GC (Gas Chromatography) merupakan metode yang dinamis untuk pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap dan senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang elektronik, komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis dengan resolusi yang meningkat. (3) GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya.Ada 2 jenis kromatografi gas, yaitu :

1. Kromatografi gas–cair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase diam.

2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan kadang-kadang berupa polimerik.(4)

SISTEM PERALATAN KROMATOGRAFI GAS (GC)1. Kontrol dan penyedia gas pembawa; 2. ruang suntik sampel; 3. kolom yang diletakkan dalam oven yang dikontrol secara termostatik; 4. sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder); serta5. komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data.

1. Fase gerakFase gerak pada GC juga disebut dengan gas pembawa karena tujuan awalnya adalah untuk membawa solut ke kolom, karenanya gas pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan tinggi (biasanya merah untuk hidrogen, dan abu-abu untuk nitrogen) 4).

2. Ruang suntik sampelLubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel ecara cepat dan efisien. Desain yang populer terdiri atas saluran gelas yang kecil atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada satu ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan semprit (syringe). Karena helium (gas pembawa) mengalir melalui tabung, sejumlah volume cairan yang diinjeksikan (biasanya antara 0,1-3,0 μL) akan segera diuapkan untuk selanjutnya di bawa menuju kolom. Berbagai macam ukuran semprit saat ini tersedia di pasaan sehingga injeksi dapat berlangsung secara mudah dan akurat. Septum karet, setelah dilakukan pemasukan sampel secara berulang, dapat diganti dengan mudah. Sistem pemasukan sampel (katup untuk mengambil sampel gas) dan untuk sampel padat juga tersedia di pasaran(1).Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu:a. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang diinjeksikan akan diuapkan dalam injector yang panas dan 100 % sampel masuk menuju kolom.b. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang diinjeksikan diuapkan dalam injector yang panas dan selanjutnya dilakukan pemecahan.c. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana hampir semua sampel diuapkan dalam injector yang panas dan dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dand. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana ujung semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom.Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap; karena kalau penyuntikannya melalui lubang suntik secara langsung dikhawatirkan akan terjadi peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi atau pirolisis(2).

3. KolomKolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen sentral pada GC.

Ada 3 jenis kolom pada GC yaitu kolom kemas (packing column) dan kolom kapiler (capillary column); dan kolom preparative (preparative column). Perbandingan kolom kemas dan kolom kapiler dtunjukkan oleh gambar berikut :

Kolom Kemas                                                Kolom KapilerKolom kemas terbuat dari gelas atau logam yang tahan karat atau dari tembaga dan aluminium. Panjang kolom jenis ini adalah 1–5 meter dengan diameter dalam 1-4 mm. Kolom kapiler sangat banyak dipakai karena kolom kapiler memberikanefisiensi yang tinggi (harga jumlah pelat teori yang sangat besar > 300.000 pelat). Kolom preparatif digunakan untuk menyiapkan sampel yang murni dari adanya senyawa tertentu dalam matriks yang kompleks.

Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE-30; CPSIL-5) dan fenil 5%-metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL-8). Fase diam semi polar adalah seperti fenil 50%-metilpolisiloksan 50% (HP-17; DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah seperti polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M) (6).

4. Detektor Komponen utama selanjutnya dalam kromatografi gas adalah detektor. Detektor

merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di antara fase diam dan fase gerak.

Pada garis besarnya detektor pada KG termasuk detektor diferensial, dalam arti respons yang keluar dari detektor memberikan relasi yang linier dengan kadar atau laju aliran massa komponen yang teresolusi. Kromatogram yang merupakan hasil pemisahan fisik komponen-komponen oleh GC disajikan oleh detektor sebagai deretan luas puncak terhadap waktu. Waktu tambat tertentu dalam kromatogram dapat digunakan sebagai data kualitatif, sedangkan luas puncak dalam kromatogram dapat dipakai sebagai data kuantitatif yang keduanya telah dikonfirmasikan dengan senyawa baku. Akan tetapi apabila kromatografi gas digabung dengan instrumen yang multipleks misalnya GC/FT-IR/MS, kromatogram akan disajikan dalam bentuk lain. Beberapa sifat detektor yang digunakan dalam kromatografi gas adalah sebagai berikut :Jenis Detektor Jenis Sampel Batas

