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Biossistemas e Biorreações
Prof. Maria Alice Zarur Coelho
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de QuímicaUFRJ
Metabolismo – nosso principal ator
Top-down versus Bottom-up
Petranovic and Nielsen, Trends in Biotechnology (2008)
Primeiro Genoma Bacteriano Sequenciado
Número de genomas sequenciados
http://sulab.org/2013/06/sequenced-genomes-per-year/
1. COMPONENTS Determine the system components (genes, proteins and metabolites)2. NETWORKS Identify the component interactions (enzyme-substrate,protein-DNA)3. MODELS Develop a system model (qualitative or quantitative)4. PHYSIOLOGY Model-based design or hypothesis-driven discovery
Bottom-up metabolic systems biology
Usos de outros dados de ômicas em modelos de escala genômica
Reações Químicas e Bioquímicas
• Químicas: fase gás frequente. Altas temperaturas e pressões.• Bioquímicas: fase aquosa duluída. Temperatura ambiente.
• Características:• Químicas: Estequiometria simples. Cinética por ser baseada em
mecanismos detalhados. Transferência de calor e massa são importantes.
• Bioquímicas: Estequiometria complexa que muda com as condições ambientais. Cinética ainda crua. Transferência de calor e massa são raramente importantes.
A célula é o biorreator e a reção é autocatalítica.
Estequiometria
• Síntese de Metanol: CH4 + H2O → CO + 3 H2
2 H2 + CO → CH3OH
Fermentação com leveduras:CH2O + 0.0164 NH3 → 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.077 CH8/3O
+ 0.137 CH1.74O0.60N0.12 + 0.037 H2OCH2O = ”glicose” (1 C-atom)CH3O1/2 = etanol (1 C-atom)CH8/3O = glicerol (1 C-atom)CH1.74O0.60N0.12 = ”biomassa” (1 C-atom)
A estequiometria muda com T, pH, pO2, cNH3, cCH2O etc.
Mas mesmo………...a estequiometria das biorreações pode ser modelada
A conversão de glicose a biomassa, etanol e glicerol pode ser expressa como três caminhos metabólicos:
v1 = -1.12 CH2O + 0.12 CO2 + X + 0.15 NADH -1.80 ATP = 0v2 = - 3/2 CH2O + CH3O1/2 + ½ CO2 + ½ ATP = 0v3 = - CH2O + CH8/3O – 1/3 NADH – 1/3 ATP = 0
Quando os balanços redox (NADH) e energético (ATP) fecham, obtém-se a estequiometria experimental.
Processo de produção de solventes usando Clostridium acetobutylicum
Glucose
BuOH
acn
HBu
AcetoAcCoA
AcCoA
PYRv1
v3
v7
v8
v12v11
CH2O0.5N0.25
v2
CO2
BuCoAv10
CO2
HLacv4
CO2
NADH H2
HAcv6
EtOH
v5
v9 ac
CO2
HBu BuCoA
v13
A rede tem 13 fluxos e 4 nós internos: com um balanço de NADH e outro de ATP, 7 taxas podem ser mensuradas para determinar v1- v13
Rede Estequiométrica com ”caminhos diretos”
Cinética
• Expressões muito simples podem ser usadas:
Estado Estacionário (ou crescimento balanceado):qx = Ypx qp = Ysx qs (kg m-3 h-1) = x rxrx = k cs (Ks + cs)-1 (kg (kg X)-1 h)-1.
Mudanças rápidas no ambiente:Falta de conhecimento do sistema regulatório da célula inibe qualquer
construção de uma cinética geral (com base mecanicística).Pedaços da rede de reações podem ser modelados.
Exceto pela estequiometria ………..
• …….. projeto dos bioprocessos não é muito diferente daqueles relacionados aos processos químicos convencionais.
• O conceito da Análise de Fluxo Metabólico (MFA) é útil para estudar as interações entre os diferentes caminhos
metabólicos e quantificar as distribuições de fluxo em torno do pontos de bifurcação…
• … não possibilita medidas quantitativas do controle do fluxo metabólico!!!
• O controle do fluxo metabólico é importante para:• (i) balancear a taxa de síntese e conversão dos metabólitos
face a uma dada condição ambiental não permitindo um aumento ou uma queda catastrófica nas concentrações intracelulares destes compostos
• (ii) modificação racional dos fluxos metabólicos
•Mecanismos moleculares que possuem papel importante no controle do fluxo metabólico (1950’s): Inibição por feed-back Cooperatividade enzimática Modificações enzimáticas por ligação covalente Controle da síntese enzimática
Controle metabólico normalmente é descrito de forma qualitativa, i.e.:
“… fosfofrutoquinase é a enzima que controla a maior parte do fluxo glicólitico nos músculos.”
ou
“o primeiro passo de uma caminho metabólico é a taxa cinética limitante.”
