Dr Dragan RadnovićDepartman za biologiju i ekologiju

PMF N i S dPMF Novi Sad

Mikrobiološki kvalitet vode za piće je zajednička briga potrošača, p j j g pvodovoda, regulatornih tela i ustanova javnog zdravljaPotencijal pijaće vode za prenos mikrobioloških patogena do velikog broja ljudiPojava hidričnih epidemija dokumentovana u mnogim zemljama bez obzira na stepen ekonomske razvijenosti Primer: kriptosporidioze 1993. godine (Milvoki, Viskonsin, SAD) Procena 400 000 lica je patilo od gastrointestinalnih (GI) tegoba

Brojni izveštaji iz celog sveta ukazuju da je voda za piće značajan

prenosliac mnogih MO uzročnika bolesti kod ljudi

simptomi gastrointestinalnih (GI) bolesti (mučnina, dijareja,p g ( ) ( , j j ,

povraćanje, bol u trbuhu) često su blagi i traju do nedelju dana, a

samo je mali procenat onih koji će posetiti lekara a još manji broj samo je mali procenat onih koji će posetiti lekara, a još manji broj

onih koji će potražiti uzrok bolesti

Mnogi slučajevi su ostali nezabeleženi odnosno skriveni

Izveštaji su nekompletni i potcenjuju stvarno stanje

Procenjuje se da je 1/3 od svih crevnih infekcija širom sveta

nastala konzumiranjem vode lošeg mikrobiološkog kvaliteta

Takozvane hhidrične epidemije su karakteristične i za p j

razvijene zemlje

1200 smrtnih slučajeva godišnje u SAD

Većina slučajeva ima blage simptome dijareje i mučnineVećina slučajeva ima blage simptome dijareje i mučnine

V. cholerae i E. coli O157:H7 – visok stepen smrtnosti

Postoje ozbiljne pretpostavke da MO iz vode mogu biti povezani i sa

nastankom ozbiljnih bolesti kao što su:

Diabetes, - Coxsackie B4 virus,

Myocarditis, - echovirus

G illi B é d C l b t Guillian-Barré syndrome Campylobacter spp.

Rak želuca - Helicobacter sp.

Reaktivni artritis-Klebsiella sp.

NOVI (NOVOTKRIVENI) PATOGENI (EMERGING PATHOGENS)

Novootkriveni patogeni - MO koji su odgovorni za infektivne bolesti p g j gkoje su se pojavile ili je zabeležen njihov porast u protekle dve decenije

Intenzivna poljoprivreda, rast ljudske populacije i klimatske promene

Calici virusi, E. coli O157: H7, Helicobacter sp, Mycobacterium avium( C) C Ckompleks (MAC) protozoa Cryptosporidium sp., Cyclospora sp. i

Toxoplasma sp.

O j bl ht t l b d t Ovaj problem zahteva stalnu budnost

"Znanje je prva linija odbrane u cilju dobijanja MB ispravne vode za piće "piće.

19. vek - veza izmedju fekalnog zagađenja i pojave infektivnih bolesti – rođenje koncepta indikatoraVeza izmedju heterotrofa i efikasnost peščanog filteraKoch – voda koja sadrži manje od 100 CFU nema rizika od kolere i tifoidne grozniceKnjiga Microorganisms in Water (Franklands in 1894 ) sadrži nekoliko važnih postavki:Broj bakterija je mera stepena zagađenja i njihov broj u morskoj, vodi jezera i podzemnoj vodi treba da bude manji od 100/ml

Spori peščani filteri redukuju broj bakterija iz rečne vode za preko 90% odnosno na ispod 100/ml90% odnosno na ispod 100/ml100 bakterija/ml postaje standard u mnogim Evropskim zemljama, a

SAD i Kanada 500/mlSAD i Kanada 500/mlDanašnji parametar - broj aerobnih mezofila odnosno broj heterotrofa (HPC)(HPC)KONCEPT FEKALNIH INDIKATORASchardinger 1892 predložio da karakteristična komponenta fekalneSchardinger 1892 - predložio da karakteristična komponenta fekalneflore, bakterija Bacterium coli "indikacija prisustva fekalnogzagađenja i samim tim mogućeg prisustva crevnih patogena”agađe ja sa t ogućeg p sust a c e patoge a

Opisane druge Gram- bakterije su izolovane iz stolice i vode,

fermentišu laktozu (Klebsiella 1882; Aerobacter 1890).

1901 ove bakterije su grupisane pod imenom koliformi 1901, ove bakterije su grupisane pod imenom koliformi.

