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DIVISIÓN DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD
LABORATORIO DE QUIMICA
TÍTULO DEL PROYECTO DEL QUE SE DERIVA: “ FENOMENOS DE ADSORCION MOLECULAR EN LA
INTERFASE ELECTRODO/ELECTROLITO, UN
ESTUDIO DE MICROSCOPIA POR SONDA”
TÍTULO DEL PROYECTO DE SERVICIO SOCIAL:
ASESOR: Dr. NIKOLA BATINA
LICENCIATURA EN BIOLOGIA EXPERIMENTAL MATRICULA:99221722
TEL: 017717153041
CLAVE DE REGISTRO: BE.038.03 .
TRIMESTRE LECTIVO
04-P.
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA
CARACTERIZACION DE MATERIALES DE ORIGEN BIOLOGICO CON MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA
INTRODUCCION
La principal composición química de la membrana celular son las proteínas y
lípidos. El colesterol es uno de los lípidos más importantes de la membrana
celular. Este está presente en todos los sistemas vivos, principalmente en la
estructura de la membrana celular, en el aislamiento de los nervios, la producción
de ciertas hormonas y la síntesis del ácido biliar, el colesterol es altamente
insoluble en agua y dentro del cuerpo normalmente en el colesterol esta adherido
a lipoproteína o incorporados en lípidos en forma de agregación tanto como en
micelas biliares y sales biliares. Cuando el colesterol es insoluble en los sistemas
biológicos, es separado en la fase de aceites o cristales. Las causas que provocan
la precipitación del colesterol no están del todo bien entendidas. Pero se puede
incrementar la concentración del colesterol o bajarla. El depósito del colesterol en
las paredes internas de las arterias, causa lo que se llama arteriosclerosis.
La molécula del colesterol contiene un núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno y
presenta un grupo hidroxilo en el carbono 3, una cadena lateral de 8 átomos de
carbono, doble enlace en el C-5 y además de los grupos metilos C-18, C-19, C-
21, C-26 y C-27, cuando se produce en un plano tiene torsiones en la región de
los carbonos número 4-5-10-1 y 5-10-1-2, tiene un carácter hidrofóbico y en su
estructura denota dos planos de superficie muy importante, la parte hidrofóbica
(CH3 – Terminal ) y la parte hidrofílica (OH – terminal). Fig.(1)
Fig. 1 Estructura del Colesterol
El microscopio de fuerza atómica (AFM, Atomic Force Microscope) o SFM
(Scanning Force Microscope), fue inventado en 1986 por Binnig, Quate y Gerber.
Fig.2.
Fig.2.Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).
El AFM registra la información de la superficie de una muestra a través del
movimiento de una punta muy delgada y aguda sobre la muestra. Fig.3. La punta
está situada en el extremo de un pequeño brazo de palanca que, cuando la punta
se mueve sobre la superficie de la muestra, se dobla como respuesta a la fuerza
de interacción atómica entre la punta y la superficie.
El primer AFM utilizaba un microscopio de transmisión de electrones (STM,
Scanning Tunneling Microscope) para detectar el doblez del brazo de palanca en
presencia de la superficie, pero ahora los microscopios de fuerza atómica
modernos utilizan un dispositivo óptico. Una ventaja inmediata es que la punta no
necesita ser conductora y las propiedades de conducción de electrones de la
muestra a analizar no son importantes.
La punta del AFM se mantiene en la misma posición todo el tiempo y es la
muestra la que se mueve bajo la punta. Esto se logra colocando la superficie
sobre el extremo de un cilindro hecho de un material piezoeléctrico, el cual, al
aplicarle una diferencia de potencial, cambia sus dimensiones. Por medio del
material piezoeléctrico podemos mover la muestra en cualquier dirección en el
espacio. El coeficiente piezoeléctrico de dicho material, cuando deseamos analizar
muestras a escalas atómicas, es del orden de 15-20 A°/Volt, lo que nos permite
tener una precisión de alrededor de 0.01 A° para el movimiento de la muestra.
Cuando queremos analizar superficies de mayor escala, como por ejemplo de
100:m x 100:m, el coeficiente del piezoeléctrico utilizado es del orden de 200-300
nm/Volt.Fig.4.
Fig. 3. Punta utilizada en AFM Si3N
Fig. 4. Esquema de un microscopio de fuerza atómica, en el se aprecian los componentes
básicos que lo conforman: punta de sondeo, explorador piezoeléctrico, censor de
desplazamiento o censor de posición y equipo de control.
La resolución del AFM depende del tamaño del área analizada de la muestra, ya
que el AFM siempre tomará 512 x 512 datos sin importar que tan grande sea el
área analizada, de modo que entre más pequeña sea el área analizada, mayor
será la resolución.
El conjunto de puntos tomados por el AFM se pueden representar como una
imagen en dos dimensiones, en donde las alturas relativas entre punto y punto se
diferencian por tonalidades. Las partes más claras representan zonas de mayor
altura, respecto a la media, y las zonas más oscuras las zonas de menor altura en
la superficie.
