THÈSE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

Délivrée par : l’Université Toulouse III - Paul Sabatier

Présentée et soutenue par Naceur DJEBALI Le 25 novembre 2008

Etude des mécanismes de résistance de la plante

modèle Medicago truncatula vis-à-vis de deux agents pathogènes majeurs des légumineuses cultivées :

Phoma medicaginis et Aphanomyces euteiches

JURY C. ROUX Professeur, UPS, Toulouse Président B. TIVOLI Ingénieur de Recherche, INRA, Rennes Rapporteur M.R. HAJLAOUI Directeur de Recherche, INRAT, Tunis Rapporteur F. LIMAM Professeur, CBBC, Borj-Cedria Examinateur M.E. AOUANI Professeur, CBBC, Borj-Cedria Directeur de thèse C. JACQUET Maître de Conférences, UPS, Toulouse Directeur de thèse

Ecole Doctorale Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques, et Bioingénieries UMR5546 CNRS-UPS, 24 chemin de Borde-Rouge BP 42617 Auzeville, 31326 Castanet-Tolosan, France.

A ma mère Saida A mon père Tahar

A mon épouse Itaf A mon petit Yassoufa

REMERCIEMENTS

Les travaux présentés dans ce mémoire ont été faits dans le cadre d’une thèse en co-tutelle

entre l’Université Tunis-El Manar- Faculté des Sciences de Tunis et l’Université Toulouse III-

Paul Sabatier. Les travaux de recherche ont été faits dans le laboratoire Interactions

Légumineuses Microorganismes au Centre de Biotechnologie de Borj-Cedria et dans l’équipe

Interaction Plantes Microorganismes « effecteurs microbiens et immunité chez les végétaux »

à l’UMR5546 CNRS-UPS Castanet-Tolosan. Ce travail a été financé en partie dans les cadres

du projet européen FP6 « Grain Legume » et du projet bilatéral franco-tunisien «CMCU

07G/0907».

Je remercie Monsieur le Professeur Mohamed Elarbi Aouani de m’avoir encadré et

encouragé tout au long de cette thèse.

Je remercie également mon directeur de thèse Christophe Jacquet, pour son encadrement,

ses discussions toujours très enrichissantes et pour son effort et sa patience lors de la

correction du manuscrit.

Je remercie Madame le Professeur Marie-Thérèse Esquerré-Tugayé de m’avoir témoigné

tout au long de ces années d’une grande confiance.

Je remercie Monsieur Bernard Dumas de m’avoir accueillie au sein de son équipe.

Je remercie tout particulièrement Messieurs Alain Jauneau et Yves Martinez,

responsables de la plateforme de microscopie au sein de l’UMR5546, pour leur aide et leurs

conseils dans les différentes manipulations en microscopie.

Je remercie aussi Monsieur Claude Lafitte pour son aide dans les dosages biochimiques.

Je voudrais également remercier les membres de jury Messieurs Christophe Roux,

Bernard Tivoli, Férid Limam et Mohamed Rabeh Hajlaoui, pour avoir accepté d’évaluer ce

travail.

Je remercie également l’ensemble des membres de l’équipe de LILM et de l’IPM pour

avoir su instaurer une ambiance chaleureuse au cours de ces années.

RESUME

Afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux microorganismes fongiques

chez les légumineuses, deux pathosystèmes ont été développés avec la légumineuse modèle

Medicago truncatula (Mt) d’une part, Phoma medicaginis (Pm), responsable de la maladie de

la tige noire de la luzerne et Aphanomyces euteiches (Ae), agent de pourriture racinaire du

pois, d’autre part. Après avoir récolté et identifié plusieurs isolats fongiques répartis sur le

territoire tunisien, une souche de Pm retenue pour son agressivité, a été inoculée à deux

lignées de Mt, sélectionnées pour leurs réponses différentielles à Pm. L’étude de la présence

et de la régulation d’H2O2 au cours de l’infection dans ces deux lignées a révélé i) une

accumulation plus rapide et plus forte de ce composé dans les cellules épidermiques de

DZA45.5 (lignée peu sensible à Pm), ii) une activité basale de peroxydase trois fois plus

élevée dans cette même lignée que dans la lignée F83005.5 (très sensible). Ces résultats

indiquent donc un rôle potentiel des espèces actives de l’oxygène dans le contrôle du

développement de Pm chez DZA45.5. Dans le pathosystème Mt –Ae, F83005.5 (sensible) et

A17 (partiellement résistante) ont été sélectionnées pour effectuer des analyses cytologiques

et génétiques. L’observation de coupes racinaires a montré que la résistance partielle d’A17

est associée à une protection du cylindre central contre l’invasion du parasite. Cette protection

est assurée par des divisions des cellules du péricycle, une accumulation de lignine sur les

parois de ces mêmes cellules et une induction de la synthèse de composés phénoliques dans

les racines d’A17. L’analyse du déterminisme génétique de la résistance à Ae en utilisant la

population de RILs (A17 x F83005.5) a permis d’identifier un QTL majeur (Ae1) en haut du

chromosome 3. Son rôle clé dans la résistance conférée à A17 a été formellement établi à

l’aide de lignées quasi isogéniques ne différant que dans la région d’Ae1. Des analyses de

cartographie fine du QTL ont permis de réduire ce dernier à une région physique du génome

d’une taille de 95Kb. Les annotations de ce fragment ont montré une sur représentativité de

gènes codant des fonctions associées au protéasome, dont certains sont seulement induits chez

A17. Les outils et résultats obtenus dans cette thèse ouvre donc la voie au clonage du (des)

gène(s) impliqués dans la résistance partielle à Ae.

ABSTRACT

To gain insights into resistance mechanisms in legumes against fungal-like

microorganisms, two pathosystems were developed with the model legume Medicago

truncatula (Mt) on one side, P. medicaginis (Pm), responsible for black stem alfalfa disease

and A. euteiches (Ae), the causal agent of pea root rot disease, on the other side. Several

fungal isolates were collected across Tunisia and thereafter identified. One Pm isolate,

selected for its high aggressiveness, was inoculated on two Mt lines that displayed contrasted

responses to Pm. Analysis of H2O2 accumulation and regulation in these two lines showed

that this compound is more rapidly and strongly produced in DZA45.5 epidermal cells. This

line has also a more elevated basal peroxidase activity than F83005.5 (the most susceptible

line). These results indicated that reactive oxygen species might play a role in DZA45.5 to

control the disease extent. In the Mt-Ae pathosystem, A17 (partially resistant) and F83005.5

(susceptible) were selected for further cytological and genetic analyses. Microscopy analyses

of root sections revealed that A17 partial resistance to Ae was linked to the protection of the

central cylinder. Pericycle cell divisions, lignin deposition around the pericycle and

accumulation of soluble phenolic compounds were found to be involved in A17 stele

protection. Genetic analyses of resistance were performed with the RIL population (A17 x

F83005.5) and identify one major QTL, named Ae1, on the top of chromosome 3.

Phenotyping results of nearly isogenic lines (NIL) confirmed the key role of this QTL in Mt

partial resistance. Fine mapping allowed the identification of a 95kb sequenced genomic DNA

region, rich in proteasome-related genes. Some of these genes were shown to be differentially

induced only in inoculated A17 line. Results and genetic tools developed during this work

will now be used to clone gene(s) involved in partial resistance to Ae.

LISTE DES ABREVIATIONS % pourcent ×g accélération de la pesanteur °C degrés Celsius µ micro A560 longueur d’onde 560 nm ADN acide désoxyribonucléique ADNc ADN complémentaire Agarose LMP agarose Low melting point APX ascorbate peroxydase ARN acide ribonucléique ARNm acide ribonuléique messager ASC acide ascorbique Avr gène d’avirulence BET ethidium bromide BSA bovine serum albumin CAD cinnamyl alcohol dehydrogenase CAO copper amine oxidase) CAT catalase CBD cellulose binding domain CBEL cellulose Binding, Elicitor and Lectin CC coiled-coil CCR cinnamoyl-CoA reductase CDPK calcium-dependent protein kinase cm centimètre CMA corn meal agar CNL CC-NB-LRR COMT caffeic acid 3-O-methyltransferase cv. cultivar DAB 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride DAsA déhydroascorbate DEPC diéthyl polycarbonate DMSO dimythysulfoxide DNase désoxyribonucléase dNTP désoxyribonucléotide 5’-triphosphate DO densité optique dpi jours après inoculation DTT dithiothréitol dTTP dioxythimydinetriphosphate E1 ubiquitin-activating enzyme E2 ubiquitin-conjugating enzyme E3 ubiquitin–protein ligase EDTA ethylenediaminetetraacetic acid eLRR extracellular LRR domain EST expressed sequence tag ET éthylène ETI effector triggered immunity f.sp. forma specialis

F1 hybride F2 2ème génération F7 7ème génération F-box domaine protéique conservé de 40 à 50 acides aminés FITC Fluorescéine IsoThioCyanate g gramme GR glutathion réductase GSH glutathion h heure H2O2 peroxyde d’hydrogène H2SO4 acide sulfurique concentré HO● radical hydroxyle HR réaction hypersensible HRGP hydroxyproline rich glycoprotein IOMT isoflavone O-methyltransferase JA acide jasmonique kb kilobase(s) kDa kiloDalton(s) l litre LAR local acquired resistance LOX lipoxygénase LRR leucine-rich repeats M molaire m milli m/m masse par masse m/v masse par volume m/v masse par volume MAPK mitogen-activated protein kinase MDHA monodéhydroascorbate MeJA méthyljasmonate min minute(s) n nano N normalité NAD(P)H nicotinamide dinucléotide phosphate NB nucleotide binding domain NBT nitro-blue tetrazolium ng nanogramme NIL Lignée quasi-isogénique NO monoxyde d’azote NOS NO synthase Ø diamètre O2

•- anion superoxyde ORF open reading frame PAL phenylalanine ammonia-lyase PAMP pathogen-associated molecular pattern pb paire de base PCR réaction de polymérisation en chaîne PDMAB Paradimethylaminobenzaldehyde pH logarithme décimal négatif de la concentration de H+ PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride

POX guaïacol peroxydase PR pathogenesis related PTI PAMP Triggered Immunity PVPP polyvinylpolypyrolidone q-PCR PCR quantitative QTL quantitative trait loci R gène de résistance RIL lignée recombinante RING finger really interesting new gene; a zinc-binding domain RLK receptor like kinase RLP receptor like protein ROS espèces réactives d’oxygène rpm tour par minute RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction RXLR motif protéique conservé (Arg-aa-Leu-Arg) SA acide salicylique SAR systemic acquired resistance SCF Skp1–cullin–F-box SDS sodium dodecyl sulphate sec seconde(s) SOD superoxide dismutase TBE tris borate EDTA TIR Toll Interleukine-Receptor TNL TIR-NB-LRR Tris tris (hydroxyméthyl)-aminométhane U unité UHQ ultra haute qualité UV ultraviolet V Volt v/v volume par volume WGA wheat germ agglutinin

LISTE DES FIGURES Introduction 1 Figure IN.1: Illustration des différents types d’interactions plante – parasite reliées aux

déterminants de la reconnaissance du parasite et à la nature des défenses mise en jeu pour chacune d’entre elle (d’après Hammond-Kosack et Kanyuka 2007).

Figure IN.2: Représentation schématique des différentes classes des protéines R (d’après van Ooijen 2007).

Figure IN.3: Interaction entre haustorium de Phytophtora infestans et une cellule de pomme de terre (d’après Birch et al. 2006).

Figure IN.4: Hypothèse d’interactions du modèle de garde (d’après Bonas et Lahaye 2002). Figure IN.5 : Les protéines kinases impliquées dans la signalisation de défenses des plantes

(d’après Romeis 2001) Figure IN.6: Sources et fonctions des ROS chez les plantes suite à l’infection par des agents

pathogènes (d’après Torres et al. 2006). Figure IN.7 : Interconnexions entre les voies de signalisation de l’éthylène (ET), de l’acide

jasmonique (JA) et de l’acide salicylique (SA) chez Arabidopsis thaliana (d’après Kunkel et Brooks 2002).

Figure IN.8: Mécanisme de protéolyse ubiquitine 26S/protéasome dépendante (d’après Viersta 2003).

Figure IN.9: Les différents complexes de l’enzyme de liaison de l’ubiquitine E3 intervenant dans le processus d’ubiquitination (d’après Delauré et al. 2008).

Figure IN.10: Organisation et structure du protéasome 26S (d’après Vierstra 2003) Figure IN.11: Symptômes d’attaque de Phoma medicaginis sur Medicago (d’après Tivoli et

al. 2006). Figure IN.12: Symptôme d’attaque d’A. euteiches sur racine de pois (A) et au champs (B).

Noter le brunissement sur racine et le jaunissement des feuilles (d’après INRA Rennes). Figure IN.13: Cycle de développement d’A. euteiches (d’après Gaulin et al. 2007). Figure IN.14: Localisation des QTLs de résistance à A. euteiches sur la carte génétique du

pois (Pisum sativum L.) (d’après Pilet-Nayel et al. 2007). Matériel et méthodes 56 Figure MM.1: Croisements établis avec les lignées de M. truncatula dans les laboratoires à

Tunis (ME. Aouani), Toulouse (T. Huguet), Montpellier (JM. Prosperi) et Rennnes (ML. Pilet-Nayel).

Figure MM.2: Carte de distribution des sites de collecte des plantes infectées de Medicago truncatula en Tunisie.

Figure MM.3: Echelle de notation des symptômes d’infection de Phoma medicaginis sur feuilles détachées de Medicago truncatula.

Figure MM.4: Méthode d’analyse des photos des coupes racinaires par Image-Pro Plus. Figure MM.5: génétique de Medicago truncatula établie sur la base de 140 lignées

recombinantes en F7 du croisement LR5 (F83005.5 x A17) avec 86 marqueurs microsatellites reparties sur les 8 groupes de liaisons. Carte établie dans l’équipe de T. Huguet (donnés non publiées).

Chapitre I 83 Figure I.1: Symptômes et structures fructifères des plus importants champignons attaquant

les Medicago annuelles en Tunisie. Figure I.2: Diversité pathologique des isolats de Phoma medicaginis. Figure I.3: Test d’inoculation racinaire et variations d’agressivité des isolats de Phoma

medicaginis sur racines de la lignée F83005.5 de M. truncatula. Chapitre II 93 Figure 1: Phoma medicaginis symptom development on four Medicago truncatula lines:

DZA45.5, A20, TN9.22 and F83005.5. Figure 2: Microscopic analysis of detached leaves from Medicago truncatula lines DZA45.5

and F83005.5 inoculated with Phoma medicaginis. Figure 3: Levels of peroxidase activity in non-infected and Phoma medicaginis-infected

leaves of Medicago truncatula lines DZA45.5 and F83005.5. Figure 4: Levels of superoxide dismutase activity in non-infected and Phoma medicaginis

infected leaves of Medicago truncatula lines DZA45.5 and F83005.5. Chapitre III 103 Figure III.1: Résultats d’inoculation à 15 dpi (A) et 21 dpi (B) de 3 souches d’A. euteiches

sur 3 lignées de M. truncatula. Figure III.2: Evaluation de la résistance de quelques lignées de M. truncatula inoculées par la

souche Ae-all d’A. euteiches. Figure III.3: Symptômes d’attaque d’A. euteiches sur deux lignées de M. truncatula à 21 dpi. Figure III.4: Observations microscopiques de la distribution des oospores de A. euteiches

dans les racines des deux lignées de M. truncatula détectées par coloration à l’encre bleue.

Figure III.5: Comparaison de l’infection d’A. euteiches dans les racines des lignées de M. truncatula F83005.5 et A17.

Figure III.6: Observations sous microscope optique de coupes de racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 avant (témoin) et après inoculation par A. euteiches.

Figure III.7: Détection de dépôt de lignine par coloration au phloroglucinol sur racines de deux lignées A17 et F83005.5 de M. truncatula à différent temps de l’inoculation par A. euteiches.

Figure III.8: Détection de l’activité peroxydase dans les racines de deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps de l’inoculation par A. euteiches.

Figure III.9: Détection de H2O2 dans les racines de deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps de l’inoculation par A. euteiches.

Figure III.10: Dosage des composés phénoliques solubles (A) et liés à la paroi (B) dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

Figure III.11: Dosage de la lignine dans les dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

Figure III.12: Dosage de l’hydroxyproline dans les dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

Figure III.13: Activités enzymatiques de 4 enzymes antioxydantes (la gaïacol peroxydase (A), l’ascorbate peroxydase (B), la superoxyde dismustase (C) et la catalase (D)) dans

les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 inoculées par A. euteiches.

Figure III.14: Evaluation de la concentration du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par dosage dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 inoculées ou non par A. euteiches.

Figure III.15: Synthèse des dosages biochimiques faits sur les racines de A17 et F83005.5 à 1, 3 et 6 jours après inoculation (dpi) par A. euteiches (Ae).

Chapitre IV 128 Figure IV.1: Comparaison des Phénotypes des lignées parentales A17 (résistante) et

F83005.5 (sensible) et de l’hybride F1 à 15 et 21 jours après inoculation d’A. euteiches. Figure IV.2: Distribution des RILs selon le paramètre « pourcentage de symptôme sur tige à

15 dpi ». Figure IV.3: Analyse en composantes principales des paramètres phénotypiques et de la

fluorescence racinaire de lignées transgressives de M. truncatula à 15 et 21 jours après inoculation par A. euteiches.

Figure IV.4: Stratégie adoptée pour la cartographie fine du QTL de résistance à A. euteiches chez M. truncatula.

Figure IV.5: Validation de Ae1 comme QTL de résistance avec des lignées quasi-isogéniques (NILs).

Figure IV.6: (A) phénotype et (B) Génotype des lignées LR5 de M. truncatula présentant un crossing-over dans la région du QTL de résistance à A. euteiches.

Figure IV.7: Recherche de nouveaux recombinants entre les marqueurs mtic742 et mtic1149. Figure IV.8: Phénotype de la lignée 600 (issue de l’autofécondation de la lignée 05F) et des

deux lignées parentales A17 et F83005.5 de M. truncatula 21 jours après inoculation par A. euteiches.

Figure IV.9: Cartographie fine du QTL de résistance à A. euteiches chez M. truncatula. Figure IV.10: Génotype de la lignée 05F-600F9 issue de l’autofécondation de la lignée 05F

qui présente un crossing-over dans la région du QTL de résistance entre les marqueurs mtic742 et mtic1209.

Figure IV.11: Etude de l’expression de quelques gènes sélectionnés situés dans le QTL de résistance à A. euteiches chez deux lignées de M. truncatula, A17 et F83005.5.

LISTE DES TABLEAUX

Introduction 1 Tableau IN.1: Exemples d’éliciteurs généraux et spécifiques décrits dans les réactions de

défense des plantes (d’après Montesano et al. 2003). Tableau IN.2: Les classes majeures des gènes de résistance clonés (d’après Hammond-

Kosack et Kanyuka 2007). Tableau IN.3 : Les effecteurs des oomycètes pathogènes (d’après Kamoun 2006). Tableau IN.4: Les différentes classes des protéines PR (d’après Van Loon et Van Strien,

1999). Tableau IN.5: Liste de quelques études montrant la variabilité des systèmes utilisés pour

comprendre la régulation du système antioxydant dans l’interaction plantes- parasites. Tableau IN.6: Résumé des études illustrant la variabilité naturelle de réponse de M. truncatula aux agents pathogènes de légumineuses. Matériel et méthodes 56 Tableau MM.1: Programme PCR utilisé pour l’amplification de fragments d’ADN. Tableau MM.2: Milieu réactionnel et étapes de la RT-PCR selon le protocole de la

SuperScriptIII Tableau MM.3: Séquence des amorces des gènes étudiés en q-PCR Tableau MM.4: composition du milieu réactionnel pour la q-PCR Tableau MM.5: Paramètres de notation des symptômes d’attaque de Apahnomyces euteiches

sur racines de Medicago truncatula. Tableau MM.6: Séquence des amorces des marqueurs microsatellites utilisées pour le

génotypage des lignées de M. truncatula ayant un crossing-over dans la région du QTL de résistance à A. euteiches.

Chapitre I 83 Tableau I.1: Champignons identifiés sur feuilles de trois espèces annuelles de Medicago en

Tunisie. Chapitre IV 128 Tableau IV.1: Valeurs de l’héritabilité (h²) des paramètres calculés après phénotypage de la

population LR5. Tableau IV.2: Corrélations entre les paramètres phénotypiques. Tableau IV.3 : Cœfficients de corrélation entre différentes valeurs de fluorescence et les

principaux symptômes pour les RILs LR5 à 6 jours après inoculation par A. euteiches. Tableau IV.4: Paramètres biométriques des QTLs de résistance identifiés à partir des

symptômes mesurés. Tableau IV.5: Contenu en gènes de la région d’Ae1 selon l’annotation IMGAG V2.0. Annexes 185 Annexe IV.1 : Corrélation entre les donnés phénotypiques et celles de fluorescence racinaire

chez les RILs LR5 à 6 jours après inoculation par A. euteiches.

SOMMAIRE

Remerciements Résumé Abstract Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux

Introduction 1

1. La reconnaissance de l’agent pathogene 3 1.1. Reconnaissance non-spécifique 3 1.2. Reconnaissance spécifique et concept gène-pour-gène 6 2. La transduction des signaux 15 2.1. Les signaux précoces 15 2.2. Les signaux secondaires 20 3. Les mécanismes de défense chez les plantes 23 3.1. Renforcement de la paroi de la cellule 24 3.2. La synthèse de composés antimicrobiens 25 3.3. Système antioxydants 28

3.4 Régulation post-traductionel des mécanismes de défenses par adressage au proteasome 33

4. Medicago truncatula plante modele pour l’etude des interactions plante- microorganisme 38 4.1. Importance des légumineuses cultivées 38 4.2. Medicago truncatula plante modèle 40 5. Les maladies importantes sur légumineuses 43 5.1. Les maladies de la partie aérienne 43 5.2. Les maladies de la partie racinaire 48 6. Objectifs de la thèse 55

Matériel et Méthodes 56

1. Matériel biologique 56 1.1. Medicago truncatula 59 1.2. Les agents pathogènes 61 2. Systèmes d’inoculations et méthodes de notations 61 2.1. Inoculation de Phoma medicaginis 63 2.2. Inoculation d’ Aphanomyces euteiches et notation des symptômes 64 3. Les analyses cytologiques 64 3.1. Temps d’analyse 64 3.2. Préparation des échantillons 64 3.3. Colorations et marquages 65 3.4. Microscopie et acquisition des photos 67 3.5. Analyse des images par le logiciel ImagePRO Plus 67 4. Méthodes d’analyses biochimiques 68 4.1. Dosage des composés phénoliques solubles et liés à la paroi 68 4.2. Extraction des composés phénoliques pariétaux 69 4.3. Dosage des HRGP 69

4.4. Extraction des parois et dosage des lignines 70 4.5. Dosage des enzymes antioxydantes 71 4.6. Dosage du peroxyde d’hydrogène 72 5. Méthodes d’analyse moléculaire 72 5.1. Méthodes relatives à l’ADN génomique 72 5.2. Méthodes relatives à l’ARN 74 5.3. Méthodes relatives à l’ADNc 75 6. Analyse génétique de la résistance à A. euteiches 78 6.1. Outils de base 78 6.2. Phénotypage des lignées recombinantes 80 6.3. Génotypage de la descendance des lignées hétérozygotes dans le QTL 80 6.4. Méthodes bioinformatiques 81 7. Analyses statistiques 82 7.1. Comparaison des moyennes 82 7.2. Méthodes de détection du QTL 82

Chapitre I: Recensement des maladies cryptogamiques attaquant trois espèces de Medicago annuelles en Tunisie 83

1. Champignons identifiés 83 1.1. Les espèces biotrophes et hémibiotrophes 87 1.2. Les espèces nécrotrophes 87 2. Diversité pathologique de Phoma medicaginis 88 3. Conclusion 92

Chapitre II: Etablissement du pathosystème Medicago truncatula – Phoma medicaginis et mise en évidence de mécanismes de défense liés au stress oxydant 93

1. Involvement of Hydrogen Peroxide, Peroxidase and Superoxide Dismutase in Response of Medicago truncatula Lines Differing in Susceptibility to Phoma medicaginis Infection. 94 1.1. Microscopic analysis of early stages of the infection process of P. medicaginis 96 1.2. Detection of H2O2 in P. medicaginis-inoculated detached leaves of M. truncatula 96 1.3. Antioxidant enzyme activities 97 2. Conclusion 102

Chapitre III: Etude des mécanismes de résistance chez Medicago truncatula contre Aphanomyces euteiches 103

1. Recherche d’interactions différentielles 103 1.1. Caractérisation pathologique des souches de A. euteiches 103 1.2. Comportement des lignées de M. truncatula après inoculation par A. euteiches 105 1.3. Validation du pathosystème 107 2. Développement de A. euteiches dans les racines de M. truncatula 108 3. Analyse des mécanismes de résistance de M. truncatula à A. euteiches 111 3.1. Analyses microscopiques 111 3.2. Analyses biochimiques 119 4. Conclusion 125

Chapitre IV: Etude génétique de la résistance à Aphanomyces euteiches chez Medicago truncatula 128

1. Analyse génétique de résistance à A. euteiches 129 1.1. Outils génétiques utilisés 129 1.2. Phénotypage de la F1 et de la population de lignées recombinantes 129 2. Etude de la corrélation entre résistance et production des composées aromatiques fluorescents 133 3. Identification et localisation d’un QTL majeur de résistance 134 4. Validation et cartographie fine d’Ae1 135 4.1. Validation d’Ae1 avec des lignées quasi-isogénique 136 4.2 Réduction de la taille d’Ae1 138 4.3. Recherche de nouveaux recombinants 140 5. Recherche de nouveaux marqueurs et réduction d’Ae1 140 6. Identification des gènes candidats et analyse de leur expression 144 6.1. Analyse bioinformatique des BACs candidats 144 6.2. Etude de l’expression des gènes candidats dans le QTL de résistance 146 7. Conclusion 150

Conclusion générale 152 Références bibliographiques 160 Annexes 185 Liste des activités scientifiques effectuées au cours de la thèse 189

1

INTRODUCTION GENERALE

Au champ, plantes et microorganismes pathogènes sont constamment en contact.

Cependant, le développement de la maladie reste plutôt rare. Les barrières physiques et

chimiques tels que la cuticule, la paroi cellulaire et les composés antimicrobiens produits

constitutivement protégent la plante contre la majorité des tentatives d’intrusion des microbes:

on parle de défenses préformées qui constituent un des mécanismes de la résistance non hôte

(figure IN.1). Dans le cas où un agent pathogène est capable de passer ces barrières on

distingue deux types d’interactions selon la réponse de la plante. Soit elle arrête le parasite

après sa reconnaissance et on aura une interaction incompatible, la plante est dite résistante;

soit le développement du parasite s’effectue et on a une interaction compatible, la plante est

alors sensible (figure IN.1). Dans le cas d’une interaction incompatible, la résistance est liée à

la reconnaissance du parasite par le système d’immunité innée des plantes (Jones et Dangl

2006). On distingue alors deux classes de résistance induite (i) la résistance non hôte liée à la

détection de motifs conservés chez l’ensemble des microorganismes appelés PAMPs

(Nürnberger et Brunner 2002), (ii) la résistance hôte associée à une détection spécifique de

certaines molécules issues du parasite, protéines d’avirulence (Avr), par des protéines de

résistance (R) des plantes. C’est ce dernier type d’interaction qui a donné naissance, au milieu

du siècle dernier au concept gène-pour-gène, développé par Flor (1955).

Dans le cas d’une interaction compatible, on distingue différents niveaux de sensibilité.

Dans tous les cas le parasite est capable d’effectuer son cycle biologique. Dans une plante

sensible, le développement du parasite se traduira par l’apparition rapide de symptômes qui

conduiront éventuellement à la mort de la plante. Dans d’autres cas d’interaction compatible,

on observe une réduction du développement du parasite ou un retard dans l’apparition de ses

structures de reproduction. Cela se traduira pour la plante par une diminution de l’intensité

des symptômes comparés à ceux observés chez un génotype sensible. On parlera alors de

tolérance ou de résistance partielle.

Dans le cas d’une interaction incompatible hôte, la résistance chez les plantes est

génétiquement contrôlée par une reconnaissance spécifique entre les gènes de résistance chez

les plantes (R) et les gènes d’avirulence (Avr) chez le parasite selon le concept gène-pour-

gène. Il a été aussi postulé que les produits des gènes R agissent comme des récepteurs pour

les protéines Avr (Keen et Dawson 1992), cette interaction moléculaire conduisant à une

cascade de signalisation qui mène à l’activation des réponses de défense chez la plante.

Cependant, pour plusieurs couples protéiques R-Avr une interaction directe n’a pas été

2

Figure IN.1: Illustration des différents types d’interactions plante – parasite reliées aux déterminants de la reconnaissance du parasite et à la nature des défenses mise en jeu pour chacune d’entre elle (d’après Hammond-Kosack et Kanyuka 2007).

montrée, et pour le moment, ce modèle est restreint à quelques interactions (Jia et al. 2000 ;

Leister and Katagiri 2000). Sur la base de l’observation que plusieurs protéines Avr ont un

rôle dans la virulence du parasite, particulièrement chez les plantes qui n’expriment pas les

gènes R correspondants, le «modèle de garde» a été proposé pour expliquer le fonctionnement

des gènes R. Ce modèle conçoit les protéines Avr comme des effecteurs qui interagissent avec

des protéines cible de la plante pour manipuler ses processus physiologiques en faveur du

parasite et inhiber ses défenses basales. Dans ce dernier modèle les protéines R constituent

des gardiens qui reconnaissent les complexes protéine cible Avr. Cette reconnaissance peut

initier les mécanismes de défense de la plante (Dangl et Jones, 2001 ; McDowell et

Woffenden 2003 ; Nimchuk et al. 2003 ; Jones et Dangl 2006). Le déclenchement de la

résistance chez les plantes n’est pas toujours dû à des protéines Avr spécifiques qui

déclenchent les réponses de défense des plantes ayant les gènes R correspondants, mais plutôt

l’œuvre d’éliciteurs généraux capables d’activer les défenses de différents cultivars de la

même ou de différentes espèces végétales (García-Brugger et al. 2006). Des rapports récents

ont montré que ces 2 types de reconnaissance (spécifique et non spécifique) étaient liés entre

3

eux et constituent deux branches du système d’immunité inné chez les plantes (Dangl and

McDowell 2006; Jones et Dangl 2006).

Trois étapes caractérisent l’interaction entre une plante et un agent pathogène. La

première étape est celle de la reconnaissance du parasite. Dans le cas d’une interaction

incompatible hôte ou non hôte elle conduit le plus souvent à la mort programmée des

cellules attaquées caractéristique d’une réaction hypersensible (HR). La deuxième étape est

l’activation de cascades de signaux appelée transduction du signal. Au cours de la dernière

étape de l’interaction entre les deux adversaires, il y a activation des gènes de défense et la

synthèse de plusieurs protéines et autres molécules de défense qui créent un environnement

défavorable à l’invasion du parasite. Les signaux émis lors de la deuxième étape peuvent

s’étendre par la suite aux cellules adjacentes conduisant à une résistance locale acquise

(LAR: local acquired resistance) puis gagner l’ensemble de la plante empêchant ainsi

d’éventuelles infections secondaires, on parle alors de résistance systémique acquise (SAR:

Systemic acquired resistance) (Durrant et Dangl 2004). Dans cette partie bibliographique, ces

trois étapes vont être détaillées pour une meilleure appréhension des mécanismes induits lors

de l’attaque d’une plante par un parasite.

1. La reconnaissance de l’agent pathogène

La reconnaissance des agents pathogènes chez les plantes fait intervenir deux types de

perception. Le premier type de reconnaissance «non race spécifique» met en jeu des

molécules appelées éliciteurs généraux, le deuxième qui est «race spécifique» a été décrit par

Flor en 1955, lors de l’énoncé du concept gène-pour-gène. Ces deux mécanismes de

reconnaissance constituent les deux branches du système d’immunité inné chez les plantes

(Jones et Dangl 2006).

1.1. Reconnaissance non-spécifique

La reconnaissance non-spécifique est médiée par des éliciteurs dits non spécifiques ou

généraux (tableau IN.1). Le terme éliciteur a été initialement utilisé pour décrire les molécules

capables d’induire la production des phytoalexines (Keen 1975), il est maintenant utilisé pour

l’ensemble des molécules qui induisent des réactions de défense chez les plantes (Montesano

et al. 2003). Ainsi d’après cette définition, les éliciteurs peuvent avoir une origine

microbienne (éliciteurs exogènes: constituant des surface ou molécules secrétées), ou bien

provenir de la dégradation de la paroi cellulaire végétale sous l’action des enzymes

4

Tableau IN.1: Exemples d’éliciteurs généraux et spécifiques décrits dans les réactions de défense des plantes (d’après Montesano et al. 2003). I = oligosaccharides ; II = peptides et protéines ; III = glycopeptides et glycoprotéines ; IV = glycolipides ; V = éliciteurs lipophiliques.

5

hyrdolytiques du parasite (éliciteurs endogènes) (Montesano et al. 2003 ; García-Brugger et

al. 2006). Les éliciteurs appartiennent à plusieurs familles chimiques: protéines,

glycoprotéines, glycanes, lipides et des molécules synthétiques (tableau IN.1). En 1997,

Medzhitov et Janeway pour formaliser la description des composants du système immunitaire

chez les mammifères ont établi un ensemble de définitions dont le terme PAMPs (Pathogen-

Associated Molecular Patterns) pour décrire des motifs présents sur les molécules d’origine

microbienne. Les composants sur lesquels on trouve des PAMPs sont souvent des molécules

indispensables à la pathogénécité et à la survie du parasite (McGuinness et al. 2003). On

trouve des PAMPs sur des molécules de différentes natures. Parmi les PAMPs de nature

polysaccharidique, il existe trois grands types (Shibuya et Minami 2001): les oligomères de ß-

glucanes qui sont communs aux parois végétales et fongiques, les oligomères de chitine ou de

chitosan présents dans les parois des champignons et enfin les oligogalacturonides des parois

végétales. Plusieurs PAMPs présents sur des composés protéiques ont été identifiés, la plus

connue d’entre eux est la flagelline qui est une protéine majeure constituant le flagelle des

bactéries. Cette protéine est reconnue par les plantes (Gomez-Gomez et Boller, 2002), les

celles animales (Hayashi et al. 2001) et la drosophile (Lemaitre et al. 1997). Le motif

responsable de l’activité élicitrice est formé d’un peptide de 22 acides aminés, flg22 (Zipfel et

al. 2004). Chez Arabidopsis, flg22 interagit avec un récepteur like-kinase (RLK) appelé FLS2

pour flagellin-sensing locus 2. Ce dernier est une protéine transmembranaire avec un domaine

protéine kinase intracellulaire et un domaine LRR extracellulaire (Gomez-Gomez et Boller,

2000). Le signal induit par la flagelline est transmit vers l’espace intracytoplasmique par

l’activation d’une cascade MAPK, formé par au moins trois protéines kinase interconnectées :

MAPKKK (ou MEKK), MAPKK (ou MEK) et MAPK (Asai et al. 2002). La flagelline induit

plusieurs réponses cellulaires dont, l’alcalinisation du milieu extracellulaire et la production

de l’ET chez la tomate et le riz (Felix et al. 1999 ; Che et al. 2000) et l’activation rapide (>1h)

au niveau transcriptionnel de 1100 gènes chez A. thaliana (Zipfel et al. 2004). Outre le

récepteur de flg22, cinq autres récepteurs de PAMPs ont été identifiés chez les plantes.

Comme pour FLS2, deux d’entre eux sont des protéines LRR-RLK (Leucin-Rich Repeat-

Recptor Like-Kinase), il s’agit d’EFR qui reconnaît EF-Tu (Zipfel et al. 2006) et CERK1 qui

reconnaît des oligomères de chitine (Miya et al. 2007). Le troisième récepteur de PAMP

caractérisé est LeEix, un RLP (Receptor Like Protein) qui reconnaît un domaine de la

xylanase fongique ElX (Ron et Avni 2004). Chez le riz, Kaku et al. (2006) ont identifiés un

récepteur protéique à domaine LysM (CEBiP), sans domaine kinase intracytoplasmique,

impliqué dans la perception de la chitine. Récemment, un cinquième récepteur RLK contenant

6

un domaine LysM a été identifié chez Arabidopsis, il est impliqué dans la perception

spécifique et la transduction du signal relative à la reconnaissance d’oligomères de chitine,

nommé LysM RLK1 (Wan et al. 2008). Tous ces PRR (Pattern Recognition Receptor) sont

localisés au niveau de la membrane plasmique et sont capables d’activer des cascades de

signalisation, sauf pour CEBiP où une interaction avec un homologue à Lys RLK1 chez le riz

pourrait être supposée (Eckardt 2008), impliquant des flux de Ca2+ et des MAPK (Mitogen

Activated Protein Kinase) qui induisent à leurs tour des réactions de défense. Ainsi la

reconnaisance des PAMPs comme «non soi» par la plante constitue donc le premier niveau

d’activation des défenses végétales. Ce mécanisme, caractérisé sous le terme PTI (PAMP

Triggered Immunity) correspond aussi à ce que l’on appelle le système d’immunité basal

(Jones et Dangl 2006). Compte tenu de la conservation des motifs reconnus, il confère donc

une protection à large spectre qui est fondamentale pour expliquer les mécanismes

moléculaires de la résistance non hôte.

Le deuxième niveau de défense des plantes contre les parasites est lié la détection

spécifique de certaines molécules microbiennes par des classes de protéines végétales dérivant

des gènes R.

1.2. Reconnaissance spécifique et concept gène-pour-gène

Ce concept a été développé pour la première fois par Harold Flor (1955), il indique que la

présence simultanée et spécifique d’un gène de résistance dans le génome de la plante et d’un

gène d’avirulence correspondant dans celui du parasite conduit à une résistance spécifique.

1.2.1. Gènes de résistance (R)

Plus de 55 gènes R ont été clonés à partir des plantes mono et dicotylédones (Martin et al.

2003 ; Hammond-Kosack et Kanyuka 2007) (tableau IN.2). La comparaison de la structure

des protéines R codées par ces gènes révèle la présence de domaines protéiques conservés,

impliqués dans la reconnaissance et la transduction de signaux (Hammond-Kosack et al.

2003). Les gènes R sont subdivisés selon la séquence de leurs protéines en 4 classes majeures

(van Ooijen et al. 2007) illustrées dans la figure IN.2. La grande majorité des protéines R

contient un domaine central NB (Nucleotide-Binding domain) faisant partie d’une entité plus

grande appelée domaine NB-ARC, qui est présent dans APAF-1 (Apoptotic protease-

activating factor1) chez l’Homme et la protéine CED4 chez Caenorbabditus elegans (van der

Biezen et Jones, 1998). Du côté C-terminal, NB-ARC est lié à un deuxième domaine LRR

«Leucine-Rich Repeat», ce complexe est appelé NB-LRR. Sur la base de leurs séquences N-

7

terminale, les protéines NB-LRR sont subdivisées en deux classes. La première catégorie

(TNL) est constituée par les TIR-NB-LRR, en raison des homologies trouvées avec le

domaine protéique TIR (Toll Interleukine-Receptor) chez la drosophile (Whitham et al. 1994).

La deuxième catégorie (CNL) possède un domaine avec une structure Coiled-coil (CC). Ces

dernières protéines sont subdivisées en 2 groupes selon que leur partie N-terminal est courte

ou longue (figure IN.2).

Parmi les autres gènes R, certains possèdent un domaine LRR extracytoplasmique

(eLRR). Ce domaine eLRR est connecté, côté C-terminale, à travers un domaine

transmembranaire à une région cytoplasmique variable. Si ce domaine cytoplasmique contient

un domaine kinase, la protéine R est classée parmi les RLK (Receptor-Like Kinase). Si le

domaine kinase n’existe pas, la protéine fait partie alors de la classe RLP « Receptor-Like

Protein ». Malgré cette classification, il existe des protéines R qui ne font pas partie d’aucune

des classes auparavant définies, c’est le cas de la protéine Asc1 (van Ooijen et al. 2007).

Figure IN.2: Représentation schématique des différentes classes des protéines R (d’après van Ooijen 2007). CC : motif coiled coil, LRR : leucine-rich repeats, NB : nucleotide binding domain; TIR : Tir-Interleukin-1 Receptor ; NB-ARC: nucleotide binding domain shared between human APAF-1, (Apoptotic Protease-Activating Factor 1), some plant R proteins, and CED-4 (Caenorhabditus elegans Dead protein 4). PM : membrane plasmique.

8

Tableau IN.2: Les classes majeures des gènes de résistance clonés (d’après Hammond-Kosack et Kanyuka 2007).

9

Les programmes de séquençage des différentes plantes couplés aux analyses

bioinformatiques ont permis de révéler que les gènes R les plus représentés se regroupaient au

sein de certaines régions des génomes analysés. Ainsi, le séquençage de Medicago truncatula

a permis de mettre en évidence l’existence de plusieurs gènes R ayant une homologie avec les

NB-LRRs (Zhu et al. 2002). La cartographie génétique et physique a montré que les TNL et

les CNL sont groupés en clusters chez cette légumineuse, et que peu de clusters contiennent

ces deux types de gènes NB-LRR réunis ensembles (Zhu et al. 2002, Ameline-Torregrosa et

al. 2008b). Cette homogénéité des clusters d’RGAs a été aussi notée chez le soja (Kanazin et

al. 1996; Yu et al. 1996). Dans le cas d’A. thaliana les clusters renferment le plus souvent un

mélange des TIR- et CC-NB-LRR (Meyers et al. 1999).

1.2.2. Exemples de gènes R

1.2.2.1. Classe TNL

Chez A. thaliana la majorité des gènes NB-LRR appartiennent à la classe des TNLs

(Meyers et al. 1999), en revanche cette classe est absente chez les monocotylédones (Pan et

al. 2000). Ceci pourrait indique une différence dans la co-évolution plante hôte- agent

pathogène entre les mono- et les dicotylédones (van Ooijen et al. 2007). Chez les solanacées

trois gènes appartenant à cette classe ont été clonés : Bs4 chez la tomate (Schornack et al.

2004), Gro1-4 chez la pomme de terre (Paal et al. 2004) et N chez le tabac (Whitham et al.

1994) conférant la résistance à Xanthomonas campestris, Globodera rostochiensis et au virus

de la mosaïque de tabac, respectivement.

1.2.2.2. Classe CNL

Un des représentants de cette classe est le gène RPS2 identifié chez Arabidopsis qui code

pour une protéine reconnaîssant spécifiquement la protéine avr Rpt2 de Pseudomonas

syringae pv. maculicola (Leister et al. 1996). Chez cette même plante un autre gène

appartenant à la classe des CNL, RPM1, a été identifié confèrant la résistance à des souches

de P. syringaye ayant les gènes avrB ou avrRpm1 (Bent et al. 1994 ; Grant et al. 1995).

1.2.2.3. Classe RLP

Cette classe est essentiellement représentée par la famille de gènes Cf conférant la

résistance race-spécifique à Cladosporium fulvum chez la tomate (Hammond-Kosack et Jones,

1997 ; Thomas et al. 1997). Les protéines correspondantes sont caractérisées par l’existence

10

d’un domaine riche en répétitions en leucine (domaine LRR) en position N-terminale et des

domaines transmembranaires putatifs en C-terminal. Les domaines LRR sont retrouvés dans

des protéines de nature très diverse et sont impliqués dans les interactions protéine-protéine

ou protéines-polysaccharides, ainsi que dans d’autres liaisons peptide-ligand (Kobe et Kajava,

2001).

1.2.2.4. Classe RLK

Le gène Xa21 est un représentant de cette classe confèrant au riz la résistance à la bactérie

pathogène Xanthomonass oryzae pv. oryzae (Song et al. 1995). La protéine correspondante

possède un domaine LRR extra cytoplasmique en N-terminal, un motif transmembranaire

ainsi qu’un domaine Sérine/Thréonine kinase cytoplasmique en C-terminal.

1.2.2.5. Autres

(a) Gènes codant des protéines à domaine transmembranaire unique : Un seul gène

de résistance de ce type a été identifié chez la tomate en réponse aux toxines produites par

Alternaria alternata f.sp lycopersici (Brandwagt et al. 2000). La séquence protéique déduite

de ce gène, appelé Asc 1 pour Alternaria stem cancer, révèle la présence de six domaines

transmembranaires, ne présentant aucune homologie avec les gènes de résistance connus

jusqu’alors. Des homologues à Asc1 ont également été trouvés chez A. thaliana (Brandwagt et

al. 2000).

(b) Gènes codant des toxines réductases : Le gène Hm1 représente la classe des gènes

codant des toxines réductases, il confère la résistance chez le maïs à la race1 du champignon

Cochliobolus caronum (Johal et Briggs, 1992). Il code une HC-toxine réductase capable

d’inactiver la toxine produite par cette race, conférant ainsi une résistance race-spécifique au

maïs. Ces gènes sont particulièrement conservés chez les céréales puisque des homologues

ont été retrouvés chez l’orge ou encore le blé (Han et al. 1997).

(c) Gènes codant des protéines à domaine CC et transmembranaire : Cette classe de

gènes R est représentée par la famille de gènes RPW conférant la résistance à Erysiphe

cichoracearum chez A. thaliana (Xiao et al. 2001). Les protéines cytoplasmiques RPW8.1 et

RPW8.2 sont caractérisées par la présence d’un signal d’ancrage putatif en N-terminal, suivi

d’un domaine CC impliqué dans les interactions avec des molécules signaux (Pan et al. 2000).

11

Un domaine transmembranaire, situé en C-terminal, intervient dans la reconnaissance directe

d’un facteur d’avirulence et facilite la reconnaissance d’autres molécules (Fluhr 2001).