DeteksiKecepatan Alir (ml/menit)

Gas Pembawa

H2 Udara

Hantaran panas

Senyawa umum 5-100 ng 15-30 - -

Ionisasi nyawa Hidrokarbon 10-100 pg 20-60 30-60 200-500

Penangkap elektron

Halogen organic, pestisida

0,05-1 pg 30-60 - -

Nitrogen-fosfor

Senyawa nitrogen organik dan fospat organic

0,1-10 g 20-40 1-5 700-100

Fotometri Senyawa-senyawa 10-100 pg 20-40 50-70 60-80

nyala (393 nm)

sulfur

Fotometri nyala (526 nm)

Senyawa-senyawa fosfor

1-10 pg 20-40 120-170 100-150

Foto ionisasi Senyawa yang terionisasi dg UV

2 pg C/detik

30-40 - -

Konduktivitas elektrolitik

Halogen, N, S 0,5 pg C12 pg S4 pg N

20-40 80 -

Fourier Transform-inframerah (FTIR)

Senyawa-senyawa organik

1000 pg 3-10 - -

Selektif massa Sesuai untuk senyawa apapun

10 pg-10 ng

0,5-30 - -

Emisi atom Sesuai untuk elemen apapun

0,1-20 pg 60-70 -

  5. Komputer Komponen GC selanjutnya adalah komputer. GC modern menggunakan komputer yang dilengkapi dengan perangkat lunaknya (software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa fungsi antara lain:

Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen seperti: aliran fase gas; suhu oven dan pemrograman suhu; serta penyuntikan sampel secara otomatis.

Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan menggunakan grafik berwarna.

Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan dengan statistik. Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa tertentu(4).

DERIVATISASIDerivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas (menjadi lebih mudah menguap). Alasan dilakukannya derivatisasi:

Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis dengan GC terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.

Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan analisis dengan GC.

Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatil). Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap karena adanya gaya tarik-menarik inter molekuler antara gugus-gusug polar karenanya jika gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi akan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebut secara dramatis.

Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa steroid. Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami dekomposisi parsial

karena panas sehingga diperlukan derivatisasi untuk meningkatkan stabilitasnya. Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap elektron (ECD).

Inilah contoh derivatisasi yang digunakan untuk memperbaiki bentuk puncak pseudoefedrin:

Caranya : Sirup dekongestan dibasakan dengan amonia dan diekstraksi ke dalam etil asetat sehingga akan menjamin bahwa semua komponen yang terekstraksi berada dalam bentuk basa bebasnya daripada bentuk garamnya. Bentuk basa inilah yang bertanggungjawab pada bagusnya bentuk puncak kromatografi. Garam-garam atau basa-basa akan terurai karena adanya panas pada lubang suntik GC, sehingga dengan adanya proses ini akan dapat menyebabkan terjadinya peruraian.Jika ekstrak pada sirup dekongestan di lakukan kromatografi gas secara langsung maka kromatogram yang dihasilkan seperti gambar dibawah. Basa bebas triprolidin dan dekstrometorfan menunjukkan bentuk puncak yang bagus, akan tetapi pesudoefedrin yang merupakan basa yang lebih kuat karena adanya gugus hidroksil dan gugus amin memberikan bentuk puncak yang kurang bagus. Hal ini dapat diatasi dengan menutup gugus polar (gugus hidroksi dan amin) pada pseudoefedrin dengan cara mereaksikannya menggunakan trifluoroasetat anhidrida (TFA). Perlakuan dengan TFA ini tidak menghasilkan senyawa derivatif terhadap senyawa-senyawa basa tersier dalam ekstrak (sirup dekongestan) ini. Reagen TFA ini sangat bermanfaat karena reagen ini sangat reaktif dan bertitik didih rendah (400C) sehingga kelebihan reagen TFA ini mudah dihilangkan dengan cara evaporasi sebelum dilakukan kromatografi gas. Ini kromatogram sebelum dan sesudah dilakukan derivatisasi......

