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UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE TECNOLOGÍA MÉDICA
DISTRIBUCIÓN DE RECEPTORES DE INOSITOL
1,4,5-TRIFOSFATO EN MÚSCULO ESQUELÉTICO
HUMANO NORMAL Y DISTRÓFICO
TESIS PROFESIONAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE TECNÓLOGO MÉDICO
CON MENCIÓN EN MORFOFISIOPATOLOGÍA Y CITODIAGNÓSTICO
AUTOR: Reinaldo Figueroa Contreras
TUTOR: Prof. Dr. Enrique Jaimovich P.
2008
2
ÍNDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN .............................................................................................................................. 4
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 5
MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 6
La distrofia muscular de Duchenne ............................................................................. 6
El Ca2+
y los IP3Rs en la célula muscular esquelética ................................................. 7
Los tipos de fibras musculares esqueléticas y los IP3Rs .............................................. 9
Rol del Ca2+
en la patogenia de la DMD ..................................................................... 9
HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 12
OBJETIVO GENERAL .......................................................................................................... 12
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 12
MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 13
Muestras de tejidos ...................................................................................................... 13
Reactivos ...................................................................................................................... 14
Inmunofluorescencia .................................................................................................... 16
Examen microscópico y adquisición de imágenes ...................................................... 17
Análisis de cuantificación de fluorescencia ................................................................. 17
RESULTADOS ....................................................................................................................... 19
Distribución y localización intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en
músculo esquelético humano normal ........................................................................... 19
Distribución y localización intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en
músculo esquelético humano distrófico ....................................................................... 23
DISCUSIÓN ............................................................................................................................ 33
Los IP3Rs presentan una distribución diferencial en el músculo esquelético
humano normal ............................................................................................................ 33
La distribución diferencial de los IP3Rs se pierde en el músculo esquelético
distrófico ...................................................................................................................... 38
REFERENCIAS ...................................................................................................................... 42
3
ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Fig. 1. Distribución del IP3R tipo 1 en músculo esquelético normal ....................................... 25
Fig. 2. Distribución del IP3R tipo 1 en músculo esquelético normal ....................................... 26
Fig. 3. Cuantificación de intensidad de la fluorescencia citoplasmática del IP3R tipo 1 ........ 27
Fig. 4. Distribución de los IP3Rs tipos 1 y 2 en músculo esquelético normal ......................... 28
Fig. 5. Localización intracelular de los IP3Rs tipos 1 y 3 en músculo esquelético normal ..... 29
Fig. 6. Distribución de los IP3Rs tipos 1 y 2 en músculo esquelético pediátrico normal ........ 30
Fig. 7. Localización intracelular de los IP3Rs en cortes longitudinales de músculo
esquelético normal ....................................................................................................... 31
Fig. 8. Distribución de los IP3Rs en músculo esquelético de pacientes con distrofia
muscular de Duchenne ................................................................................................. 32
4
RESUMEN
Los mecanismos que producen el daño tisular en la distrofia muscular de Duchenne (DMD)
permanecen poco claros. Se postula que aumentos del Ca2+
intracelular tienen un rol central en
la degeneración muscular. Los receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs) participan en la
generación de señales intracelulares de Ca2+
que modulan la expresión génica en células
musculares esqueléticas. Las señales de Ca2+
y la expresión génica asociadas a los IP3Rs
podrían estar alteradas en el músculo distrófico. No existen reportes sobre la expresión de
IP3Rs en músculo esquelético humano adulto normal ni distrófico. Se propuso que los IP3Rs
presentarían un patrón organizado de distribución en el músculo normal y que esta
distribución podría alterarse en el músculo distrófico. Mediante inmunofluorescencia se
describió la distribución y localización intracelular de los IP3Rs en músculo esquelético
humano normal y de pacientes con DMD. Los IP3Rs se expresan en músculo normal,
presentando una distribución diferencial (de mosaico) preferentemente en fibras tipo II. Los
tres tipos de IP3Rs se localizan en el citoplasma, probablemente en retículo sarcoplasmático.
Los IP3Rs tipos 1 y 3 presentan una localización compatible con los núcleos. El músculo
distrófico no presenta la distribución diferencial de IP3Rs, los que se expresan en todas las
fibras, independiente de su tipo. La distribución diferencial de los IP3Rs en el músculo normal
sugeriría que señales de Ca2+
originadas en los IP3Rs regularían programas génicos asociados
al tipo de fibra. La pérdida de este patrón en músculo distrófico sugeriría una alteración en la
expresión génica modulada por Ca2+
.