Koliformi = Gram-, nesporogeni fakultativni anaerobni bacili koji

f tiš l kt i d j ki li i k d 48 ti fermentišu laktozu proizvodnjom kiseline i gasa u roku od 48 sati na

35ºC.

Definicija je zasnovana na metodama detekcije koji dozvoljava

jednostavnu izolaciju i brojanje crevnih bacila. j j j j

Vremenom je postalo jasno da mnogi rodovi i vrste koje zadovoljavaju

ovu definiciju nisu fekalnog porekla

u stanju su da se razmnožavaju u vodenoj sredini, j j j ,

metodologija uključuje višu temperaturu inkubacije, što je poboljšalo

specifičnost indikatora termotolerantni koliformi (TK)specifičnost indikatora – termotolerantni koliformi (TK)

druge bakterije (uglavnom Klebsiella), koji ispunjavaju kriterijume za

TK nisu fekalnog porekla (otpadne vode industrije papira)

Escherichia coli je najpouzdaniji mikrobiološki indikator fekalnog j jp j gzagađenja - jedini član koliformnih bakterija koja se uvek nalazi u izmetu toplokrvnih životinja Drugi mikroorganizmi koji su predloženi kao mikrobiološki indikatorifekalnog zagađenja su: enterokoke (ranije nazvan fekalne streptokoke), kolifagii sulfitoredukujuće klostridije.

Termotolerantni koliformi (TK) i E. coli su tokom istorije bili veoma korisni MO korišćeni kao parametri za testiranje mikrobiološke korisni MO - korišćeni kao parametri za testiranje mikrobiološke ispravnosti vode za piće Njihova upotreba je vodila ka značajnom poboljšanju efikasnosti Njihova upotreba je vodila ka značajnom poboljšanju efikasnosti procene MB ispravnosti pijaće vode Prihvaćeni od strane WHO i gotovo svih nacionalnih standardaPrihvaćeni od strane WHO i gotovo svih nacionalnih standardaGlavni razlog njihovog uspeha je jednostavna metodologijaZa razliku od hemijskih mikrobiolozi su uvideli svu složenost ispitivanja Za razliku od hemijskih mikrobiolozi su uvideli svu složenost ispitivanja svih enteričnih patogena – potraga za univerzalnim indikatorom fekalnog zagađenjag g j

Mikrobiološki indikatori u upotrebi već decenijamaPrvobitno kao mera fekalnog zagađenja izvorišta a kasnije za Prvobitno kao mera fekalnog zagađenja izvorišta, a kasnije za merenje efikasnosti tretmana i post-tretmanske kontaminacije i pogoršanja kvalitetap g jPotraga za fekalnim indikatorima je zasnovana na nekoliko kriterijuma koji su dobro prihvaćeni od strane naučne zajedniceKriterijumi za izbor indikatora su sledeći:Indikator - odsutan u nezagađenoj vodi i prisutan kada je izvor

patogenih mikroorganizama prisutanindikator ne bi trebalo da se umnožava u okruženju.

Indikator treba da bude prisutan u većem broju nego patogeni

mikroorganizmi

Indikator treba da se u uslovima sredine ponaša slično kao i patogenp p g

Indikator - laka izolacija, identifikacija i brojanje

T k l d ći k it ij i d d ti i i l j li ti Tokom vremena, sledeći kriterijumi su dodati u originalnoj listi:

Test detekcije treba da bude jeftin – omogućiava veći broj uzoraka

Indikator ne bi trebalo da bude patogeni mikroorganizam

E.coli i TK su parametri izbora pomoću koji se prati fekalno

đ j di t ib ti i tzagađenje distributivnog sistema

Dodatni parametri su: enterokoke i sulfitoredukujuće klostridije

kojima se prati fekalno zagađenje i/ili integritet distributivnog sistema

Osnovni problem sa aspekta javnog zdravlja je taj što je od momenta p p j g j j j j

pojave nekog problema do detekcije potrebno od nekoliko sati do

nekoliko dananekoliko dana

60 tih godina pored upotrebe TK i EK kao indikatora fek. zagađenja – novi izazov

VIRUSI – malih dimenzija, filtrabilni, otpornost prema dezinfekciji većakoliformi neadekvatni parametar za procenu virusološkog kvalitetakoliformi neadekvatni parametar za procenu virusološkog kvalitetatretirane vode za piće Mikrobiolozi - alternativni mikrobiološki parametripBAKTERIOFAGI (fagi) -slične veličine, strukture kao humani patogeni modeli - za potencijalno prisustvo virusa i za njihov opstanak i ponašanje u životnoj sredini, Efikasnost njihovog uklanjanja i inaktivacija prilikom prečišćavanjaEfikasnost njihovog uklanjanja i inaktivacija prilikom prečišćavanjavoda i dezinfekcije

Giardia sp. i Criptosporidium sp (protozoe)

epidemija crevnih oboljenja je došla bez indikacija FK

Neuspeh koliformnih bakterija dezinfekcija je inaktivirala bakterije Neuspeh koliformnih bakterija – dezinfekcija je inaktivirala bakterije,

ali ne i viruse i protozoe

Spore Clostridium perfringens – mikrobiološki parametri za protozoe.