(d) gène codant une protéine kinase intracytoplasmique: Les gènes Pto et PBS1

conférant respectivement la résistance à Pseudomonas syringae pv tomato chez la tomate

(Martin et al. 1993) et à P. syringae chez A. thaliana (Swiderski et Innes, 2001), sont deux

représentants de cette classe. La protéine Pto présente des similarités avec les protéines IRAK

et PELLE, protéines kinases impliquées dans la réponse immunitaire chez les mammifères et

la drosophile respectivement (Medzhitov 2001), suggérant des mécanismes de transduction

communs entre les différents règnes.

1.2.3. Gènes d’avirulence (avr)

Les gènes d’avirulence codent des protéines qui possèdent une activité élicitrice

spécifique aux cultivars de plantes qui possèdent les récepteurs race-spécifique

correspondants (Montesano et al. 2003). Les protéines Avr, sont souvent localisées sub-

cellulairement comme les protéines R indiquant une interdépendance entre les deux

composants. Dans le cas des bactéries, elles sont injectées directement dans le cytoplasme des

cellules végétales. Dans le cas des champignons, elles sont majoritairement secrétées de façon

extracellulaire. Par exemple, Avr9 de C. fulvum est sécrété dans l’apoplaste (Piedras et al.

2000). De nombreux gènes d’avirulence ont été isolés chez les champignons, les bactéries et

les virus comme avrRpm1 et avrPto, inducteurs de la résistance RPM1 et Pto-dépendante

chez Arabidopsis et la tomate, respectivement (Nimchuk et al. 2001).

Dans le cas des oomycètes, deux types d’effecteurs (molécules qui manipulent la structure

et la fonction des cellules hôtes, facilitant ainsi l’infection et/ou le déclenchement des

réponses de défense dans celles-ci), existent (tableau IN.3): les effecteurs apoplastiques

secrétés dans l’espace extracellulaire et les effecteurs cytoplasmiques acheminés par le

parasite à l’intérieur de la cellule hôte probablement à travers des structures spécialisées tels

que des vésicules ou des haustoria (figure IN.3) (Kamoun 2006 ; Birch et al. 2006).

Les effecteurs apoplastiques chez les oomycètes sont groupés en 5 classes, comprenant

notamment des inhibiteurs d’enzymes et CBEL (Cellulose Binding, Elicitor and Lectin)

(Kamoun 2006). Chez Phytophtora il existe un mécanisme de défense actif par sécrétion de

protéines inhibitrices qui agissent sur les glucanases et les protéases de l’hôte. Par exemple les

inhibiteurs de glucanase GIP1 et GIP2, secrétés par P. sojae inhibent l’endo-1,3 glucanase du

soja Egase (Rose et al. 2002).

12

Tableau IN.3: Les effecteurs des oomycètes pathogènes (d’après Kamoun 2006).

13

Figure IN.3: Interaction entre haustorium de Phytophtora infestans et une cellule de pomme de terre (d’après Birch et al. 2006). Des inhibiteurs de protéases extracellulaires (EPI) (cercles en bleu) agissent sur les protéases de l’hôte induites lors de la réponse de défense (cercles en rouge). Les protéines contenant les motifs RXLR (carrés en vert) comme AVR3a sont secrétées. La façon avec la quelle elles sont transportés vers l’intérieur du cytoplasme de la cellule hôte ainsi que leurs protéines cibles (effecteur cible, orange) n’est pas encore connue. Il est possible que la reconnaissance entre la protéine AVR et l’effecteur cible soit medié par la protéine R ‘de garde’ (triangle violet).

CBEL est une protéine pariétale de 34 kDa isolée initialement à partir de P. parasitica

nicotianae, dont la fonction est double (i) elle induit des nécroses et l’expression des gènes de

défense chez les plantes de tabac et (ii) elle sert à l’attachement à la cellulose présente à la

surface des plantes (Villalba-Mateos et al. 1997). Des souches de P. parasitica dont le gène

CBEL a été éteint par silencing ont manifesté une perte de la capacité d’adhésion à une

membrane de cellophane, en revanche ils ont gardé leur capacité à infecter les plantes de

tabac (Gaulin et al. 2002). CBEL de P. parasitica contient deux domaines d’attachement à la

cellulose (CBDs). Gaulin et al. (2006) ont montré que ce domaine est essentiel et suffisant

pour induire les réponses de défense dans les feuilles de tabac et d’A. thaliana, il constitue

donc une nouvelle classe de PAMPs chez les oomycètes.

De nombreux gènes Avr codant pour des effecteurs cytoplasmiques ont été clonés chez

les oomycètes (Allen et al. 2004 ; Armstrong et al. 2005). L’étude de la séquence de ces

protéines Avr (ATR1, ATR13, Avr3a et Avr1b) (Rehmany et al 2005) a montré la présence

d’un peptide suivi d’un motif conservé RXLR (Arg-aa-Leu-Arg), dont la séquence ressemble

14

à celle d’un peptide signal nécessaire à la translocation des protéines chez le parasite de

malaria (Plasmodium) vers le cytoplasme des cellules hôtes (Hiller et al. 2004).

Il est maintenant établi que le peptide RXLR-EER permet bien l’adressage de nombreux

effecteurs d’oomycètes à l’interieur de la cellule, dont l’action permet à ces parasites de

contourner les défenses de l’hôte (Whisson et al. 2007; Govers et Bounmester 2008).

1.2.4. Les différents modèles de perception R/Avr

Le modèle gène-pour-gène initial présumait l’existence d’une interaction physique entre

éliciteur Avr et protéine R. Des preuves du contact direct entre les deux types de protéines ont

été fournies pour quelques modèles, tels que Pita/AvrPita (Jia et al. 2000), L/AvrL567 (Dodds

et al. 2006) et PopP2/RRS-1 (Deslandes et al. 2003). Cependant, les cas d’interaction directe

R-Avr restent rares, laissant supposer une relation plus complexe (Ellis et al. 2000). Un

nouveau modèle a donc été proposé, impliquant l’intervention d’une troisième composante

dans cette interaction (Luderer et al. 2001, Bergelson et al. 2001 ; van der Hoorn et al. 2002).

Dans ce dernier modèle, appelé «hypothèse de garde», la protéine Avr ne serait pas la cible

directe de la protéine R mais ferait partie d’un complexe incluant une protéine de garde

médiant l’interaction. Différents modes d’action ont été proposés (figure IN.4) pour appuyer

cette hypothèse de grade (Dangl et Jones 2001 ; Bonas et Lahaye 2002): (i) la liaison du

produit du gène d’avirulence à la protéine R par l’intermédiaire de la protéine de garde; (ii)

l’accrochage d’Avr induirait la dissociation du complexe protéine de garde-protéine R

entraînant des défenses; (iii) la protéine R s’associerait au complexe protéique une fois

l’éliciteur fixé et enfin (iv) la liaison de l’éliciteur au complexe protéique entraînerait

l’activation de la protéine R. Ce dernier modèle ne s’applique cependant pas à tous les

pathosystèmes mais il pourrait expliquer le fait, par exemple, que la protéine kinase Pto chez

la tomate requiert la présence de la protéine Prf pour activer les mécanismes de défense suite

à la reconnaissance d’AvrPto (van der Biezen et Jones, 1998).

15

Figure IN.4: Hypothèse d’interactions du modèle de garde (d’après Bonas et Lahaye 2002). Les protéines R sont en vert. Les protéines Avr (A) sont en rouge. (a) le modèle classique de ligand-récepteur prévoit une interaction directe entre la protéine R et Avr pour initier les réactions de défense. (b) selon le modèle de co-récepteur, l’interaction de la protéine Avr se fait d’abord avec un co-récepteur de haute affinité (en bleu), qui agit à sont tour (double flèche) avec la protéine R pour obtenir la réponse. (c) Dans le cadre conceptuel du modèle de garde, la protéine de résistance est gardée par une protéine cible correspondante (P en jaune) qui interagit avec la protéine Avr. (d) Etant donné que plusieurs gènes d’avirulence bactériens, fongiques et viraux codent des protéases, ce modèle d’activation de défense dépendant de la voie protéolytique, a été proposé pour expliquer l’interaction. X : la protéine ciblée par la protéase; AP: apoplaste ; PM membrane plasmique ; CY : cytoplasme.

2. LA TRANSDUCTION DES SIGNAUX

Suite à la perception de l’agent pathogène par la plante, une cascade de signalisation se

met en place afin d’induire des réponses de défense par l’intermédiaire de messagers

secondaires chez la plupart des eucaryotes (Nürnberger et Scheel, 2001). Cette transduction

met en jeu des signaux: des signaux précoces et des signaux secondaires.

2.1. Les signaux précoces

2.1.1. Les flux ioniques et la dépolarisation membranaire

Les modifications de flux ioniques (influx de Ca2+ et H+ et efflux de K+ et Cl-) à travers la

membrane plasmique constituent la réponse la plus précoce à la reconnaissance spécifique

d’un agent pathogène. L’entrée de Ca2+ dans le cytosol est nécessaire pour l’activation du

stress oxydant et de la mort cellulaire chez A. thaliana en réponse à P. syringae (Grant et al.

2000). L’implication des canaux potassiques dans l’efflux de l’ion K+ a été démontrée dans

16

les cellules de tabac dans l’interaction Cf-9/Avr9 (Blatt et al. 1999). Ces flux d’ions à travers

la membrane plasmique et la dépolarisation membranaire qui en découle ont lieu dès les

premières minutes de l’interaction. Parmi les différents ions cités, le calcium est

particulièrement important pour le bon fonctionnement des protéines kinases qui interviennent

dans la phosphorylation/ déphosphorylation de diverses protéines afin de les réguler (Bent,

2001).

2.1.2. La phosphorylation

La phosphorylation constitue la plus importante modification covalente des protéines: elle

conduit à un attachement réversible d’un groupement phosphate à un acide aminé

(Stulemeijer et Joosten 2008). La phosphorylation a été décrite comme ayant un rôle

déterminant dans la cascade de signalisation des réponses de défense chez les plantes (Peck

2003 ; Thurston et al. 2005). Les quatre types de phosphorylation connus sont, la N-, S-,

l’acyl-, et la O-phoshorylation qui est la plus commune. Celle-ci se produit sur le groupement

hydroxyl des acides hydroxyaminés, serine, thréonine et tyrosine (Reinders et Sickmann

2005), grâce à des protéines kinases «Mitogen-Activated Protein Kinase» (MAPK) qui

transfèrent le groupement phosphoryl (PO3) de l’ATP vers le groupement hydroxyl du résidu

acide aminé, conduisant à une liaison phosphoester (R-O-PO3) (Stulemeijer et Joosten 2008).

La déphosphorylation est assurée par des phosphatases qui hydrolysent les liaisons

phosphoester, libérant ainsi le groupement phosphoryl et rendant l’acide aminé à l’état non

phosphorylé (Sickmann et Meyer 2001). Les MAPKs forment un groupe de transducteurs de

signaux liés à la reconnaissance gène-pour-gène qui agissent en aval du calcium (Tena et al.

2001; Zhang et Klessig 2001). Elles interviennent normalement dans une cascade de 3 kinases

fonctionnellement liées, dans la quelle les MAPKs agissent en aval des MAPK kinases

(MAPKKs) et des MAPKK Kinases (MAPKKKs) (figure IN.5). Les MAPKKs activent les

MAPKs par phosphorylation de 2 résidus thréonine et tyrosine (Romeis 2001). Chez Le tabac,

les MAPKs activent l’expression de la phénylalanine ammonialyase (PAL) en réponse à un

traitement par des éliciteurs via la phosphorylation de facteurs de transcription (Zhang et al.

1998).

Les CDPK (Calcium-Dependent Protein Kinases), un autre type de protéines kinases, sont

spécifiques des plantes et des protozoaires et sont directement associées à la transduction des

signaux médiés par les gènes R, ainsi que cela a été démontré chez la tomate (Romeis et al.

2001) et les cellules de tabacs exprimant le gène Cf9 (Romeis, 2001). La perte de fonction

d’ACIK1 (Avr9/Cf-9 Induced Kinase 1) par VIGS abolit complètement la HR suggérant

17

qu’elle puisse jouer un rôle très important dans la mise en place du phénomène HR (Rowland

et al. 2005).

Certains travaux suggèrent également que les MAPKs régulent l’immunité innée chez les

plantes. Une cascade MAPK complète, a été activée dans les cellules d’A. thaliana suite à la

reconnaissance de la flagelline par le récepteur FLS2 (Asai et al. 2002). Cette activation

confère à la plante la résistance vis-à-vis des bactéries et champignons pathogènes.

Figure IN.5: Les protéines kinases impliquées dans la signalisation de défenses des plantes (d’après Romeis 2001). Les rectangles de couleur indiquent une élicitation non-race spécifique alors que les ellipses indiquent une interaction gène-pour-gène. Les couleurs rouge, verte, bleue, jaune, marron et orange correspondent respectivement aux modèles tabac, A. thaliana, luzerne, persil, riz et tomate. CDPK : clamodulin-domain protein kinase ; MAPK : MAP kinase ; MAPKK : MAP kinase kinase ; MAPKKK : MAP kinase kinase kinase ; SIPK : salicylic acid (SA)-induced protein kinase ; WIPK : wound-induced protein kinase ; ERMK : elicitor-responsive MAPK ; SIMK : stress induced MAPK ; SAMK : ; EDR : enhanced disease resistance ; HIN : hairpin-induced ; HMGR : 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase ; PAL : phenylalanine ammonia lyase.

18

2.1.3. Les espèces réactives de l’oxygène

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont générées naturellement au cours du

processus de développement normal des plantes, par la chaîne de transport d’électrons dans

les mitochondries et les chloroplastes et par les oxydases membranaires. Cependant, une

augmentation rapide et localisée de leur production est également souvent détectée suite à

l’attaque d’agents phytopathogènes, phénomène communément appelé «stress oxydant»

(Mehdy 1994; Lamb et Dixon 1997; Able 2003; Lee et Hwang 2005). Parmi les ROS, on

distingue le peroxyde d’hydrogène (H2O2), son précurseur l’anion superoxyde (O2•-) et le

radical hydroxyle (HO●). Ces trois formes sont les plus étudiées dans les interactions des

plantes avec les agents pathogènes. O2•- est relativement instable et peut être dismuté en H2O2

spontanément à pH acide ou enzymatiquement par l’intermédiaire de la superoxide dismutase

(SOD) (Fridovich 1986). En présence de fer, O2•- et H2O2 peuvent donner naissance au très

réactif HO● (Apel et Hirt 2004 ; Mori and Schroeder 2004). Dans le cas de la réaction

incompatible la production des ROS se fait en deux étapes, la première précoce et transitoire

(phase I) et la deuxième tardive et plus durable (phase II) (Lamb et Dixon 1997 ; De Gara et

al. 2003 ; Torres et al. 2006). Quant aux interactions compatibles, seule la phase I est détectée

(Yoshioka et al. 2001) qui est biologiquement non spécifique (Adam et al. 1989). En

revanche, la phase II se produit suite à la reconnaissance spécifique des protéines Avr par les

protéines R (Able 2003; Barna et al. 2003; Torres et al. 2006). Diverses études

pharmacologiques, immunologiques et moléculaires ont montré que l’enzyme membranaire

NADPH oxydase (Nicotinanide Adenine Dinucleotide Phosphate) est l’une des premières

sources de production des ROS (Brisson et al. 1994), en utilisant l’oxygène moléculaire pour

former O2•- (figure IN.6). Cet élément est repris par la SOD pour former H2O2 par réaction de

dismutation. D’autres enzymes ont pu être associées à la production des ROS, telles q’une

lipoxygénase dans le pathosystème Phaseolus vulgaris - Pseudomonas syringae pv

phaseolicola, via son action sur les acides gras poly-insaturées dérivant des lipides

membranaires (Croft et al. 1990). La production apoplastique de H2O2 peut aussi être due à

l’action de plusieurs enzymes tels que CAO (copper amine oxydase), flavin polyamine

oxydase et l’oxalate oxydase (De Gara et al. 2003). Les peroxydases pariétales pH-

dépendante ont été impliquées aussi dans la production de H2O2 (Bolwell et al. 1999).

19

Figure IN.6: Sources et fonctions des ROS chez les plantes suite à l’infection par des agents pathogènes (d’après Torres et al. 2006).

2.1.4. Le monoxyde d’azote (NO)

Chez les plantes les enzymes responsables de la synhtèse de NO sont la nitrate réductase

et la NO synthase (NOS) (Guo et al. 2003). AtNOS1 chez A. thaliana, appartient au groupe

des enzymes calmoduline dépendante ayant une activité NOS; celle-ci oxyde la L-arginin en

NO et L-citrulline (Wendehenne et al. 2001). Le mutant Atnos1 endommagé dans l’expression

de AtNOS1, montre une réduction de croissance, de fertilité et une vulnérabilité à l’infection

par Pseudomonas syringae pv. tomato (Zeidler et al. 2004). De plus, Guo et Grawford (2005)

ont montré que AtNOS1 est localisé dans les mitochondries et protége les plantes contre la

sénescence induite par l’obscurité en réduisant l’accumulation des ROS ainsi que l’oxydation

des lipides et des protéines. Ces résultats montrent bien que le NO intervient dans divers

processus physiologiques chez les plantes. Plusieurs études récentes ont montré que le NO est

produit par les cellules végétales en réponse aux agents pathogènes et aux éliciteurs

(Delledonne 2005 ; Wendehenne et al. 2004). Il a été montré que le NO stimule l’activation

des gènes de défense tels que la PAL, les protéines PRs et plusieurs protéines intervenant dans

le métabolisme secondaire (Klessig et al. 2000; Polverari et al. 2003; Parani et al. 2004).

Cependant, les études faites sur l’implication du NO dans la HR chez A. thaliana (Zhang et

Klessig 1998) et Avena sativa (Tada et al. 2004) ont montré qu’il ne constitue pas un

médiateur essentiel dans cette réaction de défense. Il est évident maintenant que le NO joue

un rôle de signal intracellulaire activé chez les plantes en réponse aux agents pathogènes et

aux éliciteurs (García-Brugger et al. 2006).

20

2.2. Les signaux secondaires

Les molécules signales secondaires intervenant dans les interactions plantes- agents

pathogènes sont l’acide salicylique (SA), l’acide jasmonique (JA) et l’éthylène (ET). Elles

constituent le lien entre les événements précoces de signalisation et l’activation des réponses

de défense tardives. De plus elles assurent la transmission de l’information de cellule à cellule

induisant ainsi à une SAR qui permet à la plante de protéger ses organes qui sont encore sains

contre des attaques secondaires par des parasites. Les études faites sur le rôle de ces trois

molécules signaux dans la résistance des plantes aux agents pathogènes montrent que les

voies de signalisation de l’ET et le JA interviennent généralement dans la résistance aux

agents nécrotrophes, en revanche celle impliquant le SA intervient au cours de la réponse aux

agents biotrophes (Glazebrook 2005).

2.2.1. L’acide salicylique

Les mécanismes de défense dépendants de SA sont les plus étudiés au niveau moléculaire.

Deux voies de biosynthèse du SA semblent exister chez les plantes (Shah 2003). Les travaux

faites par Chong et ces collaborateurs (2001) sur le tabac ont suggéré que le SA dérivait de la

voie des phénylpropanoïdes initiée par la PAL; il serait synthétisé à partir de l’acide

transcinnamique et de l’acide benzoïque (Métraux 2002). Cette enzyme est induite lors des

phénomènes de défenses HR et LAR (Dorey et al. 1997), et de ce fait cette voie semble être

impliquée dans la synthèse de SA dans les réponses de défense localisées. Cependant, la

caractérisation du mutant sid2 (SA induction deficient) a montré que cette voie n’était pas la

voie principale dans le cas de la SAR chez A. thaliana (Wildermurth et al. 2001). D’autres

travaux ont montré que la voie de l’isochorismate est une source majeure de SA lors de la

SAR chez A. thaliana: SID2 code une isochorismate synthase, indispensable à l’accumulation

de SA en réponse à un agent pathogène (Dewdney et al. 2000). Les marqueurs typiques de la

défense dépendante du SA sont, chez A. thaliana les protéines PR1, PR2 et PR5 et chez le

tabac, les gènes codant les protéines PR1, 2, 3 et 5 dans leurs isoformes acides (Underhill et

Ozinsky 2002; Cordelier et al. 2003).

La première étape de la voie de signalisation dépendante du SA est sa perception.

L’exemple de récepteur le plus affin au SA est la protéine SABP2 (SA Binding Protein 2) de

tabac, qui a une activité estérase stimulée par SA (Forouhar et al. 2005). La protéine NPR1

(Non Expresser of PR gene 1) d’A. thaliana est le chaînon central de la voie de signalisation

du SA. NPR1 est un oligomère cytoplasmique qui devient monomérique par réduction des

ponts disulfures en réponse au SA (Mou et al. 2003). Cela induit sa translocation dans le

21

noyau où elle permet l’activation de la transcription des gènes de défense par le biais de

facteurs de transcription TGA (Johnson et al. 2003).

2.2.2. L’acide jasmonique

L’acide jasmonique est une molécule signal de la famille des oxylipines. Il a un rôle

important dans les étapes de développement ainsi que dans la mise en place de réponses de

défense chez les plantes (Bleecker et Kende 2000; Turner et al. 2002). Sa synthèse, à partir

d’acide gras poly insaturés (acide linoléique: C18:3) (Mueller, 1997), requiert l’action de

plusieurs enzymes différentes telles que la lipoxygénase (LOX), l’allène oxyde synthase et

l’allène oxyde cyclase (Stenzel et al. 2003). Le JA peut aussi être métabolisé en un composé

volatil, le méthyljasmonate (MeJA), une molécule diffusible importante dans les

communications intra- et inter-plantes. Le JA et MeJA sont impliqués dans l’induction de

nombreuses réponses de défense telles que la synthèse de peptides et protéines antifongiques

notamment les défensines (Penninckx et al. 1998) chez A. thaliana, ou l’expression d’une

osmotine PR5c chez le tabac (Xu et al. 1994). Des mutants d’A. thaliana qui ne peuvent pas

accumuler le JA sont extrêmement sensibles à l’infection par Pythium irregulare (Vijayan et

al. 1998). L’application exogène de JA permet de réduire significativement cette sensibilité.

Le JA semble donc directement impliqué. Le rôle de de JA et MeJA comme molécule signal

dans la défense semble toutefois dépendre de l’espèce végétale et de la nature des réponses

étudiées. Par exemple, chez le riz, le JA ne semble pas nécessaire à l’induction des gènes PR

et à l’établissement de la LAR (Staswick et al. 1998).

2.2.3. L’éthylène

L’éthylène est une hormone volatile impliquée dans divers processus de développement et

de réponse à différents stress chez les plantes tels que la germination, la maturation des fruits,

la sénescence de fleurs, la chute de feuilles, la réponses aux blessures mécaniques et aux

agents pathogènes (Johnson et Ecker 1998; Bleeker et Kende 2000; Wang et al. 2002). Son

action est d’induire notamment la production de phytoalexines et la synthèse de certaines

protéines PR (Nakazato et al. 2000). Sur la base des études faites sur les mutants d’A. thaliana

insensibles à ET ou super-produisants cette molécule il a été possible de décortiquer la voie

d’action de cette hormone (Guo et Ecker, 2004). Ainsi, l’ET est perçu dans les cellules par

plusieurs récepteurs membranaires: Ethylen Receptor ETR1 et ETR2, Ethylene Response

Sensor ERS1 et ERS2 et Ethylene Insensitive4 EIN4 (Chang et Stadler 2001; Chang et

Bleecker 2004). En l’absence de l’ET, ces récepteurs activent CTR1 (Constitutive Triple

22

Response 1) une MAPKKK (mitogen activating protein kinase kinase kinase), qui régule

négativement la voie de signalisation (Huang et al. 2003). En présence d’ET, celui-ci se fixe

sur les récepteurs qui inactivent CTR1, permettant à EIN2 (Ethylene Insensitive 2), une

protéine à fonction inconnue, d’agir en tant que régulateur positif de la voie (Wang et al.

2002), car la mutation de ce gène conduit à une insensibilité complète à l’ET (Alonso et al.

1999). En aval de EIN2 intervient un ensemble de facteurs de transcription incluant EIN3 et

son homologue EIL3 (EIN3-like) (Chao et al. 1997; Guo et Ecker 2003), régulant la

transcription de gènes cible de l’ET tel que ERF1 (Ethylene Response Factor) (Solano et al.

1998). ERF1 se lie avec le motif GCC de certains promoteurs et active l’expression de gènes

dont certains gènes de défense (Guo et Ecker, 2004). Il a été récemment démontré que EIN3

est régulé au niveau post-traductionnel grâce à deux protéines F-box très similaires EBF1 et

EBF2 (EIN3 Binding F-BOX PROTEIN1 et 2) qui permettent son adressage au protéasome

(Gagne et al. 2004). En l’absence d’ET, EIN3 est donc constitutivement dégradée. En

revanche, en sa présence EIN3 devient stable et s’accumule (Gagne et al. 2004). Il a été

montré que l’accumulation de EIN3 régule positivement le niveau d’expression des deux

protéines F-box qui à leur tour limitent la concentration d’EIN3 (Potuschak et al. 2003).

Récemment une nouvelle protéine EIN5 impliquée dans la cascade de signalisation d’ET,

agissant en aval de CTR1, a été trouvée (Olmedo et al. 2006). Le rôle de EIN5 est de contrer

le feedback négatif sur EIN3 en favorisant la dégradation des ARNm de EBF1 et de EBF2, ce

qui a pour conséquence l’accumulation de EIN3 et ainsi une augmentation la réponse à l’ET

(Olmedo et al. 2006).

2.2.4. Les interconnexions entre les différentes voies de signalisation

Les réponses de défense sont modèles par des interconnexions complexes entre les

différentes voies de signalisation qui impliquent à la fois le SA, le JA et l’ET (Kunkel et

Brooks 2002 ; Gazzarrini et Mccourt 2003). Ces trois molécules signal interviennent dans

deux voies majeures: la voie dépendante de SA et la voie indépendante de SA qui implique le

JA et l’ET. Ces voies ne fonctionnent pas indépendamment, mais s’inter-influencent l’une

l’autre. En effet, le SA, le JA et l’ET peuvent interagir entre eux (figure IN.7) en ayant une

action synergique entre JA et ET (Rojo et al. 2003) ou antagoniste entre SA / JA et ET

(Kunkel et Brooks 2002). Dans le premier cas il a été montré que le JA et l’ET activent les

mêmes gènes de défense PR3, PR4 et PDF1.2 (Xu et al. 1994; Penninckx et al. 1998). De

plus, les voies de signalisation faisant intervenir ces deux dernières hormones sont impliquées

dans la résistance contre les mêmes agents pathogènes nécrotrophes (Rojo et al. 2003;

23

Glazebrook 2005). La convergence entre les voies JA et ET pourrait se faire au niveau de

ERF1. En effet, il a été montré que l’expression de ERF1 nécessitait à la fois la signalisation

du JA et de l’ET, et qu’un traitement combiné de ces deux hormones avait un effet synergique

sur son expression (Lorenzo et al. 2003). Dans le deuxième cas (antagonisme SA / JA et ET)

il a été montré qu’un apport exogène de SA est capable de bloquer la synthèse du JA chez la

tomate (Doares et al. 1995). De plus, des microarrays réalisés sur des mutants de signalisation

en réponse à P. syringae pv. maculicula ont montré que des clusters de gènes régulés par le

SA (dont PR1) avaient une expression augmentée dans les mutants insensibles aux JA/ET,

alors que les gènes reliés aux voies JA/ET voyaient leur expression augmentée dans les

mutants insensibles au SA (Glazebrook 2003).

Figure IN.7 : Interconnexions entre les voies de signalisation de l’éthylène (ET), de l’acide jasmonique (JA) et de l’acide salicylique (SA) chez Arabidopsis thaliana (d’après Kunkel et Brooks 2002). Les flèches oranges indiquent la voie dépendante de SA (les flèches bleues); la voie dépendante de JA (les flèches violettes) ; la voie dépendante de l’ET (les flèches vertes) : les régulations positives (potentielles en pointillé); et les barres rouges les réactions antagonistes. EDS : enhanced disease susceptibility ; PAD : Phytoalexin-deficient ; FAD : fatty acid deficient ; SID : SA-induction deficient ; CET : constitutive expression of thionin ; COI : coronatine-insensitive; MAPK: mitogen activated protein kinase; SSI: suppressor of SA-insensitivity ; NPR : non-expressor of PR gene ; JAR : jasmonate-response ; EIN : ethylene-insensitive.

3. LES MECANISMES DE DEFENSE CHEZ LES PLANTES

Suite aux phénomènes de reconnaissance et de transduction des signaux, les plantes

mettent en place divers mécanismes de défense qui visent à contenir ou bloquer la progression

du parasite. Ils se traduisent par un renforcement ou la mise en place de barrières structurales

et par la production de molécules ayant des activités antimicrobiennes.

24

3.1. Renforcement de la paroi de la cellule

La paroi des cellules végétales constitue une barrière physique à la pénétration des

agresseurs. Cependant, de nombreux champignons pathogènes développent une structure leur

permettant d’adhérer aux surfaces cellulaires de l’hôte, l’appresorium, puis de les traverser

par pression mécanique ou hydrolyse enzymatique. Pour contrer cette agression les plantes

ont mis en place des mécanismes visant à modifier et à renforcer la paroi. Ils se traduisent par

la synthèse de nouvelles molécules incluant les glycoprotéines riches en hydroxyprolines ou

HRGP (Benhamou et al. 1996), la callose (polymère de β-1,3 glucane) et des composés

phénoliques tels que la lignine (Boudart et al. 1995). Le dépôt rapide de certaines de ces

molécules sous le point de pénétration du parasite va former une papille bloquant ainsi sa

progression. Les papilles sont souvent associées à la résistance par exemple chez le haricot vis

à vis de Colletotrichum lendemuthianum (O’Connell et al. 1990), et d’une souche de

Xanthomonas (Brown et al. 1998).

Les HRGP ont été décrites initialement chez le melon en réponse à l’inoculation par

Colletotrichum lagenarium (Esquerré-Tugayé, 1973), mais elles se retrouvent également

induites dans de nombreux autres pathosystèmes (Esquerré-Tugayé et al. 1979; Mazau et

Esquerré-Tugayé, 1986). L’induction simultanée de peroxydases pariétales permettrait de

ponter les HRGP entre elles et/ ou à d’autres constituants, renforçant ainsi le réseau pariétal.

La voie de synthèse des phénylpropanoïdes est également induite et génère différents

composés dont la lignine et des acides phénoliques tels que les acides hydroxybenzoïques et

hydroxycinnaminiques (Mellersh et al. 2002). Outre son rôle structural, la lignine est

également impliquée dans la réponse des plantes supérieures à des attaques d’agents

pathogènes, à des traitements par des éliciteurs, ainsi qu’à la blessure (Boudart et al. 2003; de

Ascensao et Dubery 2003; Menden et al. 2007). Une corrélation a pu être établie entre la

lignification et la résistance aux maladies dans de nombreux cas. Les plantes résistantes

montrent une augmentation du dépôt de lignine plus importante que celle des plantes

sensibles (Soylu, 2006). Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs chimiques d’enzymes

impliquées dans la lignification inhibe la HR chez le blé infecté par Puccinia graminis

(Moershbacher et al. 1990). Les deux enzymes impliquées de façon plus spécifiques dans la

synthèse des lignines sont la cinnamoyl CoA réductase (CCR) et l’alcool cinnamylique

déshydrogénase (CAD). La CCR catalyse la première étape spécifique de la voie de synthèse

des monolignols, elle réduit les hydroxycinnamoyl CoA esters en aldéhydes correspondant

(Dixon et al. 2002). La CAD catalyse la seconde étape de réduction de la synthèse des

lignines, qui produit les alcools cinnamyliques (Dixon et al. 2002). Ce sont les études chez les

25

monocotylédones herbacées, chez lesquelles la lignification est l’un des mécanismes majeurs

de défense, qui ont conduis aux résultats les plus concluants sur l’implication de la CAD.

Moerschbacher et al. (1990) ont ainsi provoqué in vitro une forte inhibition de la HR d’une

variété de blé résistante à la rouille (Puccinia graminis f.sp. tritici) par application

d’inhibiteurs spécifiques de la CAD. Mitchell et ces collaborateurs (1999) ont montré

l’induction d’isoforme de CAD ayant l’alcool sinapylique comme substrat dans les feuilles de

blé suite à l’action de blessure ou d’éliciteurs, ce qui est cohérent avec l’accumulation de

lignine riche en unités syringyl. Cette induction d’isoforme particulier de la CAD présentant

une spécificité de substrat indique le rôle régulateur potentiel de cette enzyme dans la

composition des lignines de défense.

3.2. La synthèse de composés antimicrobiens

3.2.1. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS)

Outre leurs implications dans les mécanismes de transduction des signaux (Stulemeijer et

Joosten 2008), les ROS peuvent agir directement en tant que composés toxiques sur l’agent

pathogène (Peng et Kuc 1992). La présence simultannée de O2•- et H2O2, ainsi que la réaction

de H2O2 avec des métaux de transition donne naissance au radical le plus toxique HO● dont

l’effet néfaste sur les biomolécules ainsi que sur les agents pathogènes est bien connu (Mayer

et al. 2001). En outre la production locale de H2O2 au niveau du point de pénétration permet

de faciliter la réaction des peroxydases catalysant les jonctions entre les composés pariétaux et

les monomères de lignine, conduisant à une meilleure résistance à la pression mécanique et à

la dégradation enzymatique par les parasites (Bradley et al. 1992; De Gara et al. 2003; Torres

et al. 2006).

3.2.2. Les phytoalexines

Les phytoalexines sont des métabolites secondaires, de faible masse moléculaire, à activité

antimicrobienne (Ahl-Goy et al. 1993) qui se déposent rapidement autour du site d’infection,

ainsi qu’en réponse à des éliciteurs (Dixon et al. 2002). Leur accumulation est sous contrôle

des ROS au cours des réactions de défense (Lamb et Dixon 1997). Perrone et al. (2003) en co-

incubant une suspension cellulaire de tabac (Nicotiana tabacum) avec une SOD (enzyme

antioxydante qui dégrade O2•-) et des zoospores de Phytophthora nicotianae, ont pu

supprimer la réaction HR et l’accumulation de phytoalexine capsidiol. Leur production

26

entraîne une réduction du développement de l’agent pathogène et de la sévérité des

symptômes (Hammond-Kosack et Jones 1996; Hammerschmidt 1999). Chez A. thaliana, le

mutant pad3 (Phytoalexine Deficient) incapable de synthétiser la phytoalexine camalexine,

montre une sensibilité à Altenaria brassicicola (Thomma et al. 1999). L’expression

constitutive d’un gène codant la synthèse de la phytoalexine resveratrol chez le tabac et la

luzerne pérenne (M. sativa) a conduit à une réduction importante des symptômes d’attaque de

Botrytis cinerea sur le tabac (Hain et al. 1993) et de Phoma medicaginis sur la luzerne

(Hipskind and Paiva, 2000). De plus, l’expression constitutive de l’isoflavone O-

methyltransferase (IOMT) chez les plantes transgéniques de luzerne a engendré une

production plus importante et plus rapide de la phytoalexine médicarpine suite à l’infection

par P. medicaginis, aboutissant à une amélioration de la résistance des plantes (He and Dixon,

2000). La médicapine a été aussi associée à des réponses de défense chez la luzerne contre

Colletotrichum trifolii (O’Neill et Bauchan 1998) et Phoma medicaginis (O’Neill et al. 2003).

Le rôle des phytoalexines dans la défense des plantes aux agents pathogènes reste toutefois

controversé (Hammerschmidt 2003). En effet, Mert-Türk et al. (2003a) ont montré que la

production des phytoalexines (camalexin) n’est qu’une simple réponse à l’infection mais pas

une réaction de défense dans le pathosystème A. thaliana- Hyaloperonospora parasitica,

confirmant ainsi des études antérieures qui rapportaient une variabilité génétique dans

l’accumulation de la camalexin chez A. thaliana (Kagan et Hammerschmidt 2002; Mert-Türk

et al. 2003b).

3.2.3. Les protéines PR

Les protéines PR (Pathogenesis-Related) ont été identifiées chez de nombreuses espèces

végétales. Elles s’accumulent lors des stress biotiques et abiotiques (Stinzi et al. 1993). C’est

chez le tabac qu’elles sont les plus étudiées et caractérisées. Van Loon et Van Strien (1999),

ont classé les protéines PR en 14 familles selon leurs homologies de séquences, leurs parentés

sérologiques et leurs activités biologiques (tableau IN.4). Certain protéines PR sont des

hydrolases, telles que les chitinases et les lyzozymes PR-3, PR-4, PR-8 et PR-11 (Legrand et

al. 1987; Ponstein et al. 1994; Brunner et al. 1998) et les glucanases PR-2 (Kauffmann et al.

1987), capables de dégrader directement les parois des champignons et des bactéries. La

classe des PR-1 est clairement associée à la défense, comme le montre l’augmentation de la

tolérance face aux oomycètes chez le tabac surexprimant PR1 (Alexender et al. 1993). Les

PR-5 sont des protéines de petit poids moléculaire, sont induites par divers agents pathogènes,

et présentant des propriétés antifongiques (Vigers et al. 1991). Les plantes luttent contre les

27

protéases et les polygalacturonases secrétées par les agents pathogènes en synthétisant des

inhibiteurs de protéinases (PR-6) (Ryan 1990) et de polygaracturonase (Cervone et al. 1989).

La classe des PR-7 représente des protéases dont le rôle effectif dans la défense n’a pas été

caractérisé contrairement aux PR-10 structurellement proches des ribonucléases, dont

l’activité ribonucléasique a été démontrée (Kombrink et Somssich, 1995). Les PR-9 sont des

peroxydases H2O2-dépendantes dont le rôle est de renforcer la paroi végétale (Fritig et al.

1998). La classe des PR-12, appelées également défensines, inhibe la croissance fongique en

perméabilisant la membrane des champignons (Thevissen et al. 1999). Un rôle identique a été

attribué aux PR-13, appelées thionines. La famille des PR-14 comporte des protéines non

spécifiques transportant les lipides ou LTP (Molina et García-Olmedo 1993). Récemment

deux autres classes ont été ajoutées PR15 et PR16 qui comportent des protéines germine et

germine-like (Edreva 2005). La PR16 a été isolée à partir du piment durant sa réaction de

résistance à une infection bactérienne et virale (Park et al. 2004).

Tableau IN.4: Les différentes classes des protéines PR (d’après Van Loon et Van Strien, 1999).

28

3.3. Système antioxydants

3.3.1. Effet néfaste des ROS

L’intégrité des cellules, les activités de divers enzymes, les substances nutritives et les

équipements photosynthétiques sont tous sujets à de graves dommages causés par les ROS

(Zhu 2001; Hérouart et al. 2002) produites en conditions de développement normal ou sous

stress biotique et/ou abiotique. Les principaux composants cellulaires susceptibles d’être

dégradés par ces molécules sont les acides gras insaturés des lipides membranaires qui

subissent une péroxydation (Bowler et al. 1992; Blokhina et al. 2003). Cette réaction produit

des radicaux alcooxyls qui s’attaquent aux pigments, tels que les chlorophylles et provoquent

leur oxydation (Heiser et al. 1998). L’oxydation de la chlorophylle entraîne la perte de la

capacité photosynthétique des chloroplastes. De même, la peroxydation des lipides

membranaires conduit à la dégradation des membranes cellulaires. Cet effet est associé à une

altération de l’activité respiratoire au niveau de la membrane interne des mitochondries, ainsi

qu’à une perte d’électrolytes par la membrane plasmique conduisant enfin à la mort cellulaire

(Scandalios, 1993). Les ROS provoquent aussi la cassure des brins des acides nucléiques, la

fragmentation des désoxyriboses et la modification des bases azotées (Becana et al. 1998)

induisant des mutations supplémentaires, ce qui augmente la fréquence des mutations

spontanées de l’ADN (Santos et al. 2000). Les ROS peuvent aussi dénaturer les protéines

induisant une perturbation de leur fonctionnement (Bowler et al. 1992; Sreenivasulu et al.

2000).

3.3.2. Protection contre les ROS

Pour se protéger contre l’effet toxique des ROS endogènes et celles générées par une

attaque de parasite, les plantes sont dotées d’un système antioxydant qu’on peut subdiviser en

deux classes (Lee et al. 2001; Hamilton et Heckathon 2001).

Le système antioxydant non enzymatique, qui est formé par des composants de faible

poids moléculaire dont les plus importants sont les tocophérols qui sont des substances

liposolubles associées à la membrane, connues pour neutraliser les ROS à ce niveau (Zhu,

2001). L’acide ascorbique (ASC) et le glutathion sont des réducteurs hydrosolubles présents

dans les tissus végétaux à des concentrations de l’ordre du millimolaire. Les plantes possèdent

aussi d’autres antioxydants comme les caroténoïdes, les flavonoïdes, le mannitol, la proline et

la glycinebétaine (Shen et al. 1997; Hamilton et Heckathon, 2001).

29

La deuxième classe du système antioxydant comporte un ensemble d’enzymes

antioxydantes dont principalement, la superoxyde dismutase [SOD: EC.1.15.1.1], la catalase

[CAT: EC.1.11.1.6], la guaïacol peroxydase [POX: EC.1.11.1.7] et l’ascorbate peroxydase

[APX: EC.1.11.1.11] qui agissent en complémentarité (Matamoros et al. 2003). La SOD est la

première à intervenir pour dégrader l’ion superoxyde en oxygène moléculaire et peroxyde

d’hydrogène qui sera ensuite éliminé par les autres enzymes mentionnées. Une

complémentarité existe aussi, entre les systèmes enzymatiques et non enzymatiques: les

enzymes réductrices de l’ASC telle que l’ascorbate réductase, sont impliquées dans le

maintien d’une activité antioxydante élevée, de même pour la glutathion réductase [GR:

EC.1.6.4.2], qui réduit le glutathion oxydé (Monk et al. 1989).

Un nombre croissant d’études a montré que la régulation fine du système antioxydant,

outre son rôle de détoxification des ROS, est impliquée dans le processus de signalisation

conduisant à l’activation des réponses de défense (De Gara et al. 2003). Cependant, la

diversité des systèmes utilisés pour l’étude de l’interaction plantes- microorganismes

pathogènes (tableau IN.5) rend les données difficiles à agencer pour déterminer si les

changements dans les systèmes antioxydants sont directement impliqués dans l’activation des

réponses de défense ou bien s’ils sont simplement la conséquence du stress oxydant survenant

dans les cellules attaquées. En effet, l’implication des systèmes antioxydants dans les

interactions plantes – agents pathogènes a été étudiée dans des plantes infectées par des

parasites différents du point de vue systématique (champignons, bactéries ou virus); de leur

stratégie d’attaque (parasites biotrophes, necrotrophes, extra- ou intra-cellulaire); ou de leur

virulence (tableau IN.5). Tirer des règles générales sur la régulation des systèmes

antioxydants dans les interactions plantes – agents pathogènes reste donc délicat. Toutefois, la

majorité des études suggère qu’il existe une coordination dans l’activité des enzymes

antioxydantes pour maintenir les ROS à un niveau compatible avec le métabolisme cellulaire

(De Gara et al. 2003).

30

Tableau Int.5: Liste de quelques études montrant la variabilité des systèmes utilisés pour comprendre la régulation du système antioxydant dans l’interaction plantes- parasites.

Plante hôte Parasites Nécrotrophe Biotrophe Champignon /

oomycète

Bactérie Virus Référence

Avena sativa Blumeria graminis - + + - - Vanacker et al. 1999

A. sativa Drechslera spp. + - + - - Gonnen et Schlösser 1993

Arabidopis thaliana Peronospora parasitica - + + - - May et al. 1996

A. thaliana Pseudomonas syringae - - - + - May et al. 1996

Brassica campestris Xanthomonas campestris pv. campestris - - - + - Gay et Tuzun 2000

Capsicum annuum Phytophtora capsici - + + - - Alcázar et al. 1995

Cicer arietinum Fusarium oxysporum f. sp. ciceri + - + - - García-Limones et al. 2002

Hordeum vulgare Botrytis graminis - + - - - Burhenne et Gregersen 2001

Lactuca sativa P. syringae pv. phaseolicola - - - + - Bestwick et al. 2001

Lupinus luteus Fusarium oxysporum f.sp. lupini + - + - - Morkunas et al. 2004

Lycopersicon esculentum Botrytis cinerea + - + - - Kuzniak et Sklodowska 1999

Medicago truncatula Phoma medicaginis + - + - - Djébali et al. 2007

Nicotiana tabacum Tobacco Mosaic Virus (TMV) - - - - + Mittler et al. 1999

N. tabacum Pseudomonas syringae pv. siringae - - - + - Baker et al. 2002

Phaseolus vulgaris P. syringae pv. phaseolicola - - - + - Croft et al. 1990

Prunus armeniaca Plum Pox Virus (PPV) - - - - + Hernández, et al. 2001

Solonacearum toberosum Pseudomonas syringae pv siringae - - - + - Baker et al. 2002

Triticum aestivum Puccinia recondita f.sp. tritici - + + - - Ivanov et al. 2005

T. aestivu Fusarium proliferatum-like + - + - - Kwon et Anderson 2001

Zea maidis Aspergillus flavus + - + - - Magbanua et al. 2007

31

3.3.3. Les principales enzymes du système antioxydant

Les enzymes du système antioxydant régulent différentes espèces des ROS. La SOD est

chargée de transformer les radicaux superoxydes en H2O2. L’élimination de ce dernier est

alors l’œuvre d’autres enzymes telles que la catalase et les peroxydases (Monk et al. 1989;

Becana et al. 2000; Matamoros et al. 2003).