5
INTRODUCCIÓN
La DMD es una enfermedad letal causada por mutaciones en el gen de la distrofina. Aunque
es conocido que la alteración en la regulación del Ca2+
juega un rol central en la patogenia de
la enfermedad, es poco lo que se sabe acerca de la liberación de Ca2+
intracelular en este
fenómeno. La relación entre la ausencia de distrofina y la alteración en la regulación
intracelular del Ca2+
es desconocida. Los IP3Rs son una familia de canales permeables al Ca2+
localizados en el retículo sarcoplasmático y los núcleos de las células musculares esqueléticas,
que median una señal de Ca2+
de propagación lenta, gatillada por la despolarización celular,
involucrada en la regulación génica. El hecho que los niveles de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3)
y de IP3Rs se encuentren aumentados en líneas celulares derivadas de músculo distrófico
humano y de ratones mdx, uno de los modelos animales de DMD, llama la atención sobre la
posible relación entre la deficiencia de distrofina y los IP3Rs (Liberona y cols,. 1998). Por otro
lado, no existen reportes previos que describan la expresión de IP3Rs en músculo esquelético
humano adulto normal ni distrófico. Hasta la fecha, son escasos los datos sobre la relación
posible entre las señales de Ca2+
mediadas por los IP3Rs y los procesos regulados por ellas,
con la ausencia de distrofina y el fenotipo distrófico. Por lo tanto, se identifica dos problemas
de estudio. Primero, la escasa información que explique la posible participación de los IP3Rs
en la alteración de la homeostasis del Ca2+
en las fibras musculares distróficas. Segundo, la
ausencia de estudios previos que describan la expresión de los IP3Rs en el músculo esquelético
humano, tanto normal como distrófico. En nuestro estudio se abordó el segundo problema
mediante una aproximación inmunohistoquímica, intentando proponer posibles significados
funcionales a nuestros hallazgos morfológicos.
6
MARCO TEÓRICO
La distrofia muscular de Duchenne
La DMD (OMIM 310200) es una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X con una
incidencia global aproximada de 1 en 3.500 varones nacidos vivos (Emery, 1991), que
produce una progresiva degeneración muscular y la muerte prematura por insuficiencia
respiratoria o cardíaca hacia la tercera década de la vida (Emery, 2002). Está establecido que
es causada por la ausencia de distrofina, producida por deleciones o mutaciones puntuales en
el locus Xp21 (Blake y cols., 2002). La distrofina es una proteína del citoesquleto, con un peso
molecular relativo de 427 kDa, normalmente localizada en la cara interna de la membrana
plasmática (Ahn y Kunkel, 1993). En el músculo esquelético normal, la distrofina está
asociada a un complejo glicoproteico denominado complejo distrofina-glicoproteína (DGC,
dystrophin-glycoprotein complex), que incluye distroglicanos, sarcoglicanos, sintrofinas,
distrobrevina y sarcospano. Este complejo provee un anclaje entre la matriz extracelular y el
citoesqueleto, tendiendo a estabilizar mecánicamente la membrana plasmática (Blake y cols.,
2002; Bevilacqua, 2003). La ausencia de distrofina en el músculo distrófico produce la
desorganización del DGC y altera la estabilidad de la membrana plasmática, causando
fragilidad mecánica y aumento de la permeabilidad al Ca2+
(Batchelor y Winder, 2006). Los
mecanismos íntimos que subyacen a la generación de la enfermedad aún permanecen oscuros,
las hipótesis patogénicas actuales atribuyen un rol compartido a la disrupción mecánica de la
membrana celular y a los efectos deletéreos de las elevadas concentraciones del Ca2+
intracelular (Berchtold y cols., 2000; Gailly, 2002).
7
El Ca2+
y los IP3Rs en la célula muscular esquelética
El Ca2+
es un segundo mensajero versátil que juega un rol fundamental en la regulación de
variadas funciones en las células musculares esqueléticas, tales como el acoplamiento
excitación-contracción, el transporte a través de membranas y la plasticidad celular (Berchtold
y cols., 2000; Berridge y cols., 2003). Dos tipos de receptores, ambos canales de Ca2+
–los
receptores de rianodina (RyR) y los IP3Rs–, median los aumentos del Ca2+
intracelular
gatillados por la despolarización de la membrana plasmática (Jaimovich y Rojas, 1994;
Jaimovich y cols., 2000). En la fibra muscular esquelética, la despolarización de la membrana
celular, inducida por una elevada concentración de K+ extracelular o por estimulación
eléctrica, genera una elevación del Ca2+
intracelular que puede ser separada en dos
componentes. Un componente rápido (señal rápida de Ca2+
), correspondiente al acoplamiento
excitación-contracción, generado por la interacción de los receptores de dihidropiridinas
(DHPR), localizados en la membrana celular, que actúan como sensores de voltaje, y los RyR
localizados en la membrana del retículo sarcoplasmático, a través de los cuales se produce la
salida de Ca2+
hacia el citosol (Berchtold y cols., 2000; Gailly, 2002). Segundos después se
genera la señal lenta de Ca2+
, no relacionada con el acoplamiento excitación-contracción y
dependiente del aumento intracelular de IP3 (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001;
Eltit y cols., 2004). Esta señal lenta es producida por la activación de una proteína G aún no
identificada acoplada al DHPR y fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), que activa la fosfolipasa
C y la producción de IP3 y diacilglicerol (DAG). El IP3 estimula los canales IP3Rs localizados
en el retículo sarcoplasmático y la envoltura nuclear, gatillando la liberación de Ca2+
desde
estos reservorios (Araya y cols., 2003; Eltit y cols., 2006).
