Upload
others
View
8
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI
Facultatea de Fizică
Școala Doctorală de Fizică
Specializarea Biofizică
Drd. Bogdan ZORILĂ
_____________________________________________________________________ _
STUDIUL INTERACȚIEI PROTEINELOR CU MEMBRANELE
LIPIDICE MODEL ȘI CU MEMBRANELE BIOLOGICE __________________________________________________________________ ____
Rezumatul Tezei de Doctorat
Conducător științific
Prof. Univ. Dr. Aurel POPESCU
București, 2018
1
Scopul lucrării
Primul capitol al Tezei de Doctorat este reprezentat de o motivație redată integral în
paragrafele următoare.
Raportul Organizației Mondiale a Sănătății (WHO, 2014), referitor la rezistența
antimicrobiană, indică o creștere alarmantă a numărului de microorganisme rezistente la
tratamentele antimicrobiene clasice (antibiotice). Una dintre direcțiile recomandate este aceea de
a crea noi metode de tratament a infecțiilor cu agenți patogeni, bazate pe proprietățile
bacteriostatice și bactericide ale peptidelor antimicrobiene (AMP).
În cadrul unui grant de cercetare, intitulat “Generarea și investigarea unor noi peptide
antimicrobiene, cu dimensiune redusă. Corelarea structurii peptidelor cu funcția lor”,
http://www.science.research.uaic.ro/biopep/index.html, au fost generate și sintetizate 8 noi
structuri peptidice, numite în mod generic, P1 – P8, bogate în reziduuri de Triptofan și Arginină,
fiind cunoscut efectul sinergic al acestor reziduuri, împotriva liniilor celulare bacteriene.
În paralel cu experimentele in vitro, utilizând aceste 8 peptide, a fost nevoie și de un studiu
aprofundat al mecanismelor biofizice prin care acestea interacționează cu membranele lipidice,
pentru determinarea afinității acestora față de două tipuri de membrane lipidice acceptate în
literatură ca modele simple pentru membranele celulelor de mamifere și bacteriene. În urma
acestui studiu, s-a pus în evidență diferențele care apar între cele 8 peptide, comparând rezultatele
obținute, dar și făcând o paralelă cu rezultatele obținute, în aceleași condiții, pentru trei peptide
“model”, foarte bine caracterizate în literatură: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, fiecare
dintre acestea având mecanisme diferite de interacție cu bistratul lipidic.
S-a dorit, în urma experimentelor, să se obțină, pe de-o parte, gradul de accesibilitate al
reziduurilor de Triptofan la moleculele unui stingător colizional al fluorescenței (acrilamida) și, pe
de altă parte, variațiile energiilor libere Gibbs de partiționare a peptidelor din mediul hidrofil în
mediul hidrofob. Valorile obținute în aceste experimente au fost comparate cu cele obținute pentru
peptidele “model”.
Deoarece membrana (celulară, bistrat lipidic) este primul compartiment afectat de interacția
cu peptidele antimicrobiene, a fost necesară evaluarea modului în care starea bistratului lipidic este
afectată de prezența AMP. Una dintre metodele de investigare este analiza fluidității membranare
utilizând fluorofori, în particular Laurdanul, care se inseră în bistratul lipidic. Analiza detaliată a
2
spectrelor de emisie ale Laurdanului a necesitat dezvoltarea și validarea unei noi metode de
evaluare a fluidității membranare, mai sensibilă decât metodele utilizate, până în acest moment.
Această metodă folosește o procedură de deconvoluție a spectrelor de fluorescență statică,
utilizând funcții asimetrice de tip log-normal (LN). După validarea metodei, s-a pus în evidență
diferențele care apar la nivelul fluidității bistratului lipidic, în funcție de mecanismul de interacție
dintre peptidă și membrana celulară sau lipidică model.
Metoda de analiză a spectrelor complexe de fluorescență statică, utilizând deconvoluția
acestora, cu funcții asimetrice de tip LN, a fost utilizată și pentru spectrele de emisie fluorescentă
ale Triptofanului, dar utilizând o adaptare originală a metodei din literatură. Astfel, noua abordare,
furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la bistratului lipidic și peptida
liberă în soluție.
Pentru evaluarea accesibilității reziduurilor de Triptofan la moleculele de stingător și a
variației energiei libere Gibbs, s-a dezvoltat, pornind de la zero, un echipament experimental
pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. După realizarea, verificarea și calibrarea
acestuia, s-au efectuat măsurători pentru evaluarea interacțiilor dintre peptidele precizate anterior
și membranele lipidice model. Realizarea practică a echipamentului pentru măsurarea timpilor de
viață ai fluorescenței a deschis noi direcții de analiză a interacțiilor moleculare, rezultatele obținute
putând fi aplicate la o gamă largă de molecule (polipeptide, proteine etc).
Studiul bibliografic
În capitolul 2 sunt prezentate aspecte actuale legate de peptidele antimicrobiene, rezistența
microorganismelor la tratamentele clasice, avantajele și dezavantajele utilizării AMP în
tratamentele antiinfecțioase, rolul anumitor aminoacizi din structura primară a peptidelor și
mecanismele de interacție a AMP cu membranele celulare.
Toate organismele prezintă mecanisme de apărare înnăscute, mecanisme ce fac parte din
sistemul lor imunitar. Peptidele antimicrobiene, AMP, sunt implicate în aceste mecanisme de
apărare înnăscute. AMP-urile sunt compuși cu masă moleculară mică, având în structura lor
aminoacizi, prezentând un spectru larg de activități antimicrobiene împotriva bacteriilor Gram-
negative și Gram-pozitive, a virusurilor, protozoarelor și ciupercilor. Majoritatea AMP-urilor sunt
3
caracterizate de proprietăți fizico-chimice generale, ca sarcina electrică netă (încărcare pozitivă, în
general) ridicată și separarea spațială a regiunilor hidrofobe de cele hidrofile, ceea ce duce la
interacția lor diferită cu miezul hidrofob al bistratului lipidic și cu mediul hidrofil extracelular.