3.3.3.1. L’activité superoxide dismutase

La SOD est une enzyme omniprésente dans les tissus des organismes consommateurs

d’oxygène. Le rôle principal de cette enzyme est de protéger l’organisme des effets

destructeurs du radical superoxyde (García-Limones et al. 2002) par une réaction de

dismutation pour donner le H2O2 qui est moins toxique (Bowler et al. 1992). Les SOD

représentent une famille de métalloenzymes, qui comporte au moins trois formes métalliques

selon la nature du métal incorporé dans le groupement prosthétique de l’enzyme (Cu/Zn SOD,

Mn SOD et Fe SOD). Comme pour la majorité des enzymes protectrices, l’activité SOD chez

une plante est dépendante de son état physiologique et elle varie en réponse aux différentes

contraintes biotiques et abiotiques (Gay and Tuzun 2000; Kwon et Anderson 2001; Mhadhbi

et al. 2004).

3.3.3.2. L’activité Catalase

La CAT décompose l’H2O2 en eau et en oxygène moléculaire sans besoin de réducteurs et

donc peut offrir à la plante un mécanisme de dégradation de H2O2 efficace nécessitant un

minimum d'énergie. Parallélement elle entraîne une augmentation du taux d'oxygène

(Scandalios et al. 1997). Les CAT des plantes supérieures sont des hémo-enzymes

tetramériques qui existent en multiples isozymes codées par des gènes nucléaires (Scandalios

et al. 1997); elles interviennent dans divers processus physiologiques: le développement, la

défense et la sénescence (Yang et Poovaiah 2002). L’expression des CAT est affectée par

plusieurs facteurs environnementaux tels que la lumière (Willekens et al. 1997), l’ozone

(Ruzsa et al. 1999), la température (Auh et Scandalios 1997), la salinité (Mhadhbi et al. 2004)

et les blessures (Guan and Scandalios 2000). Le rôle des CAT dans la défense contre les

agents pathogènes a été étudié à l’aide des plantes transgéniques montrant une surexpression

ou une diminution de l’expression de cette enzyme (Mittler et al. 1999; Dat et al. 2001;

Vandenabeele et al. 2004). La variation de l’activité CAT suite à l’infection dépend du

32

pathosystème étudié. En effet, une augmentation de l’activité CAT a été observée chez l’orge

suite à l’inoculation par une race avirulente de Blumeria graminis (Vanacker et al. 1999). Le

gène Cat2St chez la pomme de terre a été induit suite à l’infection par une espèce de

nématode et de bactérie (Niebel et al. 1995). Une corrélation positive a été trouvée entre

l’activité CAT dans l’embryon immature du maïs et la résistance à Aspergillus flavus

(Magbanua et al. 2004). Cependant, l’activité de cette enzyme n’a pas changée chez le blé

suite à l’infection par Fusarium proliferatum (Kwon et Anderson 2001), et Adam et al. (1998)

ont trouvé qu’elle diminue chez le Phaseolus vulgaris dans le cas de l’interaction compatible

et incompatible après inoculation par Pseudomonas syringae pv. phaseolicola.

3.3.3.3. Les peroxydases

Chez les plantes supérieures, on distingue trois grandes classes de peroxydases qui

montrent des différences dans leurs structures moléculaires: l’ascorbate peroxydase et la

gluthation peroxydase qui se caractérisent par une grande affinité pour leurs substrats

respectifs, l’ascorbate et le gluthathion; la guaïacol peroxydase ou peroxydase de classe III

qui présente une faible spécificité pour le substrat et constitue donc une classe de "peroxydase

non spécifique".

(a) L’activité guaïacol peroxydase

L'activité guaïacol peroxydase [POX : EC.1.11.1.7] utilise le peroxyde d'hydrogène

comme donneur d'électrons pour oxyder des composés phénoliques selon la réaction suivante:

Ces POX sont des hémoprotéines omniprésentes chez les eucaryotes et les procaryotes.

Elles présentent un large polymorphisme et sont codées par une famille de gènes issus de la

duplication et de la diversification d’un gène parental, suivi de l’acquisition de nouvelles

capacités enzymatiques (Tognolli et al. 1999). La guaïacol peroxydase appartient à une classe

de glycoprotéines localisées dans différents compartiments cellulaires (parois, mitochondries,

membranes, cytosol, vacuoles) et est impliquée dans différents processus physiologiques et

biochimiques, tels que le contrôle de la croissance des plantes et la lignification (El Mansouri

et al. 1999; Quiroga et al. 2000), l’épaississement de la paroi cellulaire par le pontage des

polysaccharides (Lin et Kao 1999), la réparation des blessures (Lagrimini 1991) et la défense

33

contre les parasites (Alcázar et al. 1995). On peut les classer en acides, neutres et basiques

selon leur point isoélectrique (Quiroga et al. 2000).

(b) L'activité ascorbate peroxydase

L’ascorbate peroxydase [APX : EC, 1.11.1.11] qui se caractérise par une grande affinité

pour son substrat, l’ascorbate, est une hémoperoxydase de classe I à structure dimérique. Elle

est retrouvée dans différents organites de la cellule (Matamoros et al. 2003). L’APX utilise

l'ascorbate comme accepteur d'électrons pour réduire le peroxyde d'hydrogène selon la

réaction suivante:

Le monodéhydroascorbate (MDHA) formé par cette réaction est spontanément transformé

en déhydroascorbate (DAsA), ou bien il est réduit en ascorbate sous l'action de la MDAsA

réductase en présence de NAD(P)H. Le DAsA est réduit en AsA par la DAsA reductase en

présence de glutathion (GSH). Le glutathion est ensuite régénéré par la GSH réductase en

présence de NAD(P)H. Cette cascade de réaction forme le cycle ascorbate-glutathion (Asada

1992; Shigeoka et al. 2002).

3.4 Régulation post-traductionel des mécanismes de défenses par adressage au

proteasome

La plupart des voies métaboliques sont régulées par un équilibre entre la synthèse et la

dégradation des enzymes qui les contrôlent. La protéolyse médiée par l’ubiquitine et le

protéasome 26S est un mécanisme de régulation central dans le contrôle de divers processus

cellulaires chez les végétaux (Devoto et al. 2003 ; Delauré et al. 2008). «L’ubiquitination»

indique la formation de liaison covalente entre le résidu C-terminal (Gly76) de l’ubiquitine et

un groupe ε-amino lysyl de la protéine cible (Smalle et Vierstra 2004; Welchman et al. 2005).

Tandis que, la poly-ubiquitination (attachement successif des ubiquitines l’une à l’autre sur la

protéine cible) mène la protéine vers la dégradation, la mono-ubiquitination de la protéine

cible conduit à un processus non protéolytique tel que le changement de l’activité de la

protéine, de sa localisation ou de son interaction avec d’autres protéines (Shnell et Hicke

2003). Le processus de poly-ubiquitination le plus caractérisé est celui de l’attachement

successif des ubiquitines l’une à l’autre au niveau du résidu Lys48. Les protéines soumises ce

type de poly-ubiquitination sont sujettes à la dégradation par le protéasome 26S (Smalle et

Vierstra 2004). Un autre type de poly-ubiquitination, dans le quel les ubiquitines sont

attachées entre elle au niveau du résidu Lys63 (Springael et al. 1999), a été impliqué au niveau

34

de l’activité des protéines, de la réponse au stress et la réparation de l’ADN (Shnell et Hicke

2003; Hoege et al. 2002; Shi et Kehrl 2003; Zhou et al. 2004). L’ubiquitination comprend

trois étapes, faisant intervenir l’activité successive de trois types d’enzymes, E1, E2 et E3,

considérées comme les acteurs principaux de la voie d’ubiquitination (Weissman 2001;

Vierstra 2003; Delauré et al. 2008) (figure IN.8). Par exemple chez Arabidopsis 2 gènes E1,

37 gènes E2 et plus de 1300 gènes E3 ont été répertoriés (Kraft et al. 2005; Mazzucotelli et al.

2006).

Figure IN.8: Mécanisme de protéolyse ubiquitine 26S/protéasome dépendante (d’après Viersta 2003). Au cours de ce cycle l’ubiquitine est activée par l’enzyme activatrice E1 puis transférée à une enzyme de conjugaison de type E2. Ensuite, deux voies sont possibles pour la fixation de l’ubiquitine par l’ubiquitine protéine-ligase E3 au substrat (i) soit en formant une liaison covalente avec l’ubiquitine, (ii) soit la E3 ne forme pas de lien direct avec l’ubiquitine. Une chaîne poly-ubiquitine est alors allongée ce qui permet la reconnaissance de la protéine ainsi marquée par le protéasome 26S. Avant dégradation de la protéine cible, l’ubiquitine est recyclée pour entrer dans un nouveau cycle.

3.4.1. Acteurs de la voie d’ubiquitination

3.4.1.1. Ubiquitine

L’ubiquitine (Ub), est une protéine très conservée composée de 76 acides aminés présente

chez tous les organismes eucaryotes (Delauré et al. 2008). Son implication dans un système

de dégradation de protéine ATP-dépendante a été mise en évidence par Wilkinson et ces

collaborateurs en 1980.

35

3.4.1.2. Enzyme d’activation de l’ubiquitine E1

L’enzyme E1 catalyse la première réaction de la voie d’ubiquitination des protéines, et

correspond à l’activation de l’ubiquitine. Elle utilise une molécule d’ATP et aboutit à la

formation d’une liaison thio-ester avec l’ubiquitine. Les enzymes E1 ne sont pas spécifiques

d’un processus ou d’une voie particulière et sont utilisées par différentes enzymes E2. Elles ne

sont présentes dans un organisme qu’en très petit nombre, et leur séquence est bien conservée

entre espèces (Bachmair et al. 2001).

3.4.1.3. Enzyme de conjugaison de l’ubiquitine E2

L’enzyme E2 sert de transporteur de l’ubiquitine. En effet, l’ubiquitine activée est ensuite

transférée de E1 sur le cite catalytique de E2 pour former un complexe intermédiaire (E2-Ub)

qui contrôlera par la suite la fixation de l’ubiquitine à un résidu lysine de la protéine cible. Les

enzymes E2 ont en commun un domaine conservé appelé Ubc (Ubiquitin conjugating),

responsable de la fonction biochimique de la protéine (Bachmair et al. 2001). A la différence

des E1, certaines E2 montrent une spécificité vis-à-vis des ubiquitine-protéine ligases avec

lesquelles elles fonctionnent (Kraft et al. 2005).

3.4.1.4. Enzymes de liaison de l’ubiquitine E3

Les enzymes E3 permettent la fixation de l’ubiquitine activée sur un résidu lysine du

substrat. Elles jouent un rôle central dans la reconnaissance des ces protéines cibles. Certaines

classes de ces enzymes peuvent prendre en charge physiquement l’ubiquitine et dans ce cas,

E3 a une activité catalytique. Mais dans la plupart des cas E3 sert d’adaptateur pour permettre

le rapprochement entre E2 et la protéine substrat, favorisant ainsi le transfert de l’ubiquitine.

Deux groupes majeurs de E3 ont été décrits dans la littérature (Moon et al. 2004 ;

Mazzucotelli et al. 2006): les ligases contenant un domaine HECT (Homology to E6-

associated protein C-Terminus) et les ligases avec un domaine RING (really interesting new

gene) ou RING-like appelé aussi domaine U-box. HECT E3 contien un site de liaison de E2

ubiquitiné (E2-Ub) et un résidu cystéine conservé qui permet par la suite l’attachement de

l’ubiquitine pour former le complexe HECT-E3-Ub avant le transfert de l’ubiquitine vers la

protéine cible (figure IN.9). En revanche, E3 du type RING permet la fixation du substrat et

de E2-Ub ce qui conduit au transfert direct de l’ubiquitine de E2 vers la protéine cible (Craig

et Tyers 1999). Deux type de RING E3 peuvent être distingués: le premier ayant une seule

sous-unité RING alors que dans le deuxième type, RING-finger constitue une sous-unité du

complexe E3 constitué de plusieurs protéines (Pickart 2001). La sous unité RING interagit

36

avec E2-Ub et la protéine cible (Zheng et al. 2000) (figure IN.9). Le deuxième type de RING

E3 formés de plusieurs sous unités protéiques (appelé aussi culline RING ligase) contient

toujours une protéine culline (ou culline-like) et une protéine RING-finger. Actuellement, sur

la base de la protéine culline dans ce complexe, quatre classes de culline RING ligase ont été

décrites: SCF (Skp1-Cullin-F-box), cullin3-BTB (Bric a brac, Tramtrack and Broad

complexe) (Gingerich et al. 2005), cullin4-DDB1 (UV-Damaged DNA Binding Protein1)

(Bernhardt et al. 2006) et APC (Anaphase Promoting Complexe) (Moon et al. 2004 ;

Mazzucotelli et al. 2006).

Figure IN.9: Les différents complexes de l’enzyme de liaison de l’ubiquitine E3 intervenant dans le processus d’ubiquitination (d’après Delauré et al. 2008). Dans première étape la E1 va activer et liée l’ubiquitine en utilisant une molécule d’ATP. Ensuite l’ubiquitine est transférée vers E2. Enfin, la E2 délivre l’ubiquitine à une protéine cible sous le contrôle de la ligase E3. Quatre types de ligases E3 sont décrites dans la littérature; ils sont discutés dans le paragraphe 3.4.1.4.

3.4.2. La dégradation par le protéasome 26S

Le protéasome est un gros complexe protéique à activité protéolytique, il est composé de

de deux parties différentes: le complexe 20S (CP 20S: Core Protease) et la coiffe 19S (RP

19S : Regulatory Particule). La CP 20S possède l’activité protéolytique alors que la RP 19S a

un rôle dans la reconnaissance et la préparation du substrat (figure. IN.10).

Le mécanisme de la protéolyse comporte 4 étapes. La première étape de reconnaissance

des protéines ubiquitinées, est faite par la coiffe. Deux sous unités de RP, RPN1 et RPN10

(Regulatory Particule Non ATPase) sont capables de lier l’ubiquitine (Elsasser et al. 2002 ;

Elsasser et al. 2004). Elles pourraient être responsables de la reconnaissance du substrat

polyubiquitiné. Une fois reconnues, les protéines sont libérées de l’ubiquitine, c’est l’étape de

37

la dé-ubiquitination. Les sous unités RPN11 et RPN13 ont des activités protéolytiques

compatibles avec cette fonction (Verma et al. 2002). La troisième étape est celle de l’accès du

substrat à la sous unité enzymatique CP 20S. En effet, les études structurales de CP 20S

indiquent que seul un polypeptide linéaire peut entrer dans le tunnel et que l’accès à celui-ci

est bloqué par les parties N-terminales de sous-unités β (Groll et al. 1997). Par conséquent il

doit exister un mécanisme d’importation actif du substrat dans le complexe CP 20S. Cette

étape nécessite la dénaturation du substrat (Braun et al. 1999). Une fois à l’intérieur du

protéasome, la protéine est clivée en peptides de 7 à 9 acides aminés (Kisselev et al. 1999).

Figure IN.10: Organisation et structure du protéasome 26S (d’après Vierstra 2003). (a) organisation du complexe 20S « le corps » (CP : core protease). (b) Organisation du complexe 19S « la coiffe » (RP : regulatory particle). (c) structure et séquence des événements de dégradation de protéine ubiquitinée par le 26S proteasome.

3.4.3. Rôle dans la défense contre les agents pathogènes

Une somme de littérature de plus en plus importante a montré le rôle crucial des

mécanismes de dégradation des protéines par ubiquitination dans les mécanismes de défenses

des plantes contres les agents pathogènes (Devoto et al. 2003 ; Zeng et al. 2006 ; Delauré et

al. 2008). L’intervention de ce système de protéolyse dans la défense a été identifiée à

plusieurs niveaux: il peut influencer l’infection primaire, la propagation du parasite ou les

voies de signalisation de défense (Zeng et al. 2006 ; Delauré et al. 2008). L’implication dans

la HR de certaines protéines du système de dégradation des protéines par ubiquitination a

égélemement été montrée. Par exemple, l’extinction du gène SGT1 (Suppressor of G2 allele

of skp1), codant une protéine associée au complexe SCF à activité E3 ligase, supprime chez

38

Nicotiana benthamiana la HR induite par un virus, une bactérie ou des éliciteurs (Muskett et

Parker 2003). De plus, il a été suggéré que l’activation de certaines sous unités du CP 20S est

spécifique de la HR en réponse à une élicitine chez le tabac (Suty et al. 2003). Il semblerait

donc que le protéasome joue un rôle particulier dans les réactions de défense en dégradant des

protéines cibles spécifiques. Chez A. thaliana la protéine de résistance RPM1 est dégradée

lors de la HR (Boyes et al. 1998), suggérant ainsi l’intervention de du système de protéolyse

(Delauré et al. 2008). RPM1 interagit avec deux protéines RIN2 et RIN3 (RPM1-interacting

proteins) (Kawasaki et al. 2005), qui sont des protéines RING-finger suggérant qu’elles

fonctionnent comme des ligases E3 (Kawasaki et al. 2005). Chez la tomate l’étude du

fonctionnement du gène de résistance Cf-9 qui confère la résistance aux souches de C. fulvum

ayant le gène Avr9 (Rivas et Thomas 2002 ; Rivas et Thomas 2005), a permis d’identifier

plusieurs gènes ACRE (Avr9/Cf-9 Rapidly Elicited) qui répondent rapidement à la

reconnaissance spécifique Avr9/Cf-9 (Durrant et al. 2000). La plupart des gènes ACRE code

des composants des voies de signalisation: facteurs de transcription, protéines kinases et

protéines associées à la voie d’ubiquitination. Les deux gènes ACRE identifiés chez le tabac

ACRE74 (CMPG1) et ACRE276 (U-box17), essentiels pour l’activation de la HR médiée par

Cf-9, ont montré qu’ils codent pour 2 protéines U-box à activité ligase E3 in vitro (Gonzalez-

Lamothe et al. 2006; Yang et al. 2006).

4. MEDICAGO TRUNCATULA PLANTE MODELE POUR L’ETUDE DES INTERACTIONS PLANTE-

MICROORGANISME

4.1. Importance des légumineuses cultivées

Les légumineuses (Fabaceae) sont définies par leur structure florale spécifique, la cosse

de leur fruit et surtout par l'aptitude (88% des espèces examinées) à former des symbioses

fixatrices d'azote avec les bactéries de la famille des Rhizobiaceae (de Faria et al. 1989). Ces

plantes viennent en deuxième rang après les graminées pour la satisfaction des besoins

alimentaires de l'homme (Graham et Vance 2003). Les légumineuses comptent 670 à 750

genres et 18000 à 19000 espèces différentes (Polhill et al. 1981). Elles comprennent

d’importantes espèces à graines, de pâturage et forestières. Au niveau mondial les

légumineuses à graines et de fourrage occupent près de 180 millions d’hectares représentant

12 à 15% de la surface des terres arables (F.A.O. 2007). Les légumineuses à graines couvrent

33% des besoins humains en protéines alimentaires. Cette part est fournie, essentiellement,

par les cultures du haricot, petit pois, pois chiche et fève (Vance et al. 2000). Les graines des

légumineuses contiennent généralement 20 à 30% de protéines et sont particulièrement riches

39

en Lysine (acide aminé essentiel pour la croissance). Elles sont, de ce fait, complémentaires

des profils nutritionnels des céréales (Duranti et Gius 1997), et représentent les principales

sources de protéines dans les pays en voie de développement et dans les régions subtropicales.

Parmi les légumineuses, le soja (Glycine max) et l'arachide (Arachis hypogea) fournissent

plus de 35% des besoins mondiaux en huiles végétales (F.A.O. 2007). Les légumineuses

fourragères, telles que la luzerne (M. sativa) et le trèfle (Trifolium spp.) constituent une base

importante de l’alimentation des productions animales laitières et à viande en raison de leur

faible coût, et de leurs qualités nutritives (richesse en azote, énergie et fibre) de la production

de viande et de lait dans le monde (Russelle 2001), vu leurs richesses en protéines, fibres et

énergie.

En plus de ces qualités alimentaires, les légumineuses jouent un rôle capital dans la

préservation de l’environnement. L'azote est en effet l'élément nutritif le plus limitant de la

production des plantes dans la plupart des écosystèmes naturels. Les légumineuses, via leurs

capacités symbiotiques, peuvent contribuer à la colonisation des écosystèmes peu fertiles. De

nombreux genres d'arbres forestiers tels que Acacia, Anadenathera, Calliandra, Dalbergia,

Eryhtrina, Gliricidia, Melanoxylon, Parkea, Prosopis, Petrocarpus, Samanea... (Sprent et

Parsons 2000) font également partie de cette famille et sont importants pour l'enrichissement

des sols en azote et la réimplantation des zones endommagées par les mines et les carrières.

Enfin, ces espèces ligneuses ont également montré une aptitude à séquestrer le carbone, ce qui

suggère aussi la possibilité de les utiliser pour s'opposer à l'augmentation du taux de dioxyde

de carbone dans l'atmosphère (Resh et al. 2002).

Enfin outre ces bénéfices qu’elles entraînent pour l’alimentation et l’environnement, les

légumineuses peuvent être utiles dans diverses industries alimentaires (lait et dérivés, pain,

tourteau) et chimiques (plastique biodégradable, huile, bio-diésel, colorants, gomme, textile,

papier…) (Graham et Vance 2003). Plusieurs légumineuses ont été utilisées dans l'industrie

pharmaceutique (Duke 1992; Kindscher 1992). Les isoflavones du soja et d'autres

légumineuses ont été préssenties pour diminuer les risques de cancer et les effets du

cholestérol (Kennedy 1995; Molteni et al. 1995).

Bien qu’importantes sur les plans économique, écologique et industriel, les légumineuses

cultivées présentent des caractéristiques biologiques qui retardent leur amélioration génétique.

Elles possèdent en général un grand génome, sont souvent polyploïdes et leur transformation

par Agrobacterium est délicate voire impossible. C’est pourquoi il a été décidé d’identifier

une espèce légumineuse modèle qui serait plus facile à manipuler et à étudier, et qui

40

permettrait, via sa synthénie avec les légumineuses cultivées, d’accélérer les recherches

fondamentales et l’amélioration génétique concernant les traits agronomiques d’intérêt.

4.2. Medicago truncatula plante modèle

M. truncatula a été proposée comme légumineuse modèle (Barker et al. 1990; Cook 1999)

en raison de ses nombreux atouts aux niveaux de la biologie, de la génétique et des différents

outils génomiques qu’elle offre (Huguet et Prospéri 1996; Young et al. 1995). De plus, M.

truncatula présente une grande synthénie avec beaucoup de légumineuses cultivées tels que le

pois et la luzerne pérenne (Zhu et al. 2005), permettant ainsi le transfert des acquis sur cette

plante modèle vers ces légumineuses. Ces avantages sont mis à profit pour des études de

génomique fonctionnelle et structurale en vue de l’identification des gènes agronomiques

intéressants, ainsi que l’étude des interactions légumineuses-agents pathogènes et symbiotes

(Cook 1999; Cook et al. 2000).

4.2.1. Caractéristiques biologiques

Une seule plante peut produire entre 500 et 1000 graines. M. truncatula est capable

d’effectuer à la fois une symbiose avec Sinorhizobium meliloti et avec des endomycorhizes

contrairement à A. thaliana. Elle est apte à la transformation par agrobactérie et à la

régénération par embryogenèse somatique. Elle est hôte d’un grand nombre d’agents

pathogènes (champignons, oomycètes, bactéries et virus) qui attaquent les légumineuses

cultivées (Tivoli et al. 2006; Rose 2008).

4.2.2. Caractéristiques génétiques

Elle est diploïde (2n=16), autogame et annuelle. Elle possède un génome de faible taille,

550 Mpb soit environ 4 fois celui d’A. thaliana (Blondon et al 1994). Elle présente une forte

variabilité biologique pour le port, la périodicité des plantes, le nombre des graines par

gousses, l’efficacité de nodulation et de fixation de l’azote. La réponse aux parsites (Cook et

al. 2000) A mis en évidence des réactions contrastées dans différents génotypes peremttant

donc d’envisager plus facilement des approches génétiques pour identifier les régions du

génome impliquées dans le caractère étudié. Il existe une forte synténie (conservation de

l’ordre d’alignement des marqueurs ou des séquences le long des chromosomes) entre le

génome de M. truncatula et de plusieurs autres légumineuses, notamment de M. sativa et du

pois (Zhu et al. 2005 ; Loridon et al. 2005 ; Aubert et al. 2006). Des outils génétiques (cartes

génétiques et RILs) ont été générés par plusieurs laboratoires (Thoquet et al. 2002; Choi et al.

41

2004; Julier et al. 2007; kamphuis et al. 2008). M. truncatula est facilement transformée par

Agrobacterium rhizogenes et A. tumefascience (Boisson-Dernier et al. 2001)

4.2.3. Outils de génomique disponibles

La grande majorité du génome exprimé est situé dans l’euchromatine, dont le séquençage

sera terminé fin 2008 (Young et al. 2005). L’annotation des BACs séquencés de M.

truncatula est disponible sur le lien http://www.Medicago.org/genome/. Une cinquantaine de

banques d’ESTs réalisée à partir de différents organes et lors de différents processus

biologiques et physiologiques est également disponible (http://www.tigr.org/tdb/e2kl/mtal/).

Plusieurs banques de mutants existent aussi.

4.2.4. M. truncatula, source de résistance aux parasites des légumineuses cultivées

L’analyse globale des réactions de défense suppose avant tout le choix d’un système

d’étude mettant en jeu des lignées sensibles et résistantes de plantes vis-à-vis d’un agent

pathogène afin d’identifier par la suite les mécanismes différentiels entre les lignées choisies

qui permettront de mieux comprendre les composants de la résistance. Des criblages de

populations naturelles de M. truncatula par différents agents pathogènes ont été réalisés

(tableau IN.6). Ils montrent le niveau élevé de variabilité naturelle présent chez M. truncatula.

Dans tous ces cas, des lignées présentent des comportements différentiels allant de la

sensibilité jusqu’à des niveaux de résistance plus ou moins élevés. Ainsi un très fort niveau de

résistance se traduisant par une réaction hypersensible, a été observé vis à vis de l’agent

responsable de l’anthracnose de la luzerne, du mildiou du pois et de la rouille de la luzerne

reproduisant ainsi le phénotype observé chez les lignées résistantes de la légumineuse cultivée

correspondante. Pour les autres pathosystèmes des réponses contrastées ont été mises en

évidence, mais avec des résistances partielles et/ou quantitatives, se traduisant le plus souvent

par une diminution de l’intensité des symptômes observés chez la lignée résistante. Ces

réponses contrastées aux parasites, permettent de mettre en place des croisements entre les

parents sensibles et résistants, afin d’analyser plus tard la ségrégation de la résistance et

d’identifier d’éventuel QTL de résistance. Ainsi des analyses génétiques ont été conduites soit

à partir de populations F2 (Kamphuis et al. 2008) ou de populations de lignées recombinantes

ou RILs (Ameline-Torregrosa et al. 2008a, Vailleau et al. 2007). Dans ces différents travaux

plusieurs QTLs majeurs ont été identifiés. Très souvent, ces QTLs co-localisent avec des

clusters de RGA dont une étude récente a montré que ces gènes représentent environ 2% du

génome de M. truncatula et sont particulièrement concentrés sur les chromosomes 3, 4 et 6

(Améline-Torrégrosa et al. 2008b).

42

Tableau IN.6: Résumé des études illustrant la variabilité naturelle de réponse de M. truncatula aux agents pathogènes de légumineuses.

Pathogène Lignées de Medicago truncatula

QTL identifié

Position sur la carte

Niveau de résistance le plus élevé*

Référence

Colletotrichum trifolii Collection US A17 x F83005.5 A17 x F83005.5

- 2 1

- LG4/LG6 LG4

HR HR HR

O’Neill and Bauchan 2000 Torregrosa et al. 2004; Ameline-Torregrosa et al. 2008a Yang et al. 2007

Erysiphe pisi Collection US A17/DZA315.16

- 3

- LG4 et LG5

HR HR

Yaege et Stuteville 2002 Ameline-Torregrosa et al. 2008a

Aphanomyces euteiches Collection US A17 x F83005.5 Collection française

- 1 -

- LG3 -

T T R

Vandemark et Grunwald 2004 Cette thèse Moussart et al. 2007

Phoma medicaginis

Collection US Collection SARDI DZA45.5 / F83005.5 SA27063 x SA3054 SA27063 x A17

- - - 1 1

- - - LG8 LG4

- HR T HR HR

O’Neill et al. 2003 Ellwood et al. 2006 Djébali et al. 2007 Kamphuis et al. 2008 Kamphuis et al. 2008

Uromyces striatus SA29831 / SA22182 DZA.045/Jemalong

- -

- -

HR HR

Rubiales et Moral 2004 Kemen et al. 2005

Peronospora trifoliorum Collection US - - HR Yaege and Stuteville 2000

Ralstonia solanacearum A17 x F83005.5 3 LG3, LG5 et LG7 HR Vailleau et al. 2007

Mycosphaerella pinodes Collection française - - R Moussart et al. 2007

* HR : Réaction hypersensible, T : tolérance, R : résistance élevée mais pas totale.

43

5. LES MALADIES IMPORTANTES SUR LEGUMINEUSES

Les maladies fongiques notamment, constituent un des principaux facteurs limitant des

productions des légumineuses. Des descriptions des maladies aériennes et racinaires,

selectionnées pour leurs impacts économiques dans la région méditérannéenne, ont été

rassemblé dans cette deuxième partie de l’introduction. Les paragraphes concernant P.

medicaginis et A. euteiches, utilisés au cours de ce travail, ont été plus étoffés que pour les

autres parasites cités.

5.1. Les maladies de la partie aérienne

5.1.1. Colletotrichum trifolii

Les symptômes occasionnés par C. trifolii sont essentiellement des nécroses sèches

caractéristiques, qui apparaissent sur les tiges et les feuilles de la luzerne. La forme principale

de dissémination de ce champignon est constituée par les conidies, hyalines et unicellulaires,

produites à partir d’acervules. Les débris végétaux constituent la source majeure d’inoculum

du champignon, dont la dispersion est assurée par les insectes, le matériel agricole et l’eau de

ruissellement. C. trifolii possède un mode de développement de type hémibiotrophe dans

lequel une phase biotrophe de quelques jours, est suivie d’une phase nécrotrophe. Après

germination, les conidies du champignon forment une structure infectieuse appelée

appressorium qui permet l’adhesion puis la pénétration directe du champignon dans les tissus

de l’hôte à travers la cuticule. Durant cette phase, des hyphes primaires sont formés et les

tissus de la plante ne semblent pas être affectés par la croissance du parasite (Perfect et al.

1999). Après quelques jours, des symptômes de macération des tissus de la plante

apparaissent, c’est le début de la phase nécrotrophe, caractérisée du côté du parasite par la

production de nombreuses enzymes lytiques qui sont à l’origine de dégradation des parois des

cellules de l’hôte (Dumas et al. 2000).

5.1.2. Erysiphe polygoni

Connu sous le nom d’oïdium, il se caractérise par un mycélium incolore et se développe à

la surface des feuilles en y envoyant des suçoirs assurant sa fixation et sa nutrition. Il forme à

la surface des feuilles des colonies arrondies puis confluentes d’aspect blanc poudreux

(Messiaen et al. 1991). Erysiphe polygoni f. sp. pisi cause les dégats les plus importants sur

pois en climat méditerranéen, où il peut provoquer le dessèchement prématuré du feuillage et

44

l’échaudage des pois secs (Messiaen et al. 1991). Des cultivars résistants de pois sont

disponibles sur le commerce et sont recommandés dans les zones géographiques présentant un

risque élevé pour cette maladie. Un semis précoce réduit le risque d'oïdium. La pulvérisation

de fongicide (cyproconazole, difénoconazole, propiconazole, soufre) peut être appliquée si

nécessaire.

5.1.3. Botrytis fabae

Il est l’agent causal de la maladie des tâches chocolatées chez la fève (Nasraoui 2000). Le

parasite provoque sur les feuilles plusieurs petites tâches de couleur brun rougeâtre. En

conditions favorables de température et d’humidité, le champignon progresse dans les tissus

foliaires, les tâches grandissent et fusionnent entre elles. Celles-ci se caractérisent par une

couleur brunâtre à noirâtre au centre et sont entourées d’une lisière de couleur chocolatée

(Agrios 1988). Le champignon fructifie sur ces nécroses sous forme d’un feutrage gris et

libère des spores aptes à provoquer de nouvelles infections. Ce champignon provoque

d’importants dégâts sur la culture de la fève en Tunisie (Kharrat et al. 1996).

5.1.4. Ascochyta rabiei

C’est l’une des maladies les plus graves sur la culture du pois chiche (Cicer arietinum) au

Nord d’Afrique et en Asie de l’Ouest (Porta-Puglia 1990; Hamza et al. 2000). Des pertes de

récoltes allant jusqu’à 100% ont été enregistrées dans le cas du pois chiche semé en hiver. A.

rabiei, attaque feuilles, tiges, gousses et graines du pois chiche (Nasraoui 2000). Les attaques

sur la tige se manifestent par des lésions allongées de couleur brun foncée sur lesquelles se

forment les pycnides du champignon. Sur les feuilles, les attaques se manifestent par des

nécroses arrondies sur lesquelles se forment les pycnides en cercles concentriques (Nene et

Reddy 1987).

5.1.5. Mycosphaerella pinodes

Cest le principal agent causal de l’anthracnose du pois, engendrant d’importants dégâts sur

cette légumineuse à travers le monde (Bretag et Ramsey 2001). Des dégâts très sévères ont été

particulièrement signalés sur le rendement et la qualité du pois en France (Tivoli et al. 1996)

et au Canada (Chang et al. 1999). Ascochyta pisi, et Phoma medicaginis var. pinodella ont été

aussi associés à la maladie d’anthracnose chez le pois (Bretag et Ramsey 2001 ; Tivoli et

Banniza 2007). M. pinodes provoque l'apparition d'un grand nombre de petites taches brun

45

foncé ou violettes sur les parties aériennes des plantes. Ces taches peuvent devenir des petites

zones imbibées d'eau qui peuvent grossir, fusionner et détruire entièrement les parties

atteintes de la plante en quelques jours. La maladie se développe rapidement en conditions

chaudes et humides. M. pinodes peut également provoquer la pourriture du pied, c'est-à-dire

une pourriture noire localisée principalement autour de la zone cotylédonaire. Tivoli et

Banniza 2007, rapportent que M. pinodes est l’espèce dominante sur culture de pois en

France. Au champ, les épidémies réduisent (i) la croissance, principalement à cause d'une

perturbation de l'efficience de conversion du rayonnement du couvert et à une baisse de la

photosynthèse des feuilles malades (ii) les remobilisations des assimilas azotés stockés dans

l'appareil végétatif vers les graines en remplissage, et (iii) la durée du remplissage. Ainsi, la

chute du nombre et du poids des graines est due à un effet indirect de la maladie sur la

production de ressources carbonées et peut-être par un blocage des remobilisations azotées.

Les attaques d'anthracnose sur les gousses peuvent réduire directement le nombre et le poids

des graines.

Le complexe parasitaire de l’anthracnose se transmet par les semences (Tivoli et Banniza

2007). Le meilleur moyen d'éviter la maladie est d'utiliser des semences saines produites dans

des régions sèches. Le traitement des semences avec un fongicide peut réduire le nombre de

plantes infectées. Il faut pratiquer une rotation culturale car les traitements de semences ne

permettent pas de contrôler efficacement des niveaux élevés d'inoculum présent dans le sol.

Aucune résistance génétique à M. pinodes n'est disponible chez les cultivars commercialisés

même si des sources de résistance ont été identifiées (Zhang et al. 2006). Des tentatives de

recherche de nouvelles sources de résistance chez M. truncatula ont permi de montrer

l’existence d’un haut niveau de résistance chez cette légumineuse (Tivoli et al. 2006 ;

Moussart et al. 2006).

5.1.6. Phoma medicaginis

5.1.5.1. Systématique

Les isolats du genre Phoma provoquant la maladie des tiges noires sur les Medicago spp.

sont décrits appartenant à l’espèce P. medicaginis Malbr. & Roum. in Roum. var medicaginis

Boerema (syn. P. herbarum Westend. var. medicaginis Fckl. et Ascochyta imperfecta Peck),

un ascomycète de forme sexuée inconnue. Dans CABI Bioscience, une base de donnée

internationale pour la systématique des champignons, P. medicaginis est mis dans la classe

des Dothideomycetes, et la sous-classe des Pleosporales. Dans leur étude Wang et al. (2004)

46

ont pu isolés des tiges de la luzerne montrant les symptômes de la maladie des tiges noires

deux autres espèces Phoma sclerotioides et Phoma exigua qui ont montré les même

symptômes d’attaque que P. medicaginis dans un essai d’inoculation in vitro. Ces auteurs ont

déduit que P. medicaginis n’est pas le seul agent pathogène à l’origine de la maladie de la tige

noire.

5.1.5.2. Biologie et dégâts

Cette maladie provoque des chancres allongés sur les tiges avec des spots sur les feuilles

(figure IN.11A). Les feuilles attaquées jaunissent et finissent par tomber entraînant ainsi une

défoliation complète de la plante lors d’une grande infection. Les chancres sur les tiges

grandissent et peuvent atteindre le collet et les racines de la plante provoquant leurs

dépérissements (figure IN.11B) (Barbetti et Nichols 1991). Cette maladie se propage

rapidement en temps frais et humide, conditions favorables pour le développement des

pycnides (140- 235µm de diamètre) qui sont des structures de production des conidies (6,3-

11,1 x 2,1- 2,3µm). La dissémination des conidies de P. medicaginis est favorisée par la pluie

et le vent (Angevain 1983). Les pycnides se conservent pendant l’hiver sur les tiges mortes et

assurent les contaminations du printemps. L’épidémie connaît deux phases de

développement : la principale au printemps et la seconde en automne (Angevain 1983).

Cet ascomycète est une des maladies les plus courantes sur les cultures de luzerne (M.

sativa) dans les régions tempérées et méditerranéennes: Afrique du Sud, Europe, Amérique du

Nord (Angevain 1983 ; Gray et al. 1990). En Australie, P. medicaginis pose un problème pour

les cultures fourragères des Medicago annuelles (Barbetti 1983), réduisant la production de

matière fraîche aérienne ainsi que la production en graines (Crawford et al. 1989 ; Barbetti et

Nichols 1991). Barbetti (1995) indique aussi une réduction dans le poids moyen des graines

de 37,3% chez les cultivars sensibles. Les champignons pathogènes foliaires, y compris P.

medicaginis, induisent chez les variétés sensibles de luzerne la production de composés

phyto-oestrogénique tels que le coumestrole (Barbetti 1995) dont l’ingestion par les moutons

femelles affecte leur ovulation (Smith 1979).

47

Figure IN.11: Symptômes d’attaque de Phoma medicaginis sur Medicago (d’après Tivoli et al. 2006). (A) Nécroses sur feuilles (B) Chances allongées sur tige, (C) Essai variétal de sélection d’accessions résistantes à l’attaque de P. medicaginis. Noter le jaunissement et la réduction de croissance des accessions sensibles (flèches).

5.1.5.3. Méthodes de lutte contre P. medicaginis

Le moyen de lutte culturale le plus préconisé pour cette maladie est le fauchage de la

luzerne avant l’apparition des symptômes de la maladie. Cependant, ceci ne peut pas se faire à

n’importe quel moment car on aura d’un côté une réduction de la matière fraîche récoltée et

d’un autre côté l’épuisement de la luzernière suite à des fauchages successifs. D’un autre côté

la lutte chimique contre cette maladie s’est avérée inefficace (Nutter et al. 2002). De ce fait, la

lutte génétique contre cette maladie reste la voie la plus appropriée, offrant une protection

durable et à moindre coût (Tivoli et al. 2006). Jusqu’à maintenant les efforts de sélection

n’ont permis de sélectionner que des variétés de luzerne présentant un niveau moyen de

résistance. De ce fait plusieurs équipes se sont orientées vers l’exploitation de la variabilité

naturelle chez les espèces annuelles de Medicago pour la recherche de nouvelles sources de

résistance à ce parasite (Wang et al. 2004). Une variabilité de réponse très intéressante a été

décrite chez les espèces annuelles de Medicago suite à l’infection par plusieurs champignons

(Tivoli et al. 2006) dont P. medicaginis (Barbetti 1995 ; Skinner et al. 1999; O’Neill et al.

2003; De Haan et al. 2002; Ellwood et al. 2006). Récemment, Kamphuis et ces collaborateurs

(2008), ont pu déterminer deux QTLs récessifs résistance à P. medicaginis chez M. truncatula

48

en utilisant deux populations RILs en F2 issues du croisement de l’accession résistante

SA27063 avec deux sensible A17 et SA3054. Ces QTLs notés rnpm1 et rnpm2 ont été

localisés sur les chromosomes 4 (SA27063 x A17) et 8 (SA27063 x SA3054) et expliquant

respectivement 33,6% et 29,6% de la variation phénotypique observée. L’existence de deux

QTLs séparées en utilisant deux populations RILs montre selon ces auteurs qu’il y a des

locus, conférant une sensibilité génotype-spécifique, qui interagissent avec des facteurs de

virulence inconnue chez P. medicaginis.

5.2. Les maladies de la partie racinaire

5.2.1. Fusarium oxysporum

Le pois chiche est attaqué par Fusarium oxysporum f. sp. Ciceri. Ce champignon

provoque un jaunissement suivi par un flétrissement et l’effondrement des plantes (Nene et

Reddy, 1987). Ce champignon agit en obstruant les vaisseaux conducteurs du xylème et par la

production de toxines qui sont transportées par le flux ascendant de la sève jusqu’aux feuilles

où elles affectent la production de la chlorophylle et réduisent ainsi la photosynthèse. Les

toxines agissent aussi sur la perméabilité des cellules membranaire des feuilles et perturbent

ainsi la transpiration, ceci entraîne le flétrissement des feuilles suivi par des nécroses inter-

nervaires (Agrios, 1988). La fusariose du pois causée par F. oxysporum f. sp. pisi, qui se

manifeste par des chloroses foliaires, est favorisée par les températures élevées du sol

(optimum entre 25° à 30°C) et l'humidité modérée. Les feuilles s’enroulent ensuite vers le bas

et deviennent flasques. Les plantes finissent par flétrir. Souvent le système vasculaire aérien et

souterrain prend une couleur jaune clair à rouge brique. Cette maladie est souvent sévère dans

les parcelles où on pratique des rotations courtes avec d’autres cultures (Kraft 1994).

5.2.2. Verticilium albo-atrum

C’est un champignon du sol responsable d’une maladie vasculaire, la verticilliose. Présent

dans plusieurs pays du monde, il infecte un très grand nombre d’espèces végétales (luzerne,

pomme de terre, tabac, abricotier, chrysanthème, rosier, etc.). Il entre dans la racine à partir

des blessures ou activement à travers les tissus sains. En pénétrant dans les vaisseaux

conducteurs, il provoque leur obstruction ce qui conduit au symptôme de flétrissement. Il se

conserve dans les résidus de culture enfouis dans le sol. Une température moyenne de 21°C à

24°C favorise le développement de la maladie, qui apparaît habituellement au milieu de l'été

49

et provoque un flétrissement soudain. Les symptômes peuvent toucher seulement un rameau

ou deux ou bien s'étendre à l'ensemble de la plante. Le champignon est disséminé par les

graines, les débris végétaux infectés, le contact entre racines, les outils, l'air et l'eau. Il peut

aussi être disséminé par les insectes ravageurs, prédateurs et pollinisateurs, ainsi que par le

pollen de luzerne. Les symptômes d’attaque de V. albo-atrum se manifestent par une

décoloration des tissus foliaires qui deviennent de couleur jaune puis brune. Sur le collet, on

constate que la cuticule devient légèrement liégeuse et grise en présentant des crevasses; en

coupe transversale et longitudinale, la zone des vaisseaux conducteurs apparaît souvent

légèrement brunâtre. Les plantes attaquées deviennent naines, flétrissent et finissent par

mourir (Wirth et Joseph 1994).

5.2.3. Aphanomyces euteiches

5.2.3.1. Systématique et symptômes

Le genre Aphanomyces appartient au règne des Chromista, à la classe des oomycètes et à

la famille des Saprolegniaceae (Nasraoui 2000). Ce genre comprend des espèces responsables

de maladies affectant des organismes végétaux et animaux. A. euteiches infecte plusieurs

espèces annuelles et pérennes de la famille des légumineuses: pois (Pisum sativum L.), fève

(Vicia faba L.), pois chiche (Cicer arietinum L.), lentille (Lens culinaris L.), lupin (Lupinus

alba), vesse (Vicia sativa), trèfle (Trifolium repens et T. pratense), haricot (Phaseolus

vulgaris L.) et luzerne pérenne (Medicago sativa L.) (Hughes et Grau 2007 ; Moussart et al.

2008a). Les premiers symptômes commencent à apparaître sur les racines qui deviennent de

couleur jaunâtre puis prennent une teinte brune (figure IN.12A). Les symptômes de pourriture

sont relativement communs pour les espèces attaquées. A un stade plus avancé de l’infection,

les symptômes apparaissent sur le collet qui prend une couleur brun pâle (Gaulin et al. 2007).

Ensuite, la maladie progresse vers la partie aérienne provoquant la chlorose (jaunissement)

des cotylédons et la nécrose (mort et décoloration) de l’épicotyle. A l’échelle de la parcelle,

les symptômes de cette maladie se manifestent par un jaunissement des plantes, qui apparaît

par foyer (figure IN.12B). Les symptômes de chlorose sont d’autant plus aggravés par que les

plantes attaquées manifestent une réduction de la nodulation (Gilbert 2003). Les plantes

infectées qui arrivent à terme de leur cycle végétatif produisent un nombre faible de gousses

avec de petites graines. Dans le cas où le sol est fortement infesté et lorsque les conditions

climatiques sont favorables, les plantes meurent avant même la production de gousses (Gilbert

2003). Les symptômes les plus accentués ont été remarqués sur des parcelles avec un faible

drainage d’eau résultant d’une texture du sol très argileuse et/ou à une irrigation excessive.

