며 또한 위 선학들의

연구가 주로 chondrocyte 에서의 결과이며 이 연구에서는 synoviocyte 에서의 변화

를 주로 관찰하였다.

Nagashima (2002) 에 의하면 cell proliferation 이 angiogenesis 와 깊은 연관성

이 있음을 보고 하였는데 Walsh (1998) 는 rat 에서 carrageenan 으로 synovitis 을 유

도시 vascular density 가 3일까지는 감소한 후 14일까지 급격히 증가하다가 28일까

지는 다시 감소한다고 보고하였다. 이 실험에서도 carrageenan 주입후 2주후에 희생

하여 관찰 한 시기가 vascular density 가 가장 클 때라고 볼수있으며 결국

angiogenesis 가 왕성한 시기이며 이와 연관된 세포 증식이 많이 일어났음을 보여

주는 것이라 생각된다.

Hyaluronan 과 cell proliferation 과 cell apoptosis 과의 관련성은 Sheehan (2003)

이 고분자 hyaluronan 을 OA 가 있는 슬관절에 주입시 synovium 내의 macrophage

에서의 세포증식을 줄여주며 세포사멸을 억제한다고 보고하였다. Kaneco (2000) 는

hyaluronan 의 apoptosis 의 억제효과는 CD44가 관여됨을 Lisignoli (2001) 는 human

OA 을 가진 슬관절에서 chondrocyte 를 culture 한 후 500-730 kd 의 hyaluronan 을

처리한 결과 anti-Fas induced chondrocyte apoptosis 가 감소되었으며 이는 CD44,

ICAM-1 에 hyaluronan 이 결합하여 Fas-mediated cell apoptosis 를 감소시킨 결과라

고 보고하였다.

이 연구에서도 hyaluronan 을 주입한 IV 군이 carrageenan 에 의해서 cell

proliferation 이 증가된 III 군에 비해서 감소된 immunoreactivity 를 나타내었으며 이

는 hyaluronan 이 세포증식을 억제하는 기능이 있는 것으로 생각된다. 그러나

hyaluronan 이 세포사멸을 나타내는 TUNEL 염색에는 큰 영향을 주지 않는 것으로

생각된다. 이는 carrageenan 으로 세포사멸이 증가되지 않은 상태임으로 hyaluronan

34

이 세포사멸을 줄여준다는 기존의 연구결과에 상반되지는 않으나 좀 더 연구가 필

요하리라 생각된다.

Carrageenan 주입 후 hyaluronan 의 주입은 1주일 후 1회만 시행하였다. 그러나

관절에서의 이 약제의 사용은 보통 1주 간격으로 5회 정도 시행하는 것이 일반적

이나 측두하악관절에 적용된 임상연구보고 2주간격으로 2회 주입한 연구

(Kopp, 1985, 1987, 1991; Yustin, 1992; Hirota, 1998) 와 Bertolami (1993), Sato (1997),

Miyamoto (1998)가 1회만 주입한 연구도 있으며 1회 주입 한 연구에서도 그 효능이

있음이 알려졌다. 향후 비슷한 연구에서 약제사용 횟수나 분자량, 농도, 기간의 다양

성등에 의해서 나타나는 결과의 차이도 좀 더 연구가 필요하리라 생각되며 정량적

분석법을 이용한 연구도 차후에 시행되어야 할것으로 생각된다.

35

V. 결론

실험동물중 아무 조작을 시행하지 않은 I 군과 saline 을 주입한 II 군 그리고

carrageenan 으로 인위적 synovitis 을 유도한 후 hyaluronan 을 관절내에 주입하지

않은 III 군과 synovitis 유도후 hyaluronan 을 주입한 IV 군에서 NO 을 생성하는데 관

여하는 iNOS 의 발현과 이를 cell signalling 하는 NF-κB 의 발현을 III 군과 IV 군 사

이에 면역조직학적 소견을 비교하여 hyaluronan 이 NO 의 생성과 세포증식과 사멸

에 어떠한 향을 미치는지 면역조직학적방법으로 연구하여 다음과같은 결과를 얻었

다.