Kromatografi gas (atau biasa dikenal juga dengan Gas Chromatography/GC) adalah salah satu bagian dari khromatografi yaitu salah satu teknik pemisahan komponen-komponen dalam campuran di antara fase diam (kolom) dan fase gerak (gas). Ruang lingkup aplikasi kromatografi gas adalah sampel sampel yang mudah menguap,mudah diuapkan dan tidak rusak karena panas (thermally-stable).Untuk sampel yang tidak memenuhi syarat tersebut masih memungkinkan untuk dianalisis dengan menggunakan metode kromatografi gas melalui perlakuan tertentu seperti derivatisasi dan penggunaan teknik tambahan (metode headspace,pyrolizer,dll).Saat ini GC merupakan salah satu instrumen utama dalam aplikasi laboratorium.

1. Gas Pembawa

Gas pembawa (carrier gas) berfungsi sebagai fase gerak.Gas pembawa adalah gas inert yang memiliki kemurnian tinggi (direkomendasikan grade Ultra High Purity atau UHP).Gas pembawa ini yang akan membawa uap sampel masuk ke dalam kolom untuk dipisahkan komponen-komponen dalam campurannya dan selanjutnya akan masuk ke detektor untuk dideteksi secara individual. Gas pembawa yang biasa digunakan adalah Helium,Nitrogen atau Hidrogen (silakan mengacu ke kurva Van Deemter). Untuk analisis sampel gas,maka gas pembawa yang digunakan harus berbeda dengan gas target analisis. Gas pembawa biasanya disimpan dalam tabung gas bertekanan tinggi atau dari gas generator.

2. Injektor

Injektor memiliki fungsi untuk memasukkan sampel,menguapkan sampel,dan mencampur uap sampel dengan gas pembawa. Dalam kromatografi gas,semua sampel dari fase asal harus diubah menjadi fase gas/uap.Misalnya sampel padatan dapat dilarutkan terlebih dahulu,baru larutannya diinjeksikan ke sistem kromatografi gas.Untuk sampel larutan bisa langsung diinjeksikan menggunakan microsyringe biasa,sementara untuk sampel gas bisa menggunakan gas-tight syringe.Untuk otomatisasi,bisa juga menggunakan autoinjector/autosampler. Injektor dilengkapi dengan blok pemanas (heater block) yang memungkinkan pengaturan suhu injektor untuk menguapkan sampel.Biasanya yang menjadi patokan awal adalah kira-kira 50 oC di atas titik didih tertinggi dalam campuran,dengan asumsi semua zat target akan menguap tapi tidak sampai merusak komponen itu sendiri. Untuk sampel-sampel yang memerlukan perlakuan khusus bisa menggunakan opsi tambahan,misalnya Pyrolizer (untuk sampel seperti ban,kayu,dll),Headspace (untuk sampel film atau kemasan plastik,cat,dll) atau Programmable Temperature Vaporizer (untuk sampel biodiesel yang memiliki range titik didih lebar).