50

Figure IN.12: Symptôme d’attaque d’A. euteiches sur racine de pois (A) et au champs (B). Noter le brunissement sur racine et le jaunissement des feuilles (d’après INRA Rennes).

5.2.3.2. Biologie

A. euteiches est caractérisé par des hyphes coenocytiques et homothalliques. Il produit des

zoospores biflagellées qui permettent sa dissémination lorsque les conditions sont favorables à

l’infection. Les noyaux dans les hyphes végétatifs et dans les zoospores sont diploïdes. La

spore sexuée chez ce parasite est appelée oospore, c’est une structure sphérique avec une

double paroi cellulaire ce qui permet sa conservation dans le sol pendant plusieurs années en

absence de la plante hôte (jusqu’à 10 ans). Les oospores sont formées à la suite d’une

fécondation de l'oogone (gamétange femelle) par l’anthéridie (gamétange mâle). Selon

Malvick et Grau (2001), cette reproduction sexuée pourrait expliquer les variations

phénotypiques et génétiques observée entre les isolats d’A. euteiches. La température optimale

d’infection d’A. euteiches est établie entre 14°C et 18°C, cependant ce parasite est plus

destructeur si la température atteint 28°C avec un temps humide ou pluvieux. Un climat chaud

et sec permettra aux plants infectés d’exprimer les symptômes de manière plus rapide et

intense parce que les racines peu fonctionnelles amplifieront l’effet du manque d’eau (Gilbert

2003). Dans des conditions optimales, les symptômes de la maladie se déclarent dans les 10

jours après inoculation (Hughes et Grau 2007). La dissémination de l’inoculum d’A. euteiches

se fait horizontalement par l’eau à partir des foyers d’infestation (Moussart et al. 2008b).

5.2.3.3. Cycle de développement

Le cycle de développement d’A. euteiches se déroule dans la rhizosphère de la plante à

l’exception du mycélium qui peut coloniser aussi les parties aériennes de la plante hôte

(Levenfors 2003). Il comprend des étapes asexuées et des étapes sexuées qui se produisent

uniquement dans le sol (figure IN.13). La pourriture racinaire est considérée comme une

A B

51

maladie monocyclique (un seul cycle d'infection par saison). L'infection démarre par la

germination d'oospore à proximité de la plante hôte: l'oospore forme un tube germinatif et un

zoosporange terminal qui peut libérer plus de 300 zoospores qui se dirigent par

chimiotactisme vers les racines des plantes hôtes (Levenfors 2003). Au contact des tissus de la

plante, les zoospores perdent leurs flagelles et s’enkystent. Le processus de pénétration n’est

pas bien caractérisé chez A. euteiches, des structures « appressoria-like » n’ont été que très

rarement mentionnées (Cunningham et Hagedorn 1962). Une fois à l'intérieur des cellules de

l’épiderme racinaire les hyphes coenocytiques formeront, après quelques jours, les appareils

reproducteurs l'anthéridie et l'oogone. L’anthéridie pénètre l'oogone avec les tubes de

fertilisation, qui fournissent les noyaux mâles à l'oogone, ayant pour résultat la formation des

oospores diploïdes (Gaulin et al. 2007).

Figure IN.13: Cycle de développement d’A. euteiches (d’après Gaulin et al. 2007).

52

5.2.3.4. Moyens de lutte contre Aphanomyces euteiches

(a) Méthodes préventives

A l’heure actuelle, la meilleure méthode de lutte est préventive en évaluant les risques

d’attaque potentiels par la quantification de l’inoculum dans les parcelles avant semis. Dans le

cas des sols à faible inoculum, l'amélioration du drainage et la réduction du compactage du sol

réduisent l’impact de la maladie (Gilbert 2003). Pour les sols moyennent infectés, il est

conseillé de pratiquer de longues rotations. Pour les sols fortement infectés, la culture du pois

doit être abandonnée au profit d’autres légumineuses non-hôtes à ce parasite (Tivoli et al.

2006). Cependant, la quantification de l’inoculum par des bio-essais développés récemment

(Moussart et al. 2006) est une opération assez lourde surtout lorsqu’un travail à grande échelle

est envisagé.

(b) Lutte chimique

Actuellement, il n’y a pas d’anti-oomycète efficace disponible sur le marché. Plusieurs

tentatives de recherche de nouvelles substances à action efficace contre les oomycètes et

particulièrement A. euteiches ont été faites.

Une étude élaborée par Mitani et ses collègues (2001) a montré que le Cyazofamide

possède une activité élevée contre plusieurs oomycètes (Phytophthora, Plasmopara,

Pseudoperonospora, Pythium) et des Plasmodiophoromycètes (Plasmodiophora), ainsi q’une

sélectivité pour les oomycètes in vitro. En effet, il s’est avéré inactif contre les champignons

pathogènes appartenant aux groupes des Ascomycotina, Basidiomycotina et

Deuteromycotina. Ce produit inhibe la mobilité et la libération des zoospores, la formation de

l’oospore et la croissance mycélienne (Mitani et al. 2001).

(c) Lutte biologique

- Amendements organiques: des amendements en feuilles et tiges sèches de certaines

Brassicacées (choux (Brassica oleracea), la moutarde (Brassica nigra) et le navet (Brassica

rapa)) incorporés dans le sol réduisent la pourriture racinaire du pois (Papaviaz et Lewis

1971). L’efficacité des ces amendements dure jusqu’à 15 semaines après l’incorporation dans

le sol (Papaviaz, 1966). Selon Muehlchen et al. (1990), une culture de moutarde blanche

(Sinapis alba) réduit la sévérité de la pourriture racinaire infectant les plantes de pois l’année

d’après par réduction des oospores infectieuses d‘A. euteiches. D’autres travaux menés par

53

Fritz et ses collègues (1995), ont montré que les résidus d’avoine réduisent aussi la sévérité de

la maladie et augmentent le rendement en grains du pois. Ceci peut être probablement

expliqué par une saponine trouvée dans les racines d’avoine qui endommage les zoospores

d’Aphanomyces. Smolinska et al. (1997) ont montré que les graines du colza (Brassica napus

L.) produisent des composés volatiles qui inhibent totalement la croissance mycélienne et la

germination des zoospores d’A. euteiches in vitro.

- Agents antagonistes: Plusieurs études ont montré la capacité d’antagonistes microbiens à

réduire des maladies provoquées par divers agents pathogènes. Parmi eux, les champignons

mycorhiziens se sont montrés efficaces en situation de symbiose dans la réduction des

attaques d’A. euteiches sur pois (Harrier et Watson 2004). Cet effet protecteur a été rapporté

avec divers champignons mycorhiziens : Glomus fasciculatum (Rosendahl, 1985), G. mosseae

(Slezack et al. 2000) et G. intraradices (Kjøller et Rosendahl 1996). Outre ces champignons,

plusieurs autres micro-organismes antagonistes ont été décrits tels que Pseudomonas cepacia

et Pseudomonas flourescens (Parke et al. 1991). Ainsi, P. cepacia (AMMDR1) diminue la

colonisation mycélienne et la production de zoospores sur le pois essentiellement par effet

d’antibiose (Heungens et Parke 2001). La lutte biologique reste une alternative prometteuse

mais dont l’efficacité au champ reste à prouver.

5.2.3.5. Sols suppressifs

La suppressivité du sol est un phénomène qui a été décrit pour plusieurs champignons,

bactéries, oomycètes et nématodes. La connaissance des propriétés suppressives d'un sol

notamment la concentration en calcium, peut être d’une grande utilité dans l’élaboration de

nouvelles stratégies de lutte contre la pourriture racinaire du pois. En effet, Heyman et al.

(2007) rapportent que la sévérité de cette maladie est négativement corrélée à la concentration

en ions Ca2+, un apport en calcium sous forme de carbonate (CaCO3) ou de sulfate (CaSO4)

induisant une réduction de la maladie dans ces sols.

5.2.3.5. Lutte génétique

Peu d’informations sur les gènes contrôlant la résistance à la pourriture racinaire chez le

pois sont actuellement disponibles. En analysant la résistance à ce parasite chez une

population en ségrégation provenant du croisement PI175227 (résistant) x V113 (sensible),

Marx et ces collaborateurs (1972) ont montré que la tolérance à A. euteiches est associée à des

allèles sauvages dominants tels que la coloration des fleurs, et des entre-nœuds longs. Shehata

54

et al. (1983) ont été les premiers à démontrer le caractère polygénique du déterminisme

génétique de la résistance à A. euteiches sur cette plante. Ces mêmes auteurs ont signalé la

faible héritabilité de la résistance d’après l’estimation de la variance phénotypique de leur

population en ségrégation. Récemment, Weeden et al. (2000) ont montré que la tolérance au

champ de la lignée MN313 est associée à un gène majeur qui a été cartographié sur le groupe

de liaison LGIV du pois. Une collaboration scientifique entre des structures de recherches

française et américaine a permis une progression significative dans la dissection de

l’architecture de la résistance du pois à A. euteiches. Quatre populations en ségrégation ont été

développées, impliquant 4 parents partiellement résistants (90-2079, 90-2131, PI180693 et

552) et 3 parents sensibles (Puget, DSP et Bacara). Ces populations ont été utilisées pour

identifier des QTLs de résistance. La figure IN.14 résume l’ensemble des QTLs identifiés à

partir de ces populations recombinantes (Pilet-Nayel et al. 2002; Pilet-Nayel et al. 2005). Au

total, 7 QTLs ont été identifiés, répartis sur 5 groupes de liaisons correspondant aux

chromosomes LGI, LGIII, LGIV, LGV et LGVII. Les QTLs les plus consistants, indiqués sur

la carte (figure IN.14) sous les noms Aph1, Aph2 et Aph3, ont été identifiés en utilisant des

souches françaises et américaines et indépendamment de la région de culture (Pilet-Nayel et

al. 2005).

Malgré ces efforts de sélection, on ne connaît pas de pois résistant à A. euteiches.

L’amélioration génétique sur le pois est confrontée à plusieurs difficultés telles que le

caractère polygénique, la faible héritabilité de la résistance et l’existence seulement de

résistance partielle à ce parasite (Pilet-Nayel et al. 2002; Pilet-Nayel et al. 2005). C’est

pourquoi, plusieurs laboratoires se sont orientés vers l’exploitation de la légumineuse modèle

Medicago truncatula qui offre plusieurs avantages pour des études génétiques. Les recherches

effectuées sur différents pathosystèmes ont permis de mieux comprendre les mécanismes de

défense de la plante, la sélection d’écotypes résistants, le développement de marqueurs

génétiques et la recherche de nouveaux gènes de résistance (O'Neill et Bauchan 1998; Cook et

al. 2000; Torregrosa et al. 2004).

55

6. OBJECTIFS DE LA THESE

Ce travail a été réalisé dans le cadre d’une thèse en co-tutelle entre la Faculté des Sciences

de Tunis et l’Université Paul Sabatier de Toulouse. Ce travail comporte essentiellement deux

grandes parties. La première partie qui comporte l’étude du pathosystèmes M. truncatula – P.

medicaginis a été dans le Laboratoire Interactions Légumineuses Microorganismes (CBBC,

Borj-Cedria). La deuxième partie de cette thèse, consacrée à l’étude du pathosystème M.

truncatula–A. euteiches a été au sein de l’équipe Interaction Plantes Microorganismes

(UMR5546, Toulouse), dans les cadres du projet européen FP6 « Grain Legume » et du projet

bilatéral franco-tunisien «CMCU 07G/0907».

L’amélioration génétique de la luzerne et du pois est confrontée à plusieurs difficultés

telles que le caractère polygénique, la faible héritabilité de la résistance et l’existence

seulement de résistance partielle à P. medicaginis et A. euteiches, respectivement. Pour

pouvoir dépassé ces difficultés la communité scientifique internationale à décider d’utiliser M.

truncatula comme plante modèle pour faciliter les études des mécanismes d’interaction avec

les microorganismes symbiotiques et pathogènes. En plus, la forte synthènie que présente M.

truncatula avec la luzerne et le pois, permet d’envisager le transfert des acquis sur cette plante

modèle vers la luzerne et le pois. L’objectif principal de cette thèse était donc d’exploiter les

ressources biologiques, génétiques et génomiques développées sur M. truncatula pour

caractériser et identifier les composants des mécanismes de résistance de cette légumineuse

modèle vis-à-vis de deux parasites majeurs des légumineuses cultivées P. medicaginis et A.

euteiches. L’identification de lignées ayant des comportements constrastés en réponse à

l’inoculation de ces deux agents pathogènes, a permis par la suite de mettre en évidence

différents mécanismes de défense associés à la résistance partielle vis-à-vis de ces deux agents

pathogènes.

Cette thèse est organisée en deux grande parties, chacune divisée en deux chapitres. Le

premier chapitre est consacré aux résultats de sondage effectués sur différents endroits du

territoire tunisien afin d’identifier les principales maladies fongiques sur les espèces de

Medicago les plus abondantes. Le deuxième chapitre est consacré à une caractérisation du

pathosystème M. truncatula – P. medicaginis avec un accent plus particulier porté sur le rôle

potentiel des ROS et leur régulation. Le troisième chapitre est consacré au développement du

pathosystème M. truncatula – A. euteiches et à la caractérisation cytologique et biochimique

de la résistance partielle à cet oomycète. Enfin, la quatrième partie est consacrée à l’analyse

génétique de la résistance et à l’étude d’un fragment génomique impliqué dans cette

résistance.

56

MATERIEL ET METHODES

1. MATERIEL BIOLOGIQUE

1.1. Medicago truncatula

1.1.1. Origine des lignées sauvages et des lignées recombinantes

En raison de ces caractéristiques génétiques, de sa grande biodiversité naturelle, de la

facilité de sa transformation et de son interaction avec des microorganismes symbiotiques et

pathogènes, Medicago truncatula a été choisie comme plante modèle au sein de la famille des

Papillionacés (Barker et al. 1990). De ce fait plusieurs collections de lignées sauvages ont été

constituées à travers le monde, particulièrement en France (Laboratoire INRA-SGAP,

Mauguio) par Dr. J.M. Prosperi et en Tunisie (Laboratoire Interactions Légumineuses

Microorganismes, Borj Cedria) par M.E. Aouani. Les lignées F83005.5, DZA45.5, A10, A17

et A20 proviennent de la collection de Montpellier et lignées TN1.11, TN1.21, TN3.17,

TN6.18, TN6.23, TN8.3 et TN9.22 proviennent de celle de Borj-Cedria. Ces différentes

lignées sont engagées dans divers croisements qui ont donné naissance à plusieurs populations

de lignées recombinantes (figure MM.1). L’une d’entre elles appelée LR5 (Thierry Huguet,

résultats non publiés) provient du croisement de F83005.5 (mâle) x JemalongA17 (femelle).

Cette population a été obtenue par la méthode single seed descent, à partir de la population

F2, en prenant une graine par lignée à chaque génération, obtenue par autofécondation de ces

graines, la population LR5 a été générée jusqu’en F9 actuellement. Sur la base des marqueurs

microsatellites développés sur la carte LR4 (Thoquet et al. 2002), une carte génétique sur la

population LR5 a été établie dans le laboratoire du Pr. T. Huguet. Cette population LR5 a été

utilisée en F7 pour l’étude du déterminisme génétique de la résistance à A. euteiches chez M.

truncatula.

57

F83005.5

F83005.9

DZA 315.16 DZA 45.5

A20

JemalongJemalong A17A17

TN 6.18TN 8.3

TN 1.11

LR4

LR1

LR2

LR3

LR5

LR6(2006)

LR7(2007)

LR8(2008)

F6 – F8In progress

LR9(2009)

TN 3.23

TN 9.22

LR10(2009)

TN 1.21

LR11

A10 Toulouse and Tunis

DZA012J

SA028064

F11008

Salses 42B

LR B

LR CLR D

LR E LR F

Montpellier

Borung

F83005.9DZA241.2

Rennes

DZA 315.26 DZA 45.6

F83005.5

F83005.9

DZA 315.16 DZA 45.5

A20

JemalongJemalong A17A17

TN 6.18TN 8.3

TN 1.11

LR4

LR1

LR2

LR3

LR5

LR6(2006)

LR7(2007)

LR8(2008)

F6 – F8In progressF6 – F8In progress

LR9(2009)

TN 3.23

TN 9.22

LR10(2009)

TN 1.21

LR11

A10 Toulouse and Tunis

DZA012J

SA028064

F11008

Salses 42B

LR B

LR CLR D

LR E LR F

Montpellier

Borung

F83005.9DZA241.2

Rennes

DZA 315.26 DZA 45.6

Figure MM.1: Croisements établis avec les lignées de M. truncatula dans les laboratoires à Tunis (ME. Aouani), Toulouse (T. Huguet), Montpellier (JM. Prosperi) et Rennnes (ML. Pilet-Nayel).

58

1.1.2. Germination des graines

Les graines de M. truncatula sont mises dans l’acide sulfurique concentré (H2SO4)

pendant 5 à 6 min, ensuite elles sont rincées à l’eau distillée stérile 5 fois. Une stérilisation

supplémentaire des graines, selon leur état sanitaire, peut être réalisée en l’incubant dans l’eau

de Javel (à 2,5%) suivant de 4 nouveaux lavages dans l’eau stérile. Au dernier lavage les

graines sont gardées dans l’eau pendant 1heure pour l’imbibition. Les graines imbibées sont

transférées sur milieu gélosé 0,9% dans des boites de Pétri et mises à 4°C pendant une nuit à

l’obscurité pour la lever leur dormance et permettre ainsi une meilleur synchronisation de leur

germination. Le lendemain les graines sont mises dans un incubateur à 24°C à l’obscurité

jusqu’à l’émergence de la radicule.

1.1.3. Conditions de culture

1.1.3.1. Production de graines: les plantes sont cultivées en serre dans des pots (Ø: 12cm) en

présence de terreau (Tref : 35% C, 0,8% N, 85% MO, pH 5-6). La température est de 25°C,

la photopériode est de 16h lumière /8h obscurité et l’hygrométrie est de 60-80%. L’irrigation

est faite par une solution fertilisante commerciale (Agloflash).

1.1.3.2. Interaction avec P. medicaginis: dans cet essai les plantes ont été cultivées sur

perlite stérile (doublement autoclavé) dans des pots en plastiques (volume 500ml)

préalablement désinfectés à l’éthanol 95°. Les plantes ont été irriguées par une solution

fertilisante (Vadez et al.1996 modifiée par Mhadhbi et al. (2005) (annexe MM.1). Les plantes

sont mises dans une chambre de culture à 25°C et une hygrométrie entre 60-80%. La

photopériode est de 16h lumière 8h obscurité. Les essais d’inoculation et de dosage

enzymatique ont été faites sur des plantes âgées de 1 mois.

1.1.3.3. Interaction avec A. euteiches: les graines germées de M. truncatula sont repiquées

sur milieu M (annexe MM.2) dans des boites carrées (12cm x 12cm x 1,3cm). Les boites sont

fermées par du parafilm et mises dans un incubateur à 23°C/20°C et une photopériode 16h

lumière/8h obscurité.

59

1.2. Les agents pathogènes

1.2.1. Isolement des champignons

L’isolement et l’identification des espèces fongiques ont été faits sur des

échantillons de feuilles collectées dans les sites prospectés au Nord et au Sud de la

Tunisie (figure MM.2). Les échantillons sont conservés entre feuilles de papier filtre

(Whatman 3MM) jusqu’à utilisation.

2

1 3

45

6

7

8

9

10

Figure MM.2: Carte de distribution des sites de collecte des plantes infectées de Medicago truncatula en Tunisie: Ben Arous (1), Tunis (2), Soliman (3), Mateur (4), Ghezala (5), Bulla Regia (6), Kef (7), Thala, (8), Amra (9) et Djerba (10).

60

1.2.1.1. Champignons nécrotrophes : On commence par observer les

échantillons sous loupe binoculaire pour voir si le champignon est déjà en

fructification ou non. Si on observe les structures de reproduction du parasite on

procède directement à l’isolement. Sinon les parties infectées sont coupées et lavées

seulement à l’eau distillée stérile puis mises sur papier filtre stérile et humide dans une

boite de Pétri. Les échantillons préparés sont incubés dans une chambre à 25°C avec

une photopériode de 16h lumière / 8h obscurité. Au bout de 24 à 72h le champignon à

l’origine de l’attaque va sporuler. Une fois les conidies formées, une culture

monosporale est alors faite sur milieu PDA. Les cultures sont maintenues par des

repiquages réguliers (30-45 jours) sur ce même milieu.

1.2.1.2. Champignons biotrophes : l’identification des champignons

biotrophes a été faite directement sur les échantillons infectés sur la base des

symptômes et de la morphologie des conidies (Anomyme 1976 ; Agrios 1988 ;

Stuteville et Erwin, 1990).

1.2.2. Tests de pathogénicité

Les tests de pathogénicité ont été effectués selon le postulat de Koch (Agrios,

1988), qui a pour but de prouver qu’un champignon associé avec un tissu malade est

bien la cause de la maladie observée. Pour les champignons nécrotrophes en culture

sur milieu synthétique, une suspension de conidies a été faite par raclage dans l’eau

distillée stérile de la surface de la culture à l'aide d'un scalpel. L'inoculation a été faite

par dépôt de 3µl de la suspension précédente (ajustée à 106 conidies/ml) sur des

feuilles détachées. Pour les champignons biotrophes l’inoculation a été faite par

frottement de la feuille infectée sur les feuilles saines à inoculer, prélevées sur des

plantes âgées de 1mois. Les feuilles sont alors déposées sur un papier filtre humide

dans une boîte de Pétri à 25°C et une photopériode 16h lumière /8h obscurité.

1.2.3. Phoma medicaginis

La souche TN9MtPh1, utilisée par la suite pour évaluée les réponses de différentes

accessions de M. truncatula, a été isolée dans la région de Bulla Regia au Nord de la Tunisie.

61

Cet isolat a été sélectionné à partir d’une collection de 14 isolats collectés au Nord du pays.

Le maintient de la souche en culture a été fait sur milieu PDA à 25°C et à une photopériode

16h/8h. Cependant, en raison de la faible sporulation de cet isolat sur ce dernier milieu, le

milieu Sanderson & Srb. (Dhingra and Sinclair, 1995) (annexe MM.3) (milieu spécifique pour

la production de conidies) a été utilisé. Pour les tests d’inoculation des cultures de P.

medicaginis âgées de 1mois ont été utilisées. L’inoculum est quantifié à l’aide d’une cellule

de thomas et ajusté à 106 conidies/ml.

1.2.4. Aphanomyces euteiches

Trois souches d’A. euteiches ont été utilisées dans cette étude. Deux races isolées sur la

luzerne pérenne (M. sativa L.) (Ae-R1 et Ae-R2) (Vandemark et Grunwald, 2004) et un isolat

sur pois (Pisum sativum L.) ATCC201684 (Ae-all). La dernière souche a été retenue pour les

essais de criblages des lignées recombinantes pour l’identification des QTLs de résistance. La

culture de cet oomycète est maintenue par des repiquages successifs (chaque 15 à 21 jours)

sur milieu CMA (Corn Meal Agar, Sigma) (annexe MM.4) à 24°C et à l’obscurité. Pour la

production de zoospores des explants pris directement sur milieu CMA sont repiqués dans des

Erlenmeyers 250 ml avec 30 ml de milieu peptone glucose (PG) liquide (annexe MM.5) puis

sont mis dans une chambre climatique à 24°C à l’obscurité et sans agitation. Après 3 jours de

croissance, le mycélium obtenu est carencé par 3 lavages espacés de 2 heures à l’eau

commerciale de VOLVIC stérile. Entre les lavages, les erlenmeyers sont remis dans la

chambre climatique dans les mêmes conditions de culture. Au dernier lavage le mycélium est

laissé dans 30ml d’eau de VOLVIC toute la nuit (24°C, obscurité). Les zoospores sont

récoltées le lendemain dans l’eau. La concentration en zoospores, déterminée à l’aide d’une

cellule Fuchs-Rosenthal, est ajustée à 105 zoospores/ml.

2. SYSTEMES D’INOCULATIONS ET METHODES DE NOTATIONS

2.1. Inoculation de Phoma medicaginis.

2.1.1. Sur plante entière

Après un mois de culture sur perlite, la partie aérienne des plantes est inoculée avec

une suspension de conidies (106 conidies/ml), parallèlement les plantes témoins sont

traitées avec de l’eau distillée stérile. Les plantes inoculées sont recouvertes par des

62

sachets plastiques transparents pour garder une atmosphère saturée en humidité afin de

favoriser l’infection. Cette méthode d’inoculation a été adoptée pour étudier la

variabilité de l’agressivité des isolats de Phoma medicaginis sur la lignée F83005.5,

ainsi que pour les essais de dosage des enzymes antioxydantes sur les lignées

DZA45.5 et F83005.5. Les symptômes ont été notés 15 jours après inoculation. Sur

chaque plante on dénombre les feuilles totales, les feuilles nécrosées, les feuilles qui

montrent des chloroses, les feuilles mortes et les feuilles tombées. Un paramètre de

synthèse (indice d’attaque (I)) a été calculé en prenant en compte les pourcentages des

feuilles nécrosées (%FN), chlorosées (%FC), mortes (%FM) et tombées (%FD) selon

la formule suivante : I= (%FN + %FC*2 + %FM*3 + %FD*4)/(somme des

coefficients =10). Les coefficients tiennes compte du stade de développement de la

maladie sur les plantes inoculées.

2.1.2. Sur feuilles détachées et notation des symptômes

Quatre lignées de M. truncatula (DZA45.5, F83005.5, A20 et TN9.22) ont été analysées

vis-à-vis de leur résistance à P. medicaginis. L’inoculation a été faite sur des feuilles

détachées à partir de plantes âgées de 1 mois. Six microlitres d’inoculum (106 conidies/ml)

ont été déposés sur la face supérieure des feuilles à l’aide d’une micropipette. Les feuilles

témoins ont été inoculées à l’eau distillée stérile. Après inoculation les feuilles ont été mises

dans une chambre humide à 25°C avec 16h lumière et 8h obscurité. La notation des attaques

de P. medicaginis a été faite selon les pourcentages (l’échelle suivante : 0= pas de

symptômes, 1= 1% to10%, 2= 11% to 20%, 3= 21% to 30%, 4= 31% to 40%, 5= 41% to

50%, 6= 51% to 60%, 7= 61% to 70%, 8= 71% to 80% et 9= 81% to 100%) de la feuille

présentant des symptômes de nécroses et de chlorose ainsi qu’il est montré dans la figure

MM.3. Le développement des symptômes sur feuilles détachées a été enregistré sur

l’ensemble des 4 lignées testées à 4, 8, 12 et 15 jours après inoculation (jai).

63

1 2 3 4 5

76 8 9 Figure MM.3: Echelle de notation des symptômes d’infection de Phoma medicaginis sur feuilles détachées de Medicago truncatula. 2.1.3. Sur racine

La lignée F83005.5 a été choisie pour les tests d’inoculation des 14 souches de P.

medicaginis sur racine. Les graines germées sont mises sur milieu M, à raison de 5 plantules

par boîte (12 cm x 12 cm). Le lendemain, 5µl d’une suspension de spores (106 spores/ml) sont

déposés sur les racines (à 3mm de l’apex racinaire) des plantules à l’aide d’une micropipette.

Les phénotypes ont été notés à 15 jours après inoculation. Les paramètres mesurés sont : le

degré de jaunissement des cotylédons sur une échelle de 0 à 2 (0 : les deux cotylédons sont

verts, 2 : 100% des deux cotylédons sont jaunes) et le nombre de plantes mortes. Ces deux

dernières valeurs sont transformées en pourcentage. Un paramètre de synthèse (indice

d’attaque (I)) a été calculé I = (%CJ + %PM*2)/ (somme des coefficients =3). Les

coefficients sont attribués de façon à tenir compte du stade de développement de la maladie

sur les plantules et pouvoir ainsi discriminer entre l’agressivité des différentes souches.

2.2. Inoculation d’ Aphanomyces euteiches et notation des symptômes

Deux protocoles ont été utilisés : inoculation en plantes en pot ou in vitro.

Pour l’inoculation en chambre climatique, les plantules sont repiquées après germination

sur vermiculite et inoculées 2 jours après avec 5 ml par plante d’une suspension de zoospores

(105 zoospores/ml) à la base du collet. Les symptômes sont observés 15 jai.

Pour l’inoculation in vitro, les graines germées sont mises sur milieu M, à raison de 5

plantules par boîte de Pétri et inoculées le lendemain avec 5µl d’une suspension de zoospores

(105 zoospores/ml), déposés sur les racines (au milieu de l’assise pilifère des plantules). Les

symptômes sur racines, mesurés initialement à 3 jai, n’ont pas permis de mettre en évidence

de différence significative entre les 2 lignées choisies et ont été abandonnées par la suite. Une

meilleure discrimination entre les phénotypes a été notée à 15 et 21 jours après inoculation,

ces deux temps ont été choisis pour la notation des symptômes sur les parents A17 et

F83005.5 ainsi que leur descendance F7. Les paramètres mesurés sont : la longueur du

64

brunissement sur la tige, la longueur totale de la tige permettant ensuite de calculer le

pourcentage de tissus symptomatiques sur tige, le degré de jaunissement des cotylédons sur

une échelle de 0 à 2 (0 : les deux cotylédons sont verts, 2 : 100% des deux cotylédons sont

jaunes) et le nombre de plantes mortes. Ces deux dernières valeurs sont transformées

également en pourcentage. A 21 jours on mesure en plus le poids frais de la plante.

3. Les analyses cytologiques

3.1. Temps d’analyse

3.1.1. Pathosystème M. truncatula - P. medicaginis

Pour l’observation du développement de P. medicaginis et la détection de la production du

péroxyde d’hydrogène (H2O2) dans les feuilles détachées de M. truncatula les observations

ont été faites à 6 heurs après inoculation (hai), 12hai, 24hai, 48hai, 3 jours après inoculation

(dpi), 4 dpi, 5 dpi, 6 dpi, 7 dpi et 8 dpi.

3.1.2. Pathosystème M. truncatula-Aphanomyces euteiches

Les racines ont été prélevées à 1, 3 et 6 dpi pour les analyses microscopiques de la

réponse des deux lignées A17 et F83 suite à l’infection par A. euteiches.

3.2. Préparation des échantillons

3.2.1. Inclusion dans l’agarose low melting point

Pour la détection des composées phénoliques, de la lignine, du H2O2 et de l’activité

péroxidase (POX) les racines prélevées ont été incluses dans de l’agarose bas point de fusion

à 5% de concentration (Agarose LMP, SIGMA). La température de solidification très basse

de l’agarose LMP (25°C) permet de préserver l’intégrité des tissus épidermiques et ainsi

d’éviter de brûler les premières couches de tissus lors de l’inclusion. Les échantillons de

racines ainsi préparés sont ensuite coupés à l’aide d’un vibratome (Leica VTA1000S) selon

une épaisseur de 150 µm.

3.2.2. Inclusion dans la résine

Les échantillons ont été tout d’abord fixés dans une solution tampon de carbonate de

sodium (50 mM, pH 7,2) avec 2.5% de glutaraldehyde durant 24 heures à 4°C. Ils sont ensuite

65

rincés dans la solution tampon et déshydratés par une série d’incubation de 2h dans des

solutions d’éthanol de concentrations croissantes (10, 30, 50, 70, 80, 95, 100%). L’inclusion

est alors réalisée par plusieurs incubations dans des solutions d’éthanol à concentration

croissante de résine acrylique (25, 50, 75 et 100%) (LRWhite Oxford Agar, Oxford, UK). A

chaque étape les échantillons sont incubés pendant 12h à 4°C. A la dernière étape

d’enrésinement, les échantillons sont mis à 70°C pendant 24h pour permettre la

polymérisation de la résine. Des coupes semi fines (1µm d’épaisseur) ont été faites à l’aide

d’un ultra-microtome (UltraCut E, Reichert-Leica Germany). Les coupes sont ensuite

déposées directement entre lame et lamelle.

3.3. Coloration et marquage

3.3.1. Coloration de P. medicaginis au bleu de méthylène

Les feuilles récoltées après inoculation ont été mises dans une solution

d’éthanol:Chloroforme (3:1) pendant 2 jours à l’obscurité afin d’éliminer la chlorophylle.

Ainsi décolorées, les feuilles sont ensuite trempées dans une solution de bleu de méthylène

(0,5g/l) pendant 30 secondes puis lavées à l’eau distillée, ceci dans le but de mettre en

évidence les structures du champignon (conidies, mycélium et pycnides).

3.3.2. Colorations et marquage d’A. euteiches dans les racines de M. truncatula

3.3.2.1. Coloration et dénombrement des oospores à la surface des racines inoculées

Le procédé décrit par Colditz et al. (2005) a été utilisé, avec quelques modifications, pour

la coloration in planta des oospores d’A. euteiches à 6 et 21 jours après inoculation. Les

racines inoculées sont incubées 30min dans du KOH (10% m/v) à 90°C. Les racines sont

ensuite colorées par une solution d’encre bleue (2% v/v) et d’acide acétique (7% v/v) pendant

20min à 90°C, puis rincées 3 fois avec de l’eau désionisée. Dix racines de chaque lignée

parentale (A17 et F83) ont été considérées pour le comptage des oospores. Le dénombrement

a été fait sur une longueur de 5mm pour chaque racine.

3.3.2.2. Coloration des coupes semi-fines au bleu de toluidine

Afin d’observer la colonisation des racines des lignées parentales A17 et F83 par A.

euteiches, nous avons réalisé des coupes semi-fines (1 µm d’épaisseur) sur les échantillons

enrésinés de racines. Les coupes ont été colorées au bleu de toluidine (0.5% m/v dans une

66

solution aqueuse à 2.5% de carbonate de sodium pH 11) après avoir être montées sur lame de

verre. La coloration est faite à 60°C pendant 30 sec, suivie d’un rinçage à l’eau désionisée.

3.3.2.3. Marquage d’A. euteiches au WGA-FITC

Afin de bien visualiser l’envahissement des racines par A. euteiches, ce dernier a été

marqué par une solution de WGA (Wheat Germ Agglutinin) couplée au FITC (Fluorescéine

IsoThioCyanate) qui se fixe sur les composés N-acétylglycosamines (Molano et al. 1980)

contenus dans la chitine de la paroi. Après inclusion dans l’agarose et coupe, des sections de

150 µm sont incubées dans une solution tampon pH 8,2 (Tris-Base, 20mM; NaCl, 160mM),

pendant 15min. Les sections racinaires sont ensuite mises en présence de la WGA-FITC

(50µg/ml) à l’obscurité. Trois rinçages de 5 min avec le même tampon permettent d’éliminer

l’excès de WGA-FITC. La visualisation des structures du parasite se fait par excitation des

coupes sous une lumière bleue (filtre d’excitation, BP 450-490 nm, filtre de suppression LP

515 nm). Le mycélium d’A. euteiches apparaît en vert, couleur due au FITC.

3.3.3. Coloration de la lignine

Les coupes de racines faites au vibratome (150 µm) sont trempées pendant 2min dans une

solution de phloroglucinol-HCl (Prolabo) qui se fixe sur les groupements aldéhydes de la

lignine. Une coloration rouge-violet apparaît en présence de lignine.

3.3.4. Détection du peroxyde d’hydrogène au DAB

Les échantillons de feuilles ou de racines ont été ont été mises dans une solution de DAB

(3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride, Sigma) à 2g/l dans du MnCl2, 4H2O à 20mM

pendant 15min sous vide puis toute une nuit à température ambiante et à l’obscurité. Les

feuilles sont ensuite décolorées à l’éthanol:Chloroforme (3:1) pendant 2 jours. Après

coloration au DAB les échantillons de racines ont été inclus dans l’agarose (5%) et ensuite

coupés au vibratome. Plusieurs témoins ont été ajoutés, des feuilles ou des racines non

inoculées colorées au DAB et des feuilles ou des racines inoculées mais non colorées au

DAB. La réaction du DAB avec le H2O2 donne un précipité brun rougeâtre.

3.3.5. Détection des composés aromatiques fluorescents

Des coupes transversales fraîches de racines témoins et inoculées ont été observées sous

lumière UV (filtre d’excitation, BP 340-380 nm, filtre de suppression LP 430 nm) pour

détecter les composées phénoliques qui autofluorescent en bleu.

67

3.3.6. Détection de l’activité POX dans les racines

Ce protocole a été adapté à partir de celui décrit par Dumas et al. (1995). Les racines

infectées et témoins ont été incubées pendant 15min à température ambiante dans du tampon

succinate pH 4 (25mM acide succinique, 3,5mM EDTA) contenant 10mM de H2O2 (Accros)

et 0,6mg/ml de 4-chloro-1-naphthol (Sigma). Les échantillons sont ensuite inclus dans

l’agarose et coupés.

3.4. Microscopie et acquisition des photos

3.4.1. Microscope champ large à épifluorescence

Les observations microscopiques en lumière blanche et en UV ont été faites à l’aide d’un

microscope photonique à épifluorescence (DMIRBE, Leica, Rueil-Malmaison, France). Les

images sont saisies avec une caméra numérique CCD (colour Coolview, Photonic Science,

Robertsbridge, UK).

3.4.2. Microscope confocal

Les images sont réalisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (SP2 SE,

Leica, Germany) équipé d’un microscope droit (DM 6000, Leica, Germany). Les observations

ont été faites en utilisant un objectif x10 à sec (HC PL Fluotar, N.A. 0.3). La diode laser

émettant à 405 nm a permis de collecter l’autofluorescence dans la gamme 410-470 nm pour

visualiser les faisceaux conducteurs en particulier; la raie laser à 561 nm a été utilisée aussi

pour capter l’autofluorescence due aux parois cellulaires dans la gamme 565-650nm. Le FITC

a été excité avec une raie du laser Argon émettant à 488nm et collecté dans la gamme 500-

540nm. Les images ont été acquises en mode séquentiel. Les séries d’images acquises selon

l’axe Z ont été faites avec un pas de 1µm ; Les images superposées des différents canaux sont

la résultante des projections maximales d’intensités des séries acquises.

3.5. Analyse des images par le logiciel ImagePRO Plus

Image-Pro Plus est un logiciel de traitement d’image. Ce logiciel a été utilisé pour

mesurer la fluorescence sur les images des coupes racinaires excitées sous UV. Les images

ont été prises avec les mêmes paramètres d’acquisition fixés au départ. En établissant un

seuillage d’intensité sur l’image traitée, le logiciel permet de calculer le nombre de pixels

68

dans la gamme choisie. Ainsi, on peut déterminer sur une image d’une coupe transversale de

racine la surface de la partie fluorescente. Plusieurs paramètres ont été analysés : la surface

totale de la coupe racinaire en µm2, la surface de la partie fluorescente et l’intensité moyenne

de fluorescence (figure MM.4). Les paramètres calculés sont : le pourcentage de la surface

fluorescente par rapport à la surface totale de la coupe et l’intensité de fluorescence par µm2.

La fluorescence naturelle des vaisseaux du cylindre centrale a été soustraite lors de l’analyse

des images.

Figure MM.4: Méthode d’analyse des photos des coupes racinaires par Image-Pro Plus. 4. Méthodes d’analyses biochimiques

4.1. Dosage des composés phénoliques solubles et liés à la paroi

Les racines de M. truncatula sont broyées à sec dans de l’azote liquide au mortier pilon

(2mn). Le broyat est repris par 1ml méthanol aqueux (80%) pendant 5mn à température

ambiante dans un tube Eppendorf fermé. Après centrifugation 2mn à 10000×g, on garde le

surnageant et on reprend le culot par 1ml méthanol aqueux 80%, on laisse 5mn au contact et

on refait par la suite une autre centrifugation à 10000×g pendant 5mn. On mélange les deux

surnageants de 1ml. On garde le culot pour extraire les composés phénoliques pariétaux. Les

2ml d’extrait de méthanol 80% sont séchés au SpeedVac puis repris dans du méthanol 50% à

raison de 1ml / 300mg de résidus sec du départ.

Le dosage des composés phénoliques se fait au réactif de Folin-Ciocalteu (Prolabo). Cette

méthode est basée sur la réduction du phospho-molybene et du phospho-tungstate présents

dans le réactif de Folin-Ciocalteu. Pour le dosage on ajoute 2,5ml de réactif de Folin 10 fois

dilué à 0,5ml d’échantillon. Après 3min on ajoute 2ml de carbonate de sodium (75 g/l). On

69

laisse reposer le mélange 1h à température ambiante et on fait après la lecture à 760 nm. La

teneur en composés phénoliques est déterminée selon une courbe étalon faite avec différentes

quantités en acide ferrulique (de 1 à 30 µg).

4.2. Extraction des composés phénoliques pariétaux

Le culot récupéré précédemment est séché à l’acétone puis 48h dans une étuve à 50°C, le

poids de matière sèche est alors mesuré. Les acides phénoliques sont liés à la paroi par des

liaisons ester, pour les libérer il faut faire un hydrolyse alcaline (Campbelle et Ellis, 1992). Le

résidus sec est resuspendu dans du NaOH 0,5M (1ml/10mg) et mis dans un bain-marie 1 h à

90°C. L’ajout du NaOH entraîne une saponification et permet d’extraire les composés

phénoliques liés à la paroi. Les tubes sont refroidis et le mélange est acidifié par l’ajout de

HCl jusqu’à pH 2, on centrifuge alors 10mn à 12000×g. Le surnageant est récupéré dans un

Eppendorf et 1ml d’éther anhydre (diethylether anhydre) est ajouté afin de solubiliser les

composés phénoliques libérés. La phase éther est soigneusement récupérée dans un nouveau

tube après centrifugation, puis amenée à sec. Le résidu sec est repris dans 0,5ml méthanol

50%. Le dosage se fait au réactif de Folin-Ciocalteu comme précédemment décrit pour les

composés phénoliques solubles.

4.3. Dosage des HRGP

4.3.1. Hydrolyse acide des parois

Une hydrolyse acide des parois permet d’abord d’éliminer la chlorophylle, les acides

nucléiques et les protéines solubles et membranaires. Six à 12 mg de paroi sont séchées dans

l’étuve à 60°C pendant 24h et hydrolysées avec du HCl 6N à 120°C pendant 18h (3mg de

paroi/ml HCl 6N). L’hydrolysat brun obtenu est alors passé sur filtre en fibres de verre

WHATMAN GF/C. Le filtrat récupéré dans un ballon à évaporation et ramené à sec au

rotavapor (Büchi RE 111). Pour éliminer le chlore résiduel les ballons sont placés dans un

dessiccateur sous vide une nuit en présence de soude.

4.3.2. Dosage de l’hydroxyproline

L’hydrolysat conservé au dessiccateur sous vide est repris par un volume adéquat d’eau

distillée. L’hydroxyproline est dosée au spectrophotomètre à 560nm selon la méthode de

Kivirikko et Liesmaa (1959). Cette méthode permet le dosage de cet acide aminé dans un

échantillon donné à condition qu’il soit libre. Ce dosage est basé sur l’oxydation de

l’hydroxyproline en pyrrole par de l’hypobromite alcalin. Le pyrrole réagit ensuite avec du

70

réactif d’Ehrlich acide en donnant à chaud un dérivé coloré en rose absorbant à 560nm. Pour

le dosage, les tubes à essai sont placés préalablement dans un bain eau-glace (volume

réactionnel 2 ml). On ajoute alors 2 ml d’hypobromite glacé. Après agitation vigoureuse, on

attend 4 mn minimum avant d’ajouter 2ml de Paradimethylaminobenzaldehyde. On agite

vigoureusement à nouveau. Après avoir ajouté 1 ml de HCl 6N, les tubes sont transférés dans

un bain-marie à 100°C durant 2 min 30 s puis refroidis dans un bain glacé 3 mn et sont laissés

ensuite 10 mn à température ambiante. Le dosage est fait au spectrophotomètre à 560nm. Les

réactifs utilisés sont les suivants : PDMAB (Paradimethylaminobenzaldehyde) à 5% dans du

n-propanol (50g PDMAB/1L). Solution stock Hypobromite (à conserver à l’abri de la

lumière): 3,2 ml hypobromite dans 500ml NaOH 5% glacée. Pour le dosage la solution stock

d’Hypobromite (17,5ml) est diluée dans une solution de soude 5% (82,5ml).

4.4. Extraction des parois et dosage des lignines

Le dosage a été fait sur des racines de M. truncatula infectées ou non par A. euteiches à 1,

3 et 6 dpi. Les racines (700mg de matière fraîche) sont broyées à l’aide d’un mortier dans

l’azote liquide. Le broyat est lavé deux fois avec 5ml de tampon phosphate (0,1M ; pH 6,8) à

température ambiante, avec une centrifugation intermédiare10min à 2000×g. On se débarrasse

du tampon par deux lavages à l’eau UHQ. Pour éliminer les lipides et les pigments, les parois

sont traitées par 5ml d’un mélange méthanol: chloroforme (2v : 1v), 2 fois de 15min à

température ambiante, avec une centrifugation intermédiaire (10min ; 2000×g). On sèche le

culot obtenu à l’acétone puis 48h à 50°C. On pèse le résidu séché et on le traite 1h à 90°C par

du NaOH 0,5M afin d’enlever le maximum de protéines pariétales et de composés

phénoliques liés à la paroi qui peuvent interférer avec le dosage de la lignine. On élimine le

NaOH par des lavages successifs à l’eau UHQ avec des centrifugations intermédiaires

(10min ; 2000×g). Le culot de paroi est enfin séché comme précédemment décrit avant de

procéder au dosage. La teneur des parois en lignine est déterminée par la méthode à

l’acéthylbromide (Morrisson et Stewart, 1995). Le résidu séché est traité par le mélange

Acétylbromide : Acide acétique anhydre (1:3) 30min à 70°C avec 1ml par 10mg de paroi. Le

mélange est refroidi à température ambiante et on ajoute 0,9ml de NaOH 2M, puis 0,1ml

d’hydroxylamine hydrochloride 7,5M. Le mélange est vortexé et on ajoute 8ml d’acide

acétique pure (anhydre). On laisse reposer 5min et on fait la lecture de la densité optique à

280nm. Un témoin sans paroi est inclus en parallèle. Une quantité de 20µg de lignine pure

(Sigma Aldrich) correspond à une DO de 0,24 à 280nm.