Del archivo de datos, también se puede generar una imagen en tres dimensiones
de la superficie, en donde la tercera dimensión es la altura de cada punto.
Si pretendemos detectar rugosidades en la superficie producidas por átomos y
analizar las muestras en rangos de sub-ángstrom entonces es de vital importancia
lograr aislar la punta del AFM de vibraciones externas. Para evitar interferencia de
las vibraciones producidas en el laboratorio, la cabeza del AFM (donde se
encuentra la muestra, la punta, el sistema óptico, etc.), se encuentra suspendida a
través de un sistema de hule que posee una frecuencia natural de vibración del
orden de 1 Hz. Esta suspensión de hule es efectiva para eliminar vibraciones
verticales y horizontales del medio ambiente. Además, el material con el que está
hecha la cabeza del AFM es un material rígido con una frecuencia natural de
vibración alta, del orden de Khz. Con esta combinación de frecuencia de
resonancia se logra eliminar ruidos de vibración provenientes del laboratorio con
frecuencia entre los hertz y los kilohertz. Además, los brazos de palanca comunes
poseen una frecuencia natural de vibraciones mayores a 80 Khz., lo que ayuda al
aislamiento vibracional. El ruido acústico también representa un problema para las
mediciones del AFM por esto se requieren laboratorios tranquilos, además de que
resulta conveniente colocar una caja de protección sobre el AFM.
Si el sistema de retroalimentación está activado entonces el material
piezoeléctrico, conforme la punta se mueva sobre la superficie, responderá a
cualquier cambio en la fuerza, alterando la separación de la punta y la muestra
con el fin de restablecer el valor predeterminado de la fuerza. De este modo la
fuerza ejercida por el material sobre la punta se mantiene constante. A este modo
se le conoce como modo de fuerza constante.
Si por el contrario, el sistema de retroalimentación está desactivado, entonces el
microscopio operará con una separación entre la punta y la muestra constante, por
lo que se llama modo de altura constante. Este modo es útil cuando se van a
analizar superficies muy planas con una alta resolución.
Sin embargo, debido a que la fuerza entre la punta y la superficie es una función
complicada de la separación, existen diferentes tipos de imágenes que se pueden
obtener con el AFM, las tres principales clases de interacción son: modo de
contacto (Contac Mode), modo oscilante (Tapping Mode) y modo de no-contacto
(non-contactmode).Fig.5.
Fig.5.Modos de contacto de la punta (AFM).
Las ventajas del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) es una alta resolución, se
maneja en diferentes ambientes de trabajo, da información adicional a la
morfología y nos proporciona imágenes tridimensionales. Entre las desventajas
que podemos mencionar para este microscopio son, la velocidad de adquisición
lenta, sensibilidad a la temperatura y sensibilidad a vibraciones.
A continuación la representación de un arreglo estructural de la ultima capa de la
superficie de Au (111), mostrándose cada átomo de oro que se encuentra rodeado
de seis átomos Fig.6. Esta estructura es interesante, ya que dependiendo del
arreglo de substrato las moléculas podrían en un momento dado adsorberse y
arreglarse respetando la estructura del substrato .Es interesante observar y hacer
notar la posición que adoptan los átomos de una capa sobre otra. Es un buen
sustrato para usarlo en AFM ya que la superficie es completamente plana.
Fig.6. Arreglo de átomos definidos en la última capa de una superficie Au(111)
OBJETIVO GENERALES
Conocer la función y manejo del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) para
obtención de imágenes de colesterol en sustrato plano Au (111) a nivel molecular.
OBJETIVOS ESPECIFICOS -Entender el principio del Microscopio de Fuerza Atómica (AFM)
-Obtener imágenes de colesterol a nivel atómico
-Desarrollo de metodología para la fijación de material biológico (colesterol) en
AFM desde la solución de etilenglicol en sustrato sólido metálico perfectamente
plano
EQUIPO UTILIZADO
1. Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) Nanoscope III .
2. Sistema purificador de Agua Milli-Q.
3. Baño ultrasonido (Branson 1210)
MATERIAL Y REACTIVOS
1. Placas de vidrio con película de Au (111); Berliner Glas Co. Berlin,
Germany
2. Colesterol (origen humano), 99+% pureza, Marca Aldrich
3. Etilenglicol, 99.8% anhidro, Marca Aldrich Chemical
4. Hidrogeno (H2) Gas Inflamable; Infra S.A de C.V .México D.F. México
5. Dicromato de Potasio (KCr2O7), Grado técnico; Reasol S.A de C.V México
D.F.; México.
METODOLOGÍA Preparación de Soluciones
-Se preparo una mezcla de dicromato de potasio (dos cucharas pequeñas
aproximadamente, 10 grs.). Agua purificada (300 ml) y ácido sulfúrico la cantidad
necesaria hasta alcanzar la saturación.