3. Kolom

Kolom berfungsi sebagai fase diam dan merupakan jantung dari kromatografi.Dalam kolomlah terjadi proses pemisahan komponen-komponen dalam campuran berdasarkan perbedaan afinitas masing-masing komponen terhadap fase diam dan fase gerak. Secara imaginer,masing-masing komponen akan mengalami 3 kondisi:ikut dengan gas pembawa,terdistribusi secara dinamis di antara gas pembawa dan kolom,serta tertahan/larut dalam kolom.Mekanisme ini terjadi berulang-ulang mulai dari sampel masuk ke dalam kolom hingga masuk ke detektor secara individual. Proses pemisahan dalam kolom dipengaruhi oleh banyak faktor seperti sifat kimia-fisika dari sampel maupun material kolom,dimensi kolom(panjang,diameter dan tebal lapisan kolom,kapiler/kemas),laju alir gas pembawa, suhu oven kolom,dll. Secara umum,semakin mirip polaritas komponen sampel dengan fase diam,maka semakin kuat interaksi antara keduanya sehingga komponen akan tertahan lebih lama dalam kolom (waktu retensi makin lama). Semakin panjang kolom,semakin panjang jarak lintasan yang harus dilalui oleh komponen sampel sehingga waktu retensi makin lama.Laju aliran gas pembawa mempengaruhi kecepatan migrasi komponen sampel dalam kolom (semakin cepat laju alir akan mengakibatkan waktu retensi makin cepat pula).Begitu pula dengan variabel suhu oven kolom,makin tinggi suhu oven kolom,makin lemah interaksi antara komponen sampel dengan fase diam,sehingga makin cepat waktu retensi. Semua variabel tersebut dikombinasikan sedemikian rupa sehingga didapatkan kondisi analisis yang menghasilkan pemisahan yang baik namun waktu analisis juga seefektif mungkin.

4. Oven

Faktor suhu sangat berpengaruh secara signifikan dalam pemisahan di khromatografi gas,khususnya suhu kolom.Kolom diletakan dalam sebuah oven yang bisa diatur suhunya sesuai kebutuhan analisis (baik suhu tetap maupun suhu terprogram).Oven yang baik harus bisa memberikan akurasi dan kestabilan suhu yang baik.

5. Detektor

Detektor pada khromatografi gas berfungsi untuk memberikan respon linear atas komponen-komponen sampel yang sudah dipisahkan dalam kolom.Komponen-komponen dalam sampel akan masuk secara individual ke dalam sistem detektor dan akan dideteksi responnya sesuai prinsip masing-masing detektor,arusnya diperkuat,kemudian dikonversi menjadi satuan tegangan listrik (uV atau mV).Masuknya komponen-komponen sampel ke detektor terjadi secara parsial(tidak sekaligus) dan plotingnya akan membentuk kurva distribusi Gauss seperti yang bisa kita lihat sebagai “khromatogram”. Untuk detektor MS (Mass Spectrometer),mekanismenya agak berbeda dengan mekanisme detektor lain. Ada beberapa jenis detektor dalam khromatografi gas,berikut adalah jenis detektor yang dikenal :a. Flame Ionization Detector (FID),adalah detektor general untuk mengukur komponen-komponen sampel yang memiliki gugus alkil (C-H).Komponen sampel masuk ke FID,kemudian akan dibakar dalam nyala (campuran gas H2 dan udara),komponen akan terionisasi,ion-ion yang dihasilkan akan dikumpulkan oleh ion collector,arus yang dihasilkan akan diperkuat,kemudian akan dikonversi menjadi satuan tegangan.Semakin tinggi konsentrasi komponen,makin banyak pula ion yang dihasilkan sehingga responnya juga makin besar.b. Thermal Conductivity Detector (TCD) adalah detektor paling general sebab hampir semua komponen memiliki daya hantar panas.TCD bekerja dengan prinsip mengukur daya hantar panas dari masing-masing komponen.Mekanismenya berdasarkan teori “Jembatan Wheatstone” di mana ada dua sel yaitu sel referensi dan sel sampel.Sel referensi hanya dilalui oleh gas pembawa,sementara sel sampel dilalui oleh gas pembawa dan komponen sampel.Perbedaan suhu kedua sel akan mengakibatkan perbedaan respon listrik antara

