Dr. Özge KAHRAMAN ILIKKAN 4. Hafta

5. Hafta

Besiyeri Etiketi

Etikette Yer Alan Bilgiler

· Besi yerinin veya besi yeri bileşeninin ismi (pepton, Brillant Green Bile Broth ),

· Hangi laboratuvarda kullanıldığı(mikrobiyoloji için-for microbiology- gibi),

· Bileşiminde bulunan maddelerin isimleri(kazein, pepton, glikoz, agar gibi),

· Bileşiminde bulunan maddelerin g/L olarak miktarları yani tipik bileşimi,

· Bir litre besi yeri için ne kadar tartım yapılacağı,

· Sterilizasyonunun nasıl ve kaç ºC’ta yapılacağı,

· Belli sıcaklıkta olması gereken pH’sı(25 ºC’ta pH:7,0 gibi ),

· Saklama koşulları (ÖR:15 – 25 ºC’ta ağzı kapalı ve kuru olarak)

5. Hafta

Besiyeri Etiketi

5. Hafta

Besiyeri Etiketi

5. Hafta

SIVI BESİYERİ HAZIRLIĞI

Laboratuvarlarda kullanılan pek çok besiyeri, dehidre formdan hazırlanır. Bu amaçla,

gereken miktar dehidre besiyeri hazırlanacak miktara göre tartılıp, üzerine damıtık su

eklenir ve gerekli ise başka kaplara (örneğin tüplere) dağıtılıp, sterilize edilir.

5. Hafta

SIVI BESİYERİ HAZIRLIĞI

Durham tüplü besiyerleri

5. Hafta

BESİYERİ HAZIRLIĞI

Mikrobiyoloji laboratuarında sonuçların güvenirliğini etkileyen en önemli faktör

sterilizasyondur.

Kullanıma hazır steril besi yerleri ve besi yeri katkıları dışında laboratuarda hazırlanan

tüm besi yerleri ve besi yeri katkıları sterilize edilmelidir.

Otoklavda sterilizasyon genel olarak 1 atm basınçta 121 0C sıcaklıkta 15 – 20 dakika

olarak uygulanır

5. Hafta

Vitaminler ve şekerler otoklavlanmaz filtreden geçirilir ve haricen eklenir

STERİLİZASYON SONRASI İŞLEMLER

5. Hafta

Petride besiyeri hazırlığı

Katı besiyerleri 45-50oC ye gelince petrilere 15-20 ml olacak şekilde (2-3mm) kalınlığında

dökülür

KATI BESİYERİ HAZIRLIĞI

5. Hafta

KATI BESİYERİ HAZIRLIĞI Yatık Agarlı Besiyerlerinin Hazırlanması

Standart deney tüplerine 5-10 ml olacak şekilde tam olarak eritilmiş agarlı besiyeri dağıtılır ve otoklavlanır. Tüpte yatık agar hazırlanmasında amaç, geniş bir yüzey elde etmektir. Otoklav sonrasında besiyeri henüz sıvı iken tüpler bir çubuk üzerine, ağız kısmı 1 cm kadar yüksek olacak şekilde yerleştirilir ve katılaşması sağlanır. Bu aşamada dikkat edilmesi gereken husus, tüplerin dip kısımlarının yaklaşık 2,5 cm derinliğinde olmasıdır. Salmonella analizinde kullanılan triple sugar ıron agar, bu tür besiyerine örnek verilebilir.

5. Hafta

KATI BESİYERİ HAZIRLIĞI

Besiyerlerinde Yüzey Kurutma İşlemi

besiyeri yüzeyinin aşırı ıslak olması, inkübasyonda buharlaşma ile petri kapağında su damlacıklarının oluşmasına ve kontaminasyonlara neden olur. Besiyeri yüzeyinin aşırı kuru olması öze ile ekim kalitesinin düşmesine ve mikroorganizmaların normalden daha küçük koloni oluşturmalarına; bu durum da hatalı değerlendirmelere neden olabilmektedir.

5. Hafta

BESİYERİ DEPOLAMA

2. Hazırlanmış besiyeri; ISO 11133'e göre besiyerleri katkı ilave edilmemiş olmak kaydı ile buzdolabında en çok 3 ay, oda sıcaklığında en çok 1 ay süre ile depolanabilir.

Hazırlanmış besiyerlerinin ne kadar süre ile depolanacağı öncelikle besiyeri bileşimine, hangi ambalajda (tüp, vida kapaklı şişe, plastik Petri kutusu, cam Petri kutusu vb.) olduğuna, depolama koşullarına bağlıdır.