O comparație a secvențelor AMP relevă că două tipuri de catene laterale sunt esențiale pentru
activitatea antimicrobiană. Catenele laterale cationice, cum ar fi cele alcătuite din reziduurile
Arginină și Lizină, mediază interacțiunile AMP cu membranele încărcate negativ și/sau cu peretele
celular al bacteriilor Gram-negative. Catenele laterale hidrofobe, cum ar fi cele care au în structura
lor reziduurile Izoleucină, Leucină, Fenilalanină sau Triptofan, reziduuri ce apar frecvent în
structura primară a AMP-urilor, se comportă ca niște ancore lipofile care destabilizează bistratul
lipidic și, în cele din urmă, produc dezorganizarea acestuia. S-a observat că activitatea
antimicrobiană a AMP este guvernată de încărcarea net pozitivă și de hidrofobicitatea reziduurilor
din structura acestora, trebuind să existe un echilibru adecvat între aceste două tipuri de reziduuri
pentru a evita toxicitatea față de celulele de mamifere.
Mecanismul de acțiune al AMP implică interacția electrostatică a moleculelor peptidice
încărcate pozitiv cu suprafața membranelor agenților patogeni, încărcată negativ, urmată de
penetrarea membranei, ceea ce duce la scurgerea conținutului intracelular în mediul extracelular.
Majoritatea studiilor referitoare la mecanismul de acțiune al AMP-urilor cationice au fost efectuate
utilizând membrane lipidice model, cu diferite compoziții de lipide. Atunci când interacția AMP
cu membranele lipidice duce la apariția unor reorganizări la nivelul bistratului, în urma cărora apar
efecte de distrugere ale acestuia, sunt implicate trei tipuri de mecanisme, în urma cărora apar
structuri de tipul: “carpet like”, “barrel-stave” și pori toroidali.
În continuarea acestui capitol, se prezintă informații referitoare la structura membranelor
celulare (de mamifere și bacteriene) fiind evidențiate diferențele dintre acestea, la proprietățile
membranelor lipidice și sunt descrise structurile biomimetice (lipozomii) utilizate.
Tehnicile utilizate în Teză, spectroscopia statică de fluorescență și spectroscopia rezolvată
în timp și principiile fizice care stau la baza acestora sunt descrise în capitolul 3. În acest capitol
sunt prezentate și informații despre compușii chimici utilizați în aceste tipuri de măsurători, cu
evidențierea proprietăților celor doi fluorofori, Laurdanul și Triptofanul.
În capitolul 4, sunt prezentate informații despre AMP utilizate în secțiunea experimentală.
Astfel, sunt selectate din literatura de specialitate informațiile cele mai relevante referitoare la
4
cele trei peptide utilizate ca “modele”: Melitina, Indolicidina și Cecropina P1 dar, sunt prezentate
și unele caracteristici fizico-chimice ale peptidelor nou sintetizate, P1 – P8, pentru care s-a dorit
obținerea de informații relevante referitoare la modul de interacție al acestora cu membranele
lipidice model.
Cercetarea experimentală
Secțiunea de cercetare experimentală proprie începe de la capitolul 5, în care sunt prezentate
materialele și metodele utilizate pentru realizarea experimentelor descrise în Teză.
În capitolul 6, este prezentată realizarea și optimizarea funcționării echipamentului
experimental pentru măsurarea timpilor de viață ai fluorescenței. Schema practică a
echipamentului experimental are la bază planul original al fluorimetrului FluoTime 100, produs
de firma germană PicoQuant, care a fost adaptat pentru cerințele experimentale locale.
Optimizarea funcționării s-a realizat pe baza verificării performanțelor prin măsurarea
timpilor de viață ai fluorescenței pentru o serie de fluorofori, utilizați în practică drept standarde
pentru timpul de viață: NATA și L-Triptofan dizolvate în PBS, Indol dizolvat în apă, PPO și p-
Terfenil dizolvate în alcool etilic. Rezultatele obținute în urma măsurătorilor sunt similare cu cele
din literatura de specialitate.
O altă serie de experimente au vizat stabilirea “sensibilității” instrumentului de măsură,
prin varierea concentrațiilor fluoroforilor în soluție, într-o gamă largă de valori. Pentru
verificarea ”sensibilității” aranjamentului experimental, s-a realizat un al doilea set de
experimente, în care concentrația probelor a fost variată între 1 µM și 500 µM (în pași de 1-2-3-5
µM), temperatura probelor fiind menținută constantă, la 25 °C. În urma analizării datelor
experimentale s-a ajuns la concluzia că spectrofluorimetrul poate măsura timpi de viață ai
fluorescenței într-o gamă largă a concentrațiilor (1 µM – 500 µM) fluoroforilor: Indol-ul și
derivații acestuia, NATA și L-Triptofan.
O aplicație directă a aranjamentului experimental este descrisă în capitolul 7, unde s-a studiat
interacția AMP cu membranele lipidice model care imită, într-un mod simplificat, membranele
celulelor de mamifere.
5
În cadrul acestui studiu, s-a urmărit realizarea unei analize comparative, din punct de vedere
al variației timpilor de viață ai fluorescenței, între Melitină, pe de-o parte și trei dintre peptidele
nou sintetizate: P1 – din clasa celor cu trei reziduuri de Triptofan, P5 – considerată peptida de
referință pentru grupul de 8 peptide și P8 – din clasa celor cu patru reziduuri de Triptofan.
Ca referință, pentru timpii de viață analizați, s-au folosit rezultatele obținute pentru timpul
de viață al fluorescenței pentru L-Triptofan, prezentat în capitolul anterior.
Rezultatele obținute pentru cele trei peptide, P1, P5 și P8, atunci când acestea se găsesc în
prezența lipozomilor alcătuiți din DOPC, pun în evidență faptul că reziduurile de Triptofan din
structura acestora sunt localizate la nivelul suprafeței bistratului lipidic. Acest lucru rezultă din
comportamentul timpilor de viață, atunci când temperatura probei variază, timpii de viață
corespunzători celor trei peptide urmând aceeași tendință cu aceea a L-Triptofanului, pentru
ambele situații în care regăsim peptida liberă sau în prezența lipozomilor alcătuiți din DOPC.