keduanya dan ini akan dihitung sebagai respon komponen sampel.Detektor TCD banyak digunakan untuk analisis gas.c. Electron Capture Detector (ECD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan halogen organik.Banyak diaplikasikan untuk analisis senyawaan pestisida.Secara prinsip,komponen sampel akan ditembak dengan sumber radioaktif Nikel,dan jumlah elektron yang hilang dari proses itu dianggap linear dengan konsentrasi senyawaan tersebut.d. Flame Photometric Detector (FPD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan sulfur, posfor dan atau timah organik.Prinsipnya adalah pembakaran senyawaan komponen sehingga mengemisikan energi tertentu yang akan dilewatkan ke filter tertentu (filter S,P atau Sn) kemudian akan dideteksi oleh Photomultiflier.Banyak digunakan untuk analisis senyawaan pestisida.e. Flame Thermionic Detector(FTD) adalah detektor khusus untuk mendeteksi senyawaan nitrogen dan atau posfor organik.Prinsipnya adalah pembakaran senyawaan komponen kemudian direaksikan dengan garam Rubidium dan respon listrik yang dihasilkan akan diperkuat dan dikonversi menjadi satuan tegangan.Banyak digunakan untuk analisis senyawaan pestisida.f. Mass Spectrometer (MS) adalah detektor khusus yang dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.Prinsip pengukurannya adalah komponen sampel dipecah menjadi bentuk ion fragmennya (baik secara elektronik maupun kimiawi) lalu ion fragmen tersebut dilewatkan ke Mass Analyzer untuk memisahkan ion berdasarkan perbedaan massa/muatan dan selanjutnya diteruskan ke ion detector untuk mendeteksi jumlah ion yang dihasilkan.Spektrum fragmen yang dihasilkan oleh masing-masing komponen akan menunjukkan karakteristik yang khas,dan ini digunakan untuk tujuan identifikasi kualitatif dengan membandingkan dengan database atau library spektrum yang telah ada.

6. Pengolah Data

Pengolah data berfungsi sebagai pengatur sistem instrumen dan pengolahan data untuk tujuan analisis kualitatif maupun kuantitatif. Secara umum pengolah data bisa berupa integrator/recorder ataupun berupa software yang beroperasi under-Windows.

Kromatografi gas-Spektrometer Massa (GC-MS)

Kromatografi gas-spektrometer massa (GC-MS) adalah metode yang mengkombinasikan kromatografi gas dan spektrometri massa untuk mengidentifikasi senyawa yang berbeda dalam analisis sampel.  Kromatografi gas dan spketometer masa memilki keunikan masing-masing dimana keduanya memiliki kelebihan dan kekurangan. Dengan menggambungkan kedua teknik tersebut diharapkan mampu meningkatkan kemamapuan dalam menganalisis sampel dengan mengambil kelebihan masing-masing teknik dan meminimalisir kekurangannya.

Kromatografi gas dan spketometer masa dalam banyak hal memiliki banyak kesamaan dalam tekniknya.  Untuk kedua teknik tersebut, sampel yang dibutuhkan dalam bentuk fase uap, dan keduanya juga sama-sama membutuhkan jumlah sampel yang sedikit ( umumnya kurang dari 1 ng). Disisi lain, kedua teknik tersebut memiliki perbedaan yang cukup besar yakni pada kondisi operasinya. Senyawa yang terdapat pada kromatografi gas adalah senyawa yang digunakan untuk sebagai gas pembawa dalam alat GC dengan tekanan kurang lebih 760 torr, sedangkan spketometer massa beroperasi pada kondisi vakum dengan kondisi tekanan 10-6 – 10-5 torr.

Prinsip kerja GC-MS adalah terdiri dari dua blok bangunan utama: kromatografi gas dan

spektrometer massa . Kromatografi gas menggunakan kolom kapiler yang tergantung pada dimensi kolom itu (panjang, diameter, ketebalan film) serta sifat fase (misalnya 5% fenil

polisiloksan). Perbedaan sifat kimia antara molekul-molekul yang berbeda dalam suatu campuran dipisahkan dari molekul dengan melewatkan sampel sepanjang kolom. Molekul-molekul memerlukan jumlah waktu yang berbeda (disebut waktu retensi) untuk keluar dari kromatografi gas, dan ini memungkinkan spektrometer massa untuk menangkap, ionisasi, mempercepat, membelokkan, dan mendeteksi molekul terionisasi secara terpisah. Spektrometer massa melakukan hal ini dengan memecah masing-masing molekul menjadi terionisasi mendeteksi fragmen menggunakan massa untuk mengisi rasio.