71

4.5. Dosage des enzymes antioxydantes

4.5.1. Extraction des enzymes

Pour éviter la dégradation des activités enzymatiques toutes les opérations ont été faites à

4°C. Les échantillons de feuilles et de racines de M. truncatula ont été broyés dans un mortier

dans l’azote liquide avec 5% (m/m) PVPP. Les protéines solubles ont été extraites par re-

suspension de 500mg du broyat dans 2ml de tampon d’extraction contenant: 50mM tampon

phosphate de potassium, pH 7.8, 0.1mM EDTA, 1mM PMSF et 10mM DTT. Le surnageant

est récolté dans un nouveau tube après une centrifugation à 14000×g pendant 30min. Les

extraits enzymatiques sont utilisés immédiatement pour le dosage enzymatiques ou stockés à -

80°C. La concentration en protéines est mesurée selon la méthode de Bradford (1976) en

utilisant le tampon Biorad et la BSA (bovine serum albumin) comme un standard (Sigma).

4.5.2. Dosage de la peroxidase [POX: E.C. 1.11.1.7]

L’activité POX est déterminée selon la méthode décrite par Lin and Kao (1999). Le

volume réactionnel (1ml) contient du tampon phosphate de potassium 50mM pH7, 9mM

guaiacol (Sigma), 19mM H2O2 et l’extrait enzymatique. La réaction a été initiée par l’ajout de

H2O2. L’oxydation du guaïacol a été déterminée par la mesure de l’augmentation de

l’absorbance à 470nm (A470) (ε = 26.6 mM-1 cm-1). Une unité POX est définie comme étant la

quantité d’enzyme qui produit 1µmol/min du guaïacol oxydé dans les conditions précédentes.

4.5.3. Dosage de l’ascorbate peroxidase [APX: E.C. 1.11.1.11]

L’activité APX a été déterminée par la mesure de la décroissance de l’absorbance de

l’ascorbate oxydé à 290 nm, selon Nakano et Asada (1980). Le volume réactionnel (1ml)

contient 0,5 mM d’ascorbate, 0,1 mM EDTA, 1,2 mM H2O2 et l’extrait enzymatique dans un

tampon phosphate de potassium 50 mM pH 7. L’activité enzymatique est exprimée en mmol

min-1 mg-1 de protéine de l’ascorbate oxydé. Cette activité a été calculée en utilisant le

coefficient d’extinction de l’ascorbate qui est de of 2.8 mM-1 cm-1.

4.5.4. Dosage de la superoxide dismutase [SOD: E.C. 1.15.1.1]

Le dosage de l’activité SOD a été fait selon la méthode de Yu et Rengel (1999) en

mesurant l’aptitude de l’enzyme à inhiber la réduction photochimique du NBT (Sigma). Le

volume réactionnel (1ml) contient 50mM Na2CO3 pH 10.4, 13mM méthionine, 0.025% (m/v)

TritonX100, 75µM NBT, 2µM riboflavine (Sigma) et l’extrait enzymatique. La réaction est

initiée par l’ajout du riboflavine, et l’absorbance est mesurée (A560) après 10mn d’incubation

72

sous une lumière fluorescente. Une unité SOD est définie comme étant la quantité d’enzyme

(volume de l’extrait enzymatique) qui inhibe le taux de réduction du NBT de 50%.

4.5.5. Dosage de la catalase [CAT: E.C. 1.11.1.6]

Le dosage de la CAT est déterminé en suivant la décomposition de H2O2 à 240 nm (ε = 36

M–1 cm–1) (Anderson et al. 1995). Le milieu réactionnel contient 10 mM de H2O2 dans du

tampon phosphate de potassium 50mM pH 7 et 10 µl de l’extrait enzymatique.

4.6. Dosage du peroxyde d’hydrogène

L’extraction du péroxyde d’hydrogène (H2O2) a été faite par broyage des racines de M.

truncatula dans l’azote liquide et re-suspension dans une solution de méthanol:EDTA 0,5M

pH8 (9:1, v/v) à raison de 300µl par 100mg d’échantillon. Après centrifugation (15min

13000×g à 4°C) le surnageant est repris dans un tube 1,5ml autoclavé. Le dosage est fait au

luminomètre (Berthold detection system). Vingt microlitres de luminol (0,11 µM) sont ajoutés

à 20µl d’échantillon, la réaction est amorcée par l’ajout du ferricyanure de potassium

(KFe(CN)6) à 14mM. La réaction est la suivante:

L'hydrazure d'acide 3-aminophtalique (luminol) s'oxyde avec de l'eau oxygénée en milieu

alcalin pour donner de l'acide 3-aminophathalique (sous forme de son dianion), du diazote et

de l'eau. Cette réaction exothermique, catalysée par le complexe hexacyanoferrate(III), émet

une lumière froide (luminescense), visible dans l'obscurité. La concentration en H2O2 a été

déterminée à partir d’une courbe étalon établie par un dosage de quantités connues (de 1mM à

1nM) de cet élément.

5. Méthodes d’analyse moléculaire

5.1. Méthodes relatives à l’ADN génomique

5.1.1. Extraction de l’ADN et dosage spectrophotomètrique

L’extraction d’ADN est réalisée selon les étapes suivantes: Une feuille trifoliolée est

séchée dans un tube 2ml, la veille de l’extraction dans une étuve à 65°C, puis broyé avec un

broyeur à billes (Retsch MM301) (1 min 30 s à 30 vibrations/s). Un ml de tampon

d’extraction est ajouté (annexe 6) et l’ensemble est incubé 20 mn dans un bain-marie à 65°C.

73

Après ajout de 600µl de chloroforme, les tubes sont agités vigoureusement pendant 15mn,

puis centrifugé (10 mn à 13000×g). Six cents microlitres d’isopropanol sont ajoutés dans la

phase aqueuse et l’ADN est précipité après centrifugation (20 minutes à 13000×g). Le culot

est lavé à l’éthanol 70%, séché, puis repris dans 50µl d’eau UHQ stérile.

L’estimation de la quantité d’ADN est faite par dosage spectrophotométrique à 260 nm.

Une unité de densité optique correspond à l’absorption d’une solution d’ADN double brin à la

concentration de 50ng/µl.

5.1.2. Conditions de PCR (Polymerase Chain Reaction)

Cette technique permet d’amplifier un fragment d’ADN en utilisant des amorces

spécifiques et une enzyme de polymérisation la «Taq polymérase» en présence de

dNTP et de MgCl2 50mM dans un tampon (20mM Tris-HCl pH 8,4 et 50mM KCl). Le

mélange réactionnel pour une réaction contient : 1µl de dNTP (10mM), 2,5µl de

MgCl2 (50mM), 2,5µl de tampon PCR 10X, 1µl de chaque amorce (sens et antisens) à

10µM, 16,75µl H2O UHQ stérile, 2µl d’ADN et 0,25µl de la Taq DNA Polymérase

(Invitrogen) à 5U/µl. La PCR a été faite dans un thermocycleur MasterCycler Gradient

(Eppendorf) selon le programme indiqué dans le tableau MM.1. La température

d’hybridation et le nombre de cycles sont ajustés selon la longueur de l’amplifiat le

Tm (melting temperature) et la nature des amorces utilisées.

Tableau MM.1: Programme PCR utilisé pour l’amplification

de fragments d’ADN. Etape Température durée Nombre de cycles Dénaturation initiale de l’ADN 94°C 5min 1 cycle Dénaturation de l’ADN 94°C 30s

40 cycles Hybridation des amorces sur les brins d’ADN (Tm°C)

55°C-60°C 30s

Néoformation des brins d’ADN grâce à la Taq polymérase (Elongation)

72°C 30s

Elongation finale 72°C 10min 1 cycle 5.1.3. Conditions d’électrophorèse

La migration des amplifiats est réalisée à l’aide d’un générateur (LKB Bromma 2310

Macrodrive1) sous une tension de 100V sur gel d’agarose ultra pure (Invitrogene) à 3,5% en

utilisant le Tris Borate EDTA 0,5x comme tampon de migration (annexe MM.7). La cuve de

migration est de type (OWL separation system, USA). Les amplifiats sont additionnés de 5µl

74

de bleu de charge (annexe 8) et déposés dans les puits du gel à raison de 15µl. Deux types de

marqueurs de taille ont été utilisés: le « 1kb » (Invitrogene) et le « 100pb » (Invitrogene). La

migration est faite à 110V durant 3h.

5.1.4. Révélation des bandes et acquisition des images

La visualisation des bandes se fait au Bromure d’Ethidium (BET : C21H2OBrN3) sous

excitation UV (300 nm). Les gels sont trempés dans un bain de BET (0,5mg / L de TBE 0,5x)

pendant 20min. Le BET s’intercale entre les bases de l’ADN et fluoresce sous UV (plaque

UV: Bioblock Scientific TF-35M, France). Les gels d’ADN sont photographiés à l’aide d’une

caméra (Herolab EASY 429K, Allemagne).

5.2. Méthodes relatives à l’ARN

5.2.1. Extraction d’ARN et dosage au spectrophotomètre

L’extraction de l’ARN a été faite à partir de racines de plantes de F83005.5 et A17

inoculées à l’âge de 15 jours. La récolte a été faite à 1, 3 et 6 jai. Aussitôt récoltés, les

échantillons sont pesés et mis dans l’azote liquide. L’extraction des ARN a été faite avec le

Kit PROMEGA (SV total ARN isolation system Z3100) selon les instructions du fabriquant.

Le rendement total obtenu des ARN est déterminé par spectrophotomètre à une longueur

d’onde de 260nm, ainsi 1 unité d’absorbance est équivalente à 40µg d’ARN simple brin/ml.

L’absence de contamination des échantillons d’ARN par des protéines est appréciée en

calculant le rapport A260/A280. Pour une bonne qualité des échantillons ce rapport doit être

compris entre 1,7 et 2,1. L’absence de contamination des échantillons d’ARN par des

guanidines est appréciée en calculant le rapport A260/A230. Pour une bonne qualité des

échantillons ce rapport doit être compris entre 1,8 et 2,2. L’absence de contamination des

échantillons d’ARN par de l’ADN est vérifiée en PCR à l’aide d’amorces qui ciblent des

régions de l’ADN génomique. Enfin l’intégrité de l’ARN est vérifiée sur gel dénaturant. Cuve

et peigne doivent être préalablement traités avec une solution NaOH 0,5M pendant 15min et

ensuite rincées à l’eau DEPC. Cinq cents nanogrammes d’ARN sont incubés 15min dans du

tampon de dénaturation contenant un mélange de formaldéhyde et de formamide (annexe 9).

Les échantillons sont ensuite chargés dans un gel dénaturant constitué d’agarose (1,5%) et de

formaldéhyde en présence de tampon de charge (annexe 10). La migration est effectuée à

100V pendant 30min dans un tampon de migration 1X (annexe 11). La quantité des unités

28S doit être approximativement égale au double de celle des unités 18S de l’ARN

75

ribosomale chez les eucaryotes. Ceci est déterminé sur le gel en regardant l’intensité des

bandes après coloration au BET et révélation sous UV.

5.3. Méthodes relatives à l’ADNc

5.3.1. Synthèse de l’ADNc

La rétrotranscription (RT-PCR) permet d’obtenir de l’ADN complémentaire (ADNc) à

partir de l’ARN grâce à la Reverse transcriptase. La RT-PCR a été faite en utilisant le Kit de

la SuperScriptIII (Invitrogene). Le milieu réactionnel pour la RT-PCR est résumé dans le

tableau MM.2.

Tableau MM.2: Milieu réactionnel et étapes de la RT-PCR selon le protocole de la SuperScriptIII

Mix1 ARN

(500ng) Oligo(dT)20’ 50µM dNTP 10mM H2O DEPC

x µl 1µl 1µl Ajuster à 10µl Dénaturation de l’ARN

Incuber le Mix1 à 65°C durant 3mn puis placer les tubes immédiatement dans la glace (2mn).

Mix2

Tampon RT 10X

MgCl2

25mM DTT 0,1M

RNaseOUT(40U/µl)

Super ScriptIII (200U/µl)

2µl 4µl 2µl 1µl 1µl Synthèse des cDNA

Ajouter le Mix2 au Mix1 après dénaturation puis mettre à 50°C pendant 50mn.

Elongation Transférés les tubes à 85°C durant 5mn puis mettre dans la glace. Elimination des ARN

Ajouter 1µl par tube de RNaseH, incuber 20mn à 37°C.

5.3.2. PCR quantitative

5.3.2.1. Design d’amorces

La démarche d’analyse globale est la suivante. Sur les gènes sélectionnés, un alignement

multiple des séquences nucléotidiques et protéiques a été entrepris via le logiciel Clustal W. A

partir de cet alignement, des zones plus ou moins conservées ont été choisies pour rechercher

des amorces hybridant dans ces zones d’intérêt grâce au logiciel AlleleID (Invitrogene). Les

séquences des amorces pour chaque gène sont indiquées dans le tableau MM.3. Plusieurs

consignes sont à prendre en compte pour le design d’amorces l’étude l’expression des gènes

en q-PCR : le fragment à amplifier doit avoir une taille comprise entre 80 et 200 pb. Les

amorces sont choisies préférentiellement de part et d’autre d’un intron, afin de détecter

d’éventuelle contamination par l’ADN génomique des échantillons d’ADNc. Les amorces

76

sont choisies plutôt du côté de l’extrémité 3’ des gènes, le polymorphisme dans les séquences

y étant plus important.

Tableau MM.3: Séquence des amorces des gènes étudiés en q-PCR.

LG3 (BAC)

Nom du gène

Référence IMGAG V1.0

Séquence des amorces Taille ADNc (pb)

Ta (°C)

AC135103

Protéine Fbox (A)

AC135103_17

TCAGCAGGTTCCATCTTGTGAAATTC TCATTTAAGCGGCAAGCGAAAGG

99 56

Ubiquitin-associated enzyme

AC135103_21

TGCCAATAGATTCCCGCTTTTACC CACTGCCGTGTACCGTTTGC

131 60

Alcool cinnamylique déshydrogènase (CAD)

AC135103_35

GAAGGGGACTCTAAATGTGCTGAAATC AGCGATAGAAGAGGTTAATACAACACG

79 56

Protéine Fbox (B)

AC135103_31

GGGGAGGAACAACTGCTGAGG GCCACAAACCCATTTAACACAACC

136 56

Protéine à fonction inconnue (P1786)

AC135103_23

CTTTTGTCTGGTGCGTCGGTATTAG GGTCTTGTCCACTTCATTGTCTTCC

111 56

Protéine Fbox (C)

AC135103_24

ACATCATCGCCACCTACACTCTC ATTCCATGACTTACAGACGCATCG

147 60

CR940308

Protéine Fbox (D)

CR940308_25

CCATGTACCCGTTCTATTGTTTCTTTTG AACATCATCACCACAGATCAAGCAC

150 60

Protéine Fbox (E)

CR940308_17

AGGATTGCTTGTGCTTGACTTGTG GAATCTATTAGGATCACGCTCGTAAGG

116 60

Protéine Fbox (F)

CR940308_19

GGATTGGGCTGAATGTGACGATATG TGTAGACTTCGGCATGTGTATGTTTATAG

113 60

Protéine Fbox (G)

CR940308_13

ACTTTGCCCACCTGACTTCGG TGATATAGCCAGTTTCACCCTCAATTTC

266 60

Protéine Fbox (H)

CR940308_12

TCCGTGGATCTTGGATGTGATGAG AAGACTCTTCACTTCCATACTCCATAATC

101 60

Protéine Fbox (I)

CR940308_33

GCATCTGCCGCTGTATATATTTCTGAG AACCAACTTCTCCTCGCCACTG

84 56

Protéine à fonction inconnue (P4134)

CR940308_29

AGGTCCAGTTTGGTGAGGCTAATATC AAATTCTTCAACTTTCTTCGTTTGTGTTC

76 60

Protéine de résistance à la Tétracycline

CR940308_3

CGGTTTGAACTTTGGAACTAATGATGTC GCAATGCGAGCAAGAACGATAGG

132 56

Major facilitator superfamily (MSF_1)

CR940308_5

GAAAACCTGTGGCAATTTTAGGGATTATC CACTGAAAGTTGAGAGTCCAAGAGC

198 60

Ethylene insensitive 3 (EIN3)

CR940308_10

CAGGAGAAGGAGAAGATGTTTCTATTTGG GGAAGTATTCATCATGGTGCTGCTC

200 56

77

L’hybridation des amorces doit être spécifique aux gènes d’intérêt d’une part et l’hybridation

ne doit pas s’effectuer sur une autre région du génome de M. truncatula d’autre part. Ceci a

été vérifié en utilisant le logiciel Cvit BlastN, qui donne une vue d’ensemble de tout le

génome de M. truncatula.

5.3.2.2. Mise au point des conditions d’amplification pour la q-PCR

La technologie de la PCR en temps réel est basée sur la détection de la fluorescence

enregistrée proportionnellement à l’amplification de l’ADN cible. En plus de la détermination

de la quantité d’ADN accumulée après un nombre déterminé de cycles PCR, la PCR en temps

réel détermine aussi le point à partir du quel les amplifiats sont détectés. Ceci est déterminé

par le nombre de cycle suite auquel l’émission du reporter dépasse le bruit de fond. Ce

nombre de cycle est indiqué par threshold cycle (Ct). Le Ct est déterminé au cours de la phase

exponentielle de la PCR et il est inversement proportionnel au nombre de copies de l’ADN

cible. Ainsi, plus le nombre initial de copie est élevé, plus la fluorescence sera détectée

rapidement au cours des cycles successifs d’amplification et plus le Ct sera faible.

Avant d’effectuer une q-PCR, il est nécessaire de déterminer la dilution adéquate du

cDNA pour chaque gène à analyser, dans le but d’avoir par la suite un Ct optimal compris

entre 20 et 30 cycles. Dans cette étude 4 dilutions ont été testées pour chaque gène (1/25,

1/50, 1/100 et 1/1000) sur un mélange de cDNA.

5.3.2.3. Milieu réactionnel pour la q-PCR

Le niveau d’expression des différents gènes a été étudié en utilisant le Kit MasterMix Plus

SYBR Green I (Eurogentec). L’accumulation des amplifiats d’un gène donné est déterminée

par la quantité de lumière émise par le SYBR Green, couplé aux nucléotides, au moment de

son incorporation dans les brins d’ADN néoformés. La q-PCR a été faite dans un

thermocycleur Appiled Biosystem 7900. Le milieu réactionnel est résumé dans le tableau

MM.4.

Tableau MM.4: Composition du milieu réactionnel pour la q-PCR. Composants Volume en µl

SYBR Green 5 Amorce Sens (10µM) 0,5 Amorce Antisens (10µM) 0,5 H2O DEPC 3 cDNA (dilué 25x) 1

78

5.3.2.4. Normalisation de l’expression des gènes en q-PCR

Le gène EF1α, codant un facteur d’élongation, a été utilisé comme un témoin pour la

normalisation de l’expression des gènes étudiés en q-PCR. L’analyse des données de

l’amplification des cDNA est faite par le logiciel SDS2.2 qui donne à la fin un tableau qui

contient le Ct pour chaque échantillon amplifié.

5.3.2.5. Calcul du niveau d’expression des gènes analysés

Le niveau d’expression des gènes est obtenu en utilisant la technique développée par Livak

et Schmittgen (2001) qui permet de calculer la valeur de ΔΔCt pour chaque gène étudié. Ainsi

on calcule les valeurs suivantes :

Ctg,i = Ct du gène en condition d’inoculation par A. euteiches.

Ctg,t = Ct du gène en condition d’inoculation par l’eau (témoin).

Ctr,i = Ct du gène de référence (EF1α) en condition d’inoculation par A. euteiches.

Ctr,t = Ct du gène de référence (EF1α) en condition d’inoculation par l’eau (témoin).

ΔCt i = Ctg,i – Ctr,i

ΔCt t = Ctg,t – Ctr,t

ΔΔCt = ΔCt i - ΔCt t

Le niveau d’induction est égal à 2(-ΔΔCt). Si cette valeur est supérieure à 2, le gène est

induit; si elle est inférieure à ½ le gène est réprimé.

6. Analyse génétique de la résistance à A. euteiches

6.1. Outils de base

Le travail d’analyse génétique se fonde sur la création d’une population de lignées

recombinantes (RILs), issue d’un croisement entre deux lignées parentales qui extériorise un

phénotype contrasté vis-à-vis du ou des caractères étudiés et sur le génotypage de ces RILs à

l’aide de marqueurs moléculaires, utilisés pour la construction d’une carte génétique. A partir

du croisement LR5 entre A17 et F83005.5, la population en F7 a été génotypée par des

marqueurs microsatellites polymorphes répartis sur l’ensemble des 8 groupes de liaisons

(figure MM.5). Ces différents outils génétiques ont été développés dans l’équipe de Thierry

Huguet (données non publiées).

79

Figure MM.5: Carte génétique de Medicago truncatula établie sur la base de 140 lignées recombinantes en F7 du croisement LR5 (F83005.5 x A17) avec 86 marqueurs microsatellites reparties sur les 8 groupes de liaisons. Carte établie dans l’équipe de T. Huguet (donnés non publiées).

80

6.2. Phénotypage des lignées recombinantes

Le phénotypage des lignées recombinantes a été fait à 15 et 21 jours après inoculation

avec A. euteiches (tableau MM.5). Les paramètres mesurés sont le pourcentage de tissus

symptomatiques sur tige, le degré de jaunissement des cotylédons sur une échelle de 0 à 2 (0 :

les deux cotylédons sont verts, 2 : les deux cotylédons sont jaunes) et le pourcentage de

plantes mortes. A 21 jours on mesure également le poids frais des plantes.

Tableau MM.5: Paramètres de notation des symptômes d’attaque de Apahnomyces euteiches

sur racines de Medicago truncatula. Abréviation Paramètres Types de paramètres ST15 Longueur de symptôme sur la tige à 15jai

Paramètres mesurés

LT15 Longueur de la tige à 15jai CJ15 Pourcentage de cotylédons jaunes à 15jai M15 Nombre de plantes mortes à 15jai ST21 Longueur de symptôme sur la tige à 21jai LT21 Longueur de la tige à 21jai CJ21 Pourcentage de cotylédons jaunes à 21jai M21 Nombre de mort à 21jai PT21 Poids de la tige à 21jai PR21 Poids de la racine à 21jai PP21 Poids de la plante à 21jai

VST21 Egale à (ST21 – ST15) / (J21 – J15): exprime la vitesse de développement des symptômes sur la tige.

Paramètres calculés VLT21 Egale à (LT21 – LT15) / (J21 – J15): exprime la vitesse de croissance de la tige.

PR/PP21 Egale au poids de la racine / poids de la plante à 21jai

6.3. Génotypage de la descendance des lignées hétérozygotes dans le QTL

Dans le but de réduire l’intervalle de confiance du QTL, des lignées recombinantes F7

encore hétérozygotes dans le QTL ont été autofécondées pour générer des plantes fixées avec

des allèles A17 ou F83005.5 dans la région du QTL. Ces dernières sont alors qualifiées de

lignées quasi-isogéniques. L’identification de telles lignées a été fait au moyen d’un criblage

par des microsatellites polymorphes flanquant le QTL de part et d’autre (mtic742 et

mtic1149) (tableau MM.6).

81

Tableau MM.6: Séquence des amorces des marqueurs microsatellites utilisées pour le génotypage des lignées de M. truncatula ayant un crossing-over dans la région du QTL de résistance à A. euteiches.

LG3 (BAC)

Nom du marqueur

Amorce Sens Amorce Antisens

CR940308 Mtic1178 ACATTTTCAAGGGACAAAAA TAAGTGAGGAGTGGCCTACA

CR940308 Mtic1179 AGTGTGATTTTTACACCAAAGA TGTCAAGCTTCAGTTTTTCC

CR940308 Mtic1208 TAGTGAGCATGGAGAAATCA GTGAGCATGGTCAATCTCTT

CR940308 Mtic1209 AAAGATGGCAATTTCTATGG AATAAGAGGTTTCGGTGGAG

CR940308 Mtic1149 AAGGCCGCTTGTATATGTTA GGCGTAAATGCTAGAGTTGT

AC135103 Mtic742 CGCGAGTTTATACCATGACT TTCCAGAATGTTCACAATGA

AC135103 Mtic1210 AGTTACGTCGAAATGTGAAAG AAACCACCACCTCATGATAG

AC135103 Mtic1200 TGGTCACATGTTTGGCACAT TCCATTGACTCATTTGGTGTTT

AC135103 Mtic4a05(0) CGCGAGTTTATACCATGACT TTCCAGAATGTTCACAATGA

6.4. Méthodes bioinformatiques

L’analyse d’homologie de séquence a été fait par un blast sur la banque de donnée NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) en gardant les différents paramètres d’analyse par

défaut.

L’analyse du contenu en gène des BACs a été essentiellement obtenue à partir des

annotations IMGAG V1.0 ou V2.0 sur la banque de données de M. truncatula

(http://www.Medicago.org). .

Pour sélectionner de nouveaux marqueurs microsatellites (appelés SSR pour Single

Sequence Repeat) dans la région du QTL la carte physique de M. truncatula a été utilisée

(http://www.Medicago.org). A partir des BACs situés dans les premiers cM du chromosome

3, des SSRs ont été cherchés à l’aide du logiciel SSRIT (Simple Sequence Repeat

Identification Tool). Les marqueurs microsatellites ont été choisis selon les critères suivants :

le motif répété doit être di- ou tri-nucléotidique, le nombre de répétitions de ce motif doit être

supérieur à 10, la taille du fragment amplifié se situe entre 100 et 300 pb, le Tm autour de

55°C.

82

7. Analyses statistiques

7.1. Comparaison des moyennes

La comparaison des moyennes pour les analyses des dosages biochimiques a été faite avec

le logiciel STATISTICA version 5.1H.

7.2. Méthodes de détection du QTL

Les données sont arrangées dans un fichier Excel de manière à avoir pour chaque individu

de la population RILs (F7 et F8), un identifiant unique, des données génotypiques pour

l’ensemble des marqueurs utilisés (allèle A pour A17, B pour F83 ou H pour les individus

hétérozygotes) et des données phénotypiques. Des analyses de variances sont ensuite

effectuées à l’aide du logiciel statistique SAS (Carey, NC, U.S.A.) pour évaluer les effets

« génotypes » et « répétitions » et celui de leur interaction. Une estimation de la variance

génétique et de celle due à l’environnement est alors obtenue, en utilisant la procédure PROC

GLM. Ces deux paramètres servent à calculer l’héritabilité (h² = σ²g/(σ²g + [σ²e/r], σ²g :

variance génétique, σ²e : variance environnementale et r : nombre de répétition) des caractères

étudiés. La détection des QTLs a été faite par la méthode de « composite interval mapping »

(Jansen and Stam 1994; Zeng 1994) à l’aide du logiciel PLABQTL V1.1 (Utz and Melchinger

1996). Le seuil de LOD score significatif a été déterminé en faisant 10 000 permutations

(Churchill and Doerge 1994) en utilisant la commande « permute » du logiciel PLABQTL.

Dans notre cas, cette valeur est de 2,3. Les résultats fournis par PLABQTL indique la position

(numéro de groupe de liaison et distance en cM) la plus probable du QTL (LOD score

maximal), l’intervalle de confiance défini par les 2 régions de la courbe localisée à la valeur

LOD maximal -1 de part et d’autre du pic maximal et le coefficient R², correspondant dans

notre cas à la part de la résistance expliqué par le QTL identifié.

83

CHAPITRE I: RECENSEMENT DES MALADIES CRYPTOGAMIQUES ATTAQUANT

TROIS ESPECES DE MEDICAGO ANNUELLES EN TUNISIE

Les espèces annuelles du genre Medicago constituent une source importante de fourrage

pour le bétail en Tunisie. Plusieurs espèces poussent spontanément sur le territoire du pays,

parmi les quelles Medicago ciliaris, M. polymorpha et M. truncatula. Les deux premières

espèces se localisent au Nord, la troisième est ubiquiste sur l’ensemble du territoire. Dans le

cadre des projets du laboratoire plusieurs prospections ont été réalisées dans le but (i) d’établir

une collection de lignées de M. truncatula, M. ciliairis et M. polymorpha, (ii) de collecter les

champignons qui attaquent spontanément ces 3 espèces et (iii) de prendre des échantillons de

sols pour les essais de piégeage des Rhizobiums associés à ces légumineuses. Ces trois

collections (Medicago, champignons et bactéries) faites dans les mêmes régions représentent

une base pour les études génétiques et écologiques. Mon travail a été focalisé sur la

détermination des maladies fongiques les plus importantes attaquant ces trois espèces. Le

deuxième but été d’établir une collection d’isolats de Phoma medicaginis agent causal de la

tige noire de la luzerne et d’étudier leurs agressivités vis-à-vis de M. truncatula. Les

prospections ont été réalisées durant les années 2002, 2003, 2004, 2005 et 2007.

L’échantillonnage n’a concerné que les parties aériennes des plantes montrant des attaques

fongiques.

1. CHAMPIGNONS IDENTIFIES

Sur la base des observations macroscopiques des symptômes et microscopiques des

structures fructifères et en se référant à plusieurs ouvrages de phytopathologies (Anomyme

1976 ; Agrios 1988 ; Stuteville et Erwin, 1990) l’identification de la majorité des espèces

fongiques a été faite. Dix espèces appartenant à huit genres de champignons ont pu être

identifiés sur les trois espèces étudiées de Medicago (tableau I.1; figure I.1): Erysiphe

polygoni, Uromyces striatus, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza trifolii, Cercospora

medicaginis, Alternaria sp., Fusarium sp., Phoma medicaginis et Stemphylium sp.

84

Tableau I.1: Champignons identifiés sur feuilles de trois espèces annuelles de Medicago en Tunisie. Isolat Site Espèce de Medicago Mode de vie Espèce fongique VirulenceGhMp0507Al (1) Ghézala Medicago polymorpha Nécrotrophes Alternaria sp. -

SoMp0507S1Al Soliman M. polymorpha Alternaria sp. +

SoMp0507Al ++ Soliman M. polymorpha Alternaria sp. +

SoMp0507Al (1spore) Soliman M. polymorpha Alternaria sp. -

AmMt0303S1 Amra Medicago truncatula Cercospora medicaginis +

AmMt0303S5 Amra M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr1 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr2 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr3 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr4 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr5 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr9 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr10 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr14 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr15 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr16 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMt0203Cr17 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BaMT0203Cr20 Ben Arous M. truncatula C. medicaginis +

BrMT0302Cr11 Bulla Regia M. truncatula C. medicaginis +

BrMT0302Cr12 Bulla Regia M. truncatula C. medicaginis +

BrMT0302Cr18 Bulla Regia M. truncatula C. medicaginis +

BrMT0302Cr19 Bulla Regia M. truncatula C. medicaginis +

GhMp0507S2Cr Ghézala M. polymorpha C. medicaginis +

GhMp0507Cr (2) Ghézala M. polymorpha C. medicaginis +

JrMT0303Cr6 Jerba M. truncatula C. medicaginis +

JrMT0303Cr7 Jerba M. truncatula C. medicaginis +

JrMT0303Cr8 Jerba M. truncatula C. medicaginis +

JrMT0303Cr13 Jerba M. truncatula C. medicaginis +

JsMt0507S1Cr Jerissa M. truncatula C. medicaginis +

JsMt0507S1Cr Jerissa M. truncatula C. medicaginis +

JsMt0507S1Cr Jerissa M. truncatula C. medicaginis +

JsMt0507S1Cr Jerissa M. truncatula C. medicaginis +

KfMt0505Cr30 kef M. truncatula C. medicaginis +

KfMt0505Cr31 kef M. truncatula C. medicaginis +

MaMc0507Cr (2) Mateur Medicago ciliaris C. medicaginis +

MaMc0507Cr (3) Mateur M. ciliaris C. medicaginis +

MaMc0507Cr (4) Mateur M. ciliaris C. medicaginis +

MaMc0507Cr Mateur M. ciliaris C. medicaginis +

MaMc0507Cr (1) Mateur M. ciliaris C. medicaginis +

RhMP0203Cr1 Rhayet(Beja) M. polymorpha C. medicaginis +

RhMP0203Cr2 Rhayet(Beja) M. polymorpha C. medicaginis +

85

Tableau I.1: Champignons identifiés sur feuilles de trois espèces annuelles de Medicago en Tunisie (suite).

Isolat Site Espèce de Medicago Mode de vie Espèce fongique Virulence*RhMP0203Cr3 Rhayet(Beja) M. polymorpha Nécrotrophes C. medicaginis +

RhMP0203Cr4 Rhayet(Beja) M. polymorpha C. medicaginis +

SoMsp.0502Cr Soliman M. ciliaris C. medicaginis +

SoMp0507S1Cr Soliman M. polymorpha C. medicaginis +

SoMp0507S1Cr Soliman M. polymorpha C. medicaginis +

TuMc02Cr1 Tunis M. ciliaris C. medicaginis +

BrMt0404Ct Bulla Regia M. truncatula Colletotrichum sp. -

SoMt0404Ct Soliman M. truncatula Colletotrichum sp. -

GhMp0507St Ghézala M. polymorpha Stemphylium sp. +

GhMp0507St (2) Ghézala M. polymorpha Stemphylium sp. +

GhMp0507St (1) ++ Ghézala M. polymorpha Stemphylium sp. +

SoMc0505St Soliman M. ciliaris Stemphylium sp. +

JsMt0507S1Fu Jerissa M. truncatula Fusarium sp. nd

SoMt02Fu52 Soliman M. truncatula Fusarium sp. +

BrMt0302Ph1 (Ph1) Bulla Regia M. truncatula Phoma medicaginis +

BrMt0404Ph2 (Ph2) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0404Ph3 (Ph3) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0404Ph4 (Ph4) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0404Ph5 (Ph5) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0505Ph6 (Ph6) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0505Ph7 (Ph7) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

BrMt0404Ph8 (Ph8) Bulla Regia M. truncatula P. medicaginis +

SoMc0505Ph9 (Ph9) Soliman M. ciliaris P. medicaginis +

SoMc0505Ph10 (Ph10) Soliman M. ciliaris P. medicaginis +

SoMc0505Ph11 (Ph11) Soliman M. ciliaris P. medicaginis +

SoMc0505Ph12 (Ph12) Soliman M. ciliaris P. medicaginis +

MaMc0505Ph13 (Ph13) Soliman M. ciliaris P. medicaginis +

TuMt02Ph14 (Ph14) Tunis M. truncatula P. medicaginis +

JsMt0507S2Ph (2) Jerissa M. truncatula Phoma sp. nd

JsMt0507S2Ph (2) Jerissa M. truncatula Phoma sp. nd

JsMt0507S2Ph (3) Jerissa M. truncatula Phoma sp. nd

BaMt0203Pz Ben Arous M. truncatula Hémibiotrophes Pseudopeziza medicaginis +

SoMp0507Pz Soliman M. polymorpha Pseudopeziza trifolii +

BrMt0404Ur Bulla Regia M. truncatula Biotrophes Uromyces striatus +

SoMc0507Ur Soliman M. ciliaris U. striatus +

ThMt0404Ur Thala M. truncatula U. striatus +

BaMt0203Ur Ben Arous M. truncatula U. striatus +

BaMt0203Er Ben Arous M. truncatula Erysiphe polygoni +

BrMt0404Er Bulla Regia M. truncatula E. polygoni +

SoMc0507Er Soliman M. ciliaris E. polygoni +

SoMp0507Er Soliman M. polymorpha E. polygoni +

* nd : non déterminé.

86

Figure I.1: Symptômes et structures fructifères des plus importants champignons attaquant les Medicago annuelles en Tunisie. Les barres représentent 1cm (A,D,G,J,M et P), 100µm pour le reste des photos sauf (R) 10µm. cd: conidiophore, aq: asque, ap: apothécie, ur: urédie, us: urédiniospore, co : conidie, pc : pycnide.

Uromyces striatus

Erysiphe polygoni

Pseudopeziza trifolii

Cercospora medicaginis

Pseudopeziza medicaginis

Symptômes sur feuilles Morphologie des conidies

Phoma medicaginis

A B C

F D

E

I G

H

L J

K

O M

N

R P

Q

cd

us

ap

ap

aq

aq

ur

co

co

pc

co

10µm 100µm 1cm

100µm

87

1.1. Les espèces biotrophes et hémibiotrophes

L'oïdium (Erysiphe polygoni) et la rouille (Uromyces striatus) sont très répandus sur ces

espèces surtout au Nord et au centre de la Tunisie. E. polygoni a été identifié sur les trois

espèces de Medicago. Il possède des conidies hyalines, cylindriques (29-37 × 16-19 µm),

formant une chaîne portée par un conidiophore. Cette espèce d’oïdium occasionne des dégâts

sévères sur la partie végétative et reproductive des Medicago sp. U. striatus se distingue par la

production de pustules qui émergent sous l’épiderme aux deux faces de la feuille. Ces organes

de fructification appelés urédies augmentent de taille jusqu’à rompre l’épiderme de la feuille

et laissent alors échapper des urédiniospores (18,4-20,7 µm) de couleur brun rouge. U.

striatus et E. polygoni ont été trouvés, particulièrement lors des années pluvieuses, au Nord et

au Centre du pays, endommageant la qualité du fourrage produit. Deux espèces appartenant

au genre Pseudopeziza (hémibiotrophes) ont été trouvées: la première P. medicaginis, se

manifeste sur les feuilles par des taches arrondies de couleur rouge sans halo chlorotique, au

centre desquelles on trouve les apothécies, structures fructifières. La deuxième espèce, P.

trifolii, se manifeste sur les feuilles de M. polymorpha par des plages noires renfermant les

apothécies. En cas de forte attaque, le champignon provoque le dessèchement et la défoliation

des plantes infectées. En 2007, les dégâts occasionnés par cette maladie ont été sévères sur M.

polymorpha dans la région de Soliman.

1.2. Les espèces nécrotrophes

Cinq espèces de champignons nécrotrophes ont été isolées sur les luzernes annuelles:

Alternaria sp., Stemphylium sp., Fusarium sp., Cercospora medicaginis et Phoma

medicaginis. Alternaria et Stemphylium sont deux genres de champignons qui ont été trouvés

sur l’ensemble des échantillons analysés. Il scontiennent tous les deux des espèces

saprophytes et d’autres pathogènes. L’inoculation de plusieurs isolats monosporaux de ces

deux genres a montré l’existence de quelques isolats pathogènes sur M. truncatula. Le degré

d’attaque d’Alternaria sp. et de Stemphylium sp. comme agents pathogènes primaire est

faible. En revanche, ils sont redoutables comme parasites secondaires lorsqu’ils s’installent

après une attaque primaire d’un autre agent pathogène, d’un insecte ou même à la suite de

blessures occasionnées par un agent non biotique. Cercospora medicaginis a été isolé sur les

trois espèces étudiées dans diverses régions allant du Nord au Sud du pays (figure I.2). Ce

champignon se caractérise par une diversité très importante. En effet, l'analyse de plusieurs

isolats de C. medicaginis a montré une diversité au niveau des dimensions des conidies, de la

morphologie des cultures et du degré d’infection (données non montrées). Phoma medicaginis

88

a été isolé sur M. truncatula et M. ciliaris dans les régions Nord de la Tunisie. Ce champignon

provoque des nécroses sur feuilles et tiges. Sur feuilles les tâches sont brunes, plus ou moins

foncées et de forme irrégulière. Sur la tige, les nécroses sont allongées de couleur brun-foncé

à noir. En cas d’une forte infection il provoque une défoliation des plantes. Les conidies

peuvent être mono ou bi-cellulaires de dimension 4,99-7,20 × 2,01-2,90 µm (figure I.1). Sur

les cultures âgées (75-100 jours) de P. medicaginis on remarque la production de cristaux

caractéristique de l’espèce (Gray et al. 1990), qui sont bien visibles à la face inférieure de la

boîte.

Dans cette partie du travail nous avons montré que les espèces annuelles du genre

Medicago sont sujettes à l’attaque par plusieurs maladies qui sans doute déprécient la qualité

de leur fourrage. A notre connaissance il n’y a pas eu d’étude en Tunisie qui se soit intéressée

à recenser les maladies attaquant ces espèces ni à évaluer leur impact sur le potentiel pastoral

dans le pays. Il est donc intéressant de continuer cette étude pour voir l’impact de ces

maladies sur la quantité et la qualité du fourrage chez les espèces annuelles de Medicago.

Parmi ces maladies, celle des tiges noires, causée par Phoma medicaginis, est la plus redoutée

dans plusieurs régions du monde, à savoir l’Europe, l’Amérique du Nord (Gray et al. 1990) et

l’Afrique du Nord (Bouznad et al. 1996). De plus cette maladie attaque plusieurs espèces de

légumineuses à graines (pois et pois chiche) (Bouznad et al. 1996) et fourragères (Luzerne

pérenne) (Stuteville 1990 ; Gray et al. 2003). Dans la suite de ce chapitre on s’intéressera à

l’étude de la diversité pathologique d’isolats tunisiens de P. medicaginis.

2. DIVERSITE PATHOLOGIQUE DE PHOMA MEDICAGINIS

Afin de sélectionner l’isolat de P. medicaginis la plus agressif parmi les 14 souches

identifiées (tableau I.1), ces dernières ont été inoculées par pulvérisation sur plante entière de

la lignée F83005.5 qui a montré une sensibilité assez élevée lors des tests d’inoculations

préliminaires. En plus, la lignée F83005.5 a montré une sensibilité de réponse vis à vis de

l’attaque de plusieurs autres agents phytopathogènes tels que Colletotrichum trifolii

(Torregrosa et al. 2004), Erysiphe pisi (Ameline-Torregrosa et al. 2008a) et Aphanomyces

euteiches (Gaulin et al. 2007). L’ensemble des isolats provoque des nécroses sur feuilles qui

s’entourent par la suite d’un halo jaune. La zone nécrosée et la chlorose foliaire augmentent

au cours du développement du champignon dans les tissus jusqu’à provoquer le dessèchement

total de la feuille. Dans la zone nécrosée, le champignon commence 3 à 5 jours après

l’inoculation à produire des pycnides, structures fructifères contenant des conidies. En

conditions favorables d’humidité et de température, les pycnides libèrent une gelée sporifère.

89

Pour évaluer l’agressivité des souches, plusieurs symptômes ont été observés sur feuilles. Les

pourcentages des feuilles chlorosées, nécrosées, mortes et tombées ont été mesurés afin

d’évaluer un indice d’attaque (I) (figure I.2). Les résultas montrent qu’il y a une variabilité

assez importante dans le degré d’agressivité des isolats de P. medicaginis. En effet, 15 jours

après inoculation les isolats Ph1, Ph2, Ph3, Ph4, Ph9, Ph10 et Ph11 ont montré l’indice

d’attaque le plus élevé (entre 34,4% et 44,1%). Les isolats Ph5, Ph6, Ph7, Ph8 et Ph13 ont un

indice d’attaque intermédiaire variant entre 15,9% et 28%. Les isolats Ph12 et Ph14 ont

montré un degré d’attaque faible de 4,3% et 2,8%, respectivement. Ces deux derniers isolats

ne provoquent pas la mort des feuilles infectées, seulement des nécroses localisées ont été

observées sans apparition de pycnides, ce qui témoigne probablement d’une réaction HR. En

conclusion a cette première expérience, on constate que l’on observe une importante

variabilité du pouvoir pathogène de P. medicaginis sur feuilles de M. truncatula. Douze sur

les 14 des souches testées ont été virulentes, refermant celles initialement isolées sur M.

ciliaris.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Ph1 Ph2 Ph3 Ph4 Ph5 Ph6 Ph7 Ph8 Ph9 Ph10 Ph11 Ph12 Ph13 Ph14

Isolats de Phoma medicaginis

% d

'att

aque

% de Feuilles Nécrosées % de Feuilles chlorosées % Défoliation

% de Feuilles Mortes Indice d'attaque

Figure I.2: Diversité pathologique des isolats de Phoma medicaginis. Des plantes de 1 mois de la lignée F83005.5 ont été inoculées par des suspensions de conidies (106 conidies/ml). Les symptômes ont été mesurés 15 jours après inoculation. L’indice d’attaque: I= (%FN + %FC*2 + %FD*3 + %FM*4) / (somme des différents coefficients =10). Les coefficients ont été attribués de façon à tenir compte du stade de développement de la maladie sur les feuilles et pouvoir ainsi discriminer entre l’agressivité des différentes souches.