-Todo el Material de cristalería fue previamente lavado con la mezcla crómica y se
enjuago con abundante agua purificada con el sistema Milli-Q Millipore.
-Se prepararon 5 ml de solución de colesterol 2x10-4M pesamos 3.98301 x10-4 g
de colesterol, se colocaron en un matraz volumétrico y se aforaron a 5 ml con
etilenglicol, posteriormente la solución fue sometida a baño de ultrasonido por 1
hora con la finalidad de disolverla por medio de ondas de sonido.
-Se prepararon 500 ml de hidróxido de sodio (NaOH) 6 N, se pesaron 24 g de
hidróxido de sodio, los cuales se colocaron en un matraz volumétrico para
posteriormente aforar a 500 ml con agua ultra pura.
Preparación del Sustrato de Au (111)
Se corto aproximadamente 1 cm2 de placa de vidrio con película de oro
depositado en su superficie de marca Berliner Glass y se enjuagado con agua
ultra pura para eliminar toda las impurezas generadas en el corte. Posteriormente
se le aplico calor, con el método de annealing que consiste en calentar con flama
de Hidrogeno a la placa con película de oro a una temperatura 400 °C de 25-30
segundos, para tener una superficie con terrazas mas planas y grandes, es decir
una superficie plana y ordenada. Después se enfrió a temperatura ambiente
cubriéndola con una caja petri para evitar que se adsorban impurezas. Una vez
enfriada dicha placa se utiliza para la colocación de muestra.
Preparación de muestra
Se coloco una gota de la disolución (2x10-4 M) del colesterol en etilenglicol sobre
el sustrato Au (111), la muestra se sometió a movimientos rotatorios durante 4
minutos, para mejorar la dispersión de la solución sobre el substrato. Se dejo
secar y se coloco en una caja petri de vidrio para protección contra el ambiente.
ACTIVIDADES REALIZADAS
Programación en meses Actividad Mes1 Mes 2 Mes 3 Mes 4 Mes 5 Mes6
Revision Bibliográfica
X X X X X X
Investigación de métodos
X X
Preparación de muestras
X X
Visualización X X Interpretación de resultados
X
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
Entre los objetivos alcanzados durante el tiempo de la prestación del servicio
social están el conocimiento del fundamento y manejo de un microscopio de alta
resolución como es el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM), el desarrollo de una
metodología para la fijación de muestras biológicas y visualización de imágenes.
Las metas logradas fueron el conocimiento de nuevas técnicas para trabajar en un
laboratorio de Nanotecnología, como son; Preparación de soluciones, preparación
de placas de oro y muestras para observar en los microscopios.
RESULTADOS
Fig.1. Imagen tridimensional de una película de colesterol monohidratado 2x10-4
M en etilenglicol y adsorbidas a temperatura ambiente sobre Au (111) con el
microscopio de fuerza atómica (AFM).
Fig. 2. Imagen tridimensional de capas de moléculas de colesterol monohidratado
2x10-4 M en metanol (AFM).La mayoría de las moléculas están acumuladas sobre
las orillas del sustrato del oro, color blanco (colesterol).
CONCLUSION
Las moléculas de colesterol monohidratado (colesterol 99% Aldrich) con una
concentración 2x10-4 M es preparado en diferentes solventes como, metanol y
etilenglicol, que son absorbidas sobre placas Au (111) a temperatura ambiente
(20°C) y visualizado por medio de Microscopia de Fuerza Atómica (AFM). En el
caso del colesterol en etilenglicol, en la imagen se muestra una película compacta
delgada sin posibilidad de disolver el sustrato en oro, esto es posible por la
tendencia que tiene el etilenglicol y el colesterol para coabsoberse en una
superficie de oro y formar una película compacta. En el caso del metanol se
observo que esta molécula se agrega en las orillas de los granos de Au, la
diferencia se debe probablemente a que la polaridad del etilenglicol (1.99) es más
baja en comparación con el metano (5.1).
La Visualización con el Microscopio de Fuerza Atómica tiene una gran importancia
para los materiales biológicos, ya que puede trabajar con cualquier tipo de
muestra y determina la estructura de material biológico e interacciones con
sustrato sólido u otros materiales.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN
Las evaluaciones se realizaron de la siguiente forma:
-Semanalmente el asesor junto con otros participantes del servicio social
discutíamos los resultados obtenidos en el periodo semanal.
- Al final de cada actividad se realizaba una junta en la cual se discutían los
resultados obtenidos y se planeaba las actividades para el siguiente mes.
- También se realizo una evaluación final donde se valoro el trabajo realizado
durante el periodo total del servicio social.
BIBLIOGRAFIA
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*G.Binnig, C.F. Quate , Ch .Gerber.Physical review letters. V56 NO. 9 . (1986) 930-933 *S,Morita.R,Wiesendanger.E,Meyer.Noncontact atomic force microscopy.Germany ,Springe.P.11-14