Instrumen/alat :1.      Gas Chromatography (GC)·         Injection port

Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan dan padatan. Oleh karena itu, senyawa yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan. Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat pada tempat injeksi. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau penguraian dari senyawa yang akan dianalisa. Kita juga t idak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak, karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita mengadakan analisa 0,5 -50 ml  gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar di bawah.

·         Oven Oven digunakan untuk memanaskan column pada temperature tertentu sehingga mempermudah proses pemisahan komponen sample. Biasanya oven memiliki jangkauan suhu 30oC – 320oC.

·         ColumnKolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Ada beberapa bentuk kolom, diantaranya lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Kolom selalu merupakan bentuk tabung. Berisi fasa diam, sedangkan fasa bergerak akan lewat didalamnya sambil membawa sample. Secara umum terdapat 2 jenis kolom, yaitu:

1) Packed column, umumnya terbuat dari glass atau stainless steel coil dengan panjang 1 – 5 m dan diameter kira-kira 5 mm.

2) Capillary column, umumnya terbuat dari purified silicate glass dengan panjang 10-100 m dan diameter kira-kira 250 mm. Beberapa jenis stationary phase yang sering digunakan:

ü  Polysiloxanes untuk nonpolar analytes/sample.  ü  Polyethylene glycol untuk polar analytes/sample. ü  Inorganic atau polymer packing untuk sample bersifat small gaseous species.

2.      Mass Spectrometer (MS) sebagai detektor·         Sumber ion

Setelah analit melalui kolom kapiler, ia akan diionisasi. Ionisasi pada spektroskopi massa yang terintegrasi dengan GC ada dua, yakni Electron Impact ionization (EI) atau Chemical Ionization (CI), yang lebih jauh lagi terbagi menjadi negatif (NCI) dan positif (PCI). Berikutnya akan dijelaskan ionisasi EI. Ketika analit keluar dari kolom kapiler, ia akan diionisasi oleh elektron dari filamen tungsten yang diberi tegangan listrik. Ionisasi terjadi bukan karena tumbukan elektron dan molekul, tapi karena interaksi medan elektron dan molekul, ketika berdekatan. Hal tersebut menyebabkan satu elektron lepas, sehingga terbetuk ion molekular M+, yang memiliki massa sama dengan molekul netral, tetapi bermuatan lebih positif. Adapun perbandingan massa fragmen tersebut dengan muatannya disebut mass to charge ratio yang disimbolkan M/Z. Ion yang terbentuk akan didorong ke quadrupoles atau mass filter. Quadrupoles berupa empat elektromagnet.

·         Filter

Pada quadrupoles, ion-ion dikelompokkan menurut M/Z dengan kombinasi frekuensi radio yang bergantian dan tegangan DC. Hanya ion dengan M/Z tertentu yang dilewatkan oleh quadrupoles menuju ke detektor.

·         Detector Detektor terdiri atas High Energy Dynodes (HED) dan Electron Multiplier (EM) detector. Ion positif menuju HED, menyebabkan elektron terlepas. Elektron kemudian menuju kutub yang lebih positif, yakni ujung tanduk EM. Ketika elektron menyinggung sisi EM, maka akan lebih banyak lagi elektron yang terlepas, menyebabkan sebuah arus/aliran. Kemudian sinyal arus dibuat oleh detektor proporsional terhadap jumlah ion yang menuju detektor.

3.      Komputer Data dari spekrometri masa dikirim ke computer dan diplot dalam sebuah grafik yang disebut spectrum masa.Limitasi/BatasanSecara umum, penggunaan metode GC-MS hanya terbatas untuk senyawa dengan tekanan uap berkisar10-10 torr. Kebanyakan senyawa dengan tekanan lebih rendah hanya dapat dianalisis jika senyawa tersebut merupakan senyawa turunan (contoh , trimetilsili eter). Penentuan penentuan gugus fungsional pada cincin aromatic masih sulit. Untuk senyawa isomer tidak dapat dibedakan oleh spketometer (sebagai contoh : naftalena vs azulena), tapi dapat dipisahkan dengan kromatograpi.Sensivitas dan Batas DeteksiBergantung pada faktor pelarutan dan metode ionisasi, sebuah ekstrak dengan 0,1 – 100 ng dari setiap komponen mungkin dibutuhkan agar sesuai jumlah yang diinjeksikan.Perbandingan dengan Teknik lainnya

-          IR spketometer dapat menyediakan informasi posisi aromatic isomer dimana GC-MS tidak bisa; namun IR biasanya lebih rendah sensitivitasnya sebesar 2 – 4.