1. Toz besiyeri; Kapağı açılmış besiyerleri ve besiyeri bileşenleri kuru, karanlık ve serin bir yerde saklanmalıdır. Toz haldeki besiyeri ve bileşenleri için en büyük tehlike bunların nem almasıdır. Orijinal ambalaj kapağının açılmasından sonraki raf ömrü, saklama koşullarına doğrudan bağlıdır.

5. Hafta

TSA Hazırlanması Dehidre besiyeri, 40,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilip, otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilir ve steril Petri kutularına 12,5'er mL dökülür. Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarımsı kahve renktedir. Sterilizasyon sonrası 25 oC'da pH'sı 7,3±0,2'dir.

ÖRNEK HAZIRLIK

15 petri TSA hazırlamam için; 15 x 15ml = 225 ml besiyerine ihtiyacım var dolayısıyla; 1000 ml ye 40 g ise; 225 ml ye x X= 9g toz besiyeri tartıp 225 ml distile su eklemem gerekir.

5. Hafta

BESİYERİ HAZIRLAMA ÖRNEK PROBLEM

20 Petri ve 10 ml besiyeri içeren 30 tüp hazırlamak için toplam ne kadar besiyerine ihtiyacım olacak ve ne kadar toz besiyeri tartmam gerekiyor ?

Besiyeri etiketleri:

Tryptic Soy Broth: Hazırlanması Dehidre besiyeri, 30,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde eritilip, amaca uygun kaplara (tüp, erlen vb.) dağıtılır ve otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilir. Hazırlanmış besiyeri berrak sarımsı renkte olup, 25 oC'da pH'sı 7,3±0,2'dir.

Hazırlanması Dehidre besiyeri, 40,0 g/L olacak şekilde damıtık su içinde ısıtılarak eritilip, otoklavda 121 oC'da 15 dakika sterilize edilir ve steril Petri kutularına 12,5'er mL dökülür. Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarımsı kahve renktedir. Sterilizasyon sonrası 25 oC'da pH'sı 7,3±0,2'dir.

Tryptic Soy Agar:

5. Hafta

https://www.youtube.com/watch?v=vdeVOUn6_8U

HAZIR BESİYERLERİ

5. Hafta

HAZIR BESİYERLERİ

5. Hafta

STERİLİZASYON YÖNTEMLERİ

Sterilizasyon: Bir ortamdaki mikroorganizmaların ve sporların tamamının öldürülmesi ya da ortamdan uzaklaştırılması işlemidir.

5. Hafta

FİZİKSEL YÖNTEMLER

1. Isıl uygulama

1.1 Nemli ısıyla sterilizasyon

1.1.1)Basınçlı Buharla otoklavda sterilizasyon Su buharı, ısı enerjisini kuru havaya göre çok daha iyi bir şekilde ilettiği için

sterilizasyonda çok daha etkilidir.

Vejetatif bakteri hücreleri 75-80 °C'da ölmekle beraber Bacillus ve Clostridium cinslerine ait sporlar 100 °C'ın üzerinde ölmektedirler

5. Hafta

Otoklavda etkin bir sterilizasyon; 121oC’de, 1 atm basınçta, 15-20 dak gerçekleşir

Otoklavlar, çoğu kere otoklav içindeki havanın çıkışını zorlaştıracak şekilde hatalı olarak doldurulurlar. Örneğin tüpler, yaygın olarak boş konserve kutularına konulup otoklava yerleştirilir. Bu şekilde kutu içinde hava paketleri kalabileceği için otoklav sıcaklığı 121 °C'ı gösterse dahi kutu ve dolayısıyla tüplerin sıcaklığı otoklavlama süresi boyunca 121 °C'a çıkmayabilir.

1.1.1)Basınçlı Buharla otoklavda sterilizasyon

5. Hafta

1.1.2) Kaynar Su banyosunda Bazı besiyerleri otoklavda sterilize edilmez. Örneğin VRB Agar besiyeri sadece kaynar su banyosunda 30 dakika tutulur. Burada, kaynar su banyosuna konulan VRB Agar besiyeri sıcaklığının kaynar su banyosunda 30 dakika tutulması kastedilmektedir. Bu süre, besiyeri merkez sıcaklığının 95–98 oC'a çıkması ve bu sıcaklıkta birkaç dakika kalması için yeterlidir. Kaynatılarak hazırlanması gereken besiyerleri ideal olarak 100 oC'a ayarlanmış otoklavda tutularak sterilize edilir. 1.1.3) Tindalizasyon