Aerobne spore – indikatori efikasnost tretmana uklanjanja patogena

Glavna svrha mikrobiološkog monitoringa je da proveri efikasnosti

tretmana i dezinfekcije i detekcija kontaminacije posle tretmanatretmana i dezinfekcije i detekcija kontaminacije posle tretmana.

Otkrivanje i karakterizacija značajnog broja crevnih patogena - novemetode za detekciju i identifikaciju metode za detekciju i identifikaciju

Rezultati - virusi i paraziti mogu i dalje biti prisutni u inače navodno bezbednoj vodi za piće. j pVoda za piće može biti rizična po zdravlje iako ispunjava standardeindeksirane tradicionalnim bakterijskim parametrima SAD proširio princip “voda bez patogena" u voda sa nula patogena Istraživanja ukazala na teškoće vezanim za takvo ispitivanje i za prikupljanje podataka o pojavi patogena

Testiranje patogena (TP) može biti korisno sredstvo za sanitarnaistraživanja slivova, za laboratorijsko ili pilot-postrojenje radi ispitivanja efikasnosti postojećih ili novih tretmana vode i za istraživanje epidemijaistraživanje epidemijaTP - pomaže da se poboljša postupak za dobijanje mikrobiološki ispravne vode kao i argument za korektivne mere ispravne vode kao i argument za korektivne mere. TP - dodati standardnom monitoringu što nije jednostavnoNizak nivo enteričnih virusa i parazitskih cista protozoa pronađeni su Nizak nivo enteričnih virusa i parazitskih cista protozoa pronađeni su u vodi za piće u odsustvu prijavljenih epidemija Ovo bi moglo biti povezano sa nedostatkom infekcije greškom pri Ovo bi moglo biti povezano sa nedostatkom infekcije, greškom pri identifikaciji, stečenim imunitetom ili asimptomatskom infekcijom

mala osetljivost – mala brojnost patogena u vodi, prekoncentracija neophodna

moguće detektovati samo nekoliko patogena - voda može da sadrži g gstotine različitih patogena - koje patogene treba tražiti?

Metode ispitivanja patogena su relativno specifične i neće otkriti sve Metode ispitivanja patogena su relativno specifične i neće otkriti sve prisutne patogene.

Molekularne metode i bioinformatika otkrivanje šireg spektraMolekularne metode i bioinformatika - otkrivanje šireg spektramikroorganizama - nije još uvek izvodljivo.

Velika Britanija je usvojila ovaj pristup i testovi za Cryptosporidium oociste u prečišćenoj vodiAnaliza – zahteva specijalizovanu laboratoriju, obučeno osoblje i odgovarajući nivo biosigurnosti. Razvijene zemlje - nekoliko laboratorija van kliničkog okruženjaTestiranje patogena zahteva gajenje i manipulisanje patogenom, potencijalni rizik po zdravlje analitičaraZa većinu patogena je potrebno nekoliko dana za dobijenje rezultata

Metodološki ograničenja – veliki oprez u interpretaciji rezultata testiranja patogena. Pozitivan rezultat - voda mikrobiološki neispravna, koristi se za procenu nivoa rizika za potrošače Pozitivni rezultati – koriste se samo u sistemima sa dobrim

lj j d š j dl k i ik upravljanjem, donošenje odluka na osnovu procene rizika Negativni rezultati - posmatrati sa određenom dozom skepse obzirom na veliki broj mogućih patogena obzirom na veliki broj mogućih patogena

Nivoi testiranja patogena (TP) - može da varira od pojedinačnihtestova ili rutinski monitoring izvorištatestova ili rutinski monitoring izvorištaTP – ne sme biti učinjeno na štetu suštinskog osnovnog praćenja.Gde i kada treba da se uradi TP? Gde i kada treba da se uradi TP? inicijalna ispitivanja novih izvorištaNakon uređaja za pripremu - negativan za infektivne patogene, j p p g p g ,Koliko uzoraka treba analizirati ? - statistički reprezentativan TP– visoka cena Dobar set mikrobioloških i nemikrobioloških parametara je verovatno isplativiji