-          NMR (nuclear magnetic resonance) spektrometri dapat memberikan informasi rinci pada konformasi molekuler ekstrak; namun biasanya NMR lebih rendah sensivitasnya sebesar 2-4.Sampel Keadaan sampel harus dalam keadaan larutan untuk diijeksikan ke dalam kromatografi. Pelarut harus bersifat volatile dan organic (sebagai contoh heksana atau dikllorometana). Jumlah sampel bergantung pada metode ionisasi yang dilakukan, biasanya yang sering digunakan untuk analisis sensivitas adalah sebesar 1 – 100 pg per komponen.Informasi analitikal GC-MS digunakan untuk identifikasi kualitatif dan pengukuran kuantitatif dari komponen individual dalam senyawa campuran kompleks. Terdapat perbedaan strategi analisis data untuk aplikasi keduanya.Keunggulan dari metode ini adalah sebagai berikut :

1.      Efisien, resolusi tinggi sehingga dapat digunakan untuk menganalisa partikel berukuran sangat kecil seperti polutan dalam udara

2.      Aliran fasa bergerak (gas) sangat terkontrol dan kecepatannya tetap.3.      Pemisahan fisik terjadi didalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan

temperaturnya dapat diatur.4.      Banyak sekali macam detektor yang dapat dipakai pada kromatografi gas (saat ini dikenal

13 macam detektor) dan respons detektor adalah proporsional dengan jumlah tiap komponen yang keluar dari kolom.

5.      Sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel kedalam fasa bergerak.6.      Kromatograf sangat mudah digabung dengan instrumen fisika-kimia yang lainnya,

contohnya GC/FT-IR/MS.7.      Analisis cepat, biasanya hanya dalam hitungan menit.8.      Tidak merusak sampel.9.      Sensitivitas tinggi sehingga dapat memisahkan berbagai senyawa yang saling bercampur

dan mampu menganalisa berbagai senyawa meskipun dalam kadar/konsentrasi rendah. Seperti dalam udara, terdapat berbagai macam senyawa yang saling bercampur dan dengan ukuran partikel/molekul yang sangat kecil.

Kekurangan dari metode ini adalah sebagai berikut :1.      Teknik Kromatografi gas terbatas untuk zat yang mudah menguap2.      Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar.

Pemisahan pada tingkat mg mudah dilakukan, pemisahan pada tingkat gram mungkin dilakukan, tetapi pemisahan dalam tingkat pon atau ton sukar dilakukan kecuali jika ada metode lain.

3.      Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan zat terlarut.

HPLC

Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan : 1.      Kromatografi penukar ion terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air

yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. Fase diam pada kromatografi penukar ion umumnya resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-beda. Pada resin penukar kation terdapat gugus aktif yang bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk pemisahan zat-zat bersifat basa, misalnya amina. Sebaliknya pada resin penukar anion teredapat gugus aktif bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat, sulfonat atau karboksilat, yang bermuatan negatif. Senyawa larut air yang ionik atau yang dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin, dan perbedaan dalam afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. pH fase gerak, suhu, jenis ion, konsentrasi ionik, dan senyawa organik tertentu yang berfungsi untuk memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut, dan variabel-variabel tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang diinginkan.

2.      Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non-polar, dikenal sebagai kromatografi fase balik, maka senyawa non-polar yang larut dalam hidrokarbon, dengan bobot molekul kurang dari 1000, seperti vitamin larut lemak dan antrakinon, dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. Jika fase gerak bersifat non polar dan fase diam polar, maka zat yang bersifat polar, seperti golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Fase gerak yang non-polar dapat dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar, untuk mengurangi retensi dan mengubah pemisahan.