Bazı besiyerleri, bileşimlerine giren bazı maddeler nedeni ile yüksek sıcaklıkta sterilize edilemezler. Tindalizasyonda besiyeri önce 100 °C 'da 30 dakika süre ile tutularak tüm vejetatif hücreler öldürülür. Ancak sporlar halen canlıdır. Ertesi gün yine 100 °C 'da 30 dakika tutulur. 3. gün aynı işlem tekrarlanır, böylece besiyeri aşamalı olarak sterilize edilmiş olur. Tindalizasyon 12 saat aralıklarla da yapılabili

5. Hafta

1.2. Kuru Hava Sterilizasyonu- pastör fırını

Normal olarak doldurulmuş (aşırı yüklenmemiş) kuru hava sterilizatörlerinde

sterilizasyon süresi 160 °C 'da 2 saat veya 170 °C 'da 1 saattir.

Pipet, Petri kutuları gibi cam malzeme otoklavlama sırasında hava paketleri

oluşturabilecekleri ve dolayısı ile yeterince sterilize edilememe riski de dahil olmak

üzere pek çok nedenle kuru hava sterilizatörlerinde sterilize edilir.

5. Hafta

1.3. Yakma

Bek alevinden geçirmek suretiyle öze,L baget gibi malzemeler steril edilirler

5. Hafta

2. Filtrasyon Tekniği

Vitaminler, aminoasitler ve şeker gibi maddeler besiyerinin bileşimine gireceklerse, bunların termal sterilizasyonu söz konusu olamaz. Vitaminler gibi sıcaklık uygulanamayacak maddeler, filtrasyon tekniği ile sterilize edilip, ana (bazal) besiyeri bileşimine sonradan ilave edilirler Filtreler çeşitli por boyutlarına sahip olabilirler; 0,45µm, 0,22µm Enjektöre doldurulan sıvı filtrelerden geçirilip ortama eklenir.

Şırınga filtreler

PES: Polietersülfon

5. Hafta

3. Işınlama ile sterilizasyon

3.1. İyonize radyasyon dalga boyu 100 A°'dan daha kısa olan X ışınları ve dalga boyu 1 A° 'dan

daha kısa olan gamma ışınları oluşturur. Ameliyat malzemeleri gibi malzemelerin sterilizasyonunda kullanılır. Baharatların sterilizasyonunda kullanılmaktadır

ultraviyole (UV) ışını ile yapılır

Bakteri sporları, vejetatif hücrelere göre, UV'ye daha fazla direnç gösterirler. Çoğu küf sporu, bakteri sporları kadar dirençli iken, bazıları bakteri sporlarından 10 kat daha yüksek dirençlidirler.

UV; havanın, suyun ve ambalaj kâğıtları gibi düzgün yüzeylerin dezenfeksiyonunda kullanılmaktadır

3.2. ) İyonize olmayan radyasyon olmak üzere 2 grupta toplanabilir

5. Hafta

KİMYASAL YÖNTEMLER 1. Sıvılar

2. Gazlar

Bazı kimyasal çözeltiler ile bunların gaz ya da buharları, sterilizasyon ve dezenfeksiyon

amacıyla kullanılabilir.

Dezenfeksiyon, kelime anlamı olarak patojen mikroorganizmaların yüzeylerden

arındırılması olup, bu tarif altında sterilizasyon yerine kullanılamaz.

DEZENFEKTANLARIN ETKİ MEKANİZMALARI • Hücre zarına etki • Mikroorganizmaların proteinlerini denatüre ederek etki • Mikroorganizma enzimlerinin işlevlerini bozarak etki • Nükleik asitlere etki

5. Hafta

yaygın olarak kullanılan dezenfektanlar

1. Grup : Halojenler

1.1. Klor bileşikleri

1.2. İyot bileşikleri (iyodoforlar)

2. Grup : Yüzey Aktif Maddeleri

2.1. Kuaterner Amonyum Bileşikleri

2.2. Amfoterik Bileşikler

3. Grup : Oksidan Maddeler ( Hidrojen peroksit, perasetik asit, ozon gibi )

4. Grup : Alkali ve asit Bileşikler

5. Grup : Alkoller ( etil alkol gibi )

6. Grup : Fenol ve Türevleri

7. Grup : Aldehitler ( formalin )

5. Hafta

1. 1. Klor Bileşikleri

Sıvı klor, hipoklorit, inorganik kloramin ve organik kloraminler ve klordioksit,

sanitizer olarak etki gösteren ajanların başında gelmektedirler.

