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Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire
Détection des allergènes alimentaires
Comité consultatif, 24/01/2014
Dr. P. DELAHAUT CER Groupe - Département Santé Comité scientifique de l’AFSCA
Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire
Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire 2
1. introduction
2. législation
3. standards d’allergènes
4. méthodes analytiques
– ELISA
– ADN
– MS
5. conclusions
Sci Com-Com Cons – Bruxelles, 24/01/2014
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1. introduction
réaction à la nourriture
non-toxique
réaction immunologique allergie alimentaire
IgE non-IgE
réaction non-immunologique intolérance alimentaire
enzymatique pharmacologique indéfinie
toxique
Sci Com-Com Cons – Bruxelles, 24/01/2014
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background • Avis Sci Com 37-2006 & 18-2013 • L’allergie alimentaire peut être définie comme étant une
réponse anormale du système immunitaire à des aliments habituellement inoffensifs.
• Le développement d’anticorps IgE qui sont capables de reconnaître et de réagir avec une protéine d’un aliment spécifique, est la cause la plus fréquente des allergies banales et sévères.
‘One man’s food is another man’s poison’
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allergènes pertinents ? en principe, toutes les protéines alimentaires peuvent provoquer des réactions allergiques
→ thérapie: éviction
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allergènes pertinents ?
a) prévalence des allergènes alimentaires b) gravité des réactions allergiques (symptômes) c) potentiel allergisant des aliments (valeurs seuils cliniques)
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a) prévalence
• très difficile à déterminer - autorapportage: surestimation
- test de provocation: beaucoup de main-d'œuvre + onéreux
- variation: préparation des aliments, population choisie
• augmentation des allergies alimentaires
• enfants : 4,7 % en Europe
• adultes : 3,2 à 3,7 % en Europe
Sci Com-Com Cons – Bruxelles, 24/01/2014
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le % le plus bas et le plus élevé de personnes atteintes d’une allergie alimentaire (méta-analyse du projet EuroPrevall; enfants + adultes) (basé sur Zuidmeer et al., 2008 et Rona et al, 2007; Nørhede, 2008)
prévalence relative (%) (source: Moneret-Vautrin, 2008; sur base des données CICBAA)
allergène 0-1 an (n=14
7) 1-3 jans (n=359)
3-15 ans (n=468)
adultes(n=287)
oeufs 77,5 69,6 24,3 6,3
lait 29,2 25,6 7 3,5
arachides 19,7 37,6 49,3 10,1
fruits à coque 2,7 4,4 10,2 15,7
légumineuses 0,6 4,4 13,4 5,9
poisson 0,6 5 10 3,1
prunoïdés 0 0 0 31,3
avocat, banane, noix du Brésil, kiwi
0,6 1,3 5,3 22,6
apiacées 0 0 1,7 16,4
a) prévalence
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b) gravité de la réaction - symptômes
• rhinite
• dermatite atopique
• angio oedème
• shock anaphylactique
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b) gravité de la réaction - symptômes fréquence (%) suivant laquelle les allergènes alimentaires provoquent
l’ anaphylaxie
(a) Étude clinique européenne en coupe transversale sur des patients externes - EuroPrevall – résultats préliminaires (source: Montserrat Fernández Rivas, 2012)
(b) Étude française chez les adultes; Reseau Allergo Vigilance (novembre 2010) (source: Riziv, 2010)
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c) valeurs seuils cliniques Allergène LOAEL (a)
(mg protéine) Dose de référence VITAL (b)
Dose (mg protéine)
risque quantitatif Qualité de la banque de données
Arachides 0,25-10 0,2 ED01* excellente Lait 0,36-3,6 0,1 ED01 excellente Œuf 0,13-1,0 0,03 ED01 et ED05 95% lci** excellente
Soja 88-522 1,0
ED05 95% lci Rem. : cette concentration ne protégera pas
certaines personnes sensibles au lait de soja
suffisante
Blé 1,0
ED05 95% lci Rem. : les consommateurs allergiques au blé
sont pour la plupart protégés lorsque les denrées alimentaires contiennent < 20 ppm
gluten
suffisante
Noix de cajou 2,0 (provisoire) ED05 95% lci marginalement suffisante
Moutarde 1-936 0,05 ED05 95% lci suffisante Lupin 4,0 ED05 95% lci suffisante
Graines de sésame 30 0,2 ED05 95% lci marginalement suffisante
Crevettes 10 ED05 95% lci marginalement suffisante
Céleri n/a *** insuffisante Poisson 1-100 n/a insuffisante Fruits à coque (noix, noix de pécan, amande, pistache, noix du Brésil, noix de macadamia)
0,02-7,5 insuffisante
Noisette 0,1 ED01 et ED05 95% lci bonne
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2. législation: Règlement 1169/2011
• information sur la présence d’allergènes dans les aliments non pré-emballés
• étiquetage: clair et lisible • 14 allergènes : céréales contenant du gluten, crustacés,
œufs, poissons, arachides, soja, lait, noix, céleri, moutarde, graine de sésame, sulfite, lupin et mollusques
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Qu’est-ce qu’un allergène alimentaire ? aliment
un allergène alimentaire – beaucoup d’épitopes allergéniques
composant alimentaire
protéines
épitopes
3. standards d’allergènes
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variabilité des extraits protéiques
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échantillons • standard protéique • beurre d’arachide • arachide grillée • arachide grillée salée • arachide entière – grillée • arachide entière
1 2 3 4 5 6 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa
50 kDa
37 kDa
25 kDa 20 kDa
15 kDa
• extraits de protéines de différents échantillons d’arachides • détermination de la concentration en protéine par BCA • comparaison des profils par SDS-PAGE (chaque échantillon est à 1 mg/mL de protéine)
Arah1
Arah3/4
Arah2
→ Quel extrait est le standard ?