Deoarece, în cazul măsurătorilor în prezența lipozomilor, timpii de viață ai fluorescenței sunt mai
mari, avem o indicație directă a interacției care apare între peptidele studiate și bistratul lipidic,
Triptofanul interacționând într-o măsură mai mică cu moleculele solventului.
În capitolul 8, este descrisă o nouă metodă de analiză a fluidității membranelor lipidice.
Metoda dezvoltată are la bază o procedură de deconvoluție a spectrelor complexe de fluorescență
ale Laurdanului și s-a dovedit a fi mai sensibilă la modificările de fluiditate ale membranei, în
comparație cu metodele clasice.
În cadrul experimentelor descrise în acest capitol, s-a pus la punct o nouă metodă de analiză
a spectrelor de emisie fluorescentă a Laurdanului inserat în bistraturi lipidice. Această metodă are
la bază un model de deconvoluție cu funcții de tip log-normal (LN).
Pentru punerea la punct a metodei este necesar ca parametrii funcției de deconvoluție să fie
calibrați în prealabil. Această calibrare se face utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului
dizolvat într-o gama largă de solvenți (cu diferite valori ale momentului de dipol electric). În urma
calibrării parametrilor, s-a pus la punct modelul de deconvoluție cu funcții LN.
Modelul matematic de deconvoluție, cu funcții LN, utilizează intensitatea fluorescenței
reprezentată în scala numerelor de undă și a fost propus anterior pentru descrierea spectrelor de
emisie a fluoroforilor organici.
6
Validarea modelului s-a făcut utilizând spectrele de fluorescență a Laurdanului inserat în
lipozomi preparați din trei tipuri distincte de lipide: C13, DPPC și DSPC. În urma deconvoluției
au fost obținute câte două peak-uri distincte, corespunzătoare celor două stări ale bistratului lipidic.
Dependența de temperatură a ariilor relative ale celor două peak-uri obținute în urma
deconvoluției, oferă o imagine mai realistă referitoare la tranziția de fază a bistratului, atunci când
această dependență este comparată cu cea obținută în urma analizei cu funcții Gauss.
Pentru toate rezultatele experimentale s-a făcut o comparație între deconvoluția cu funcții
LN și Gauss. În Fig. 1 se pot observa comparațiile între aceste două tipuri de deconvoluție, pentru
spectrele de emisie a Laurdanului, inserat în lipozomii preparați din DPPC, la trei temperaturi
distincte. Pentru spectrele din A, B și C s-au folosit funcții de tip LN, iar pentru cele din D, E și F
funcții de tip Gauss.
7
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
5
6I F
LU
OR
ES
C. [x
10
10]
[cm-1]
Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verdeA
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
5
6
Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verde
I FL
UO
RE
SC
. [x10
10]
[cm-1]
D
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verde
I FL
UO
RE
SC
. [x10
10]
[cm-1]
B
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verde
I FL
UO
RE
SC
. [x10
10]
[cm-1]
E
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
5
Spectrul de fluorescenta
LN fit
LN peak albastru
LN peak verde
I FL
UO
RE
SC
. [x10
10]
[cm-1]
C
16000 18000 20000 22000 24000 26000
0
1
2
3
4
5
Spectrul de fluorescenta
Gauss fit
Gauss peak albastru
Gauss peak verde
I FL
OR
ES
C. [
x10
10]
[cm-1]
F
Figura 1. Comparație între deconvoluția cu funcții LN (A, B și C) și funcții
Gauss (D, E și F).
LUV preparate din DPPC la 20 °C (A și D), 41 °C (B și E) și 60 °C (C și F).
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR, este
mult mai sensibil cu privire la nivelul de hidratare al bistratului, așa cum este indicat de către
Laurdan. Aria peak-ului corespunzător fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care
are loc tranziția de fază sunt dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.
8
0 10 20 30 40 50 60
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 s
R GP
S
r, G
P
T [oC]
A20 30 40 50 60
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
B
S
r, G
P
T [oC]
30 40 50 60 70
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
C
S
r, G
P
T [oC]
Figura 2. Dependența mărimilor ΔSR și GP de temperatură.
Lipozomi preparați din: A – C13, B – DPPC, C – DSPC.
În capitolul 9, sunt prezentate efectele peptidelor “model” asupra membranelor lipidice
model și asupra membranelor biologice, utilizând metoda de analiză descrisă în capitolul anterior.
Rezultatele obținute în cadrul acestui capitol fac obiectul unui articol de specialitate, aflat în curs
de redactare.
Pentru tratamentul aplicat LUV preparate din DOPC (model simplificat de membrană
celulară de mamifer), cu cele trei peptide, Melitina, Indolicidina și Cecropina P1, s-a observat că,
cea mai mică influență asupra fluidității bistratului a avut-o Cecropina P1. Acest comportament
era de așteptat, având în vedere modul de acțiune al acestei peptide, de tip “carpet-like”,
concentrația la care s-a lucrat fiind insuficientă pentru afectarea împachetării laterale a lipidelor.
Efectul Melitinei s-a manifestat pe toată gama de temperaturi de lucru, în urma interacției cu
bistratul lipidic aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR fiind mai mari decât în cazul
lipozomilor fără tratament aplicat. Efectul Melitinei s-a manifestat pe toată gama de temperaturi
de lucru, în urma interacției cu bistratul lipidic aceasta inducând o rigidizare a lui, valorile ΔSR
fiind mai mari decât în cazul lipozomilor fără tratament aplicat.