90

P. medicaginis est décrit comme étant capable d’infecter aussi bien les partie aériennes

que racinaires (Rodriguez et al. 1990; Rodriguez et Leath 1992). Pour confirmer cette

caractéristique biologique et comparer les niveaux d’agressivités, les 14 souches ont été

inoculées directement sur les racines des plantes de la lignée F83005.5 en culture in vitro sur

milieu M. L’inoculation par les différents isolats a provoqué des symptômes de brunissement

(figure I.3) sur racine, le jaunissement des cotylédons et la mort des plantules pour la plupart

des isolats. L’observation microscopique sous UV des coupes racinaires infectées par P.

medicaginis colorés à la WGA-FITC (figure I.3) a montré que ce parasite envahit le cortex et

le cylindre central de la racine des plantes inoculées à partir de 15 jours après inoculation. Le

degré d’attaque sur racine a été variable entre isolats (figure I.3). Les isolats les plus agressifs

sur racines sont Ph2, Ph6, Ph7, Ph10 et Ph11 avec un indice d’attaque supérieur à 80%. Les

isolats Ph1, Ph5, Ph8, Ph9 et Ph14 ont un indice moyen autour de 65%. Les isolats Ph3, Ph4

et Ph12 ont les indices d’attaque les plus faibles, en plus ces isolats n’ont pas provoqué de

mortalité chez les plantes inoculées. La corrélation entre les indices d’attaques sur feuilles et

sur racines est faible (R2= 0,25 ; p=0,37). On trouve néanmoins l’isolat Ph12 appartient aux

groupes les moins agressifs dans les 2 cas et les isolats Ph1, Ph2, Ph10 et Ph11 font partie du

groupe le plus agressif avec les deux méthodes d’inoculation. L’isolat Ph1 a été choisi afin

d’effectuer les tests de criblage des lignées de M. truncatula pour rechercher un couple ayant

des réponses différentielles.

91

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Ph1 Ph2 Ph3 Ph4 Ph5 Ph6 Ph7 Ph8 Ph9 Ph10 Ph11 Ph12 Ph13 Ph14

Isolats de Phoma medicaginis

% d

'att

aqu

e

% de cotylédons jaunes par plante % de plantes mortes Indice d'attaque

Figure I.3: Test d’inoculation racinaire et variations d’agressivité des isolats de Phoma medicaginis sur racines de la lignée F83005.5 de M. truncatula. Les racines de plantules de 3 jours, cultivées sur milieu M sont inoculées par une goutte de 5µl de conidies (106 conidies/ml). Les paramètres mesurés sont : le pourcentage de cotylédons jaunes par plante (%CJ) et le pourcentage de plantes mortes (%PM) 15 jours après inoculation. (A) symptôme d’attaque sur plante, (B) observation sous lumière blanche d’une coupe de racine de M. truncatula après inoculation par P. medicaginis, (C) coupe montrant l’envahissement de la racine de M. truncatula par P. medicaginis marqué au WGA-FITC après excitation sous UV, (D) Résultats de l’essai d’inoculation de 14 isolats sur racine de F83005.5. L’indice d’attaque (I)= (%CJ + %PM*2) / (somme des coefficients =3). Les coefficients ont été attribués de façon à tenir compte du stade de développement de la maladie sur les feuilles et pouvoir ainsi discriminer entre l’agressivité des différentes souches. Les bars correspondent à 1cm (A) et 100µm (B et C).

D

A B C

92

3. CONCLUSION

L’ensemble de résultats montre que M. truncatula, M. polymorpha et M. ciliaris sont

sujettes à l’attaque par plusieurs champignons (E. polygoni, U. striatus, P. medicaginis, P.

trifolii, C. medicaginis et Phoma medicaginis) qui sont connus pour occasionner des dégâts

importants dans la production de plusieurs légumineuses à graines telles que la fève, la

luzerne et le pois au Maghreb et particulièrement en Tunisie (Wirth et Joseph, 1994 ; Kharrat

et al. 1996 ; Mabsoute et al. 1996). La plante modèle M. truncatula, hôte pour tous ces

parasites, offre une alternative pour contourner les problèmes d’amélioration génétique de la

résistance contre ces maladies chez ces légumineuses à graines. En effet, cette plante a été

utilisée à travers le monde pour l’étude des mécanismes de résistance et la découverte de

nouveaux gènes de résistance à divers parasites (Cook et al. 1999 ; Torregrosa et al. 2004 ;

Kamphuis et al. 2008). De ce fait, on se propose dans le chapitre suivant d’étudier quelques

mécanismes de résistance chez M. truncatula à P. medicaginis. Dans ce chapitre il a été

montré une variabilité importante dans l’agressivité des souches de P. medicaginis, qui

dépend de l’organe inoculé. Il est donc important dans un programme de sélection de cultivars

résistants de faire des inoculations sur la partie aérienne et racinaire.

93

CHAPITRE II : ETABLISSEMENT DU PATHOSYSTEME MEDICAGO TRUNCATULA –

PHOMA MEDICAGINIS ET MISE EN EVIDENCE DE MECANISMES DE DEFENSE LIES

AU STRESS OXYDANT

L’objectif de ce chapitre qui a fait l’objet d’une publication dans la revue Journal of

Phytopathology (2007, vol.155: 633-640) était d’évaluer la réponse des plusieurs lignées de

M. truncatula à l’attaque par P. medicaginis. Ces lignées sont à l’origine de la production de

plusieurs outils génétiques: population en ségrégation de la F2 à la F9 et les lignées

recombinantes qui en dérivent (RILs); cartes génétiques essentiellement fondées sur des

marqueurs microsatellites. Après avoir identifié un couple de lignées différentielles, l’activité

de plusieurs enzymes intervenant dans le système antioxydant a été analysée pour évaluer

l’implication potentielle des ROS dans le niveau de résistance de M. truncatula à P.

medicaginis.

94

95

96

97

98

99

100

101

102

2. CONCLUSION

Un des objectifs de ce chapitre était d’évaluer les niveaux de résistance à P. medicaginis

de plusieurs lignées de M. truncatula, notamment impliquées dans la production de RILs. Les

résultats des inoculations ont montré que l’ensemble des lignées testées était sensible,

cependant des différences ont pu être mises en évidence en étudiant la réponse des lignées

après inoculation de feuilles détachées. Un couple de lignées mettant en jeu les accessions

F83005.5 (la plus sensible) et DZA45.5 (la moins sensible) ont été sélectionnées pour

analyser la présence et la régulation du peroxyde d’hydrogène au cours de l’infection des

deux lignées. Les résultats ont montré que ce composé s’accumule plus vite et plus fortement

dans la lignée la moins sensible. Bien que l’étude cinétique des activités des enzymes SOD et

POX n’ait pas permis d’identifier des différences majeures dans l’induction de l’une ou de

l’autre de ces enzymes entre ces lignées au cours du temps, il faut noter que l’activité POX

basale est clairement supérieure dans la lignée DZA45.5. Ces résultats, associés à une

accumulation plus forte de H2O2 chez DZA45.5, suggèrent qu’un mécanisme de résistance

partielle présent chez cette lignée pourrait impliquer ces deux éléments, et gêner via

l’épaississement des parois la progression de P. medicaginis, comme le montre faible

pourcentage de tissus foliaires colonisés chez DZA45.5 par rapport à F83005.5. En

perspective à ce travail des analyses plus précises, réalisées en microscopie confocale ou

électronique devraient permettre de confirmer cette hypothèse. Parallèlement un dosage

d’HRGP, tel qu’il a été fait dans le pathosystème M. truncatula – A. euteiches pourrait aussi

renforcer ces résultats. D’un point de vue génétique, les interactions différentielles observées

entre F83005.5 et DZA45.5 peuvent être exploitées grâce l’existence de la population LR3,

issue d’un croisement initial entre ces deux lignées. Une carte génétique est également

disponible pour cette population (Pilet-Nayel, non publié). Associé au phénotypage de la

population LR3, une recherche de QTL de résistance permettrait de comparer les régions du

génome impliquées dans la résistance partielle par rapport à celles identifiées par Kamphuis et

ses collaborateurs (2008), en utilisant deux populations F2 issues du croisement de génotypes

de M. truncatula différents.

103

CHAPITRE III: ETUDE DES MECANISMES DE RESISTANCE CHEZ MEDICAGO

TRUNCATULA CONTRE APHANOMYCES EUTEICHES

Compte tenu de la difficulté de l’amélioration génétique de la résistance du pois à A.

euteiches, l’objectif principal du travail présenté dans ce chapitre était d’utiliser M. truncatula

pour identifier les mécanismes de résistance à Aphanomyces euteiches. Les résultats présentés

dans ce chapitre et celui du chapitre 4 ont été obtenus au cours de 3 périodes de stages de 4, 5

et 6 mois chacune à l’UMR5546, réparties en 3 ans de cette thèse en co-tutelle.

1. RECHERCHE D’INTERACTIONS DIFFERENTIELLES

L’établissement d’un pathosystème repose sur la réalisation de plusieurs étapes

successives. La première consiste à choisir un isolat dont le pouvoir pathogène (virulence +

agressivité) est élevé et permet une discrimination nette entre deux génotypes sélectionnés

ultérieurement pour analyser les mécanismes de résistance. Trois souches d’A. euteiches ont

été testées pour leur pathogénécité sur quelques lignées de M. truncatula. Une fois la souche

choisie, on passe au criblage des lignées de l’hôte afin d’identifier un couple présentant un

comportement différentiel. Les lignées qui ont été testées (TN1.11, TN1.21, TN3.17, TN6.18,

TN6.23, TN8.3, DZA45.5, A10, A17, A20 et F83005.5) proviennent des collections

tunisienne (Borj-Cedria) et française (Montpellier). Plusieurs d’entre elles sont impliquées

dans la production de RILs (voir matériel et méthodes). L’évaluation de la résistance des

lignées de M. truncatula et de l’agressivité des souches d’A. euteiches a été réalisée en

utilisant le test d’inoculation in vitro développé au laboratoire depuis 4 ans.

1.1. Caractérisation pathologique des souches d’A. euteiches

Les souches d’A. euteiches Ae-R1, Ae-R2 ont été isolés sur la luzerne (Medicago sativa)

et Ae-all sur le pois (Pisum sativum). Les deux souches Ae-R1, Ae-R2 ont été définies comme

deux races différentes R1 et R2 par Vandemark et Grunwald (2004). L’inoculation des 3

souches d’A. euteiches sur trois lignées de M. truncatula (DZA45.5, A17 et F83005.5) montre

qu’elles sont toutes virulentes sur cette espèce. Les 2 souches (Ae-R1 et Ae-R2) isolées sur M.

sativa ont pratiquement le même niveau d’agressivité par rapport aux symptômes sur tige à 15

et 21 dpi sur l’ensemble des lignées testées (figure III.1). En revanche, la souche Ae-all a

montré des différences de symptômes sur tige très variables selon la lignée utilisée. En effet,

104

15 jours après inoculation, près de 100% des tissus de la tige des plantes F83005.5 présentent

des symptômes, alors que seulement 14 et 38% des tiges sont attaqués chez DZA45.5 et A17

respectivement. Le pourcentage de cotylédons jaunes a été très variable en fonction de

l’interaction souche-lignée étudiée, le plus élevé étant noté dans l’interaction Ae-all-F83005.5

à 15 et 21 dpi. Pour le pourcentage de plantes mortes, on remarque qu’il est aussi variable en

fonction de l’interaction souche-lignée. Par exemple aucune plante de la lignée F83005.5

n’est morte à 21 jours après inoculation par les deux souches Ae-R1 et Ae-R2. En revanche il

atteint 62,1% après 21 jours d’inoculation par la souche Ae-all. Ainsi la comparaison des

résultats indique que Ae-all permet de discriminer le mieux les lignées testées quel que soit le

paramètre étudié. Cet isolat a donc été sélectionné pour la suite du travail.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Ae-R1/

DZA45

.5

Ae-R1 /

A17

Ae-R1 /

F83

005.5

Ae-R2 /

DZA45

.5Ae-

R2 / A

17Ae-

R2 / F

8300

5.5Ae-

all /

DZA45

.5

Ae-al

l / A

17Ae-

all /

F83

005.5

Souche / Lignée

% Symptôme sur tige 15 dpi % Cotylédons Jaunes 15 dpi % Plantes Mortes 15 dpi

Figure III.1: (A) Résultats d’inoculation à 15 dpi de 3 souches d’A. euteiches sur 3 lignées de M. truncatula. Trois paramètres phénotypiques ont été mesurés: le pourcentage (%) de symptômes sur tige, le % de cotylédons jaunes et le % de plantes mortes.

A

105

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Ae-R1/

DZA45

.5

Ae-R1 /

A17

Ae-R1 /

F83

005.5

Ae-R2 /

DZA45

.5

Ae-R2 /

A17

Ae-R2 /

F83

005.5

Ae-all

/ DZA45

.5

Ae-all

/ A17

Ae-all

/ F83

005.5

Souche / Lignée

% Symptôme sur tige 21 dpi % Cotylédons Jaunes 21 dpi % Plantes Mortes 21 dpi

Figure III.1 (suite): (B) Résultats d’inoculation à 21 dpi de 3 souches d’A. euteiches sur 3 lignées de M. truncatula. Trois paramètres phénotypiques ont été mesurés: le pourcentage (%) de symptômes sur tige, le % de cotylédons jaunes et le % de plantes mortes.

1.2. Comportement des lignées de M. truncatula après inoculation par A. euteiches

L’inoculation d’A. euteiches au niveau des racines provoque un brunissement qui

commence à être visible dès 3 dpi. Le brunissement s’étend de part et d’autre du point

d’inoculation atteignant ainsi la zone du collet et la tige à 6 dpi. La colonisation racinaire

entraînant alors le jaunissement puis le dessèchement des cotylédons entre 10 et 21 dpi.

Lorsque la lignée inoculée est sensible elle meurt à partir de 15 dpi. Ces différents critères ont

été pris pour l’évaluation de la résistance de quelques lignées de M. truncatula. Deux

répétitions indépendantes ont été faites pour l’ensemble des lignées avec en moyenne 10

plantes par lignée. Onze lignées (TN1.11, TN1.21, TN3.17, TN6.18, TN6.23, TN8.3,

DZA45.5, A10, A17, A20 et F83005.5) ont été inoculées par la souche Ae-all. Sur la base du

pourcentage de plantes mortes à 21 dpi (%PM21) les lignées testées se classent de la manière

suivante (figure III.2): les lignées sensibles TN1.11, TN6.23, A10 et F83005.5 qui ont un

%PM21 supérieur à 50%, les lignées partiellement résistantes TN1.21 et A17 qui ont un

%PM21 inférieur à 20% et les lignées résistantes DZA45.5, A20, TN6.18, TN3.17 dont le

%PM21 est nul. Toutefois on remarque qu’à l’intérieur de ces classes il existe des différences

entre les lignées. En effet, dans la classe des lignées partiellement résistantes la lignée A17

montre moins de symptômes sur tige et de cotylédons jaunes que la lignée TN1.21. Dans la

B

106

classe des lignées résistantes, la lignée DZA45.5 montre un pourcentage de symptôme sur tige

faible (16,6%) et pas de jaunissement sur cotylédons à 21 dpi, par contre la lingée TN6.18

montre un pourcentage de symptômes sur tige et un pourcentage de cotylédons jaunes de

l’ordre de 87% et 75% respectivement. Ceci dénote probablement l’existence de plusieurs

mécanismes de résistance à A. euteiches au sein des différentes lignées de M. truncatula.

Figure III.2: Evaluation de la résistance de quelques lignées de M. truncatula inoculées par la souche Ae-all d’A. euteiches. Les caractères mesurés sont le pourcentage (%) de symptômes sur tige, le % de cotylédons jaunes et le % de plantes mortes à 21 jours après inoculation.

On remarque, malgré ce nombre restreint de lignées, une variabilité de réponse assez

importante. Ce résultat confirme l’intérêt de l’utilisation de la variabilité naturelle comme

source de gènes de résistance, ainsi que cela a été montré avec d’autres accessions de M.

truncatula vis à vis d’A. euteiches (Vandemark et Grunwald 2004, Moussart et al 2007) ou

d’autres agents pathogènes (pour revue, Tivoli et al. 2006).

Dans ce travail, le couple de lignées F83005.5 (sensible) (figure III.3B) et A17

(partiellement résistante) (figure III.3E) a été retenu. La justification majeure de ce choix

repose sur i) l’existence de lignées recombinantes impliquant ces deux parents, produites

dans l’équipe de T. Huguet, ii) associé à une carte génétique de ce croisement, iii) le

séquençage du génome de M. truncatula réalisé sur la lignée A17 permettant d’établir

ultérieurement des liens entre la carte génétique et la carte physique et iv) l’existence de

réponses contrastées à d’autres agents pathogènes dans ce même couple de lignée tels que

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

TN1.11

TN1.21

TN3.17

TN6.18

TN6.23

TN8.3

A10 A20

DZA45.5

A17

F8300

5.5

Lignées

% Symptôme sur tige 21 dpi % Cotylédons Jaunes 21 dpi

% Plantes Mortes 21 dpi

107

Colletotrichum trifolii (Torregrosa et al. 2004), Erysiphe pisi (Ameline-Torregrosa et al.

2008a) et Ralstonia solanacearum (Vailleau et al. 2007) et même en réponse à des stress salin

et hydrique.

Figure III.3: Symptômes d’attaque d’A. euteiches sur deux lignées de M. truncatula à 21 dpi. (A) et (D) plantes F83005.5 et A17 témoins, (B) et (E) plantes F83005.5 et A17 inoculées sur milieu M et (C) et (F) plantes F83005.5 et A17 inoculés sur vermiculite. Les flèches indiquent le brunissement observé sur les racines de la lignée partiellement résistante A17, par contre on observe une décoloration de la racine chez la lignée sensible F83005.5. Les barres correspondent à 1cm.

1.3. Validation du pathosystème

Afin de confirmer les phénotypes obtenus in vitro, des inoculations en pots sur

vermiculite ont été faites sur les deux lignées parentales A17 et F83005.5 selon le protocole

décrit dans matériel et méthodes, adapté de Moussart et al. (2007). La principale différence

résidant dans l’inoculation précoce (2 jours après transfert sur vermiculite des plantules

germées). Des symptômes typiques d’attaque d’A. euteiches ont été observés sur la lignée

F83005.5, caractérisés par le jaunissement de la partie aérienne, la décoloration des racines et

la mort des plantules (figure III.3C). La lignée A17 ne présente pratiquement pas de

symptômes sur les parties aériennes (figure III.3F). Un brunissement racinaire est observable

B A

F83005.5 A17

D E

C F

108

sur 25 à 50% des racines. La comparaison des résultats, indique une similarité de symptômes

entre les deux tests pour les deux lignées inoculées. Les tests in vitro sont probablement un

peu plus «stringeant»: les symptômes apparaissent plus vite chez F83005.5 et les symptômes

sur les parties aériennes sont plus marquées chez A17. Compte tenu de ces résultats, le test

d’inoculation in vitro, permettant notamment de tester un nombre de plantes plus important, a

été ensuite préféré au test d’inoculation en pots.

2. DEVELOPPEMENT D’A. EUTEICHES DANS LES RACINES DE M. TRUNCATULA

Afin d’analyser le degré de colonisation des racines des deux lignées A17 et F83005.5 de

M. truncatula par A. euteiches, un comptage d’oospores a été fait à la surface des racines

après coloration à l’encre bleue à 6 et 21 dpi (figure III.4). Les résultats ont montré que les

racines de F83005.5 contiennent respectivement 2,6 fois et 2,5 fois plus d’oospores que celles

d’A17 à 6 et 21 dpi (figure III.4B). De plus, l’observation de coupes de ces racines a révélé

une différence nette entre les deux lignées concernant la distribution des oospores. En effet,

alors que de nombreuses oospores sont présentes dans le cortex et le cylindre central des

racines de F83005.5 (figure III.4C et E), ces structures n’ont été observées que dans le cortex

des racines d’A17 mais pas le cylindre central sur l’ensemble des coupes examinées (figure

III.4D et F). Afin de confirmer ces résultats un marquage d’A. euteiches par la WGA-FITC

dans les racines des deux lignées a été fait à 3, 6, 15 et 21 dpi. Ce marquage est possible grâce

à la présence de chitine récemment découverte dans la paroi d’A. euteiches (Badreddine et al.

2008). Aucun marquage de mycélium ou d’oospores n’a été détecté dans le cylindre central de

la lignée résistante A17 pour les 4 temps analysés (figure III.5B, D, F et H) contrairement

aux racines de la lignée sensible, dans lesquelles A. euteiches a été détecté dans l’ensemble

des tissus, notamment le cylindre central où il est présent dès le 15ème jours après inoculation.

(figure III.5E et G).

109

Figure III.4: Observations microscopiques de la distribution des oospores d’A. euteiches dans les racines des deux lignées de M. truncatula détectées par coloration à l’encre bleue. (A) Apex d’une racine colonisé par des oospores. (B) Nombre d’oospores à la surface des racines de deux lignées de M. truncatula à 6 et 21 jours après inoculation par une souche d’A. euteiches. Le comptage des oospores a été fait, après coloration à l’encre bleue des racines infectées, sur une longueur moyenne de 5 mm linéaire pour dix racines. (C et D) coupes transversales de racine de F83005.5 et A17 et (E et F) coupes longitudinales de racines de F83005.5 et A17. Les barres correspondent à 100 µm. CR: cortex racinaire, CC: cylindre central. Les oospores sont indiquées par des flèches.

A

F83005.5 A17

C

C

cc

C D

A17

cc

F83005.5

cc

E FC

C

cc

0

50

100

150

200

250

300

350

400

6 dpi 21 dpi

Te mps d'obse rvations

Nom

bre

d'oo

spor

es

F83005.5 A17B

110

Figure III.5: Comparaison de l’infection d’A. euteiches dans les racines de deux lignées de M. truncatula A17 et F83005.5. Le mycélium et les oospores sont marqués au WGA-FITC (vert). La couleur bleue indique la présence de composés aromatiques intervenant dans la défense chez la lignée lignée A17. Ces composés sont peu ou pas détectés chez la lignée F83005.5. CC: cylindre central, les barres correspondent à 100µm.

A 21

21 dpi

A

C

E

B

D

F

3 dpi

6 dpi

15 dpi

F83005. A1

HG

cc

cc

c

cc

cc

cccc

cc

111

3. ANALYSE DES MECANISMES DE RESISTANCE DE M. TRUNCATULA A A. EUTEICHES

L’objectif de cette partie était d’identifier des composantes des mécanismes de

résistance à A. euteiches à partir de la comparaison des deux lignées sélectionnées en

utilisant des approches complémentaires cytologiques et biochimiques. Les

mécanismes identifiés chez A17 par la suite concernent une tolérance ou une

résistance de type quantitative.

3.1. Analyses microscopiques

Pour chercher au niveau cytologique des différences éventuelles entre les racines des deux

lignées avant et après inoculation nous avons examiné des coupes fraîches ou fixées dans la

résine en microscopie optique et confocale en utilisant différents colorants. Des observations

ont été réalisées sur les racines des deux lignées à 1, 3, 6, 15 et 21 dpi afin d’analyser sur le

plan histologique les deux types d’interactions.

3.1.1. Mise en évidence de mécanismes protégeant le cylindre central chez A17

3.1.1.1. Accumulation des composés aromatiques

L’analyse microscopique en épifluorescence des coupes racinaires d’A17 et F83005.5 à

différents temps après inoculation indique une forte accumulation de composés aromatiques

solubles dans le cortex racinaire d’A17 dès le 1er jour après inoculation. Cette fluorescence est

détectée dans différents endroits du cortex jusqu’à 15 dpi. Les composés fluorescents

s’accumulent progressivement autour du cylindre central à partir de 15 dpi, puis sont ensuite

retrouvés à l’intérieur du cylindre central entre 15 et 21 dpi (figure III.5D, F et H). Une très

légère fluorescence a pu être observée vers 6 dpi dans les racines de F83005.5, mais celle-ci

disparaît par la suite.

En conclusion, l’accumulation de composés aromatiques, fluorescents sous UV, constitue

une première différence majeure entre A17 et F83005.5. Elle est beaucoup plus forte, plus

rapide et plus stable dans les racines d’A17 inoculées. On a pu constater une relation

inversement proportionnelle entre l’accumulation de ces composés et la présence du

mycélium dans les racines d’A17, suggérant ainsi leurs propriétés antimicrobiennes. Outre

cette induction plus forte après inoculation, il faut noter que le niveau de fluorescence basal

chez A17 est également plus fort que chez F83005.5 et entre donc vraisemblablement dans un

mécanisme de défense constitutive qui n’est pas présent chez la lignée sensible.

112

3.1.1.2. Division des cellules du péricycle

En fond clair, les différentes observations montrent qu’il n’y a pas de différence

cytologique entre les racines des deux lignées avant et jusqu’à 3 jours après inoculation. En

revanche, des divisions observées au niveau des cellules du péricycle d’A17 inoculées font

partie des différences majeures entre les deux lignées. Ces divisions ne sont pas orientées par

rapport aux vaisseaux, contrairement à la formation des racines secondaires, mais peuvent

apparaître tout autour du cylindre central (figure III.6F et H), allant jusqu’à 3 couches de

cellules supplémentaires. Elles n’ont jamais été détectées chez F83005.5 (figure III.6E et G).

Ces divisions du péricycle constituent donc probablement une barrière physique

supplémentaire pour protéger le cylindre central. Une autre hypothèse, non exclusive, peut

être le fait qu’elles favorisent l’émission de racines secondaires qui permettraient à la plante

d’échapper plus facilement à la colonisation par le parasite et de maintenir ainsi des organes

lui assurant la fourniture en eau et éléments minéraux nécessaire à sa croissance. Cette

hypothèse concorde avec le fait que la lignée A17 produit plus de racines secondaire

consécutivement à l’infection par A. euteiches (figure III.3E) par rapport à la lignée sensible

F83005.5 (figure III.3B) ou aux plantes A17 non inoculées (figure III.3D).

113

Figure III.6: Observations sous microscope optique de coupes de racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 avant (témoin) et après inoculation par A. euteiches. On observe des divisions des cellules de péricycle chez A17 mais pas chez F83005.5. Les barres correspondent à 100µm. Les divisions des cellules du péricycle sont indiquées par des flèches. CC: cylindre central. Les barres correspondent à 100µm.

Témoin

A17

3 dpi

6 dpi

6 dpi

F83005.5

CC CC

A

C

B

D

E F

G H

114

3.1.1.3. Dépôt de lignine

Une différence supplémentaire, visible en épifluorescence, réside dans le dépôt de

composés fluorescents sur la paroi des cellules externes du péricycle et de l’endoderme. Pour

identifier ces composés une coloration au phloroglucinol a été réalisée sur des coupes de

racines inoculées et témoins. Une coloration rouge-violette, est visible à partir de 3 dpi chez la

lignée A17 et s’étend autour du cylindre central dès 6dpi (figure III.7C). Ce résultat indique

donc l’accumulation de lignine qui forme un anneau autour du cylindre central. Sur les coupes

de racines inoculées de F83005.5 (figure III.7E et F), ou non inoculées de la lignée A17 la

coloration n’apparaît qu’au niveau du xylème.

En conclusion à cette partie on peut dire que le renforcement des cellules autour du

cylindre central constitue une différence majeure entre les deux lignées. Elle est marquée par

une production plus rapide et plus importante de composés fluorescents autour et dans le

cylindre central d’A17 par rapport à F83005.5. Un autre mécanisme de renforcement qui n’a

jamais été décrit auparavant, à notre connaissance, lors d’interactions plantes- agents

pathogènes réside dans la division des cellules du péricycle ajoutant jusqu’à 3 assises

cellulaires autour du cylindre central. Enfin, un troisième mécanisme de renforcement des

parois du péricycle et de l’endoderme, classiquement impliqué dans la défense contre

l’envahissement des tissus des plantes par les parasites, est celui du dépôt de lignine autour du

cylindre central.

115

Figure III.7: Détection de dépôt de lignine par coloration au phloroglucinol sur racines de deux lignées A17 et F83005.5 de M. truncatula à différent temps de l’inoculation par A. euteiches. Les barres correspondent à 100µm.

Témoin 3 dpi 6 dpiA

17

F83

005.

5

A

D

B C

F E

116

3.1.2. Les mécanismes associés aux ROS

3.1.2.1. Détection de l’activité peroxydase

La détection histochimique de l’activité POX a été faite par incubation des racines avant

et après inoculation dans un tampon succinate contenant H2O2 et le substrat chromogénique 4-

chloro-1-naphthol. Le H2O2 est utilisé par les peroxydases endogènes pour oxyder le 4-

chloro-1-naphthol qui donne alors un précipité bleu foncé. Les résultats ont montré que

l’activité de cette enzyme est détectée dans les cellules épidermiques à 1 (figure III.8D) et 3

dpi (figure III.8F) et dans les cellules corticales à 6 dpi chez A17 (figure III.8H et J). En

outre, on remarque dans les coupes racinaires d’A17, que les cellules montrant l’activité POX

sont adjacentes à celles montrant un brunissement dû à l’oxydation de composés phénoliques

indiquant ainsi l’implication des POX dans ce processus comme suggéré dans d’autres études

antérieures (Takahama et al. 2004). Par contre, aucune coloration n’a été observée dans les

racines de F83005.5 aux différents temps analysés (figure III.8C, E, G et I), et parallèlement

peu ou pas de cellules corticales ont montré un brunissement à 6 dpi (figure III.8G et I).

3.1.3. Détection du peroxyde d’hydrogène

Afin d’étudier l’implication du H2O2 dans le processus de défense chez M. truncatula

contre A. euteiches, les racines des deux lignées A17 et F83005.5 ont été incubées dans une

solution de DAB (diaminobenzidine). La réaction entre le DAB et les molécules de H2O2

donne un précipité brun rougeâtre. Des coupes sont ensuite effectuées après inclusion dans

l’agarose. L’observation microscopique n’a pas montré de coloration spécifique dans les

racines des deux lignées 1 dpi (figure III.9C et Q) par rapport à leurs témoins relatifs (figure

III.9D et L). Dans les racines infectés de la lignée A17, à 3 et 6 dpi (figure III.9M et O), il a

été difficile de juger s’il y a ou non production de H2O2, car la coloration due au DAB ne se

différencie pas de la coloration brune (oxydation des composés phénoliques) observée

habituellement lors de l’infection des racines de cette lignée (figure III.9N et P). De même

pour F83005.5 il n’y avait pas de différence de coloration entre les coupes traitées (figure

III.9E et G) ou non (figure III.9F et H) avec DAB à 3 et 6 dpi, respectivement.

117

Figure III.8: Détection de l’activité peroxydase dans les racines de deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps de l’inoculation par A. euteiches. La détection histochimique de l’activité POX est révélée par une coloration bleu foncé. Les flèches rouges indiquent la localisation de l’activité POX. pr: les poils racinaires. Les barres correspondent à 100µm.

F83005.5 A17

Témoin

6 dpi

3 dpi

1 dpi

A B

C D

E F

H G

I J

6 dpi

pr

pr

pr

pr

pr

pr

pr

118

Figure III.9: Détection de H2O2 dans les racines de deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps de l’inoculation par A. euteiches. La détection de H2O2 a été faite après incubation des racines dans le Diaminobenzidine (DAB). DAB+ racines traités avec le DAB, DAB- racines non traitées au DAB. Les barres correspondent à 100µm.

119

3.2. Analyses biochimiques

3.2.1. Biosynthèse des composés phénoliques solubles et liés à la paroi

Le dosage au réactif de Folin-Ciocalteu des composés phénoliques solubles (CPS) et liés à

la paroi (CPLP) est présenté dans les figures III.10A et III.10B, respectivement. Les résultats,

correspondant à la moyenne de 3 expériences indépendantes, montrent que la teneur en ces

éléments ne change pas chez les deux lignées A17 et F83005.5 à 1 dpi. En revanche, ces deux

types de composés sont significativement induits notamment à 3 dpi, mais également à 6 dpi

chez A17. Ainsi on a augmentation de la production de CPS par rapport au témoin de 44,3%

et 38,8%, à 3 et 6 dpi respectivement (figure III.10A). De même, la teneur en CPLP dans les

racines d’A17 augmente à 3 dpi (+102,6%) et avec une moindre ampleur à 6 jours (+53,8%)

(figure III.10B). La lignée sensible F38005.5 a montré une légère augmentation des

composés solubles à 6 dpi seulement (figure III.10A). Pour les composés pariétaux, on

observe une légère diminution (-19,8%) dans la teneur en CPLP à 3 dpi suivie d’une légère

augmentation (+15,9%) à 6 dpi (figure III.10B).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1 dpi 3 dpi 6 dpi

Temps d'observation

Com

posé

s ph

énol

ique

s so

lubl

es

(µg

mg-1

de M

S)

F83005.5 Témoin F83005.5 Inoculée

A17 Témoin A17 Inoculée

Figure III.10: (A) Dosage des composés phénoliques solubles dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

A

120

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

1 dpi 3 dpi 6 dpi

Temps d'observation

Com

posé

s ph

énol

ique

s lié

s à

la p

aroi

(µg

mg-

1 de

MS)

F83005.5 Témoin F83005.5 Inoculée

A17 Témoin A17 Inoculée

Figure III.10 (suite): (B) Dosage des composés liés à la paroi dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

3.2.2. Biosynthèse de la lignine

Le dosage de la lignine a également été entrepris. Les résultats sont présentés dans la

figure III.11. On observe une augmentation de l’accumulation de ce polymère à 3 (+13,8%)

et 6 dpi (+47%) chez la lignée A17. Ce résultat est en corrélation avec l’apparition de

l’anneau de lignine autour du cylindre central, observé en microscopie à 6 dpi. En revanche,

aucun changement n’est observé dans la teneur en lignine chez la lignée sensible aux

différents temps d’analyse (figure III.11).

3.2.3. Biosynthèse des HRGP

Les HRGP sont des glycoprotéines qui s’accumulent en réponse à de nombreux stress

biotiques (Benhamou et al. 1996) et permettent de renforcer la paroi. Le dosage

d’hydroxyproline, acide aminé spécifique de ces protéines, a donc été entrepris pour détecter

une éventuelle différence de concentration entre les deux lignées. Les résultats montrent que

la teneur en hydroxyproline est significativement plus élevée chez les plantes A17 inoculées

par rapport aux contrôles et ainsi que par rapport aux plantes F83005.5 inoculées. On note en

particulier un pic d’augmentation (+68,5%) d’HRGP à 3 dpi chez A17 (figure III.12). Bien

que les moyennes obtenues soient légèrement supérieures à 3 et 6 dpi chez F83005.5 inoculé

par rapport aux contrôles équivalents aucune de ces augmentations n’est réellement

significative (figure III.12).

B

121

0

5

10

15

20

25

30

1 dpi 3 dpi 6 dpi

Temps d'observation

Lig

nin

e

(µg

mg-1

de

MS)

Figure III.11: Dosage de la lignine dans les dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

Temps d'observation

Hyd

roxy

prol

ine

(µg

mg-1

de

MS)

F83005.5 Témoin F83005.5 InoculéeA17 Témoin A17 Inoculée

Figure III.12: Dosage de l’hydroxyproline dans les dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 à différents temps après inoculation par A. euteiches.

122

3.2.4. Enzymes antioxydantes

Pour déterminer l’implication éventuelle des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans

les mécanismes de défense de M. truncatula contre A. euteiches, l’activité de quatre enzymes

antioxydantes a été étudiée par dosage spectrophotométrique dans les racines des deux lignées

au cours d’une cinétique d’infection. Il s’agit de la gaïacol peroxidase (POX), l’ascorbate

peroxidase (APX), la superoxide dismustase (SOD) et la catalase (CAT). Trois dosages

indépendants ont été faits pour l’ensemble de ces enzymes avec à chaque fois 10 plantes. Les

résultats, présentés dans la figure III.13, ont montré que les activités de ces enzymes varient

chez les deux lignées inoculées.

L’activité POX augmente significativement à 1 dpi chez A17, alors qu’elle diminue dans

les racines de F83005.5 à ce même temps (figure III.13A). Aucune différence significative

n’est ensuite enregistrée par rapport à l’activité POX des racines témoins des deux lignées à 3

et 6 dpi (figure III.13A).

Une cinétique identique est enregistrée pour l’activité APX dans les racines d’A17

inoculées: augmentation à 1 dpi puis stabilisation au temps suivants. Dans les racines de la

lignée sensible F83005.5, on note une diminution de l’activité APX à 3 et 6 dpi (figure

III.13B).

L’activité SOD est relativement stable chez la lignée A17, en revanche elle diminue

significativement dans les racines de F83005.5 à 3 et 6 dpi (figure III.13C).

La différence la plus importante entre les deux lignées a été observée pour la CAT. En

effet, l’activité de cette dernière enzyme est supérieure d’un facteur de 8, 9 et presque 3 dans

les racines inoculées d’A17 à 1, 3 et 6 dpi, respectivement par rapport aux contrôles

équivalents non inoculés (figure III.13D). Inversement, les dosages de la CAT dans les

racines inoculées de F83005.5 ont montré que l’activité de cette enzyme subit une diminution

de 74.1% et 86.1% à 3 et 6 dpi, respectivement (figure III.13D).

123

0

10

20

30

40

50

60

70

1 dpi 3 dpi 6 dpi

temps d'observations

Per

oxyd

ase

(µm

ole

min

-1 m

g-1

of p

orte

in) F83005.5 témoin F83005.5 inoculée

A17 témoin A17 inoculée

012345

6789

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

temps d'observations

Asc

orba

te p

erox

ydas

e

(µm

ole

min

-1 m

g-1 p

rote

in)

F83005.5 témoin F83005.5 inoculéeA17 témoin A17 inoculée

0

10

20

30

40

50

60

1 dpi 3 dpi 6 dpi

temps d'observations

Supe

roxi

de d

ism

utas

e

(U m

in-1

mg-1

pro

tein

)

F83005.5 témoin F83005.5 inoculéeA17 témoin A17 inoculée

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

1 dpi 3 dpi 6 dpi

temps d'observationsC

atal

ase

(µm

ole

min

-1 m

g-1 o

f pr

otei

n)

F83005.5 témoin F83005.5 inoculéeA17 témoin A17 inoculée

Figure III.13: Activités enzymatiques de 4 enzymes antioxydantes (la gaïacol peroxydase (A), l’ascorbate peroxydase (B), la superoxyde dismustase (C) et la catalase (D)) dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 inoculées par A. euteiches. Les mesures des activités ont été faites à 1, 3 et 6 jours après inoculation (dpi). Les valeurs indiquées correspondent aux moyennes de 3 répétitions.

A

C D

B

124

3.2.5. Production de peroxyde d’hydrogène

Afin de pallier à l’absence de conclusions nettes du test avec le DAB, une méthode de

dosage de l’H2O2, basée sur l’oxydation du luminol a été utilisée. Les résultats sont présentés

dans la figure III.14.

Les résultats de dosage d’H2O2 dans les racines inoculées d’A17 ont montré que sa

concentration diminue par rapport à celle des témoins de 62.3%, 55.5% et 53.3% à 1, 3 et

6dpi, respectivement. Suite à l’infection de F83005.5 par A. euteiches, on note une faible

augmentation initiale de la production de H2O2 à 1 dpi, qui diminue ensuite à 3 dpi (-24.1%),

mais avec une moindre ampleur que dans la lignée résistante, puis qui chute fortement (-

54.3%) à 6 dpi. Elle reste cependant significativement plus élevée que dans les racines

inoculées d’A17 à ce temps de l’interaction. Les concentrations d’H2O2 dans les racines

témoins des deux lignées ont été de l’ordre de 100µmole/g de matière fraîche. Il est à noter

que la concentration de H2O2 chez le témoin de F83005.5 a été relativement stable au cours du

temps, en revanche celle d’A17 a connu une diminution significative à 6 dpi par comparaison

avec 1 et 3 dpi.

Initialement utilisée pour tester la réponse des plantes à différents PAMPs (Ziepfel et al.

2006) la technique de dosage de H2O2 au luminol a été sensible, reproductible et simple à

réaliser. En effet, elle a permis de détecter des quantités de H2O2 de l’ordre du nanomolaire.

Cette technique est donc une alternative très intéressante en particulier lorsque le DAB n’est

pas utilisable.

125

0

20

40

60

80

100

120

140

1 dpi 3 dpi 6 dpi

temps d'observations

Pér

oxid

e d

'hyd

rogè

ne

(µm

ole

g-1 M

F)

F83005.5 témoin F83005.5 inoculéeA17 témoin A17 inoculée

Figure III.14: Evaluation de la concentration du peroxyde d’hydrogène (H2O2) par dosage dans les racines des deux lignées de M. truncatula F83005.5 et A17 inoculées ou non par A. euteiches. Les concentrations absolues ont été déterminées grâce à une courbe étalon faite à partir de concentrations bien déterminées de H2O2. Les observations ont été faites à 1, 3 et 6 jours après inoculation (dpi). MF : matière fraîche.

4. CONCLUSION

Un protocole d’inoculation in vitro d’A. euteiches pour le criblage des lignées de M.

truncatula a été mis au point. Il permet d’étudier le développement en temps réel de la

maladie et l’apparition simultanée des symptômes sur racines et tiges. Il s’agit d’un test

reproductible et fiable qui permet de tester un nombre assez important de plantes dans un

espace relativement réduit. Un protocole comparable a été utilisé par Vailleau et al. (2007)

pour l’étude du processus d’infection de Ralstonia solanacearum sur racines de M.

truncatula. Malgré le nombre réduit de lignées testées, une variabilité importante de la

résistance a été notée. En effet, selon leur pourcentage de mort à 21 dpi les lignées ont été

groupées en 3 classes: sensibles (ex. F83005.5), partiellement résistantes (ex. A17) et

résistantes (ex. DZA45.5). A partir des résultats obtenus et en s’appuyant sur les outils

génomiques et génétiques disponibles, le couple F83005.5 et A17 a été sélectionné pour les

analyses cytologiques et biochimiques afin d’identifier différents mécanismes de résistance.

Les analyses microscopiques des réponses de défense chez la lignée A17 ont montré qu’elles

étaient accompagnées par (i) l’accumulation de composées aromatiques solubles dans le

cortex racinaire dès 1 dpi, (ii) le dépôt de lignine autour du cylindre central dès 3 dpi et (iii)

126

une activité peroxydase intense qui est localisée d’abord dans les cellules de l’épiderme à 1 et

3 dpi puis dans les cellules corticales à 6 dpi.

Les analyses biochimiques ont confirmé les résultats observés en microscopie. En effet,

les réponses de défense chez A17 mettent en jeu une accumulation de composés phénoliques

solubles et liés à la paroi. Ces derniers s’accompagnent d’une accumulation de lignine dès 3

dpi. L’épaississement des parois observé est corrélé à une augmentation des HRGP chez A17.

Par ailleurs, une augmentation générale de l’activité des enzymes antioxydantes a été aussi

observée chez A17 concomitante d’une diminution du peroxyde d’hydrogène dans cette

même lignée. Consécutivement à ces résultats, nous proposons le modèle présenté dans la

figure III.15 pour expliquer le mécanisme oxydant de résistance à A. euteiches. Par

opposition à plusieurs autres études (Levine et al. 1994; Mehdy 1994), nous avons trouvé que

la résistance à A. euteiches a été associée à une diminution de la concentration en H2O2. Cette

diminution de la concentration de H2O2 chez A17 est attribuable à l’activité élevée de la POX,

de l’APX et de la CAT au début de l’interaction (1 dpi). A 3 dpi, seule l’activité CAT

continue d’être élevée chez les plantes inoculées d’A17, parallèlement les plantes

commencent à synthétiser des composés phénoliques solubles ou liés à la paroi, ainsi que de

la lignine. En présence de POX il y a probablement oxidation des composés phénoliques par

consommation de H2O2, ce qui mène au brunissement observé dans les racines d’A17. Cette

réaction consommatrice de H2O2, laisse supposé qu’elle contribue au maintien de l’état

d’équilibre des ROS dans les cellules infectées d’A17. De plus, le processus de lignification

constitue un processus au cours duquel les peroxydases pariétales consomment H2O2 pour

l’assemblage des monolignols de lignine. A 6 dpi on remarque une augmentation de la

production des composés phénoliques et un dépôt plus important de lignine. En revanche, au

début de l’interaction sensible (A. euteiches – F83005.5) nous avons remarqué une

augmentation de la production de H2O2. Cette augmentation est attribuable à une diminution

de l’activité des enzymes antioxydantes (POX et CAT). Bien que la concentration de H2O2

diminue aussi dans les racines de F83005.5 à 6 dpi, elle reste plus élevée que celle des racines

infectées d’A17. D’après Peng et Kuc (1992), la concentration toxique pour les

microorganismes est de l’ordre de 26,1µM. Dans les racines infectées d’A17 la concentration

en H2O2 a variée de 27,35 à 40.19µM ce qui est probablement suffisant pour réduire le

développement d’A. euteiches sans endommager les cellules de la racine, et pourrait induire la

cascade des gènes de défense dont la CAT (Polidoros et Scandalios 1999; Guan et Scandalios

2000). Ce même phénomène a été observé auparavant par Magbanua et al. (2007) chez le

maïs dont la résistance à Aspergillus flavus s’accompagne d’une diminution de la

concentration en H2O2.

127

Lignée partiellement résistante : A17

Lignée sensible : F83005.5

CC

Figure III.15: Synthèse des dosages biochimiques faits sur les racines d’A17 et F83005.5 à 1, 3 et 6 jours après inoculation (dpi) par A. euteiches (Ae). SOD : superoxide dismutase, CAT : catalase, POX : gaïacol peroxydase, APX : ascorbate peroxydase, SPC : composés phénoliques solubles, LIG : lignine, CC : cylindre central. Augmentation, diminution, pas de changement.

CC

128

CHAPITRE IV: ETUDE GENETIQUE DE LA RESISTANCE A APHANOMYCES

EUTEICHES CHEZ MEDICAGO TRUNCATULA

Depuis l’énoncé du concept de gène-pour-gène de Flor en 1955, plus d’une quarantaine de

gènes de résistance (R) ont été clonés à partir de plantes modèles ou cultivées (Martin et al.