Carrageenan 으로 유도된 III 군이 아무런 조작을 하지 않은 I 군이나 saline 만

을 주입한 II 군에 비해서 iNOS 와 NF-κB, PCNA immunoreactivity 가 증가된 양상

을 나타내었으나 TUNEL staining 에서는 차이가 없었다. Carrageenan 으로 유도된 III

군과 IV 군사이의 비교에서 hyaluronan 을 주입한 IV 군이 주입하지 않은 III 군에 비

해서 iNOS immunoreactivity, NF-κB immunoreactivity, PCNA immunoreactivity 가 감

소되는 양상을 보였다.. Carrageenan 으로 유도된 III 군과 IV 군사이의 비교에서

hyaluronan 을 주입한 IV 군과 주입하지 않은 III 군사이에 TUNEL staining 의 차이

는 보이지 않았다.

이상의 결과로 hyaluronan 을 주입하는 것이 carrageenan 으로 유도된 synovitis

에 관여되는 염증전구물질중의 하나인 nitric oxide 의 생성과 세포 증식을 조절함에

영향을 미치며 세포사멸에는 큰 영향을 보이지 않는 것으로 사료된다. 이와 같이

염증성 질환에서의 hyaluronan 의 주입은 nitric oxide 의 감소와 세포증식의 감소를

통하여 염증반응을 억제하여 관절기능의 회복에 중요 역할을 한다.

36

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53

ABSTRACT

The Effects of Hyaluronan on the Synthesis of Nitric

Oxide in the TMJ Synoviocyte (Immunohistochemistry

research)

Kook Jin Han, D.D.S., M.S.

Department of Dentistry, The Graduate School, Yonsei University

(Directed by Professor, Han Sung Jung, Ph.D)

This study was performed to evaluate the effectiveness on the nitric oxide

synthesis, cell proliferation and cell apoptosis in the synovial membrane when the

intraarticular injection of high molecular weight exogeneous hyaluronan (sodium

hyaluronate) in the carrageenan-induced synovitis of rat TMJ is done. The expressions

of iNOS, which participate in nitric oxide production, and NF-κB, which is involved

cell signals of iNOS from the four groups were immunohistochemically compared by

iNOS immunohistochemistry, NF-κB immunohistochemistry. Cell proliferation and

apoptosis were compared by PCNA immunohistochemistry and TUNEL staining.

Twenty rats were classified into 4 groups. The four groups included the control

group I, the saline-injected group II, the carrageenan-induced synovitis group III, and

the carrageenan-induced synovitis with hyaluronan injection group IV.

54

The results were as follows.

1. Group III showed increased iNOS, NF-κB, and PCNA immunoreactivity than group

I or group II.

2. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreased iNOS

immunoreactivity than Group III.

3. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreased

NF-κB immunoreactivity in some areas than Group III.

4. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group IV showed decreased

PCNA immunoreactivity than Group IV.

5. In comparing the two carrageenan-induced groups, Group III and Group IV did

not show any differences in tunnel staining.

These results suggest that injection of hyaluronan into the joint space of rat TMJ

synovitis induced by carrageenan is made it to decrease the synthesis of nitric oxide

and cell proliferation in the synovial membrane. But it does not have a significant effect

on cell apoptosis. Injection of hyaluronan into the joint space as therapy of TMJ

inflammatory disease has advantage on the diminishment of inflammatory cascade by

involvement of iNOS and cellular interaction

Key Words: Carrageenan, Hyaluronan, TMJ (temporomandibular joint), Synovitis, Nitric

Oxide (NO), iNOS (inducible nitric oxide synthetase), NF-κB (Nucleo Factor involved

in the transcription of the κ-light-chain gene in B lymphocyte), immunohistochemistry,

PCNA (proliferating cell nuclear antigen), TUNEL staining, Cell proliferation, Cell

apoptosis

55

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(면역조직학적 연구) - Yonsei University · 2019-06-28 · 국문요약 Hyaluronan이TMJ synoviocyte에서 Nitric oxide 의 생성에 미치는 영향 (면역조직학적 연구)