Același comportament de modificare al fluidității membranare, la interacția cu Melitina și
Indolicidina, s-a obținut și pentru situația în care LUV au fost preparate din DOPC:DPPG (model
simplificat de membrana bacteriana). Gradul de afectare a fluidității bistratului este, pentru cele
două peptide, mai mare decât în cazul interacției acestora cu LUV formate din lipide neutre
datorită, probabil, manifestării interacțiilor de natură electrostatică, în plus față de interacțiile
hidrofobe. Acest comportament era de așteptat, deoarece ambele peptide au afinitate mai mare
pentru lipidele care prezintă sarcini negative în zona capetelor polare. În schimb, Cecropina P1
9
prezintă același comportament față de membranele formate din DOPC:DPPG, ca și în cazul
DOPC, fluiditatea bistratului lipidic fiind identică cu cea din situația în care lipozomii s-au aflat
singuri în soluție.
Pentru testarea efectelor AMP asupra membranei externe a bacteriilor E. coli, s-au ales
Melitina și Indolicidina. Valorile ΔSR indică un grad de împachetare mult mai ridicat al lipidelor,
datorat complexității pe care o au membranele biologice, față de cele din bistratul lipidic al
lipozomilor. Efectele peptidelor asupra membranelor de E. coli se manifestă pe tot intervalul
temperaturilor studiate, fiind mai pronunțat la temperaturi < 25 °C.
Rezultatele obținute au indicat că împachetarea lipidelor, atât din membranele artificiale, cât
și din cele biologice, este afectată de interacția cu AMP. Gradul de afectare al împachetării
lipidelor, raportat în cadrul acestor experimente de parametrul ΔSR, este dependent de proporția
peptidă-lipide, dar și de tipul de peptide și lipide utilizate.
Complexitatea membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un
nivel de împachetare mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste membrane
sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP.
Considerând că bistratul lipidic este prima componentă afectată de tratamentul cu AMP,
această metodă de analiză poate fi utilizată, împreună cu alte tehnici de fluorescență, pentru
evaluarea efectelor peptidelor antimicrobiene asupra membranelor biologice sau artificiale.
În capitolele 10 și 11 s-a studiat interacția AMP, nou sintetizate (P1 – P8), cu două tipuri
de membrane lipidice model. Studiul a avut două abordări: din punctul de vedere al gradului de
accesibilitate a reziduurilor de Triptofan la moleculele solventului și din punctul de vedere al
dependenței variației energiei libere Gibbs de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob.
În ambele capitole, s-a făcut o corelație între rezultatele obținute și structura primară a peptidelor,
dar și a diferențelor care apar în funcție de tipul de membrana lipidică model utilizată. Rezultatele
obținute fac obiectul unui articol de specialitate, aflat în curs de redactare.
Fenomenul de stingere a fluorescenței se referă la orice proces fizico-chimic ce duce la
scăderea intensității fluorescenței unei probe. Există o mare varietate de interacții moleculare care
duc la apariția fenomenului de stingere a fluorescenței. Aceste interacții includ reacțiile care apar
în timpul stării excitate a fluoroforului, rearanjări ale structurii moleculare, transferul rezonant de
10
energie între molecule, formarea de complexe moleculare în starea fundamentală și stingerea
colizională a fluorescenței.
Stingerea colizională a fluorescenței este descrisă de ecuația Stern-Volmer:
𝐹0𝐹=𝜏0𝜏= 1 + 𝑘𝑏𝜏0[𝑄] = 1 + 𝐾𝑆𝑉[𝑄]
unde 𝐹0 și 𝐹 sunt intensitătile fluorescenței, 𝜏0 și 𝜏 sunt timpii de viață a fluorescenței în absența,
respectiv în prezența stingătorului, 𝑘𝑏 reprezintă constanta bimoleculară, 𝜏0 este timpul de viață al
fluoroforului în absența stingătorului și 𝑄 reprezintă concentrația stingătorului. Din ecuație se
observă că 𝐾𝑆𝑉 = 𝑘𝑏𝜏0 reprezintă constanta de stingere Stern-Volmer. Pentru fluoroforii care
prezintă mai mulți timpi de viață, așa cum este și în cazul de față pentru reziduurile de Triptofan
din structura peptidelor, în ecuație se vor folosi valorile timpului de viață mediu.
Datele obținute în urma experimentelor de stingere a fluorescenței sunt, în general,
reprezentate ca F0 F⁄ în funcție de [𝑄]. Din panta acestui grafic se obține, în urma unei fitări liniare,
constanta de stingere 𝐾𝑆𝑉.
Utilizând valorile obținute pentru 𝐾𝑆𝑉 și timpii de viață ai fluorescenței, măsurați în absența
stingătorului, se poate determina valoarea constantei bimoleculare, 𝑘𝑏, valoare care este un
indicator al eficienței stingerii sau al gradului de accesibilitate al stingătorului la moleculele de
fluorofor.
Măsurătorile de stingere a fluorescenței Triptofanului, utilizând ca stingător o soluție
concentrată de acrilamidă, s-au efectuat utilizând peptidele la o concentrație finală de 1 µM.
Lipozomii au fost preparați din DOPC și DOPC:DPPG, iar lipidele din care aceștia au fost
preparați au avut o concentrație finală de 50 µM. Din aceste spectre s-au obținut valorile
corespunzătoare maximului intensității fluorescenței (F0) și timpului de viață mediu (𝜏0), valori
care s-au utilizat ulterior la prelucrarea datelor. Pentru stingerea fluorescenței s-a titrat o soluție
concentrată de acrilamidă, având concentrația inițială de 10 M, în pași de 7.5 µL. Astfel,
concentrația acrilamidei a fost incrementată în pași de 25 mM. După echilibrarea soluției timp de
15 min., au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și rezolvată în timp. Din spectrele de
fluorescență statică, în urma prelucrării datelor se obțin reprezentări Stern-Volmer de tipul celei
din Fig. 3.
11
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20
1
2
3
4
5
F0/F
Cacy
[M]
PBS DOPC DOPC:DPPG
Figura 3. Reprezentare Stern-Volmer pentru Indolicidină.
Rezultatele obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru toate peptidele
utilizate în acest studiu, sunt reprezentate grafic în Figura 4.