3.      Beraneka ragam senyawa non ionik dapat dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi, dengan memilih fase diam dan fase gerak yang tepat.

1.      Pengertian HPLC              HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Chromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

         HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.     Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak. Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan

chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening, karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

         Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.

2.      Fasa gerak dan fasa diam dalam HPLCDi dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu

dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT,  tetapi ada  beberapa sifat umum  yang disukai, yaitu fasa gerak harus :

·      Murni, tidak terdapat kontaminan ·      Tidak bereaksi dengan wadah (packing) ·      Sesuai dengan defektor ·      Melarutkan sampel ·      Memiliki viskositas rendah ·      Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery" ·      Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Fasa diam yanng biasa digunakan (pada kolom) HPLC jenis fasa terbalik dimana R adalah rantai alkana C-18 atau C-8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur komposisinya (gradien elusi). Misalnya air: asetonitril (80:20). Hal ini bergantung pada kepolaran anallit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatan untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah

3.      Komponen-komponen HPLC1.      Botol pelarut (reservoir)

            Botol untuk fase gerak (mobile phase) dapat berisi campuran eluen atau eluen murni disesuaikan dengan kepentingan analisa.

2.      Pompa (pump)            Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor. Sebagian besar pompa HPLC memiliki keluaran tekanan (output pressure) 1000-6000 psi dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 mL/menit.

3.      Injektor (injector)            Injektor adalah tempat untuk menyuntikan sampel ke dalam kolom. Sampel yang akan dimasukkan  ke bagian  ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom.

4.      Kolom (coloum)            Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge, ada pula yang terbuat dari stainless steel. Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin, dll) yang terikat secara kimia dengan partikel-partikel silika berpori yang terdapat dibagian dalam kolom.            Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.             Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1)      Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2)      Kolom preparatif: umumnya memiliki  diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk  kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung  pada model KCKT  yang digunakan (Liquid Solid Chromatography,  LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion  Exchange Chromatography,  IEC, Exclution Chromatography, EC)

5.      Detektor (detector)            Detektor yang paling banyak digunakan adalah detector ultra violet (UV)/Visible, fluorometer (terutama untuk zat yang memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi) dan detektor indeks bias.Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan  fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.  Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan  untuk mendeteksi banyak  senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang  sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.

6.      Komputer (PC) dan Printer            Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.

1.      Cara Menggunakan HPLCLangkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi

dengan syringe. Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi.

Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase diam yaitu biasanya H2SO4 0,05 N dan CH3OH berdasarkan afinitas elektron. Setelah terpisah, dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit.

Rumus perhitungannya adalah y = ½ b.h yaitu persamaan yang diplotkan dengan least square. Sesuai dengan pengerjaan least square, maka sebelum menggunakan HPLC untuk analit, kita harus membuat kurva standar terlebih dahulu dengan menggunakan larutan standar.     Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek  dari Elusi Gradien adalah  mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang  tertahan kuat pada kolom.

Diagram alir HPLC Adapun cara untuk melihat seluruh proses diagram alir HPLC, antara lain:

a.    Injeksi sample               Proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.

b.    Waktu retensi        Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.

c.    Detektor         Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

d.    Interpretasi output dari detector

         Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menyerap sinar UV. Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama.

Kelebihan dan Kekurangan HPLC

a.      Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi:·      Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)·      Isolasi zat yang secara termal tidak stabil·      Dapat diopersikan pada suhu kamar·      Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran ·      Sudah digital sehingga penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis·      Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi ·      Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis ·      Resolusi yang baik ·      Dapat digunakan bermacam-macam detektor ·      Kolom dapat digunakan kembali ·      Mudah melakukan "sample recovery"

b.      Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi:·      Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu·      Hanya bisa digunakan untuk asam organic·      Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi·      Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas

KESIMPULAN

1.      HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

2.      Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya sedangkan prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggungakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.