2003). Ces gènes R, dont la majorité d’entre eux appartient à la famille des NB-LRR (Takken

et al. 2006), ont été mis en évidence dans le cadre de l’étude de résistance qualitative. Celle-ci

est le plus souvent race spécifique et est en général accompagné d’une réponse hypersensible

(HR) qui permet l’arrêt rapide du développement du parasite. Dans le cadre de l’actualisation

des concepts concernant l’immunité innée des plantes (Jones et Dangl, 2006), la résistance

liée aux gènes R a été requalifiée sous le terme d’«Effector Triggered Immunity» (ETI). Elle

intervient, en effet, en deuxième ligne de défense, pour contrer les effecteurs du parasite qui

ont permis à ce dernier de contourner les défenses liées à la «PAMP-Triggered Immunity»

(PTI). Si l’ETI a été particulièrement bien étudiée au cours des 10 dernières années, tant vis-à-

vis de l’identification des gènes R que des voies de signalisation qui leur sont liées (Jones et

Dangl 2006; Glazebrook 2005; Hammond-Kosack et Parker 2003), il y a eu en revanche très

peu d’études qui ont permis d’identifier formellement les gènes et les mécanismes associés à

la résistance quantitative.

L’étude du pathosystème sélectionné dans ce travail entre M. truncatula et A. euteiches

devrait permettre de répondre à une partie de ces interrogations. Le chapitre précédent a

montré, en effet, que le parasite effectue un cycle complet dans les lignées F83005.5 et A17,

ainsi que le montre la présence d’oospores. La résistance étudiée chez A17 est donc d’ordre

quantitatif. Les objectifs poursuivis dans ce chapitre étaient :

(i) d’identifier par une recherche de QTL la ou les régions du génome de M. truncatula

responsable(s) de cette résistance;

(ii) d’entreprendre la validation des QTLs éventuellement identifiés et la cartographie fine

de ces derniers en associant les outils génétiques;

(iii) d’étudier les liens éventuels entre les résultats de l’analyse génétique et ceux obtenus

dans le chapitre précédent, concernant les mécanismes de résistance observés.

129

1. ANALYSE GENETIQUE DE RESISTANCE A A. EUTEICHES

1.1. Outils génétiques utilisés

Deux outils sont nécessaires pour aborder le travail de recherche de QTL de résistance :

une population de lignées recombinantes (RILs) et une carte génétique de M. truncatula

permettant de génotyper les RILs. Tous deux ont été développés au laboratoire SP2 (ENSAT)

dans l’équipe de T. Huguet. Dans le cadre de ce travail 139 RILs en génération F7, issus de la

population LR5 (F83005.5 x A17) ont été utilisées. Une carte génétique cadre contenant 105

marqueurs microsatellites répartis régulièrement sur les 8 groupes de liaison (un tous les 5,5

cM, pour une taille totale de 574 cM) représentant les 8 chromosomes de M. truncatula a

servi à la recherche de QTL. La région identifiée a ensuite été enrichie en marqueurs, déduits

à partir de la séquence connue de A17 (www.medicago.org).

1.2. Phénotypage de la F1 et de la population de lignées recombinantes

Le criblage d’hybrides F1 et des 139 RILs a été fait selon le protocole d’inoculation in

vitro décrit dans la partie « matériel et méthodes ». Le phénotypage a été réalisé sur des lots

de 15 à 20 RILs en incluant à chaque fois les deux parents comme témoins. Les symptômes

ont été relevés à 15 et à 21 dpi et ont permis de calculer: les pourcentages de tissus de tige et

de cotylédons montrant des symptômes, le pourcentage de plantes mortes, le poids de la partie

aérienne et le poids de la racine.

1.2.1. Analyse de l’hybride F1

En dépit du peu de graines F1 disponibles, une dizaine ont été inoculées pour être

phénotypées. Les résultats sont présentés dans la figure IV.1 et indiquent que, quel que soit le

paramètre mesuré, l’hybride F1 a le même phénotype que F83005.5 (figure IV.1A et B).

Selon Mendel, l’observation phénotypique d’une plante hybride issue du croisement entre

deux lignées parentales présentant un comportement différentiel pour un caractère donné

permet d’identifier la dominance ou la récessivité de ce caractère. Ainsi, les résultats obtenus

montrent que la résistance observée chez A17 à A. euteiches est récessive.

130

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

110%

% Symtôme surtige 15 dpi

% Cotylédonsjaunes 15 dpi

% plantesmortes 15 dpi

% Symptôme surtige 21 dpi

% Cotylédonsjaunes 21 dpi

% plantesmortes 21 dpi

Paramètres mesurés

A17 F83005.5 F1

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

Tige 21 dpi Racine 21 dpi Plante 21 dpi

Paramètres mesurés

mas

se e

n g

A17 F83005.5 F1

Figure IV.1: Comparaison des Phénotypes des lignées parentales A17 (résistante) et F83005.5 (sensible) et de l’hybride F1 à 15 et 21 jours après inoculation d’A. euteiches.

A

B

131

1.2.2. Analyses des RILs

1.2.2.1. L’héritabilité

L’héritabilité est le rapport entre la variance génétique et la variance totale (variance

génétique + variance liée à l’environnement). Elle représente donc une estimation de la part

due à la génétique dans les résultats obtenus. Le tableau IV.1 présente la valeur de

l’héritabilité calculée pour les différents paramètres calculés. Elle varie entre 58% pour les

symptômes sur la tige à 35% pour le poids des racines.

La proportion des symptômes sur tige semble donc être le paramètre le plus fiable pour

rechercher des QTL, et se rapproche de la valeur d’héritabilité calculée sur la même

population phénotypée avec différentes races de Colletotrichum trifolii (Ameline-Torregrosa

et al. 2008a). Des valeurs plus faibles obtenues pour le poids des plantes semblent indiquer un

rôle plus important de l’environnement pour ce paramètre. Ces faibles valeurs pourraient

également être liés à un déficit de mesures qui n’ont pas été réalisées pour environ un quart de

la population lors de la première répétition. La valeur moyenne (45%) pour l’héritabilité du

jaunissement des cotylédons pourrait être liée à la fragilité de ces feuilles, en particulier en

condition in vitro ou au fait que la mesure des pourcentages de tissus jaunes est une

appréciation visuelle et par définition reste subjective. Même si certaines valeurs ne sont pas

très fortes, elles n’empêchent pas de rechercher des QTLs, ainsi que d’autres études l’ont

montré (Sicard et al. 2008).

1.2.2.2. Corrélation entre les caractères étudiés

L’étude des corrélations entre les différents paramètres mesurés (tableau IV.2) a montré

que les paramètres symptôme sur tige à 15 et 21 dpi sont significativement et positivement

corrélés au jaunissement des cotylédons à 21 dpi et le nombre de plantes mortes à 15 et 21 dpi

et sont négativement corrélés au poids de la plante et de la tige. Ces résultats sont donc

conformes aux attentes intuitives selon lesquelles les paramètres mesurant l’intensité de la

maladie varient en sens inverse de ceux qui évaluent la croissance des plantes inoculées. La

corrélation positive entre les différents symptômes mesurés montre que tous sont

significativement associés au développement de la maladie.

132

Tableau IV.1: Valeurs de l’héritabilité (h²) des paramètres calculés après phénotypage de la population LR5. Paramètres h2 % symptômes sur tige (15 dpi) 0,58 % jaunissement des cotylédons (21 dpi) 0,44 % de plantes mortes (21 dpi) 0,51 Poids des plantes (21 dpi) 0,41 Poids des racines (21 dpi) 0,35

Tableau IV.2: Corrélations entre les paramètres phénotypiques.

CJ15 CJ21 LT21 LT15 M15 M21 PP21 PR21 PT21 ST15 ST21 ST/LT15 ST/LT21 PR/PP21 VST VT CJ15 1,000 CJ21 0,597 1,000 LT21 -0,118 -0,180 1,000 LT15 -0,121 -0,200 0,988 1,000 M15 0,487 0,671 -0,325 -0,339 1,000 M21 0,528 0,823 -0,341 -0,363 0,852 1,000 PP21 -0,506 -0,740 0,406 0,424 -0,700 -0,780 1,000 PR21 -0,368 -0,472 0,255 0,251 -0,422 -0,433 0,741 1,000 PT21 -0,493 -0,745 0,408 0,434 -0,714 -0,809 0,969 0,554 1,000 ST15 0,354 0,475 0,549 0,547 0,274 0,406 -0,264 -0,146 -0,274 1,000 ST21 0,291 0,389 0,702 0,688 0,118 0,231 -0,147 -0,085 -0,151 0,930 1,000

ST/LT15 0,526 0,775 -0,255 -0,270 0,708 0,846 -0,725 -0,400 -0,752 0,625 0,433 1,000 ST/LT21 0,544 0,781 -0,161 -0,168 0,614 0,758 -0,698 -0,404 -0,718 0,635 0,559 0,928 1,000 PR/PP21 0,012 0,125 -0,043 -0,059 0,138 0,230 -0,052 0,539 -0,262 0,095 0,079 0,212 0,208 1,000

VST -0,154 -0,218 0,359 0,325 -0,386 -0,451 0,288 0,147 0,303 -0,222 0,150 -0,504 -0,200 -0,049 1,000 VT 0,115 0,246 -0,105 -0,231 0,306 0,287 -0,231 -0,094 -0,253 0,003 0,004 0,252 0,156 0,057 0,074 1,000

Abréviations: CJ15 (21) : pourcentage de cotylédons jaunes à 15 dpi (21 dpi)

LT15 (21) : longueur de la tige à 15 dpi (21 dpi) M15 (21) : pourcentage de plantes mortes à 15 dpi (21 dpi). PP21 : poids de la plante à 21 dpi. PR21 : poids de la racine à 21 dpi. PT21 : poids de la tige à 21 dpi. ST15 : longueur de symptôme sur tige à 15 dpi (21 dpi). VST : vitesse de progression des symptômes sur tige. VT : vitesse d’élongation de la tige.

133

1.2.2.3. Distribution des valeurs des RILs

La distribution des valeurs des RILs a été étudiée pour chacun des paramètres

calculés. La figure IV.2 réalisée à partir des valeurs obtenues pour le paramètre « %

symptôme sur tige 21 dpi » dont l’héritabilité est la plus forte est tout à fait

représentative, dans sa forme, des autres courbes obtenues (non montré). Elle se

caractérise notamment par un déséquilibre en faveur des plantes sensibles avec la

présence de RILs transgressives de part et d’autre des valeurs des 2 parents,

confirmant ainsi le caractère quantitatif de la résistance.

2. ETUDE DE LA CORRELATION ENTRE RESISTANCE ET PRODUCTION DES COMPOSEES

AROMATIQUES FLUORESCENTS

L’objectif de cette partie était d’évaluer si l’on pouvait établir un lien direct entre le

niveau de résistance mesuré des RILs (symptômes visuels) et la quantité de fluorescence

observée en microscopie au sein de leurs racines après inoculation. Pour ce faire, nous avons

classé les RILs par ordre de sensibilité croissante sur la base des résultats obtenus pour les

symptômes sur tige et sur cotylédons et le pourcentage de plantes mortes à 21 dpi. Huit

lignées résistantes et 9 lignées sensibles ont été choisies en plus des deux parents. Des coupes

fraîches de racines de ces lignées ont été observées sous microscope à épifluorescence à 1 et 6

jours après inoculation par A. euteiches pour la détection des composés aromatiques

fluorescents. Toutes les photos ont ensuite été prises avec les mêmes paramètres d’acquisition

pour les différentes lignées et pour les deux temps d’analyses. Les images ont été traitées par

le logiciel de traitement d’image ImageProPlus. Les paramètres mesurés ont porté sur la

surface et l’intensité de fluorescence par coupe de racine, ainsi qu’il est expliqué plus en

détail dans la partie « matériel et méthodes ».

L’étude statistique des corrélations entre les données de fluorescence et les données

phénotypiques réalisées par Fabien Chardon n’a pas permis de montrer de fortes corrélations.

L’ensemble des résultats est présenté en annexe IV.1. Le tableau IV.3 présente un résumé

des coefficients de corrélation entre les principales valeurs (intensité moyenne de fluorescence

et pourcentage de fluorescence observée sur une coupe) et les valeurs obtenues pour les

paramètres de symptômes les plus représentatifs. Les plus fortes valeurs de R² sont comprises

entre 0,3 et 0,4. Même si les R² sont relativement faibles on peut néanmoins noter une

certaine tendance puisque les valeurs de fluorescence avant inoculation sont corrélées

134

négativement aux symptômes observés. Ceci pourrait donc signifier que le niveau basal de

composés fluorescents est important pour évaluer la réponse de la plante après inoculation.

Une analyse en composante principale (ACP) a été conduite avec l’ensemble des

paramètres phénotypiques et ceux mesurés pour la fluorescence. Les résultats présentés dans

la figure IV.3 montrent à nouveau un regroupement des différents symptômes mesurés, en

opposition avec le poids des plantes à la fin du test, mais indiquent qu’il n’y a pas de

regroupement direct entre les mesures de fluorescence et les symptômes observés. Le seul

regroupement significatif est obtenu entre le rapport du poids des racines sur le poids de la

plante et l’intensité de la fluorescence après inoculation, indiquant que plus le niveau de

fluorescence est élevé après inoculation plus le développement racinaire est important.

Tableau IV.3: Cœfficients de corrélation entre différentes valeurs de fluorescence et les principaux symptômes pour les RILs LR5 à 6 jours après inoculation par A. euteiches. Racines ST15 CJ21 M21 PP21 Inoculées IMF 0,178 0,145 0,148 -0,181

%F 0,240 0,292 0,300 -0,294 Témoins IF -0,314 -0,352 -0,276 -0,065

%F -0,295 -0,313 -0,236 -0,088 IMF : intensité moyenne de fluorescence dans la coupe racinaire %F : pourcentage de fluorescence sur la coupe de racine = Surface de la partie fluorescente/ surface de la coupe racinaire.

3. IDENTIFICATION ET LOCALISATION D’UN QTL MAJEUR DE RESISTANCE

Après avoir phénotypé la population LR5 et en utilisant les données de génotypage

disponibles, la détection de QTL de résistance a été entreprise avec le logiciel PLABQTL,

selon la méthode de composite interval mapping (CIM) qui permet notamment de calculer la

probabilité de présence d’un QTL à un locus donné du génome en claculant le LOD score.

L’analyse a montré que la résistance à A. euteiches est sous le contrôle d’un QTL majeur en

haut du chromosome 3 formé par la co-localisation des QTLs de l’ensemble des paramètres

mesurés (tableau IV.4). L’intervalle de confiance le plus large est compris entre 0 et 8 cM.

Le LOD score maximal de 10,84 a été atteint avec les mesures des pourcentages de

symptômes sur tige. Ce QTL explique 30,4% de la variation phénotypique. Il faut noter que le

pourcentage de symptôme relatif sur tige (taille des tissus avec symptôme / taille totale de la

tige) est environ deux fois plus informatif que les symptômes sur tige en eux même, avec des

LOD scores et des R² de (10,84 et 30,4%) contre (5,83 et 17,7%) respectivement. Deux autres

QTLs mineurs ont aussi été détectés. Il sont localisés respectivement en en haut du

chromosome 5, centré sur 6 cM et sur le chromosome 8 à 56 cM Tous les deux ont un LOD

135

score de 2,46 et expliquent 7,8% de la variation phénotypique (tableau IV.4). La suite de

notre travail sera focalisée sur le QTL majeur détecté en haut du chromosome 3. Depuis ces

résultats initiaux, d’autres calculs ont été réalisés avec les principaux paramètres (%

symptômes tige 15 dpi, cotylédons jaunes 21 dpi, % de plantes mortes 21 dpi et poids des

plantes 21 dpi) en rajoutant quelques marqueurs dans la région du QTL. Ces calculs ont

montré des LODs scores quasiment identiques mais ont permis de réduire l’intervalle de

confiance à 4 cM (entre 2 et 6 cM). Le R² du QTL avec les symptômes sur tige étant alors de

34%. Le QTL majeur a été appelé Ae1.

Tableau IV.4: Paramètres biométriques des QTLs de résistance identifiés à partir des symptômes mesurés.

Paramètres Chromosome Position

(cM) Marqueur

SSR gaucheIntervalle de

Confiance (cM) LOD R²

Effet additif

CJ15 chrom3 4 mtic136 0 8 2,87 9,1 0,241 CJ21 chrom3 2 mtic706 0 8 4,59 14,3 0,152 M15 chrom3 2 mtic706 0 6 6,12 18,6 0,147 M21 chrom3 2 mtic706 0 6 7,31 21,8 0,159 PP21 chrom3 6 mtic136 0 8 3,72 11,7 -0,004 PR21 chrom3 6 mtic136 2 8 2,26 7,3 -0,001 PT21 chrom3 0 mtic706 0 8 3,76 11,9 -0,003 ST15 chrom3 4 mtic136 0 6 5,83 17,7 1,501 ST21 chrom3 4 mtic136 0 8 3,21 10,2 1,118 %ST15 chrom3 4 mtic136 0 8 10,84 30,4 0,102 %ST21 chrom3 4 mtic136 2 8 10,16 28,8 0,078 ST chrom3 0 mtic706 0 8 2,93 9,4 -0,063

VT chrom5 6 E18M20 2 14 2,46 7,8 0,025 chrom8 56 mtic364 42 66 2,45 7,8 -0,028

4. VALIDATION ET CARTOGRAPHIE FINE D’AE1

La stratégie suivie est résumée dans la figure IV.4. La première étape a consisté à

chercher des lignées F7 (05 et 184), hétérozygotes avec des marqueurs microsatellites bordant

le QTL (mtic879, mtic818 et mtic847). Ces lignées ont été autofécondées pour avoir des

lignées F8. Parallèlement une recherche plus fine de nouveaux SSRs a été faite dans la zone

du QTL. Ces marqueurs seront utilisés pour le génotypage des lignées F8 produites dans le

but de sélectionner les lignées ayant des crossing-over dans le QTL et d’autres qui sont fixées

avec des allèles A17 ou F83005.5 dans celui-ci (lignées quasi-isogéniques: NILs). Les lignées

possédant des crossing-over ont été utilisées pour réduire la taille du QTL, une fois leur

phénotype identifié. Le phénotypage des NILs doit servir à valider (ou non) le rôle d’Ae1 dans

la résistance à A. euteiches.

136

Analyse de la carte physique. Recherche de nouveaux marqueurs microsatellites

dans le QTL

Génotypage des lignées F8

Autofécondation des lignées hétérozygotes F7 (5, 184)

Sélection des lignées quasi-isogéniques (NILs) F9 fixées A17 ou F83005.5 dans le QTL (5B, 5D, 5F, 184T5 et 184T15).

Sélection des lignées avec des crossing-over dans le

QTL

Phénotypage des lignées F9 produites

Validation (ou non) du QTL

Réduction de la taille du QTL

Analyse et annotation des BACs identifiés

Phénotypage de lignées (RILs) ayant des crossing-over dans le

QTL

Figure IV.4: Stratégie adoptée pour la cartographie fine du QTL de résistance à A. euteiches chez M. truncatula.

4.1. Validation d’Ae1 avec des lignées quasi-isogéniques

Afin de produire des lignées quasi-isogéniques (NILs), les lignées F7-05 et F7-184 encore

hétérozygotes dans Ae1 ont été autofécondées. Les descendances F8 de ces deux lignées ont

été génotypées à l’aide de 3 marqueurs répartis sur les 9 premiers cM du chromosome 3,

incluant le QTL. Les résultats obtenus sont indiqués dans la figure IV.5A. Ils révèlent la

présence de NILs fixés F83005.5 (05D, 184T5) ou fixés A17 (05B, 184T15) sur le haut du

chromosome 3. D’autres lignées sont restées hétérozygotes (05C, 05E et 05F).

Les NILs F9 fixées A17 (05B, 184T15) ou F83005.5 (05D, 184T5) dans Ae1 ont été

inoculées par A. euteiches. Les symptômes (% symptôme sur tige, % cotylédons jaunes et %

de plantes mortes) ont été relevés à 21 dpi. Les lignées parentales utilisées comme contrôle

ont montré des réponses conformes après inoculation du parasite (figure IV.5B). L’analyse

des résultats a montré que tous les paramètres mesurés pour la lignée 05B sont inférieurs à

ceux de A17 (figure IV.5B et C). Bien que présentant des symptômes sur racines, les plantes

de la lignée 05B continuent de se développer sans symptôme foliaire. Par opposition, les

symptômes observés sur la lignée 05D sont équivalents à ceux observés chez la lignée

parentale F83005.5 (figure IV.5B et D). Pour la NIL 184T15, elle présente des symptômes

équivalents à ceux de A17 alors que la 184T5 présente des symptômes plus proches de la

137

lignée sensible F83005.5 avec un pourcentage de plantes mortes de 58%, à comparer à celui

de F83005.5 qui est de 67% (figure IV.5B). En conclusion on peut dire que les lignées 05B et

184T15, fixées A17, présentent une résistance équivalente ou supérieure à celle de A17. En

revanche, les lignées 05D et 184T5, fixées avec des allèles F83005.5 dans Ae1 sont sensibles

à A. euteiches. Ces résultats montrent clairement que Ae1 joue un rôle majeur dans la

résistance de M. truncatula à A. euteiches.

Marqueurs cM F7.05 F7.184 F8.05B F8.05C F8.05D F8.05E F8.05F F8.184T5 F8.184T15

mtic879 0 H H A H F H H F A

mtic818 8,7 H H A H F H H F A

mtic847 14,1 H H A H F H H F A

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

05B 05D 184T5 184T15 F83005.5 A17

Lignées

% Symptôme sur tige 21 dpi % Cotylédons Jaunes 21 dpi

% Plantes mortes 21 dpi

Figure IV.5: Validation de Ae1 comme QTL de résistance avec des lignées quasi-isogéniques (NILs). (A) Identification de NILs dans la descendance des lignées 05 et 184, hétérozygotes dans la zone d’Ae1. Les NILs identifiées sont: 05B et 184T15 fixées avec des allèles A17 dans la zone de QTL; 05D et 184T5 fixées avec des allèles F83005.5 dans la zone de QTL. 05C, 05E, 05F sont restés hétérozygote dans la zone du QTL (A: allèle 17, B: allèle F83005.5 et H: allèle hétérozygote). (B) Phénotypes des NILs sélectionnées 21 jours après inoculation par A. euteiches. (C) et (D) photos des symptômes des lignées 05B et 05D à 21 dpi, respectivement. Les barres correspondent à 2 cm.

A

B

C D

05B 05D

138

4.2 Réduction de la taille d’Ae1

4.2.1. Phénotypage des RILs LR5 recombinant dans Ae1

Le génotypage des RILs F7 a permis de sélectionner des lignées qui ont des crossing-over

dans la région du QTL et contiennent donc des zones fixées avec des allèles A17 et F83005.5

à l’intérieur d’ Ae1 (59, 60, 183 et 222). D’autres sont encore hétérozygotes (184 et 199) et

sont utilisées comme contrôle pour évaluer la récessivité du caractère déjà évaluer en F1. Les

résultats de phénotypage correspondant à la moyenne de 2 expériences sur les F8 sont

présentés dans la figure IV.6A. Ils confirment les résultats obtenus en F7, utilisés pour la

recherche de QTL, à savoir que les lignées 183 et 222 sont d’un niveau de résistance

équivalent à A17. Les lignées 59, 60, 184 et 199 sont d’une sensibilité équivalente à

F83005.5. L’étape suivante a consisté à rajouter des marqueurs supplémentaires pour localiser

plus précisément la position des crossing-over et réduire ainsi Ae1 en confrontant les données

de génotypage et de phénotypage.

4.2.2. Réduction de la taille d’Ae1 et correspondance avec la carte physique

Afin de définir de nouveaux marqueurs microsatellites, les données de séquençage de la

lignée A17 ont été utilisées. Une vingtaine de marqueurs ont été ainsi sélectionnés à partir des

séquences de BACs localisés dans la zone recouvrent Ae1 entre 2 et 8 cM sur le haut du

chromosome 3. Après vérification du polymorphisme entre A17 et F83005.5 une dizaine de

SSR (figure IV.6B) ont été cartographiés sur la carte LR5, révélant quelques erreurs dans

l’ordonnancement des BACs prédit sur le site du séquençage de M. truncatula

(www.Medicago.org/genome). Les marqueurs ont ensuite été utilisés pour phénotyper les

RILs sélectionnées (figure IV.6B). Les données de génotypage et phénotypage ont été ensuite

comparées pour restreindre la taille d’Ae1. Les lignées 59 et 60 qui ont un génotype fixé

F83005.5 et les lignées 184 et 199 qui sont hétérozygotes dans la zone de QTL de résistance

(figure IV.6B) montrent un phénotype sensible comparable à celui de la lignée parentale

sensible F83005.5. Les lignées 183, 222 qui ont un génotype fixé A17 dans la région du QTL

de résistance (figure IV.6B) montrent un phénotype résistant comparable à celui de la lignée

parentale A17. Finalement la taille maximale d’Ae1 est de 1,2 cM, entre les deux marqueurs

mtic1149 et mtic742. Ces deux marqueurs permettent d’identifié un contig de 2 BACs

chevauchant: AC135103 et CR940308.

139

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

59 60 183 184 199 222 A17 F83

Lignées

% Symptôme sur tige 21 dpi % Cotylédons Jaunes 21 dpi

% Plantes mortes 21 dpi

Chromosome 3

BACs SSR / LG3 cM 59 60 183 184 199 222 A17 F83

CT010464 mtic879 0 A B B H H H A B

CR931739 mtic136 2,4 A B B H H B A B

AC147959 mtic826 3,6 A B B H H A A B

CT030192 mtic1151 4,5 B B B H H A A B

AC144723 mtic846 4,8 B B B H H A A B

CT963080 mtic1155 4,8 B B B H H A A B

CT967313 mtic1158 4,8 B B B H H A A B

CR940308 mtic1149 5,1 B B B H H A A B

AC135103 mtic742 6,3 B B A H H B A B

CR956402 mtic811 7,8 A A B H H B A B

CR956631 mtic812 7,8 A A B H H B A B Phénotypes S S R S S R R S

Figure IV.6: (A) phénotype et (B) Génotype des lignées LR5 de M. truncatula présentant un crossing-over dans la région du QTL de résistance à A. euteiches. Abréviations : A (allèle A17), B (allèle F83005.5), H (allèle hétérozygote), S (phénotype sensible) et R (résistance similaire à A17). Le rectangle indique la zone maximale dans la quelle se trouve le ou les gènes conférant la résistance à A. euteiches.

A

B

140

4.3. Recherche de nouveaux recombinants

Pour réduire encore la taille de Ae1, de nouvelles lignées recombinantes dans Ae1 ont été

recherchées. Pour pouvoir trouver ces lignées nous avons autofécondé la lignée F8-05F qui

est encore hétérozygote dans zone du QTL. Six cent vingt quatre plantes ont été générées et

génotypées à l’aide de deux marqueurs mtic1149 et mtic742 bordant le QTL (figure IV.7A).

Seulement 3 plantes ont montré une recombinaison entre ces deux marqueurs : 352, 567 et

600 (figure IV.7B). Les deux plantes 567 et 600 sont particulièrement intéressantes puis

qu’elles présentent dans le QTL une partie fixée A17 et une deuxième partie hétérozygote.

Les deux parties A et H étant inversée dans chacune des plantes.

Les plantes 567 et 600 ont été autofécondées pour avoir des graines à phénotyper. Faute

de temps, seule la descendance de la plante 600 a été inoculée avec A. euteiches. Les résultats

montrent que cette plante, fixée A du côté de mtic1149 a un phénotype résistant comparable à

celui de la lignée A17 (figure IV.8).

5. RECHERCHE DE NOUVEAUX MARQUEURS ET REDUCTION D’AE1

Afin de localiser plus précisément les crossing-over dans les plantes sélectionnées de

nouveaux marqueurs dont le numéro est supérieur à 1000, ont été rajoutés au cours de ce

travail, en collaboration avec Carine Ameline- Torregrosa dans l’équipe de T. Huguet (figure

IV.9). À partir des deux BACs d’intérêt de nouveaux SSRs ont été recherchés à l’aide du

logiciel SSRIT (Simple Sequence Repeat Identification Tool).

Les nouveaux marqueurs ont été utilisés pour localiser le crossing-over trouvé chez la

plante 600 et ont permis de génotyper aussi les lignées recombinantes dans Ae1. La figure

IV.10 montre le génotype de la plante 600 dans la région du QTL. On remarque la présence

d’un crossing-over entre les deux marqueurs mtic742 et mtic1209 pour la 600. L’association

des données de génotypage et de phénotypage de la plante 600, avec celles de la RIL 183, ont

permis de montrer que les marqueurs mtic1179 et mtic742 étaient les deux bornes de la région

impliquée dans la résistance, réduisant ainsi l’intervalle à environ 95 kb (figure IV.9). Le

génotype de la lignée 567 s’avère décevant, montrant l’existence d’une double recombinaison

qui n’apporte pas d’information réelle pour réduire la zone.

141

HH BB HHHH BHHHBB HAHHHBBBA17

F83

A

1 B B 60 H H 116 B B 173 H H 227 H H 284 A A 340 H H 395 B B 450 H H 505 A A 560 H H 616 H H2 B B 61 H H 117 B B 174 A A 228 H H 285 H H 341 H H 396 A A 451 A A 506 H H 561 H H 617 A A3 H H 62 B B 118 B B 175 A A 229 B B 286 B B 342 A A 397 A A 452 B B 507 H H 562 H H 618 B B4 H H 63 H H 119 B B 176 A A 231 H H 287 A A 343 H H 398 H H 453 B B 508 A A 563 A A 619 B B5 H H 64 A A 120 H H 177 H H 232 A A 288 B B 344 A A 399 A A 454 H H 509 H H 564 B B 620 B B6 H H 65 B B 121 H H 178 H H 233 H H 289 H H 345 H H 400 H H 455 H H 510 H H 565 H H 621 H H7 B B 66 B B 122 B B 179 B B 234 H H 290 B B 346 A A 401 H H 456 H H 511 H H 566 H H 622 H H8 H H 67 H H 123 H H 180 H H 235 H H 291 A A 347 B B 402 H H 457 B B 512 A A 567 A H 623 A A9 H H 68 H H 124 A A 181 H H 236 H H 292 H H 348 H H 403 A A 458 B B 513 H H 568 B B 624 A A

10 H H 69 H H 125 B B 182 H H 237 A A 293 A A 349 B B 404 H H 459 H H 514 H H 569 B B11 B B 70 H H 126 A A 182 H H 238 H H 294 H H 350 B B 405 B B 460 B B 515 A A 570 H H12 B B 71 B B 127 H H 183 B B 239 A A 295 A A 351 H H 406 H H 461 H H 516 B B 571 H H13 H H 72 H H 128 B B 184 H H 240 B B 296 H H 352 B H 407 H H 462 B B 517 B B 572 H H14 A A 74 H H 129 H H 185 H H 241 B B 297 H H 353 A A 408 B B 463 H H 518 H H 573 A A15 H H 75 H H 130 H H 186 A A 242 A A 298 H H 354 B B 409 B B 464 H H 519 H H 574 H H17 H H 76 H H 131 B B 187 A A 243 A A 299 B B 355 B B 410 B B 465 B B 520 A A 575 B B18 H H 77 H H 132 A A 188 B B 244 H H 300 B B 356 B B 411 B B 466 H H 521 B B 576 A A20 B B 78 H H 133 B B 189 A A 245 H H 301 H H 357 B B 412 H H 467 H H 522 H H 577 B B21 B B 79 A A 134 H H 190 H H 246 B B 302 H H 358 A A 413 H H 468 B B 523 H H 578 A A24 A A 80 A A 135 H H 191 A A 247 H H 304 A A 359 H H 414 H H 469 B B 524 H H 579 H H25 A A 81 H H 136 H H 192 H H 248 H H 305 B B 360 B B 415 B B 470 A A 525 B B 580 H H26 B B 82 A A 137 B B 193 A A 249 H H 306 B B 361 A A 416 H H 471 H H 526 H H 581 A A27 B B 83 A A 138 H H 194 H H 250 H H 307 B B 362 H H 417 B B 472 H H 527 H H 582 A A28 H H 84 B B 139 B B 195 H H 251 A A 308 H H 363 H H 418 A A 473 B B 528 B B 583 A A29 A A 85 A A 140 H H 196 H H 252 H H 309 B B 364 H H 419 H H 474 H H 529 A A 584 H H30 H H 86 H H 141 B B 197 H H 253 B B 310 H H 365 H H 420 A A 475 H H 530 B B 585 B B31 A A 87 H H 142 H H 198 H H 254 B B 311 A A 366 A A 421 B B 476 H H 531 A A 586 B B32 B B 88 H H 143 H H 199 H H 256 H H 312 H H 367 B B 422 B B 477 H H 532 H H 587 B B33 B B 89 A A 144 A A 200 H H 257 A A 313 H H 368 H H 423 B B 478 B B 533 B B 588 A A34 H H 90 A A 145 A A 201 A A 258 H H 314 H H 369 H H 424 A A 479 H H 534 A A 589 H H35 H H 91 A A 146 H H 202 H H 259 A A 315 H H 370 H H 425 H H 480 A A 535 H H 590 H H36 H H 92 H H 147 A A 203 B B 260 B B 316 H H 371 A A 426 H H 481 B B 536 H H 591 A A37 H H 93 H H 148 A A 204 A A 261 H H 317 A A 372 H H 427 H H 482 A A 537 H H 592 H H38 B B 94 B B 149 H H 205 A A 262 H H 318 B B 373 B B 428 A A 483 H H 538 B B 593 H H39 H H 95 H H 150 B B 206 H H 263 A A 319 B B 374 A A 429 H H 484 H H 539 B B 594 A A40 H H 96 A A 151 B B 207 H H 264 A A 320 A A 375 A A 430 H H 485 H H 540 H H 595 A A41 A A 97 H H 152 A A 208 A A 265 H H 321 B B 376 A A 431 A A 486 H H 541 B B 596 A A42 B B 98 H H 154 B B 209 H H 266 H H 322 H H 377 H H 432 A A 487 A A 542 B B 597 B B43 A A 99 A A 155 B B 210 H H 267 H H 323 H H 378 B B 433 H H 488 H H 543 H H 598 H H44 B B 100 H H 156 B B 211 H H 268 A A 324 H H 379 H H 434 H H 489 H H 544 H H 599 B B45 B B 101 A A 157 B B 212 B B 269 H H 325 H H 380 A A 435 H H 490 H H 545 H H 600 H A46 H H 102 H H 158 B B 213 B B 270 A A 326 B B 381 H H 436 A A 491 H H 546 H H 601 H H47 A A 103 H H 159 H H 214 A A 271 B B 327 A A 382 B B 437 A A 492 A A 547 H H 602 H H48 A A 104 H H 160 H H 215 A A 272 H H 328 B B 383 H H 438 H H 493 A A 548 B B 603 H H49 H H 105 H H 161 B B 216 H H 273 H H 329 A A 384 H H 439 H H 494 H H 549 B B 604 B B50 A A 106 A A 162 B B 217 B B 274 B B 330 A A 385 B B 440 A A 495 H H 550 H H 605 B B51 H H 107 B B 163 B B 218 A A 275 A A 331 H H 386 B B 441 A A 496 H H 551 H H 607 H H52 H H 108 A A 164 H H 219 H H 276 H H 332 B B 387 H H 442 A A 497 B B 552 B B 608 H H53 H H 109 H H 165 A A 220 B B 277 B B 333 H H 388 A A 443 B B 498 H H 553 H H 609 H H54 H H 110 H H 166 H H 221 B B 278 H H 334 A A 389 H H 444 H H 499 B B 554 B B 610 H H55 H H 111 B B 167 A A 222 A A 279 H H 335 B B 390 A A 445 H H 500 A A 555 H H 611 B B56 H H 112 B B 168 A A 223 A A 280 H H 336 B B 391 B B 446 H H 501 A A 556 B B 612 A A57 H H 113 H H 170 H H 224 H H 281 A A 337 H H 392 H H 447 H H 502 A A 557 B B 613 H H58 B B 114 H H 171 B B 225 H H 282 H H 338 A A 393 H H 448 H H 503 H H 558 H H 614 A A59 B B 115 H H 172 H H 226 A A 283 H H 339 H H 394 A A 449 H H 504 A A 559 H H 615 B B

N° de la plante

Mtic742 Mtic1149

Figure IV.7: Recherche de nouveaux recombinants entre les marqueurs mtic742 et mtic1149. (A) Gel d’agarose montrant le profil de quelques plantes descendantes de la lignée 05F et les deux parents A17 et F83005.5 avec le marqueur mtic1149. (B) génotype de la descendance de la lignée 05F. Trois plantes (352, 567 et 600) présentent un crossing-over entre les deux marqueurs mtic1149 et mtic742 bordant le QTL de résistance à A. euteiches.

B

142

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

600 A17 F83

Lignées

% Symptôme sur tige 21 dpi % Cotylédons Jaunes 21 dpi

% Plantes mortes 21 dpi

Figure IV.8: Phénotype de la lignée 600 (issue de l’autofécondation de la lignée 05F) et des deux lignées parentales A17 et F83005.5 de M. truncatula 21 jours après inoculation par A. euteiches.

A

600 A17 F83005.5

143

Figure IV.9: Cartographie fine du QTL de résistance à A. euteiches chez M. truncatula. La carte physique (en haut) est celle récupérée sur le site de medicago.org. La position des marqueurs ajoutés est indiquée sur les 2 BACs (CR940308 et AC135103) recouvrant cette zone. Les pointillés indiquent la réorientation nécessaire des BACs, selon les résultats de la carte génétique LR5. L’ensemble des marqueurs dont le numéro est supérieur à 1000 a été rajouté au cours de ce travail en collaboration avec Carine Ameline- Torregrosa dans l’équipe de T. Huguet.

C R 9 4 0 3 0 8 (1 2 1 4 9 4 n t )

A C 1 3 5 1 0 3 (9 9 3 9 9 n t )

1 0 K b

mti

c879

m

tic7

06

mti

c811

mti

c657

mti

c811

mti

c742

mti

c114

9

mti

c115

1

mti

c115

5

mti

c115

8

mti

c846

mti

c114

9

mti

c117

9

mti

c117

8

mti

c120

8

mti

c117

7

mti

c120

9

mti

c742

mti

c4a0

5(0)

mti

c119

8

mti

c119

9

mti

c120

0

mti

c120

1

1 0 K b

A e 1

144

Figure IV.10: Génotype de la lignée 05F-600F9 issue de l’autofécondation de la lignée 05F qui présente un crossing-over dans la région du QTL de résistance entre les marqueurs mtic742 et mtic1209. Sachant que cette lignée présente un phénotype résistant comparable à celui de la lignée parentale A17, ceci montre donc que le QTL de résistance se réduit à la zone (≈95kb) entre les deux marqueurs mtic1179 et mtic742 (zone encadrée). 6. IDENTIFICATION DES GENES CANDIDATS ET ANALYSE DE LEUR EXPRESSION

Les données précédentes arrivant vers la fin de ce travail de thèse, en raison de l’obtention

tardive de graines F8, d’autres tests visant à rechercher un éventuel polymorphisme

d’expression de plusieurs gènes d’Ae1 ont été entrepris. Après annotation de la séquence des

gènes et recherche de leur fonction, plusieurs amorces spécifiques ont été définies pour des

expériences de q-PCR afin d’étudier leur expression chez les deux lignées parentales (A17 et

F83005.5) à différents temps après inoculation par A. euteiches.

6.1. Analyse bioinformatique des BACs candidats

La région du QTL est contenue dans 2 BACs chevauchants: AC135103 et CR940308

(figure IV.9). Une annotation de cette région a été réalisée en utilisant les prédictions de

IMGAG V2.0 (International Medicago Genome Annotation Group), qui associe la

comparaison d’ESTs identifiées dans la base de données du TIGR (The Institute for Genomic

Research) et la recherche de domaines protéiques (pfam). Les résultats (tableau IV.5)

montrent la présence dans la zone du QTL de 26 gènes.

Chromosome 3

BACs SSR / LG3 cM 59 60 183 222 567 600 A17 F83

CT010464 mtic879 0 A B B H A A A B

CT030192 mtic1155 4,8 B B B A A A A B

CR940308 mtic1149 5,1 B B B A H A A B

CR940308 mtic1179 5,1 B B B A A A A B

CR940308 mtic1178 5,5 B B A A A A A B

CR940308 mtic1208 - B B A A A A A B

CR940308 mtic1209 - B B A A A A A B

AC135103 mtic742 6,3 B B A B A H A B

AC135103 4a05(0) - B B A B A H A B

AC135103 mtic1200 - B B A B A H A B

CR956402 mtic811 7,8 A A B B A H A B

CR956631 mtic812 7,8 A A B B A H A B

Phénotypes S R R R ? R R S

145

Tableau IV.5: Contenu en gènes de la région de Ae1 selon l’annotation IMGAG V2.0.

Neuf d’entre eux sont de fonction inconnue. Parmi les autres, le trait le plus marquant est

l’existence d’un cluster de neuf gènes codant des protéines ayant un motif F-box. Parmi ces

gènes associés au protéasome se trouve aussi une enzyme associée à l’ubiquitine. Un autre

gène identifié par IMGAG comme une dihydroflavonol-4-reductase a été renommé en CAD

(Alcool cinnamylique déshydrogènase), compte tenu des homologies de séquence bien plus

fortes. Un autre gène code une protéine ayant des homologies avec les HRGPs. On trouve

également trois transporteurs dont l’un appartient à la famille des MFS (Major Facilitator

Référence des gènes Type Description des gènes Taille Orientation AbbréviationAC135103_40 transcript hypothetical protein 5852 forwardAC135103_41 transcript hypothetical protein 6445 reverseAC135103_42 transcript Disease resistance protein 2538 reverseAC135103_43 transcript Disease resistance protein RPM1 , related 3745 reverseAC135103_44 transcript Disease resistance protein 3235 reverseAC135103_45 transcript Ovarian tumour, otubain, identical 168 forward

marqueur mtic1199 AC135103_46 transcript Nucleic acid-binding, OB-fold 1048 forwardAC135103_47 transcript Zinc finger, TTF-type 562 reverseAC135103_26 transcript hypothetical protein 405 reverse

marqueur mtic1198AC135103_16 transcript hypothetical protein 355 forwardAC135103_17 transcript Cyclin-like F-box 1494 forwardAC135103_19 transcript hypothetical protein 372 reverse

marqueur 4a05(2)marqueur mtic742 marqueur 4a05(5)

AC135103_21 transcript Ubiquitin-associated * 5965 forward UBQmarqueur 4a05(0)

AC135103_32 transcript At14a , related 264 reverseAC135103_35 transcript homology to cinnamyl alcohol dehydrogenase 2188 reverse CADAC135103_31 transcript F-box protein interaction domain 1112 reverse F-boxBAC135103_23 transcript Protein of unknown function DUF889, eukaryote * 1787 reverse P1787AC135103_24 transcript Cyclin-like F-box; F-box protein interaction domain * 2200 forward FboxC

marqueur mtic1176CR940308_36 transcript hypothetical protein 1944 reverseCR940308_21 transcript hypothetical protein 386 reverseCR940308_37 transcript F-box protein interaction domain; Galactose oxidase, central 1775 forward

marqueur mtic1209CR940308_30 transcript hypothetical protein 264 reverseCR940308_38 transcript Cyclin-like F-box; F-box protein interaction domain * 318 forward F-boxE

Ae1 marqueur mtic1177CR940308_39 transcript Vegetative cell wall protein gp1 precursor , related 423 reverseCR940308_40 transcript hypothetical protein 1304 reverseCR940308_41 transcript Cyclin-like F-box 818 forwardCR940308_42 transcript Cyclin-like F-box 4444 forwardCR940308_43 transcript Cyclin-like F-box; Galactose oxidase, central 1754 forwardCR940308_44 transcript hypothetical protein 819 reverseCR940308_15 transcript Cyclin-like F-box 2387 reverse

marqueur mtic1208CR940308_45 transcript Cyclin-like F-box; F-box protein interaction domain; Galactose oxidase, central * 950 reverse F-boxICR940308_29 transcript hypothetical protein * 4215 forward P4215CR940308_46 transcript Transporter-like protein 1970 reverseCR940308_47 transcript ZINC INDUCED FACILITATOR-LIKE 1; (tetracycline:hydrogen antiporter/ transporter) 3210 reverse

marqueur mtic1178CR940308_16 transcript hypothetical protein 177 reverseCR940308_7 transcript Polynucleotidyl transferase, Ribonuclease H fold 225 forwardCR940308_48 transcript hypothetical protein 450 reverseCR940308_49 transcript Major facilitator superfamily MFS_1 * 4537 reverse MFS

marqueur mtic1179CR940308_22 transcript Protein of unknown function DUF1191 978 forwardCR940308_10 transcript Ethylene insensitive 3 * 3194 reverse EIN3

marqueur mtic1149

marqueur monomorphemarqueur polymorphe

* gènes étudiés en Q-PCRRégion du QTL

146

Superfamily). Enfin EIN3 (Ethylen Insensitive 3), un gène codant un facteur de transcription

régulant l’éthylène chez A. thaliana. Dans ce travail nous avons sélectionné quelques gènes,

indiqués par des étoiles dans le tableau IV.5. Dans cette étude d’expression le gène F-boxB,

préalablement identifié par la version 1 de IMGAG mais éliminé par la version V2.0, a été

gardé par ce qu’il est dans Ae1 avant mtic1149. L’étude de l’expression de ces gènes fait

l’objet du paragraphe suivant.

6.2. Etude de l’expression des gènes candidats dans le QTL de résistance

Une PCR sur l’ADN génomique des deux lignées parentales (A17 et F83005.5) a été faite

pour chaque couple d’amorce. L’amplification pour les différents gènes a généré une seule

bande, montrant ainsi la spécificité des amorces. Les différents couples d’amorces ont été

aussi testés sur l’ADN de A. euteiches. Aucune bande n’a été générée pour l’ensemble des

gènes testés. La comparaison des tailles des amplifiats pour les différents gènes n’a pas

montré de différence entre les allèles de A17 et ceux de F83005.5.