Mel Ind CP1 P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
4
8
12
16
20
KS
V [
M-1]
PBS DOPC DOPC:DPPGA
Figura 4. Valorile KSV, τ0 și kb pentru peptidele utilizate în acest studiu, aflate în
PBS, în amestec cu LUV preparate din DOPC sau din DOPC:DPPG.
12
Pe baza rezultatelor obținute pentru cele trei peptide “model”, pentru situația în care acestea
s-au aflat în PBS, am pus în evidență relația care există între structura secundară pe care acestea o
adoptă în soluție și constanta bimoleculară care a rezultat în urma prelucrării datelor
experimentale. Astfel, pentru cea mai complexă structură, α-helix-ul alungit al Cecropinei P1, s-a
obținut cea mai mică valoare a constantei bimoleculare, iar cea mai mare valoare a acestei
constante a fost obținută pentru Indolicidină, care are o structură dezordonată. În prezența LUV
preparate din DOPC, interacția dintre reziduurile hidrofobe din structura primară a peptidelor, duce
la o scădere substanțială a constantei bimoleculare pentru toate cele trei peptide. Interacțiile dintre
reziduurile cationice, din structura peptidelor, și lipidele anionice, în situația în care peptidele s-au
aflat în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG, a dus la o creștere a constantelor bimoleculare,
corespunzătoare celor trei peptide, datorită reorientării acestora față de planul membranei
lipozomilor.
Comportamentul peptidelor P1 – P8, în prezența moleculelor de stingător (acrilamidă) este
asemănător, dacă se ține cont de numărul reziduurilor de Triptofan din structura acestora și de
timpul de viață al fluorescenței în absența acrilamidei, excepție făcând P4 și P6. Astfel, se poate
spune despre aceste două peptide că, atunci când se află în PBS, prezintă o structură distinctă de
celelalte șase, în sensul că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de acrilamidă,
ca rezultat al valorilor obținute pentru constantele bimoleculare.
Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV preparate din DOPC sunt puse în evidență cu
ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide.
Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din
structura peptidelor. Astfel, s-a obținut un prim grup de valori pentru peptidele cu 3 reziduuri, P1
– P3, un grup de valori pentru P5 – P8 și, separat, valoarea cea mai mică a constantei bimoleculare,
pentru P4. O valoare aparte o are timpul de viață corespunzător peptidei P3, mai mică în comparație
cu al celorlalte peptide, ceea ce duce la concluzia că aceasta adoptă, în interacția cu bistratul format
din DOPC, o conformație în care reziduurile de Triptofan sunt mai expuse mediului hidrofil.
În prezența LUV formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile cationice, în cazul
de față Arginina, și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în plus față de interacțiile
hidrofobe datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate
peptidele, scădere care este un indicator că grupările cromofore sunt mai puțin accesibile
moleculelor de acrilamidă.
13
Utilizarea tehnicilor de spectroscopie de fluorescență pentru studierea interacțiilor care apar
între AMP și membranele lipidice au avantajul că în structura primară a acestor peptide se
regăsește reziduul Triptofan. Mai multe proprietăți ale acestui fluorofor intrinsec, proprietăți
dependente de mediul în care acest fluorofor se găsește, pot fi utilizate pentru determinarea
variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în mediul hidrofob:
deplasarea maximului de fluorescență care apare la interacția peptidă-bistrat, modificări ale
eficienței cuantice și a timpului mediu de viață al fluorescenței Triptofanului.
Pentru determinarea variației energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare a peptidelor din
mediul hidrofil în mediul hidrofob a fost folosit un protocol de lucru în care soluția de peptidă a
fost titrată cu o soluție concentrată de LUV.
Soluția de peptidă dizolvată în PBS, având concentrația finală de 1 µM, a fost ținută în
întuneric, cu agitare continuă, timp de 30 min., pentru atingerea echilibrului. După scurgerea
acestui interval, au fost înregistrate spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în
timp. Titrarea soluțiilor de peptidă s-a făcut utilizând soluții concentrate de LUV, 12.5 mM,
preparate din DOPC și DOPC:DPPG. La fiecare pas al titrării, amestecul de peptide cu lipozomi a
fost ținut în întuneric, timp de 15 min. și agitat continuu, pentru atingerea echilibrului. În final
s-au înregistrat spectrele de fluorescență statică și fluorescență rezolvată în timp ale amestecului
de peptide și LUV. Concentrațiile finale ale lipidelor, în soluția de peptide, rezultate în urma
titrării, au fost: 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, …, 180 µM și 200 µM. Din prelucrarea acestor
spectre au rezultat valorile folosite pentru determinarea ΔG utilizând ecuațiile din modelele
descrise pe larg în Teză. O familie de spectre, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din
DOPC, utilizate pentru determinarea variației energiei libere Gibbs de partiționare a peptidelor din
mediul hidrofil în mediul hidrofob, este prezentată în figura următoare.
14
300 350 400 450 500
0
1
2
3
4
5
200 M
I FL
UO
RE
SC
. [x10
5 c
ps]
[nm]
0 M
Concentratia lipidelor
in solutie
Figura 5. Familie de spectre din care se obțin valorile parametrilor
utilizați în modelele de calcul a ΔG utilizând fluorescența statică.
Pentru obținerea ΔG, datele experimentale au fost fitate, în Origin, cu ecuațiile
corespunzătoare fiecărui model de analiză. Este de precizat faptul că pentru concentrația lipidelor
s-au folosit valori reduse la jumătate, deoarece se consideră că peptidele interacționează numai cu
peretele exterior al LUV. Un exemplu de fitări, pentru Indolicidină titrată cu LUV preparate din
DOPC, este ilustrat în Figura 6.
15
0 2 4 6 8 10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Model fit
[
nm
]
CL/2 [x10
-5 M]
Model RectHyperbola
Equation y = a*b*x/(1+b*x)
Plot \g(Dl)
a 13.95282
b363074.71028
Reduced Chi-Sqr 0.68117
R-Square(COD) 0.96285
Adj. R-Square 0.95947
A
0 2 4 6 8 10
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
IFLUORESC.