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pourquoi des tests ?
• mention sur l’emballage – mention d’absence – étiquetage de précaution
• chaînes d’approvisionnement – validations des mentions – surveillance des fournisseurs
• plaintes des consommateurs
4. méthodes analytiques
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techniques
• techniques basées sur la détection de protéines: dosages immunologiques
• Elisa • LFD • Biosensor • FCA
• techniques basées sur la détection de l’ADN: PCR
• techniques physico-chimiques: LC/MS-MS
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ELISA – caractéristiques principales
• basé sur l’interaction anticorps/antigène • les anticorps sont dirigés contre les protéines
allergéniques spécifiques • en général, cliniquement pertinent (relation avec la
réaction) • quantitatif (courbe standard) • méthode très spécifique et sensible (ppb - mg/kg) • largement utilisé par l’industrie et les organismes de
réglementation
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sandwich ELISA
Anticorps spécifique coaté dans le puit
Enzyme lié à l’anticorps spécifique de l’antigène
S S S S
positif negatif
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0,1 1 10
Abs
(DO
)
Concentration (ppm)
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→ influence du process (ex. ‘cookies’)
A B C DE
baked
Not baked050
100150200250300350400450500
caséine
1000 ppm
A B C DE
baked
Not baked0
5
10
15
20
25
beta-lactoglobuline
1000 ppm
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→ tests de diagnostics rapides
• lateral flow device • flow through • dipstick
– faciles d’utilisation – détection rapide (en quelques minutes) – spécifiques – sensibles
=> on site tests
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principe LFD
https://www.cytodiagnostics.com/lateral-flow-immunoassays.php
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techniques basées sur la détection de l’ADN PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNA séquence spécifique
amplification par PCR utilisé pour
déterminer la présence de
l’arachide dans l’échantillon peut être séquencé
pour confirmation
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protéines
technique LC-MS/MS - principe
digestion enzymatique
peptides un allergène alimentaire – de nombreuses protéines allergéniques
sélection requise de la protéine/du peptide cîble
analyse par MS/MS
approche instrumentale analyse d’échantillons biologiques pour identifier les peptides d’intérêts
approche théorique digestion de novo, sélection des peptides & prédiction des paramètres MS
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α-S1-casein MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW
α-S2-casein MKFFIFTCLLAVALAKNTMEHVSSSEESIISQETYKQEKNMAINPSKENLCSTFCKEVVRNANEEEYSIGSSSEESAEVATEEVKITVDDKHYQKALNEINQFYQKFPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKRNAVPITPTLNREQLSTSEENSKKTVDMESTEVFTKKTKLTEEEKNRLNFLKKISQRYQKFALPQYLKTVYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL
Ovalbumin MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAMGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP
analyse d’oeuf et de lait dans le vin
→ chromatogrammes
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MS – principales caractéristiques • la MS permet une bonne quantification des
allergènes - problème du standard interne à résoudre • les dosages par MS sont standardisés avec des
réactifs chimiques • la spécificité est supérieure à d’autres techniques • les méthodes MS peuvent être développées pour la
confirmation - avantage : méthode multi-allergènes • une validation complète: la variation interlaboratoire
est importante à évaluer • la MS nécessitera quelques années pour être
complètement reconnue • coût!!!
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détectabilité vs. allergénicité 5. conclusions
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comparaison des méthodes Méthodes Limites Avantages
ELISA •manque de robustesse au process
• rapidité + • semi-quantitatif
on site tests • qualitatif • rapidité ++ •utilisation sur site
PCR •qualitatif • échantillons positifs même en absence de protéines allergisantes
• complémentarité à l’ELISA
LC-MS/MS •délai et coût d’analyse •modification des protéines/peptides lors du process : impact sur le résultat
•multi-screening •quantitatif (! standard interne) • spécificité
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MERCI à …
• groupe de travail: P. Delahaut (Sci Com), M. De Loose (ILVO), B. De Meulenaer (Sci Com), V. Dumont (CER), A. Huyghebaert (UGent), H. Lapeere
(UZGent), G. Maghuin-Rogister (ULg), M.-L. Scippo (Sci Com), C. Van Peteghem (Sci Com)
• Direction d’encadrement pour l’évaluation des risques
• AFSCA – Comité scientifique
28 Sci Com-Com Cons – Bruxelles, 24/01/2014
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