Klor bileşiklerinin en aktifi olup, yaygın olarak kullanılan bir dezenfektandır. •

Kalsiyum ve sodyum hipoklorit, bu grupta yer alan ve yaygın kullanılan ana

bileşiklerdir.

Bu dezenfektanlar, sulu süspansiyonlarda yeniden aktive olan mikrobiyal

hücrelerde etkilidir ve yaklaşık 1.5-100 saniyelik temas zamanı gerekir.

hipoklorit

Klor gazı: • Gıda endüstrisinde genel olarak su stoklarının dezenfeksiyonunda kullanılır

5. Hafta

1.2. İyot Bileşikleri

Genel olarak kullanılan iyot bileşikleri; a) İyodoforlar b) Alkol-iyot çözeltileri c) Sulu iyot çözeltileri İlk iki çözelti genellikle deri dezenfektanları olarak kullanılır. • İyodoforlar, ekipman ve yüzeylerin temizlik ve dezenfeksiyonu ile deri antiseptiği olarak bir değer taşır.

5. Hafta

2. Grup : Yüzey Aktif Maddeleri

2.1. Kuaterner Amonyum Bileşikleri ( KAB ) Kuaterner amonyum bileşikleri daha çok yerlerin, duvarların, eşyaların ve ekipmanların sanitasyonunda kullanılır. İyi bir nüfuz etme özelliği gösterirler ve bu nedenle gözenekli yüzeyler için çok uygundur. En yaygın olanları katyonik deterjanlar olup, zayıf deterjan özelliklerine sahiptir. Fakat, mükemmel germisidlerdir. Listeria monocytogenes için etkili bir sanitizerdir ve küf gelişiminin azaltılmasında halojen sanitizerlerden daha etkilidir 2.2. Amfoterik Bileşikler Kullanıldığı alanlar: Gıda temas yüzeyleri, çevresel yüzeyler, sisleme, el hijyeni ürünleri

5. Hafta

3. Grup : Oksidan Maddeler ( Hidrojen peroksit, perasetik asit, ozon gibi )

Hidrojen peroksit

• Hidrojen peroksit (H2O2 ) Gram (+) ve Gram (-) mikroorganizmalara karşı oldukça

etkilidir.

• Hidrojen peroksit, oksidatif etkisi nedeniyle mikroorganizmaların biyolojik aktif

sistemlerine zarar vermekte ve bu şekilde ölmelerine neden olmaktadır.

Perasetik asit

• Gıda işletmelerinde dezenfektan olarak kullanılan diğer bir oksitleyici madde perasetik

asittir

• Perasetik asit, küfler hariç diğer mikroorganizmalara karşı oldukça etkindir.

Ozon

• Ozon (Trioksijen-O3 ) stabil olmayan gaz halinde bir maddedir. • Doğal olarak oluşur ve

kuvvetli bir oksitleyici özelliği vardır. • Ozon gazı stabil değildir. Hava ve suya karıştığı

zaman hızla oksijene dönüşür. • Bu nedenle kullanılacağı yerde üretilmelidir.

5. Hafta

4. Grup : Alkali ve asit Bileşikler

Asit – Anyonik Dezenfektanlar • Fosforik asit ile anyonik surfaktanların oluşturduğu dezenfektanlardır. • Pek çok mikroorganizmaya karşı etkilidir. 5. Grup : Alkoller ( etil alkol gibi ) % 70 konsantrasyonlu etil alkol veya izopropil alkol genellikle yüzeylerin ve el dezenfektanı olarak kullanılır. Alkoller birkaç dakika içinde vejatatif mikroorganizma üzerine öldürücü etkide bulunmaktadır. Bakteri sporları üzerine etkileri yoktur.

6. Grup : Fenol ve Türevleri

Fenol: Kokusu rahatsız edici olduğu gibi, kullanıldıktan sonra yüzeyde yapışkan bir iz

bırakır. Bakteri sporları fenol bileşiklerinden etkilenmezler

7. Grup : Aldehitler ( formalin )

Formaldehit: Dezenfektan olarak, genellikle % 37-40'lık konsantrasyonu ile (formol)

sıvı halde; ya da keti polimerize bileşik (paraformaldehit) halinde kullanılır. bina veya

odalarda yüzey sterilizasyonunda etkin bir şekilde kullanılır. Formaldehit, zehirli

buharları nedeni ile kullanımına özen gösterilmesi gereken bir bileşiktir.

Sterilizasyon (Sterilliğin) Kontrolü

5. Hafta

OTOKLAV BANDI

5. Hafta

5. Hafta