@ 335 nm
Model fit
I FL
UO
RE
SC
. [x
10
5 c
ps]
CL/2 [x10
-5 M]
Model deltaG_comp (User)
Equation112735.80439+((A-112735.80
439)*B*x)/(55.3+B*x)
Plot 335
A 438301.29416
B 4.25478E6
Reduced Chi-Sqr 1.29099E8
R-Square(COD) 0.98702
Adj. R-Square 0.98584
B
0 2 4 6 8 10
1.50
1.65
1.80
1.95
2.10
2.25
2.40
0
Model fit
[
ns]
CL/2 [x10
-5 M]
Model deltaG_tau (User)
Equation(1.5701+A*0.782*x*B)/(1+A*0.7
82*x)
Plot \g(t\-(0_))\-(AMP)
A 270545.39786
B 2.26207
Reduced Chi-Sqr 0.0012
R-Square(COD) 0.97509
Adj. R-Square 0.97282
C
Figura 6. Fitarea datelor experimentale cu modelele teoretice, pentru
Indolicidină titrată cu LUV preparate din DOPC.
A – fitarea variației Δλ ([L]/2), cu ecuația (11.4) descrisă în Teză; B – fitarea variației 𝐹𝑃𝐿
([L]/2), cu ecuația (11.7) descrisă în Teză; C – fitarea variației �̃� ([L]/2), cu ecuația (11.8)
descrisă în Teză.
Trebuie precizat că, în cazul peptidelor P3 și P4, în urma titrării cu soluția concentrată de
lipozomi, nu s-au obținut deplasări ale maximului de emisie fluorescentă. Totuși, în urma titrării,
au apărut creșteri ale intensității spectrelor de emisie fluorescentă, poziția maximului de emisie
rămânând neschimbată, relativ la situația în care peptidele au fost doar în PBS, acest lucru sugerând
că la nivelul reziduurilor de Triptofan se manifestă interacții care afectează eficiența cuantică a
fluorescenței acestuia.
Rezultatele obținute pentru celelalte peptide, care au prezentat deplasări ale maximului de
emisie fluorescentă sunt detaliate Fig. 7. În situația interacției acestor peptide cu LUV, preparate
16
din DOPC, cea mai mare valoare a variației energiei a avut-o P2, de -8.27 ± 0.34 kcal/mol, iar cea
mai mică a fost pentru P6, de -9.34 ± 0.33 kcal/mol. Valorile mai mici obținute pentru peptidele
cu 4 reziduuri de Triptofan în structura lor, P5 – P8, față de cele cu 3 reziduuri, P1 – P2, sunt
explicabile datorită faptului că, având un reziduu de Triptofan în plus în structură, acesta duce la
adoptarea unei configurații mai stabile a peptidei relativ la planul membranei.
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8
-10
-8
-6
-4
-2
0
DOPC DOPC:DPPG
G
[kcal/M
]
A
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8
0
5
10
15
20
[
nm
]
DOPC DOPC:DPPGB
Figura 7. Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de
ecuația (11.4) prezentată în Teză.
A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în
bistratul lipidic; B – Deplasarea maximului de emisie fluorescentă.
Din valorile deplasărilor maximului emisiei fluorescente, se observă că reziduurile de
Triptofan, care intră în componența peptidei P2, sunt cele mai expuse mediului hidrofil de la
interfața bistratului, în situația în care acesta este obținut din DOPC. Pentru aceeași compoziție
lipidică a bistratului, cel mai puțin expuse reziduuri sunt ale peptidei P7. O creștere semnificativă
(dublare) a deplasării maximului o are P2 în prezența LUV preparate din DOPC:DPPG. Cea mai
mare valoare a deplasării maximului a fost obținută, în această situație, pentru peptida P1.
17
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8
-10
-8
-6
-4
-2
0
DOPC DOPC:DPPG
G
[k
ca
l/M
]
A
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
1 2 3 4 5 6 7 8
0
1
2
3
4 DOPC DOPC:DPPG
lim
. [n
s]
B
Figura 8. Parametrii obținuți pentru P1 – P8 din modelul descris de
ecuația (11.8) prezentată în Teză.
A – Variația energiei libere Gibbs, ΔG, de partiționare din mediul hidrofil în
bistratul lipidic; B – Timpul de viață al fluorescenței.
Valorile obținute în urma prelucrării datelor experimentale, pentru peptidele P1 – P8,
analizate cu cu modelul descris în Teză, sunt reprezentate sub formă grafică în Fig. 8. La fel ca la
modelul utilizat anterior, cea mai mică energie a fost obținută tot pentru peptida P6, în ambele
cazuri, pentru DOPC.
Surprinzător a fost comportamentul peptidei P3 pentru care, utilizând această metodă de
analiză, s-a obținut o variație mare a timpului de viață pentru cele două situații, în cazul DOPC,
având valoarea de 1.51 ± 0.08 ns, iar în cazul DOPC:DPPG, având valoarea de 3.70 ± 0.20 ns,
valori care nu se corelează cu cele ale energiilor de partiție pentru cele două situații, în cazul
DOPC:DPPG energia de partiție fiind de -7.35 ± 0.16 kcal/mol, mai mică decât în cazul DOPC,
când a avut valoarea de -8.15 ± 0.19 kcal/mol.
Rezultatele obținute pentru peptidele P1-P8, pentru valorile variației energiei libere Gibbs,
indică faptul că peptida P6 are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide
anionice. Aceste rezultate se corelează cu testele in vitro efectuate pentru aceste peptide.
Ținând cont de proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă, număr mare de
reziduuri de Triptofan (4 pentru jumătate dintre ele, P5 – P8) și sarcina netă a acestora, se poate
trage concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei.
18
În capitolul 12, s-a propus o nouă abordare în analiza spectrelor de fluorescență ale
Triptofanului, care furnizează o soluție pentru evaluarea raportului între peptida legată la nivelul
bistratului lipidic și peptida liberă în soluție.