Trenutno detekcija mikrobioloških parametara uključuje:U k j fil ij k l i ij i b ik iUzorkovanje, filtraciju, kultivaciju izabranog mikroorganizma naselektivnoj podlozi, brojanje kolonija ili, u nekim slučajevima,demonstracija rasta (npr testovi prisustvo odsustvo)demonstracija rasta (npr testovi prisustvo-odsustvo)proces koji može da potraje 24 do 72 sata

U poslednje dve decenije 20. veka - razvoj molekularne biologije i brzo testiranje (manje od osam sati) brzo testiranje (manje od osam sati). tehnikama lančane reakcije polimeraze (PCR) - brza, osetljiva i specifična detekcija indikatorskih mikroorganizama i patogena. specifična detekcija indikatorskih mikroorganizama i patogena. Detekcija nekultivabilnih VIRUSA - npr. Norwalk virusispecifičnost PCR i i naknadne metode verifikacije (hibridizacije, sekvenciranje) - otkrivanje patogenih vrsta ili genotipova u okviru CryptosporidiumB i j j š j d k kt i tik PCR i d ih l k l t h ikBrzina je još jedna karakteristika PCR i srodnih molekularne tehnikaNekoliko istraživača su razvili PCR tehnike za brzu detekciju E coli i crevnih bacila detekcija za detekciju E. coli i crevnih bacila - detekcija za nekoliko sati

molekularne metode - procena vijabilnosti/infektivnosti otkrivenih MO?

prisustvo sekvence NK- potiče iz mrtvih ćelija ili čak od fragmenata DNK

Odgajivačke tehnike – izoluju se živi mikroorganizmi

Nekoliko tehnika ili kombinacije tehnika sada su dostupni za

prevazilaženje problema vijabilnost/infektivnostiprevazilaženje problema vijabilnost/infektivnosti

Primeri: upotreba inducibilne mRNK kao meta za RT-PCR (reverzne

transkriptaze - lančana reakcija polimeraze)

upotreba vijabilnost/infektivnosti metode za 'predkultivaciju” ciljnog

organizma pre PCR detekcije kao što je ćelijske kulture PCR metoda za

Cryptosporidium i virusa iako predkultivacija povećava ukupno vreme Cryptosporidium i virusa iako predkultivacija povećava ukupno vreme

testa.

Taksonomija mikroorganizama se pre svega zasniva na genotipiskim

a ne na fenotiskim karakteristikama.

genetska taksonomija - brza karakterizacija i poređenje genotipova.

Ovo je bilo korisno u istraživanjima epidamije - izvor epidemije i put

prenošenja MO prenošenja MO

Napredak u kompjuterskoj, čip, lasera i optičkih tehnologija pružili su

i pružaju, nove mogućnosti za detekciju i identifikaciju MO

Nova oprema se koristi prvenstveno u istraživačkom prostoru, ali

nekoliko tehnologija se trenutno koriste u praksi, kao što su

protočnoa (flow) citometrija i sortiranje ćelija, p ( ) j j j ,

Konfokalna mikroskopija i lasersko skeniranje.

Mnoge metode su skupe

Cena opreme je visoka Cena opreme je visoka.

kombinacija kompjuterski čip tehnologije i molekularne

mikrobiologije,

treba da omogući automatsko testiranje više patogena jednim DNK g j p g j

čipom

Moderne tehnologije brza i pouzdana detekciju patogena ili indeks Moderne tehnologije – brza i pouzdana detekciju patogena ili indeks

/ indikatorskih mikroorganizama u bliskoj budućnosti

Izazovi koji ostaju za ove nove metode su:Kvantifikacija Kvantitativne aspekte treba unaprediti jer sadašnje Kvantifikacija Kvantitativne aspekte treba unaprediti jer sadašnje molekularne metode su, u najboljem slučaju, samo semi-kvantitativneInfektivnost. Vijabilnost i infektivnost otkrivenih MO je još uvek Infektivnost. Vijabilnost i infektivnost otkrivenih MO je još uvek neizvesna "Pitanje koncentracija". Detekcija u vodi zahteva testiranje velike količine (0.1-100 litara ili više), dok su nove tehnologije trenutno rade sa malim količinama (0.00001-0.001 litara). Ovo zahteva metode koncentracije gubici oporavka koncentracije - gubici oporavka. obuka kadrova i oprema - dalja primena ovih tehnologija u praksi zahteva dalje pojednostavljenje i automatizaciju. j p j j j jTroškovi Cena je i dalje visoka i trenutno nemaju primenu u rutinskom monitoringu