Não necessariamente correto!!!
Regulação da Atividade Enzimática
Controle da Disponibilidade Enzimática:A quantidade de uma dada enzima na célula depende da sua taxa de síntese e da sua taxa de degradação
Controle da Atividade Enzimática:A atividade catalítica de uma enzima pode ser diretamente regulada por meio de alterações conformacionais ou estruturais
Aspartato transcarbamoilase (ATCase)
H2N – CO – OPO3-2 + -OCO – CH2 – CH – COO- ATCase -OCO – CH2 – CH – COO-
NH3+ NH
carbamoil fosfato aspartato H2N – CO
+ H2PO4-
ligação cooperativa homotrópica positiva para ambos os substratosheterotropicamente inibida pela cistidina trifosfato (CTP)heterotropicamente ativado pela adenosina trifosfato (ATP)
Mudanças conformacionais na ATCase
Enzimas Alostéricas e com Múltiplos Sítios Ativos
A presença do substrato em um dos sítios influencia:- a ligação do substrato aos demais sítios vazios - a taxa de formação de produto nos sítios ocupados
O próprio substrato atua como um modificadorou um efetor
Ativação (incluindo respostas sigmoidais de v verus [S]) ou Inibição
Sítios não-cooperativos
E + S KS ES K
P E + P + + S S
KS KS
E + P KP SE + S KS SES K
P SE + P
KP
ES + P
2S
2
S
2S
2
S
MAX
K]S[
K]S[21
K]S[
K]S[
Vv
++
+
=tPMAX ]E[K2V =
KS - constante de dissociação intrínseca
Constante de dissociação intrínseca
constante de um sítio isolado, ou seja, a constante cinética de um sítio desconsiderando sua associação com os demais sítios da mesma
molécula enzimática
descreve o equilíbrio entre o substrato livre, o sítio ativo livre e o complexo sítio-substrato
descreve o equilíbrio entre o substrato livre, enzima disponível e o complexo enzima-substrato
Constante de dissociação efetiva
Ligações cooperativas
Se a ligação de uma molécula de substrato induz a mudanças estruturais ou eletrônicas que resultam em
alterações nas afinidades dos sítios vazios
a curva de velocidade não seguirá mais o modelo cinético de Henri-Michaelis-Menten
Enzima Alostérica(curvas de velocidade sigmoidais)
Aumento das afinidades dos sítios vazios de ligação:
ligação cooperativa ou cooperatividade positiva com respeito a ligação do substrato, ou resposta homotrópica
positiva
Interações entre substrato e inibidor ou substrato e ativador:
respostas heterotróficas positivas (ativador) ou negativas (inibidor)
Resposta sigmoidal à variação do substrato
proporciona um maior controle da taxa de reação pelas variações na concentração de substrato
Modelos de Interação Seqüencial
assumem mudanças seqüenciais ou progressivas nas afinidades dos sítios vazios a serem ocupados
Modelos de Simetria Orquestrada
a enzima pré-existe como uma mistura em equilíbrio de oligômeros de alta afinidade e oligômeros de baixa afinidade
Distribuição das espécies enzimáticas
enzima com 4 sítios catalíticos idênticos e sem cooperatividade
enzima com 4 sítios catalíticos onde a ligação de cada molécula de substrato aumenta as constantes de ligação dos sítios vazios
isocitrato desidrogenase -NAD dependente (leveduras)
Equação de Hill
n
n
MAX ]S['K]S[
Vv
+=
n = número de sítios de ligação ao substrato por molécula de enzimaK’ = KS
n (an-1bn-2cn-3...z1) = constante envolvendo os fatores de interação (a, b, c, ... z) e a constante de ligação intrínseca
2n
1nMAX
)]S['K(]S[V'Kn
]S[ddv
+=
−
d2v / d[S]2 = 0 - ponto de inflexão
Modelo Genérico de Interação Seqüencial de Koshland-
Nemethy-FilmerE ES ou SE SES
+ S S + S S S
A2 BSA ou ABS B2S2
Modelos tetraédricos:
Modelos lineares:
Modelos quadráticos:
Modelo de Geometria Orquestrada
(Monod, Wyman e Changeux)
T representa a conformação de baixa afinidade em equilíbrio com R a forma da enzima de alta afinidade
Modelos Híbridos
primeira coluna -modelo de simetria orquestrada
quarta coluna -modelo de interação seqüencial