În literatura de specialitate, există studii care utilizează deconvoluția cu funcții de tip LN a
spectrelor complexe de fluorescență ale Triptofanului, din structura peptidelor și proteinelor, dar
doar câteva din acestea tratează interacția dintre peptide/proteine cu membranele lipidice. Toate
aceste studii tratează problema deconvoluției spectrelor pe baza principiilor amintite în Teză, din
punctul de vedere al stingerii fluorescenței reziduurilor de Triptofan.
Ținând cont de ipotezele de lucru ale metodei de analiză a spectrelor de emisie fluorescentă
a reziduurilor de Triptofan și de existența celor cinci clase de spectre de emisie, descrise în Teză,
s-a dezvoltat unui pachet asemănător de coduri de analiză a spectrelor de fluorescență, precum cel
descris în capitolul 8. Scopul a fost determinarea fracției dintre peptidă aflată în faza apoasă și cea
adsorbită la nivelul bistratului lipidic.
La prelucrarea și analiza datelor s-au luat în considerare următoarele:
1. Cele două peptide analizate, Indolicidina și P6, în soluții apoase, prezintă o structură
secundară dezordonată, astfel că reziduurile de Triptofan sunt total expuse moleculelor
solventului; datorită acestui lucru, era de așteptat să se regăsească în spectrul de emisie
fluorescentă (corespunzător fiecărei peptide aflate doar în PBS sau în faza apoasă atunci
când interacționează cu bistratul) o singură specie de molecule fluorescente, cu
caracteristicile de emisie foarte apropiate de emisia fluorescentă a moleculelor de L-
Triptofan dizolvate în soluție apoasă (clasa III din lista anterioară).
2. În situația în care peptida se află adsorbită la nivelul bistratului lipidic, toate reziduurile
de Triptofan din structura acesteia interacționează, prin interacții hidrofobe, cu suprafața
exterioară a bistratului.
3. Datorită lungimii reduse a peptidelor, acestea nu pot penetra bistratul lipidic în urma unei
reorientări la nivelul acestuia (cazul Melitinei) în urma căreia unele reziduuri ar fi mai
puțin accesibile mediului hidrofil, rezultând astfel două categorii de reziduuri cu grade
diferite de accesibilitate pentru moleculele solventului și, implicit, asociat acestora, două
peak-uri elementare care să rezulte în urma deconvoluției.
19
4. Ținând cont de ipoteza anterioară, s-a considerat că, pentru peptidele adsorbite la nivelul
bistratului, fluorescența reziduurilor de Triptofan va genera în spectrul complex de
fluorescență un singur peak elementar, corespunzător uneia dintre clasele A, S, I sau II.
5. În prezența LUV, peptidele care nu sunt adsorbite la nivelul bistratului vor genera un
peak elementar cu caracteristici care se încadrează în clasa III.
Pentru analiza spectrelor de fluorescență, s-a dezvoltat un pachet de coduri, scrise în limbajul
de programare MatLab, care respectă algoritmul de calcul descris în capitolul 8. În Fig. 9, sunt
reprezentate valorile ariilor relative, corespunzătoare celor două fracții de peptidă, aflate fie în faza
apoasă, fie adsorbite la nivelul bistratului, obținute în urma deconvoluției, pentru Indolicidină și
pentru P6.
0 5 10 15 20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DOPC - fractia de peptida adsorbita
DOPC - fractia de peptida libera
DOPC:DPPG - fractia de peptida adsorbita
DOP:-DPPG - fractia de peptida libera
FP
EP
T.
C [x10-5 M]
1
23 4
A
0 5 10 15 20
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DOPC - fractia de peptida adsorbita
DOPC - fractia de peptida libera
DOPC:DPPG - fractia de peptida adsorbita
DOPC:-DPPG - fractia de peptida libera
FP
EP
T.
C [x10-5 M]
B
Figura 9. Variația ariei relative a peak-urilor obținute în urma
deconvoluției.
A – Indolicidina; B – peptida P6.
Se remarcă faptul că, la concentrați mari ale lipidelor, unde ariile relative ale peak-urilor
rămân aproximativ constante, pentru DOPC:DPPG, fracția de peptidă adsorbită reprezintă
aproximativ 75 % din cantitatea totală de peptidă din soluție, spre deosebire de DOPC, unde
această fracție reprezintă aproximativ 60 % din cantitatea totală de peptidă.
Pentru P6 am obținut aproximativ același tip de variație a ariilor relative ale peak-urilor
elementare obținute în urma deconvoluției. Spre deosebire de cazul Indolicidinei, atunci când în
suspensia de P6 a fost titrată soluția de LUV, preparate din DOPC, fracția de peptidă adsorbită la
bistrat a fost mai mică decât fracția de peptidă din faza apoasă, pentru toate valorile raportului
20
peptidă-lipide, așa cum se observă din Fig. 9 – B. În cazul LUV, preparate din DOPC:DPPG,
fracția de peptidă adsorbită la nivelul bistratului pentru concentrațiile mari ale lipidelor a fost de
aproximativ 65 %, iar pentru LUV, preparate din DOPC, de aproximativ 45 %.
Utilizând această metodă se obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipidic,
respectiv aflată în faza apoasă. Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile
dintre diferite AMP și membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Concluzii generale
Toate rezultatele experimentale, obținute cu aranjamentul experimental realizat și calibrat în
Teză, referitoare la timpii de viață ai fluorescenței, sunt comparabile cu cele din literatură. Timpul
de viață al fluorescenței, în cazul moleculelor care includ în structura lor un inel indolic, este afectat
de variațiile de temperatură într-o măsură mai mare decât timpul de viață obținut pentru ceilalți
compuși. De aceea, în experimente, trebuie să se aibă în vedere influența factorilor fizico-chimici
asupra grupărilor cromofore ale moleculelor studiate.