Prvi motiv za bakteriološko ispitivanje piće - da li je voda koja se k i k t i i ik i i tj P t ikonzumira kontaminirana mikroorganizmima tj. Patogenimamikrobiološki parametri - korisne informacije tokom procesa proizvodnje vode za piće uključujući i istraživanja sliva, karakterizacija izvora efikasnost prečišćavanja i ispitivanje karakterizacija izvora, efikasnost prečišćavanja i ispitivanje distributivnog sistema. indeks organizmi - meru količine fekalnog zagađenja izvora vode, dok parametri indikatora mogu da se koriste da bi se dobile dok parametri indikatora mogu da se koriste da bi se dobile informacije o efikasnosti tretmana prisustvo MO posle tretmana ukazuje da patogeni mogu dalje biti prisutni. Na primer, prisustvo spora sulfitoredukujućih klostridija ili prisutni. Na primer, prisustvo spora sulfitoredukujućih klostridija ili bakteriofaga u pijaćoj vodi ukazuje da veoma otporni mikroorganizmi mogu preživeti, kolonija aerobnih heterotrofna bakterija ili direktna j jDirektno mikroskopsko brojanje - informacije o dostupnosti hranljivih materija u vodI, koja može dovesti do estetskih problema ili u prisustvu oportunističkih patogena.

metode za otkrivanje patogena je često teško sprovesti, jer su skupe i dugo trajuNe preporučuje se da se voda ispita u odnosu na svaki patogen Ispitivanje finalne vode za patogene samo će potvrditi da su potrošači bili izloženi patogenimai iti j t ih i k i d k f k l đ j ispitivanje nepatogenih organizama kao indeks fekalnog zagađenja ili pokazatelj adekvatnosti tretmanaOvo poglavlje opisuje parametre Indeks / indikatore koji su Ovo poglavlje opisuje parametre Indeks / indikatore koji su najpogodniji za različite svrhe sa osnovnim ciljem da se smanji fekalno-oralno prenošenje bolestip j

Voda za piće ne sme da predstavlja rizik od Infekcije

Rizik od infekcije je pre svega povezan sa fekalnim zagađenjem, a

njegova kontrola zavisi od sposobnosti procene rizika po izvorište i njegova kontrola zavisi od sposobnosti procene rizika po izvorište i

primeniti odgovarajuće mere za uklanjanje utvrđenih rizika.

U t d k š tk i j i t ti t k j Umesto da se pokuša sa otkrivanjem prisutnosti patogena, praksa je

da se traže mikroorganizmi koji nisu patogeni, ali koji pouzdano

ukazuju na prisustvo fekalnog zagađenja a time i na prisustvo

patogena.

Brojni mikrobiološki parametri su korišteni kao 'Indeks' organizmi koji ukazuju na količinu fekalnog zagađenja izvora vode, najpouzdaniji je E.coli. Provera efikasnosti tretmana pripreme u uklanjanju patogenaS š I dik t t b d b d t b d k Savršen Indikator treba da bude otporan na procese obrade kao najotporniji potencijalni patogen, niti jedan parametar je idealan. j p jU principu, tretman treba da uklobni sve sprorgene bakterije i enterične viruse P t j b j i ik bi l ški t i čiji j d t k ć j k lit t Postoje brojni mikrobiološki parametri čiji je zadatak praćenje kvaliteta vode za piće od izvora do distributivnog sistema gde se kvalitet takođe može pogoršati zbog pojave biofilma .p g g p j

MO i drugih indikatori parametri igraju bitnu ulogu u svim modelima koji se koriste u proceni rizika se koriste u proceni rizika Tačan odnos između indikatorskih parametara i rizika za zdravlje je još uvek nejasanI k i t ži j k l d j ć t i f k l Iako su istraživanja pokazala da je zamućenost i fekalne streptokoki su nezavisni pokazatelji zdravstvenog rizika ne oni se još uvek ne mogu koristiti u predviđanju rizikaČak i tamo gdje su dostupne informacije o patogenima u pitkoj vodi trenutni kvantitativni modeli za procenu su još uvek nepouzdani Stvarna vrednost takvog indikatorskog paramtra je u kvalitativnoj g g p j jproceni rizika, Koristite se za identifikaciju kvarova koji se mogu pojaviti u procesu prečišćavanja i distributivnog sistema.p j g