6.2.1. Gènes codant des protéines à motifs F-box

Quatre gènes codant des protéines F-box ont été étudiés par q-PCR (F-boxB

(AC135103_31), F-boxC (AC135103_24), F-boxE (CR940308_38) et F-boxI

(CR940308_45) (tableau IV.5). Trois gènes ont montré une amplification sur ADNc: F-boxB

et F-boxC et F-boxI. Le gène codant la F-boxB (AC135103_31) est induit significativement

(ratio > 2) aux trois temps d’analyse chez A17 (figure IV.11A). Chez F83005.5 ce gène n’a

pas montré de changement d’expression chez les plantes inoculées par rapport aux trois temps

d’analyses (figure IV.11A). Le gène F-boxC (AC135103_24) est fortement induit à 1 dpi

(ratio > 3) chez A17 seulement (figure IV.11B). Enfin le gène F-boxI (CR940308_45) est

induit chez A17 et réprimé à 6 dpi chez F83005.5 (figure IV.11C).

6.2.2. Gène associé à l’ubiquitine (AC135103_21)

Ce gène a montré une très forte induction (ratio > 7) précoce (1 dpi) chez A17. Il est

réprimé significativement (ratio < 0,5) chez F83005.5 à 1 dpi (figure IV.11D).

6.2.3. Gène CAD (AC135103_35)

Il est induit chez la lignée A17 à 3 et 6 dpi. Aucun changement significatif d’expression

par rapport au témoin n’est observé chez F83005.5 pour les trois temps d’analyses (figure

IV.11E).

147

6.2.4. Gène de la famille des MFS (Major Facilitator Superfamilly)

L’expression de ce gène (CR940308_49) est fortement contrastée entre les deux lignées

A17 et F83005.5. Ce gène est en effet fortement induit chez A17 à 1 et 3 dpi alors qu’il est

réprimé chez F83005.5 de 1 à 6 dpi (figure IV.11F).

6.2.5. Gène EIN3 (Ethylene Insensitive 3) (CR940308_10)

Le gène EIN3 est fortement induit chez les plantes inoculées de la lignée A17 à 3 et 6 dpi

(figure IV.11G). Chez la lignée sensible ce gène est réprimé significativement à 1 dpi et à 3

dpi, par la suite il est induit à 6 dpi (figure IV.11G).

6.2.6. Gènes codant des protéines à fonctions inconnues

L’expression de deux gènes P1787 (AC135103_23) et P4215 (CR940308_29) codant des

protéines de fonction inconnue est également différentiellement modifiée après inoculation

chez les deux lignées A17 et F83005.5. Le gène P1787 est induit seulement chez A17 à 1 dpi

(figure IV.11H). A 3 et 6 dpi l’expression de ce gène est comparable entre les deux lignées.

Le gène P4215 est induit chez la lignée sensible à 1 et 3 dpi (figure IV.11I). Chez A17 ce

gène est induit plus tardivement à 3 et 6 dpi.

148

Fbox BAC135103-31

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 pi

Niv

eau

d'i

ndu

ctio

n

A17F83005.5

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

FboxCAC135103-24

Niv

eau

d'in

du

ctio

n

A17

F83005.5

F-boxI CR940308_45

0

1

2

3

4

1 dpi 3 dpi 6 dpi

Niv

eau

d'in

du

ctio

n

A17

F83005.5

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

UBQAC135103-21

Niv

eau

d'i

nd

uct

ion

A17

F83005.5

Figure IV.11: Etude de l’expression de quelques gènes sélectionnés [3 protéines à motif Fbox (A) F-boxB, (B) F-boxC et (C) F-boxI, d’un gène codant une protéine associée à l’ubiquitine et (D) d’une CAD] situés dans le QTL de résistance à A. euteiches chez deux lignées de M. truncatula, A17 et F83005.5. Les résultats des plantes inoculées ont été exprimés pour chaque lignée et à chaque temps par rapport à leurs témoins (plantes inoculées par l’eau) relatifs.

A

B

C

D

Temps d’observation

149

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

CADAC135103-35

Niv

eau

d'i

nd

uct

ion

A17F83005.5

0,01

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

MFSCR940308-49

Niv

eau d

'ind

uct

ion

A17

F83005.5

0,1

1

10

100

1 dpi 3 dpi 6 dpi

EIN3CR940308-10

Niv

eau

d'in

du

ctio

n

A17

F83005.5

Figure IV.11 (suite1): Etude de l’expression de quelques gènes sélectionnés [(E) gène CAD, (F) gène appartenant à la famille des MFS (Major Facilitator Superfamilly), (G) gène EIN3 (Ethylene Insensitive 3)] situés dans le QTL de résistance à A. euteiches chez deux lignées de M. truncatula, A17 et F83005.5. Les résultats des plantes inoculées ont été exprimés pour chaque lignée et à chaque temps par rapport à leurs témoins (plantes inoculées par l’eau) relatifs.

E

F

G

Temps d’observation

150

0,1

1

10

1 dpi 3 dpi 6 pi

P1787AC135103-23

Niv

eau

d'in

du

ctio

n

A17

F83005.5

1

10

1 dpi 3 dpi 6 dpi

P4215CR940308-29

Niv

eau

d'in

du

ctio

n

A17

F83005.5

Figure IV.11 (suite2): Etude de l’expression de deux gènes codant pour des protéines à fonctions inconnues (H) P1787 et (I) P4215 situés dans le QTL de résistance à A. euteiches chez deux lignées de M. truncatula, A17 et F83005.5. Les résultats des plantes inoculées ont été exprimés pour chaque lignée et à chaque temps par rapport à leurs témoins (plantes inoculées par l’eau) relatifs. 7. CONCLUSION

Dans cette partie, l’objectif était d’identifier les composantes génétiques de la résistance

quantitative observée dans le chapitre précédent chez A17. A partir du phénotypage d’une

population de 139 RILs, l’analyse génétique réalisée sur plusieurs paramètres mesurant le

niveau de résistance des lignées a révélé l’existence d’un QTL majeur que l’on retrouve en

commun pour l’ensemble des paramètres mesurés sur tige, cotylédons, pourcentage de plantes

mortes ou poids de la plante. Ce QTL a été localisé en haut du chromosome 3, dans un

intervalle de 4 cM. Il explique plus d’un tiers de la résistance observée et a été nommé Ae1.

Deux autres QTLs mineurs ont été trouvés sur les chromosomes 5 et 8. Compte tenu du

paramètre observé (vitesse de croissance de la tige) il n’est pas évident que ces QTLs

identifient des gènes impliqués dans la résistance. Ils pourraient par exemple être associés à

des caractères de développement. Quoi qu’il en soit les travaux se sont par la suite concentrés

sur Ae1. Son rôle clé dans la résistance conférée à A17 a été formellement établi à partir de

I

H

Temps d’observation

151

l’utilisation de lignées quasi isogéniques ne différant que dans la région d’Ae1. Les NILs

fixées A17 dans la région du QTL sont résistantes, inversement les allèles F83005.5 dans Ae1

confèrent la sensibilité. L’étape suivante a consisté à réduire Ae1 à partir de lignées

recombinantes dans le QTL. Deux lignées résistantes à A. euteiches (183 et 222) se sont

révélées particulièrement utiles puisque les crossing-over qu’elles ont dans Ae1 ont permis de

réduire le QTL à 1,2 cM entre les marqueurs mtic742 et mtic1149. Ces deux marqueurs,

ancrés à la carte physique ont permis de montrer que l’intervalle ainsi défini s’étale sur 135

kb, compris dans deux BACs séquencés AC135103 et CR940308. L’apport d’informations

génomiques a permis d’enrichir Ae1 en marqueurs microsatellites. Couplés à la sélection de

lignées recombinantes une dernière réduction a permis d’amener la taille d’Ae1 à 95 kb. Les

annotations de ce fragment ont montré une sur-représentativité de gènes codant des fonctions

associées au protéasome (8 protéines à motif F-box et une enzyme agissant sur l’ubiquitine).

Les expériences de qRT-PCR montrent une expression différentielle entre les deux lignées de

plusieurs gènes testés, mais ne permettent pas de déduire de candidat(s) précis pour leur

action sur la résistance. Parmi les autres candidats se trouve également un gène codant une

CAD induite chez A17 seulement, simultanément à l’apparition de l’anneau de lignine.

Plusieurs gènes restent donc en lice pour leur responsabilité potentielle dans la résistance à

Ae1.

152

CONCLUSION GENERALE

En Tunisie, il existe une dichotomie entre la céréaliculture dans les zones humides et

subhumides et l'élevage ovin relégué en zones arides et steppiques. Ce dernier, ne pouvant

survivre sur les maigres ressources de ces régions, est obligé de transhumer annuellement vers

le Nord. L'intégration de la céréaliculture-élevage et la création de parcours améliorés à base

de légumineuses annuelles aux dépens des jachères improductives représentent une solution

prometteuse pour le développement de l’élevage ovin. La flore végétale tunisienne est

extrêmement riche en diverses espèces spontanées qui sont consommées par les animaux. La

grande variation des conditions du milieu fait que pour chaque espèce, il existe un grand

nombre d’écotypes dont la variabilité génétique constitue un matériel de choix pour la

sélection et la création de variétés adaptées aux conditions diverses. Compte tenu de la valeur

agronomique des légumineuses dans les régions méditérannéennes pour améliorer la

production pastorale, plusieurs études ont été faites sur le potentiel génétique disponible et

sur la conservation de la variabilité génétique présente en Tunisie (Seklani et al. 1992;

Zoghlami et al. 2001; Zoghlami et Hassen 1999). Les espèces du genre Medicago constituent

un patrimoine génétique extrêmement riche et diversifié en Tunisie (Badri et al. 2007). On

estime à 50% en moyenne selon les régions, la fréquence des espèces annuelles dans la

végétation spontanée (Seklani, 1991) et à 40% leur fréquence parmi les légumineuses

récoltées en Tunisie septentrionale (Hassen et al. 1994). Ces plantes dont la valeur alimentaire

est mal connue, produisent à l'état naturel et selon les régions environ 4 tonnes de MS/ha.

L'introduction en Tunisie de la culture des Medicago annuelles en assolement avec les

céréales a été retenue parmi les solutions envisagées pour l'amélioration pastorale (Seklani et

Hassen 1990). Cependant, l’introduction de lignées étrangères de Medicago est confrontée à

de nombreux problèmes d’adaptation aux différents stress abiotiques et biotiques. Parmi ces

derniers, les champignons phytopathogènes engendrent une diminution de la quantité et de la

qualité de la matière fraîche produite. Cependant, les maladies fongiques attaquant les espèces

annuelles du genre Medicago en Tunisie sont mal connues et aucun recensement n’était

disponible. Dans ce travail, plusieurs prospections ont permis de combler cette lacune en

identifiant différentes espèces fongiques attaquant les Medicago. Le recensement réalisé a

notamment montré que M. truncatula, M. polymorpha et M. ciliaris, espèces abondantes en

Tunisie, sont attaquées par plusieurs champignons biotrophes et nécrotrophes, à savoir :

Erysiphe polygoni, Uromyces striatus, Pseudopeziza medicaginis, Pseudopeziza trifolii,

153

Cercospora medicaginis, Phoma medicaginis, Alternaria sp., Fusarium sp. et Stemphylium

sp. Les maladies causées par E. polygoni, U. striatus, P. trifolii et P. medicaginis sont

également capables d’attaquer la luzerne pérenne M. stativa et d’autres légumineuses

cultivées (Stuteville et Erwin 1990 ; Wirth et Joseph 1994 ; Mabsoute et al. 1996). Ainsi les

Medicago constituent des réservoirs pour ces agents pathogènes notamment dans les régions

de culture tunisienne de la luzerne pérenne. Les champignons biotrophes des genres Erysiphe,

Uromuces et Pseudopeziza sont les plus destructeurs pour les Medicago annuels au Nord de la

Tunisie, surtout lors des années pluvieuses. Les attaques par P. medicaginis et C. medicaginis

sont également fréquentes sur les Medicago et provoquent surtout une dépréciation de la

qualité du fourrage plutôt qu’une diminution de sa quantité. Les attaques engendrées par

Alternaria sp., Fusarium sp. et Stemphylium sp. sont en revanche plutôt sporadiques sur les

Medicago. Par ailleurs, compte tenu du climat chaud et sec, les attaques fongiques sont plutôt

rares au Sud de la Tunisie. Ce recensement constitue le point de départ pour cibler les

maladies fongiques les plus graves, pour entamer des programmes de sélection de lignées

locales de Medicago qui soient à la fois à haut rendement fourrager et résistante à l’attaque de

ces maladies. Dans le chapitre II, les ressources génétiques de M. truncatula ont été mises à

profit pour rechercher des lignées à réponses différentielles vis-à-vis de l’attaque de P.

medicaginis, maladie redoutée sur la culture de la luzerne et d’autres légumineuse au Nord de

l’Afrique (Wirth et Joseph 1994; Mabsoute et al. 1996) ainsi que dans plusieurs autres parties

du monde tels que la France (Angevain 1983), l’USA (Gray et al. 1990) et l’Australie

(Barbetti 1995). Ce champignon, présente la particularité d’attaquer les parties aériennes et

racinaires. Il constitue donc un bon modèle pour comparer par exemple les mécanismes de

résistance dans ces deux types d’organes. Les souches tunisiennes de P. medicaginis ont

montré une variabilité importante dans leur agressivité que ce soit sur les parties foliaire ou

racinaire. La comparaison entre les niveaux d’infection sur feuilles et sur racines pour

l’ensemble des isolats n’a pas permis de trouver de corrélation significative montrant ainsi

que l’agressivité varie selon l’isolat et l’organe étudié. En conséquence, dans les essais de

sélection de variétés résistantes à cet agent pathogène il s’avère donc nécessaire d’évaluer et

de prendre en compte à la fois le niveau de résistance mesuré après inoculation sur feuilles et

sur racines pour pouvoir choisir les lignées qui présentent la meilleure combinaison de

résistance.

Dans le but de mieux comprendre les mécanismes de contrôle du développement de P.

medicaginis sur les plantes, quatre lignées (TN9.22, DZA45.5, F83005.5 et A20) de M.

truncatula ont été particulièrement étudiées en utilisant un système d’inoculation sur feuilles

154

détachées et sur plantes entières. Bien que toutes se soient révélées sensibles, une variabilité

de réponses entre ces lignées a été observée 15 dpi. DZA45.5 a été identifiée comme la lignée

la moins sensible alors que F83005.5 s’est révélée être la plus sensible. Malgré le nombre

restreint de lignées inoculées, les réponses contrastées observées chez M. truncatula, montrent

l’intérêt d’utiliser la variabilité naturelle de cette espèce dans l’étude des interactions

légumineuses – champignons phytopathogènes comme cela a déjà été mentionné dans

d’autres pathosystèmes (Torregrosa et al. 2004; Tivoli et al. 2006). Les deux lignées DZA45.5

et F83005.5 ont été retenues pour évaluer notamment le rôle des ROS dans l’interaction P.

medicaginis – M. truncatula en utilisant le test d’inoculation sur feuilles détachées qui s’est

montré fiable et reproductible. Ainsi le processus d’infection de ce champignon sur feuilles et

la détection histochimique du peroxyde d’hydrogène au cours des phases précoces de

l’interaction ont pu être analysés. Les différences entre DZA45.5 et F83005.5 apparaissent

durant les phases de colonisation et de sporulation du parasite. En effet on observe une

réduction des symptômes, ainsi qu’une diminution du nombre de pycnides et un retard de leur

apparition chez DZA45.5 par rapport à la lignée F83005.5. Une des hypothèses pouvant

expliquer les différences entre les deux lignées est liée aux ROS. Il a été notamment montré

que l’H2O2 s’accumule plus précocement (à 1 dpi) dans la lignée DZ45.5 que dans les tissus

foliaires de F83005.5. Par sa toxicité sur le champignon, l’accumulation de H2O2 joue

probablement un rôle déterminant dans la réduction de la colonisation et de la sporulation de

P. medicaginis, ainsi que cela a déjà été montré chez la tomate pour Cladosporium fulvum un

autre champignon nécrotrophe (Borden et Higgins, 2002). Par ailleurs, l’accumulation de

H2O2 peut aussi servir pour renforcer les barrières structurales de la plante, comme observé au

niveau des papilles des cellules d’orge et de blé infecté par Blumeria graminis f.sp. hordei

(Hückelhoven et al. 1999) et B. graminis f.sp. tritici (Li et al. 2005) respectivement. Les ROS

générés durant l’interaction plante-parasite sont éliminés grâce à un système antioxydant pour

maintenir un développement normal des cellules. Parmi ces enzymes la SOD et la POX sont

souvent utilisés par la plante pour éliminer les ROS (Garcίa-Limones et al. 2002). Dans le but

de déterminer le rôle éventuel de ces deux enzymes dans la défense contre P. medicaginis,

leurs activités ont été mesurées dans les feuilles des deux lignées de M. truncatula à 1, 4 et 9

dpi. Ni la POX, ni la SOD n’ont montré d’augmentation d’activité dans aucune des deux

lignées analysées après infection. Ce résultat n’est donc pas équivalent à ceux rencontrés dans

d’autres études dans lesquelles l’activité des enzymes antioxydantes varie après inoculation

dans les lignées résistantes (Gay et Tunzun 2000; Garίa-Limones et al. 2002). Une différence

significative a été en revanche enregistrée dans le niveau basal de l’activité POX qui est

155

supérieur dans les feuilles de DZA45.5 par rapport à F38005.5. Reuveni et ses collaborateurs

(Reuveni et al. 1991 ; Reuveni et al. 1992 ; Shimoni et al. 1991) ont montré qu’une activité

POX élevée avant infection peut jouer un rôle important dans la défense contre les agents

pathogènes. Les POXs catalysent en effet les réactions de polymérisation des protéines

pariétales comme les HRGP et d’autres polymères comme les lignines (Ralph et al. 2004). Le

renforcement des structures de la paroi permet donc de réduire la dégradation entraînée par les

enzymes du parasite, diminue la possibilité de diffusion des toxines et peut agir comme une

barrière physique pour empêcher ou bloquer la pénétration directe de l’agent pathogène dans

le protoplaste (Brisson et al. 1994). Comme perspective à ce travail, il serait intéressant de

confirmer la corrélation positive entre l’activité basale de la POX et la résistance à P.

medicaginis en analysant la descendance du croisement DZA45.5 x F83005.5 ou d’autres

lignées de M. truncatula. La mise en évidence d’interaction différentielle entre DZA45.5 et

F83005.5 permet également d’envisager une utilisation de la population RILs LR3 (DZA45.5

x F83005.5) pour chercher les QTLs de résistance à P. medicaginis. Les résultats obtenus

pourraient être donc comparés à ceux de l’équipe Australienne qui a identifié deux QTL de

résistance à P. medicaginis en utilisant d’autres accessions de M. truncatula dans les

croisements analysés (Kamphuis et al. 2008).

Dans la seconde partie de ce travail nous avons développé et caractérisé un pathosystème

entre M. truncatula et A. euteiches pour identifier des composantes de la résistance à cet

oomycète racinaire. Un test d’inoculation in vitro fiable et reproductible a été développé pour

quantifier les niveaux de résistance observés en suivant de façon continue et simultanée le

développement du parasite au cours de l’infection. Deux lignées, dans les quelles le parasite

effectue son cycle de développement complet, ont été sélectionnées en raison de leurs

réponses contrastées à l’infection par A. euteiches. La résistance partielle d’A17 se manifeste

par un nombre d’oospores réduit dans les racines infectées et de symptômes beaucoup moins

marqués sur la partie aérienne. Outre ces différences, des changements importants

apparaissent au niveau des racines d’A17: l’architecture racinaire est modifiée avec une

augmentation du nombre de racines secondaires chez les plantes inoculées par rapport aux

contrôles et à F83005.5 inoculées. Pour cette dernière, le nombre faible de racines secondaires

produites peut être expliqué par la prolifération rapide du parasite associée à une activité

lytique dans ces tissus racinaires colonisés. Ces résultats suggèrent donc que la production de

racines secondaires est probablement un moyen pour la plante d’échapper à la pression

parasitaire et de compenser les pertes en eau et minéraux lièes à la destruction des tissus

racianires infectés. La deuxième différence majeure entre les deux lignées est visible au

156

niveau du cylindre central d’A17 qui n’est pas envahi par A. euteiches. Les comparaisons des

cinétiques d’infection associées à l’analyse en parallèle de réactions de défense de la plante a

permis de proposer un modèle expliquant les différences de comportement entre les deux

lignées; le premier mécanisme défensif est lié à la production élevée de composés phénoliques

solubles chez A17 dès les premiers jours après inoculation. La corrélation négative observée

entre l’accumulation des composés phénoliques solubles et la détection des hyphes mycéliens

d’A. euteiches dans les racines d’A17 indique probablement l’activité antimicrobienne de ces

composés. Les légumineuses, et particulièrement M. truncatula sont bien connues pour la

production de composées phénoliques, provenant de la voie des isoflavonoïdes et des

phenylpropanoïdes (Dixon et al. 2002), lors des réactions de défense contre les parasites

(Torregrosa et al. 2004 ; Foster-Hartnett et al. 2007 ; Kamphuis et al. 2008), ou en réponse à

des éliciteurs microbiens (Naoumkina et al. 2007, Farag et al. 2008). Par comparaison aux

racines de F83005.5 dans lesquelles la fluorescence n’est que faiblement détectée, on peut

penser que le niveau élevé de production des composés phénoliques solubles dans les racines

infectées d’A17 retarde la colonisation par A. euteiches permettant ainsi à la plante de mettre

en place des barrières physiques efficaces pour protéger le cylindre central.

Certains autres composés phénoliques peuvent être utilisés pour la construction de

polymères pariétaux tels que la lignine qui se forme après une réaction d’oxydation

impliquant les peroxydases pariétales et le H2O2 (Hatfield et Vermerris 2001, Ralph et al.

2004). La diminution d’H2O2 et l’augmentation de l’activité peroxydases ont également été

observées au cours de ce travail et entre donc vraisemblablement en jeu lors de la formation

d’un dépôt de lignine sur les parois externes des cellules du péricycle. Ainsi, par opposition à

plusieurs autres études (Garía-Limones et al. 2002 ; Morkunas et Gmerek 2007), nous avons

trouvé que la résistance partielle à A. euteiches est associée à une diminution de la

concentration en H2O2. Celle-ci est corrélée aux activités élevées de l’APX et de la CAT dans

la lignée A17 et à une activité POX observée dans les cellules corticales des racines infectées

d’A17. Ces résultats suggèrent l’existence d’une réaction d’oxydation des composées

phénoliques solubles qui engendre le brunissement important observé dans le cortex racinaire

d’A17. Une telle situation dans la quelle une diminution de la concentration en H2O2 est

associée avec la résistance à un parasite est similaire à celle décrite lors de l’étude de

l’interaction entre le maïs et Aspergillus flavus (Magbanua et al. 2007).

Le renforcement des barrières structurales autour du cylindre central est la deuxième

différence majeure entre les deux lignées. Outre le dépôt de lignine mentionné précédemment,

on observe également un épaississement des parois qui pourrait être dû à l’accumulation

157

observée d’HRGP et composés phénoliques pariétaux dans les racines infectées d’A17. Mais

le phénomène le plus marquant est celui de la division des cellules du péricycle. Ce

mécanisme original non encore décrit lors d’une interaction plante- parasite comme moyen de

défense de la plante, peut permettre d’ajouter jusqu’à 3 assises cellulaires autour du cylindre

central. Les cellules du péricycle sont bien connues pour avoir la propriété de se re-

différencier pour donner naissance aux cellules fondatrices des racines secondaires

(Dubrovsky et al. 2000) ou des nodules chez les légumineuses (Timmers et al. 1999). Selon

l’espèce, les cellules fondatrices sont localisées face aux pôles du xylème ou phloème. Dans

notre cas les divisions cellulaires du péricycle sont observables tout autour du cylindre central

chez A17 mais pas chez F83005.5. Compte tenu du phénotype d’A17 deux rôles potentiels

non exclusifs peuvent être suggérés pour ces divisions: (i) elles jouent un rôle défensif en

constituant des barrières supplémentaires à franchir pour le parasite, (ii) elles favorisent

l’émission de racines secondaires, ce qui expliquerait les changements architecturaux

observés sur les racines inoculées d’A17.

Afin de localiser les régions du génome de M. truncatula impliqué dans la résistance

partielle à A. euteiches, la recherche de QTL a été entreprise à l’aide d’une population de

lignées recombinantes issues du croisement entre A17 et F83005.5. Les analyses statistiques

réalisées à partir des symptômes mesurés au cours du test d’inoculation in vitro ont montré

que les mesures des symptômes sur les parties aériennes, et non celles sur racines, sont

significatives pour identifier des QTL de résistance. Cette observation est probablement liée

aux conditions in vitro de notre test. Bien qu’initialement déposées très précisément sur la

zone pélifère de la racine, les gouttes d’inoculum ont tendance à tomber et à glisser le long

des racines, ce qui augmente la taille de la zone d’inoculation et rend ensuite difficile la

comparaison de la zone racinaire touchée entre les différentes plantes.

Quel que soit le paramètre et le temps après inoculation analysé, un seul QTL récessif

majeur (Ae1) expliquant plus du 1/3 de la résistance observée a été détecté en haut du

chromosome 3. Le rôle clé d’Ae1 pour la résistance a été formellement démontré par

l’inoculation des lignées isogéniques (NILs) qui diffèrent entre elles seulement au niveau de

la région d’Ae1. L’observation des RILs et même de NILs transgressifs (plus sensibles que

F83005.5), suggère l’existence d’autres gènes modulateurs des réactions de défense de la

plante interagissant avec un ou plusieurs gènes présents dans Ae1. Il est à noter que le haut du

chromosome 3 chez M. truncatula dans lequel se trouve Ae1, est aussi impliqué dans la

résistance à d’autres stress biotiques. Il contient par exemple un QTL mineur de résistance à

Ralstonia solanacearum (Vailleau et al. 2007), ainsi que deux gènes de résistance contre les

158

pucerons (Klingler et al. 2005 ; Klingler et al. 2007). L’importance de cette zone dans les

résistances aux stress biotiques est corrélée avec sa richesse en RGAs qui appartiennent à la

famille des NBS-LRR (Ameline-Torregrosa et al. 2008b). Néanmoins grâce à la cartographie

fine d’Ae1, qui a permis de réduire sa taille à un fragment physique d’ADN de 95 Kb, il a été

montré qu’aucun RGA n’était présent dans la séquence analysée. Parmi les gènes candidats

identifiés, se trouve un étonnant cluster de gènes codant des protéines à motifs F-box. La

possibilité d’association putative entre les gènes reliés au protéasome et la résistance partielle

d’A17 est renforcée par l’existence supplémentaire au sein d’Ae1 d’un gène codant une

enzyme associant l’ubiquitine à d’autres protéines et par le faite que plusieurs de ces gènes

associés au protéasome sont différentiellement induits chez A17 à au moins un des temps

testés. Ces différents éléments laissent donc penser que le protéasome joue un rôle dans la

résistance partielle à A. euteiches, ainsi que certains résultats obtenus par une approche

protéomique le suggéraient aussi (Colditz et al. 2005). Les protéines F-box assurent de

nombreuses fonctions dans la plante (Lechner et al. 2006), cependant plusieurs hypothèse

peuvent être émises quant à un rôle potentiel de ces F-box, compte tenu du phénotype

racinaire d’A17. La majorité des F-box d’Ae1 ont des homologies avec des cyclines. Un rôle

dans la régulation des divisions cellulaires du péricycle peut être envisagé, ainsi que cela été

démontré pour certaines protéines F-box chez A. thaliana (del Pozo et al. 2006). D’un autre

côté, comme il est connu que la production des racines secondaires est sous contrôle de

l’auxine et de l’éthylène (Ivanchenko et al. 2008), une des F-box candidats pourrait également

jouer un rôle dans la régulation de ces deux hormones, comme le font EBF1 et EBF2 pour

l’éthylène (Gagne et al. 2004). Ces deux dernières F-box sont en effet capables d’adresser le

facteur de transcription EIN3 vers le protéasome et donc réguler négativement la voie de

l’éthylène (Guo et Ecker 2003). D’autres données indiquent aussi l’intervention de F-box

(COI 1) dans la régulation de l’acide jasmonique (Katsir et al. 2008), hormone très importante

dans la régulation des mécanismes de défense.

Parmi les gènes annotés d’Ae1, deux autres sont aussi de bons candidats potentiels car

leurs fonctions peuvent contribuer au renforcement des parois cellulaires observé chez les

racines d’A17. Un des deux a été annoté comme une protéine de la paroi précurseur gp1,

appartenant à la famille des HRGP, connu d’être responsable dans le renforcement de la paroi

en réponse à des attaques par les parasites (Esquerré-Tugayé et al. 1999). Le deuxième gène

partage une forte similarité avec un gène atypique de CAD (Goffner et al. 1998), une enzyme

impliquée directement dans la lignification (Dixon et al. 2002). Ainsi, ce gène pourrait être

responsable du dépôt de lignine sur les parois externes des cellules du péricycle à 6 dpi chez

159

A17. Ce rôle est en tout cas compatible avec les données d’expression de qRT-PCR, puisque

ce gène est différentiellement induit chez A17 à partir de 3 dpi.

En conclusion, les analyses sur le pathosystème M. truncatula – A. euteiches ont apporté

des résultats originaux sur l’identification des mécanismes de résistance partielle à un

oomycète racinaire. Des mécanismes nouveaux (divisions du péricycle) sont décrits pour la

première fois dans le cadre d’une interaction plante – parasite. L’identification de séquences

géniques formellement identifiées comme responsable du contrôle du développement d’A.

euteiches dans une légumineuse, constitue également une nouveauté importante qui aura

certainement des répercutions, tant fondamentales qu’appliquées, qui permettront de mieux

comprendre les mécanismes de résistance et d’amélioration de la lutte génétique vis-à-vis

d’un parasite aussi destructeur qu’A. euteiches. Cependant, même dans un fragment d’ADN

génomique réduit à 95 Kb les gènes candidats potentiels restent nombreux, d’autant que

certains d’entre eux tels que celui codant pour l’enzyme intervenant sur l’ubiquitine et une des

F-box par exemple, pourraient très bien fonctionner en tandem pour former un complexe

permettant l’adressage au protéasome d’une molécule d’origine microbienne (effecteur…) ou

végétal (facteur de transcription régulant une hormone par exemple). Ainsi, les perspectives à

court et moyen terme de ce travail de génétique seront donc dans un premier temps réduire

encore Ae1. Ce travail peut être d’ores et déjà initié en cherchant les points de recombinaisons

exacts chez certaines RILs (183 et 222) et même chez certaines NILs intéressantes qui n’ont

pas encore été exploitées. La séquence équivalente d’Ae1 doit aussi être obtenue chez la

plante sensible pour accélérer le choix des gènes candidats. En raison de la nature récessive de

la résistance, la complémentation chez F83005.5 par transformation génétique n’est pas

possible avec la séquence d’A17. Cependant l’identification de mutants (ou de plantes RNAi)

A17 qui auront perdu leur résistance. Il est aussi important de confronter nos résultats avec

ceux trouvés par Pilet-Nayel et ces collaborateurs (2008), qui ont identifiés dans la même

zone d’Ae1, un QTL majeur dominant AER1 en utilisant le croisement LR3 entre DZA45.5 et

F83005.5 avec la souche RB48 d’A. euteiches. Donc la comparaison de la séquence du parent

résistant DZA45.5 avec celle de A17 devraient permettre de découvrir le(s) gène (s)

responsable(s) de la résistance partielle à A. euteiches.

160

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185

ANNEXES

Annexe MM.1: Solution fertilisante Vadez et al. (1996) modif. par Mhadhbi et al. (2005) Macroéléments

K2SO4 0.70mM MgSO4 7H2O 10mM CaCl2 2H2O 165mM KH2PO4 0.36mM Chélate de Fer 1.26g/l

Micoéléments H3BO3 4µM MnSO4 H2O 6.6µM ZnSO4 7H2O 1.55µM CuSO4 5H2O 1.55µM Na2MoO4 2H2O 0.12µM CoSO4 7H2O 0.12µM

Annexe MM.2: Milieu M (Bécard et Fortin 1988) Pour 1 litre d’eau distillée : Macroéléments

KNO3 80mg MgSO4, 7H2O 731 mg KCl 65 mg KH2PO4 4,8 mg NaFe-EDTA 8 mg Ca(NO3)2, 4H2O 288 mg

Microéléments MnCl2, 4 H2O 6 mg H3BO3 1,5 mg ZnSO4, 7H2O 2,65 mg Na2MoO4, 2H2O 0,0024 mg CuSO4, 5H2O 0,13 mg KI 0,75 mg

Vitamines Glycine 3 mg Myoinositol 50 mg Nicotinic acid 0,5 mg Pyridoxine HCl 0,1 mg Thiamine HCl 0,1 mg

Ajuster le pH à 5,5 avec du HCl Ajouter 5g de Phytagel (Sigma)

186

Annexe MM.3: Milieu Sanderson & Srb. (Basic Plant Pathology Methods 1995) Pour 1 litre d’eau distillée :

KH2PO 2 g MgSO4, 7H2O 0,6 g NaCl 0,1 g Agar 20 g NaNO3 2,4 g Sucrose 10 g CaCl2 0,1 g Extrait de levure 2,5 g Micro-éléments 1 ml de la solution stock

Pour préparer la solution stock des micro-éléments il faut :

9 mg H3BO3/ 58,5 mg CuSO4 5H2O/ 1,95 mg KI/ 9 mg MnSO4 H2O/ 7,6 mg NaMoO4/ 822

mg ZnSO4 6H2O/ 139,8 mg FeCl3 6H2O dans 300 ml d’eau distillée.

Annexe MM.4: Milieu CMA Pour 1 litre d’eau distillée :

10 g Corn Meal Agar (Sigma) Annexe MM.5: Milieu PG Pour 1 litre d’eau distillée :

20g peptone (Sigma) 5g glucose monohydrate (Sigma)

Annexe MM.6: Tampon d’extraction de l’ADN Pour 100 ml 2g de CTAB (cetyl trimethyl-ammonium bromide, Sigma) 10 ml Tris-HCl 1 M pH 8 28 ml NaCl 5 M 4 ml EDTA 0,5 M pH 8 (disodium éthylène diamine tetra acétate, Sigma) 0,5 ml de βmercapto-éthanol (à ajouter après autoclavage du tampon) A conserver à température ambiante et à l’abris de la lumière. Annexe MM.7: Tampon de migration de l’ADN (TBE 10x) Dissoudre 108 g de Tris et 55 g d’acide borique dans 800 ml d’eau distillée Ajouter 40 ml d’EDTA 0,5 M pH 8 Ajuster le volume à 1 litre

Filtrer et stériliser par autoclavage (20 min, 120°C, 1 bar)

187

Annexe MM.8: Bleu de charge pour ADN Pour 20ml

- Dissoudre 0,05 g de bleu de bromophénol et 0,05 g de xylène cyanol dans 10 ml d’eau UHQ. - Ajouter ensuite 3 g de Ficoll400 et compléter à 20 ml avec l’eau UHQ.

Annexe MM.9: Dénaturation de l’ARN

- 500ng ARN dans un volume final 15µl de H2O DEPC - Ajouter 4µl de tampon 5X ARN - Chauffer 10min à 60°C, refroidir sur glace. H2O DEPC 1litre eau UHQ (milliQ) 1ml de DEPC (diethyl pyrocarbonate) Mettre en agitation pendant une nuit pour que le DEPC puisse désactiver les RNases dans l’eau. Autoclaver l’eau DEPC (20min, 120°C, 1 bar)

Tampon 5X ARN 16 µl Bleu de bromophénol saturant 80 µl de EDTA 500mM (pH8) 720 µl de formaldéhyde 37% 2 ml de glycérol 100% 3,084 µl de formamide 4 ml de tampon de migration 10X 10 ml de H2O DEPC

Annexe MM.10: Tampon de migration 5X pour ARN

- 20,6 g d’acide 3-(N morpholino)propanesulfonique (MOPS) : 0,1M final - 800 ml d’acétate de Sodium à 50 mM (CH3COONa) traité à l’eau DEPC : 40mM final - Ajuster le pH à 7 avec NaOH 2 N - Ajouter 10ml de EDTA 0,5 M pH 8 (traité au DEPC) : 5mM final - Autoclaver la solution. Conserver à température ambiante et à l’abri de la lumière.

188

Annexe IV.1: Corrélation entre les donnés phénotypiques et celles de fluorescence racinaire chez les RILs LR5 à 6 jours après inoculation par A. euteiches.

Racines CJ15 LT15 M15 ST15 CJ21 LT21 M21 PP21 PR21 PT21 PR/PP21 ST21

Inoculées

SC -0,131 -0,138 -0,017 -0,083 -0,234 -0,130 -0,058 0,004 0,128 -0,018 -0,004 -0,163 SF 0,097 -0,227 0,136 0,112 0,142 -0,226 0,174 -0,216 -0,074 -0,223 0,170 0,012 %F 0,246 -0,175 0,249 0,240 0,292 -0,173 0,300 -0,294 -0,160 -0,294 0,231 0,184 IMF 0,100 -0,096 0,108 0,178 0,145 -0,091 0,148 -0,181 -0,022 -0,195 0,181 0,154 IMF/µm² -0,087 0,171 -0,178 0,200 -0,057 0,183 -0,073 0,101 0,230 0,072 -0,022 0,267

Témoins

SC 0,034 -0,353 -0,001 -0,127 -0,061 -0,358 -0,031 -0,169 -0,173 -0,155 0,054 -0,157 SF -0,262 -0,204 -0,181 -0,277 -0,274 -0,208 -0,187 -0,105 0,086 -0,130 0,208 -0,197 %F -0,313 -0,202 -0,206 -0,295 -0,313 -0,198 -0,236 -0,088 0,132 -0,119 0,219 -0,200 IMF -0,349 -0,180 -0,242 -0,314 -0,352 -0,175 -0,276 -0,065 0,180 -0,102 0,222 -0,209 IMF/µm² -0,290 -0,185 -0,216 -0,159 -0,293 -0,181 -0,244 -0,046 0,191 -0,083 0,174 -0,120

Abréviations:

SC surface totale de la coupe racinaire SF surface de la partie fluorescente %F pourcentage de la surface fluorescente = (SF/SC)*100 IMF Intensité moyenne de fluorescence dans la coupe racinaire IMF/µm² Intensité moyenne de fluorescence par µm² = (IMF*SF)/SC

189

LISTE DES ACTIVITES SCIENTIFIQUES EFFECTUEES AU COURS DE LA THESE

1. LISTE DES PUBLICATIONS 1.1. Article paru dans une revue à comité de lecture

Djébali N, Mhadhbi H, Jacquet C., Huguet T. and Aouani M. E. (2007). Involvement of Hydrogen Peroxide, Peroxidase and Superoxide Dismutase in Response of Medicago truncatula Lines Differing in Susceptibility to Phoma medicaginis Infection. Journal of Phytopathology, 155: 633-640. 1.2. Article soumis :

Djébali N, Jauneau A, Ameline-Torregrosa C., Chardon F., Mathé C., Bottin A., Cazaux M., Pilet-Nayel M-L, Baranger A., Aouani M. E., Esquerré-Tugayé M-T, Dumas B., Huguet T. and Jacquet C.. Partial resistance of Medicago truncatula to Aphanomyces euteiches is associated with protection of the root stele and is controlled by a major QTL rich in proteasome-related genes. The Plant Journal, (Annexe IV.2). 1.3. Articles en préparation :

Cazaux M., Djébali N., Martinez Y., Rey T., O’Connell R., Esquerré-Tugayé M-T, Dumas B. and Jacquet C. Analyses of root infection process by an aerial pathogen revealed new features of fungal colonization but a similar resistance locus in plant genome.

Djébali N., Krajinski F., Lafitte C, Mhadbi H., Aouani M. E., Dumas B., Esquerré-Tugayé M-T and Jacquet C. Transcriptome, cytological and biochemical analyses of M. truncatula partial resistance to Aphanomyces euteiches highlight key roles for phenylpropanoid pathway and ROS scavenging. 1.4. Autre manuscript:

Djébali N. Compte rendu du XVI congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB 2008), Tampere – Finlande 17 – 22 Août 2008. Notes de l’Asedis-SO (document envoyé). 2. Participations à des congrès 1) Djébali N. et Aouani M. E. (2004). Identification des champignons attaquant

naturellement les luzernes annuelles en Tunisie. 1er séminaire international de Microbiologie: 19-22 décembre 2004 Hammamet, Tunisie.

2) Djébali N., Mhadhbi H., Limam F., Huguet T and Aouani M.E. (2005). Involvement of peroxydase and superoxide dismutase in the resistance of Medicago truncatula to Phoma medicaginis. VIème Congrés de la Société Française de Phytopathologie, Toulouse 23-24-25 Février 2005, France

3) Jacquet C., Djébali N., Bottin A., Huguet T., Esquerré-Tugayé M-T. and Dumas B. Identification of M. truncatula resistance components to A. euteiches through cytological and genetic analysis. Third Year Grain Legumes Integrated Project Workshop, Montpellier (20-23 février 2006).

4) Jacquet C., Djébali N., Cazaux M., Ameline-Torregrosa C., Krajinski F., Aouani M. E., Dumas B., Esquerré-Tugayé M. T. and Huguet T. Development of genomic and genetic

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tools to improve and understand legume resistance to biotic stress. First Mediterranean Congress on Biotechnology. 25-29 March 2006.

5) Djebali N., Jauneau A., Ameline-Torregrosa C., Moumene A., Bottin A., Esquerre-Tugayé M.T., Dumas B., Aouani E., Huguet T. and C. Jacquet. Cytological analyses and QTL cloning to identify Medicago truncatula candidate genes involved in resistance to Aphanomyces euteiches. Model Legumes Congress, March 24-28 2007, Tunisia

6) Djébali N., C. Jacquet, T. Huguet, and M. E. Aouani. Establishment of two pathosystems to identify resistance components in Medicago truncatula to Phoma medicaginis and Cercospora medicaginis. Model Legumes Congress March 24th-28th, 2007 Tunis.

7) Djébali N., Mhadhbi H. , Lafitte C., Jauneau A., Dumas B., Aouani M.E. and Jacquet C.. Induction of antioxidant enzyme system and phenolics synthesis are both involved in Medicago truncatula resistance to Aphanomyces euteiches. 3rd International Aphanomyces Workshop. 7-9 Novembre 2007, Rennes, France.

8) Djébali N., Jauneau A., Ameline-Torregrosa C., Bottin A., Dumas B., Aouani M. E., Huguet T., C. Jacquet. Deciphering mechanisms of resistance to Aphanomyces euteiches in Medicago truncatula. 3rd International Aphanomyces Workshop. 7-9 Novembre 2007. Rennes, France.

9) Pilet-Nayel M.-L., Djébali N., Ameline-Torregrosa C., Bottin A., Esquerré-Tugayé M.-T., Dumas B., Aouani M. E., Baranger A., Huguet T., Jacquet C.. New advances in legume resistance against Aphanomyces euteiches. 6th European conference on grain legume. 12-16 November 2007, Lisbon, Portugal (Plenary Session).

10) Djébali N., Cazaux M., Ameline-Torregrosa C., Aouani M.E., Esquerre-Tugayé M.T., Huguet T. and Jacquet C. Genetic analysis of Medicago truncatula resistance to root rot caused by Aphanomyces euteiches. Tunisian-German Workshop on Bioinformatics. 8-10 septembre 2006. Borj Cedria, Tunisie.

3. PARTICIPATION SCIENTIFIQUE ET ADMINISTRATIVE A DES PROJETS DE RECHERCHE

Projet bilatéral Tunisie-France: Amélioration de la résistance aux maladies fongiques des légumineuses en utilisant la plante modèle Medicago truncatula. Code CMCU07G0907, 2007-2009. Coordinateur tunisien M.E. Aouani, coordinateur français C. Jacquet. 4. ORGANISATION DE MANIFESTATIONS SCIENTIFIQUES

Cours national pratique 2004 « Interaction légumineuse microorganismes, module deux approches de lutte contre les champignons phytopathogènes des légumineuses : approche génétique et biologique ».

Membre du comité organisateur du congrès international Model Legumes Congress 24-28 mars 2007 Tunis.

Participation à l’organisation de l’atelier « Interactions plantes microorganismes : décoder le dialogue plantes- champignons » à l’UMR5546 au cours de la fête de la science du 8 au 14 octobre 2007.

5. ENSEIGNEMENT

Enseignement de travaux pratiques de Rhizobiologie à l’Institut National Agronomique de Tunisie au cours des années 2004 et 2005.

Enseignement de travaux pratiques de Microbiologie à l’Ecole Supérieur des Sciences et Technologie de l’Environnement durant l’année 2005.

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6. FORMATIONS

Formation en informatique : j'ai effectué un stage au centre national de formation des formateurs et de l'ingénierie de formation (CE.NA.F.F.I.F) de Rades (Tunisie) du 15 au 20 décembre 2003. Cette formation a porté sur les applications informatiques du niveau III.

Formation en bioinformatique : j’ai effectué un stage du 31 May au 05 Juin 2004 dans le centre de biotechnologie de Sfax (Tunisie) portant sur l’introduction à la bioinformatique (recherche dans les bases de données, homologie de séquences, recherche de motifs conservés, recherche d’exons dans une séquence de gène…).

Formation en microscopie confocal du 14 au 15 juin 2007 au Centre de Biotechnologie de Sfax (Tunisie).

Formation en microscopie optique à l’UMR5546 (Auzeville) sous la direction de monsieur Alain Jauneau.