În urma analizării datelor în cazul Melitinei, a rezultat că, la creșterea fluidității bistratului,
obținut din DOPC, aceasta se reorientează față de bistrat, pătrunzând în profunzimea lui, către zona
hidrofobă a acestuia. Spre deosebire de Melitină, cele trei peptide analizate, și anume: P1, P5 și
P8, având reziduurile de Triptofan localizate la nivelul interfeței membrană lipidică-solvent,
paralele cu planul membranei, sunt mult mai expuse mediului hidrofil, în comparație cu reziduul
de Triptofan din structura Melitinei. Datele experimentale din Teză demonstrează că mecanismul
de acțiune al peptidelor nou sintetizate (P1, P5 și P8) asupra bistratului lipidic diferă față de cel al
Melitinei.
Noul parametru propus pentru caracterizarea fluidității membranelor lipozomale, ΔSR,
obținut în urma deconvoluției spectrelor de emisie fluorescentă ale Laurdanului inserat în
membrane lipidice, utilizând funcții asimetrice de tip LN, este mult mai sensibil la gradul de
hidratare a bistratului, așa după cum este indicat de către Laurdan. Aria peak-ului corespunzător
fazei de gel a bistratului și intervalul de temperatură în care are loc tranziția de fază sunt
dependente de lungimea cozilor hidrofobe ale lipidelor.
21
Împachetarea lipidelor, obținută din spectrele de fluorescență ale Laurdanului din
membranele artificiale și a celor biologice, este afectată de interacția cu AMP. Complexitatea
membranelor biologice, mult mai mare decât a celor artificiale, duce la un nivel de împachetare a
lipidelor constituenete mai mare decât în cazul lipozomilor. Datorită complexității, aceste
membrane sunt mai puțin afectate de interacția cu AMP. Gradul de destabilizare a bistratului, în
cazul membranelor artificiale, depinde de componentele constituente ale acestuia. Pentru interacția
dintre Melitină și lipozomi, preparați din DOPC și DOPC:Chol, există o concentrație limită, peste
care efectul destabilizator nu se mai manifestă.
Interacțiile dintre peptidele P1 – P8 și LUV, preparate din DOPC, sunt puse în evidență cu
ajutorul valorilor obținute pentru constantele bimoleculare, kb, corespunzătoare fiecărei peptide.
Se observă că și aceste valori sunt grupate în funcție de numărul reziduurilor de Triptofan din
structura peptidelor. În prezența LUV, formate din DOPC:DPPG, interacțiile dintre reziduurile
cationice și lipidele anionice (DPPG) din structura bistratului, în afară de interacțiile hidrofobe
datorate Triptofanului, au dus la o scădere a constantelor bimoleculare pentru toate peptidele,
indicând că grupările lor cromofore sunt mai puțin accesibile moleculelor de stingător (i.e.,
acrilamidă).
Valorile variației energiei libere Gibbs, pentru peptidele P1-P8, indică faptul că peptida P6
are cea mai mare afinitate pentru membranele care conțin lipide anionice. Ținând cont de
proprietățile peptidelor P1 – P8: structura primară scurtă și sarcina netă pozitivă a acestora, se
poate trage concluzia că acestea au un comportament asemănător cu cel al Indolicidinei, față de
membranele lipidice.
Utilizând deconvoluția spectrelor de fluorescență ale Triptofanului cu funcții de tip LN se
obțin fracțiile de peptidă adsorbită la nivelul bistratului lipidic, respectiv aflată în faza apoasă.
Astfel, se pot pune în evidență diferențele care apar la interacțiile dintre diferite AMP și
membranele lipidice model, cu diferite compoziții ale lipidelor constituente.
Protocoalele dezvoltate pe parcursul acestei Teze, permit studierea efectelor diferiților agenți
de stres: radiații ionizante, tratamente termice, chimice etc., asupra membranelor celulare de
mamifere și bacteriene.
22
23
Articole legate de Teză publicate in extenso în reviste științifice indexate ISI, cu
factor de impact
Chilom, C. G., Zorilă, B. și Popescu, A. I. (2017) Characterization of Some Physico-Chemical
Properties and Interactions of Human and Bovine Serum Albumins with Mitomycin C, Romanian
Journal of Physics, 62. (IF = 1.433, AIS = 0.259)
Zorila, F. L., Ionescu, C., Craciun, L. S. și Zorilă, B. (2017) Atomic force microscopy study of
morphological modifications induced by different decontamination treatments on Escherichia coli,
Ultramicroscopy, 182, 226-232. (IF = 2.929, AIS = 1)
Zorilă, B., Bacalum, M., Popescu, A. I. și Radu, M. (2016) Log-Normal Deconvolution of Laurdan
Fluorescence Spectra - a Tool to Assess Lipid Membrane Fluidity, Romanian Reports in Physics,
68, 702-712. (IF = 1.467, AIS = 0.18)
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2016) Investigating the Anticancer Activity of Some Cationic
Antimicrobial Peptides in Epithelial Tumor Cells, Romanian Reports in Physics, 68, 1159-1169.
(IF = 1.467, AIS = 0.18)
Bacalum, M., Zorilă, B. și Radu, M. (2013) Fluorescence spectra decomposition by asymmetric
functions: Laurdan spectrum revisited, Analytical Biochemistry, 440, 123-129. (IF = 2.275,
AIS = 0.8)
Bacalum, M., Zorilă, B., Radu, M. și Popescu, A. (2013) Laurdan solvatochromism: influence of
solvent polarity and hydrogen bonds, Optoelectronics and Advanced Materials-Rapid
Communications, 7, 456-460. (FI =0.386, AIS = 0.07)
Articole legate de Teză aflate în stadiul de manuscris
Claudia G. Chilom, Bogdan Zorilă, Maria Bălăşoiu, R. N. Yaroslavtsev, S. V. Stolyar, Anna S.
Artemyeva, D. Soloviov, A. I. Kuklin, Mihaela Bacalum, Structural and spectrophotometric
characterization of ferrihydrite nanoparticles in interaction with liposomes and the effect against
normal and tumour cells.
B. Zorilă, Mihaela Bacalum, Claudia G. Chilom, Spectral characterization of folic acid effects of
lipid membranes: from model membranes to cells membranes.
F. L. Zorilă, M. M. Manea, B. Zorilă, Spectroscopic study of membrane modifications induced by
different decontamination treatments on Escherichia coli.
24