8
Los IP3Rs corresponden a una familia de canales permeables al Ca2+
compuesta de tres
isoformas (IP3Rs tipos 1, 2 y 3) que difieren en su secuencia aminoacídica, afinidad por el IP3
y modulación por Ca2+
(Patterson y cols., 2004). Los tres tipos de IP3Rs se expresan en células
musculares esqueléticas en cultivo primario y su localización intracelular está claramente
establecida. Los tres tipos de IP3Rs están distribuidos en el sarcoplasma, los tipos 1 y 2
asociados al retículo sarcoplasmático, y el tipo 3 distribuido difusamente en el citosol; además,
los tipos 1 y 3 se localizan en los núcleos celulares, el tipo 1 asociado a la envoltura nuclear y
el tipo 3 localizado en el nucleoplasma (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001;
Cárdenas y cols., 2005). La distribución normal de los IP3Rs ha sido previamente estudiada en
músculo esquelético adulto de rata (Moschella y cols., 1995) y ratón (Salanova y cols., 2002;
Powell y cols., 2003). En músculo esquelético de rata se describió la expresión diferencial de
los IP3Rs en fibras de tipo oxidativo (Moschella y cols., 1995). En músculo esquelético de
ratón se localizó al IP3R tipo 1 en retículo sarcoplasmático, células satélites y componentes de
la unión neuromuscular (Salanova y cols., 2002; Powell y cols., 2003). Se han identificado
sitios específicos de unión de IP3 en líneas celulares de músculo esquelético humano normal y
distrófico (Liberona y cols., 1998). Pero hasta el momento no ha sido publicado ningún
reporte sobre la distribución de los IP3Rs en músculo esquelético humano adulto.
La señal lenta de Ca2+
es dependiente de IP3 y mediada por los IP3Rs, se propaga a través de
los núcleos celulares (Jaimovich y cols., 2000; Cárdenas y cols., 2005) y está relacionada con
la regulación de la expresión de genes tempranos (c-fos, c-jun, egr-1; Araya y cols., 2003;
Carrasco y cols., 2003) y tardíos (IL-6, troponina I; Juretić y cols., 2006 y 2007). La señal
lenta de Ca2+
también ha sido identificada en las células satélites, que constituyen la población
de reserva proliferativa del tejido muscular (Powell y cols., 2003). Esta evidencia sugiere que
9
las señales de Ca2+
dependientes de IP3 podrían jugar un rol en la diferenciación y
regeneración de las células musculares.
Los tipos de fibras musculares esqueléticas y los IP3Rs
El músculo esquelético humano está compuesto por un conjunto heterogéneo de fibras
musculares. Los distintos tipos de fibras pueden ser descritos utilizando características
fisiológicas, morfológicas, histoquímicas o bioquímicas. Un método de tipificación de fibras
utilizado es la identificación inmunohistoquímica de las isoformas lentas y rápidas de las
cadenas pesadas de la miosina (MHCs, myosin heavy chains). La miosina es un filamento
grueso constituyente del sarcómero. Corresponde a un heterohexámero conformado por dos
cadenas pesadas, dos cadenas livianas esenciales o alcalinas, y dos cadenas livianas
regulatorias o fosforilables (Schiaffino y Reggiani, 1996). En el músculo esquelético humano
se expresan tres isoformas de MHCs: I (isoforma lenta), IIA y IIX (isoformas rápidas). La
identificación de estas isoformas permite caracterizar, al menos, dos tipos de fibras
musculares: tipo I (fibras lentas) y tipo II (fibras rápidas) (Scott y cols., 2001). Como se
mencionó, existe un reporte que describe una distribución diferencial de los IP3Rs en los
distintos tipos de fibras musculares esqueléticas (Moschella y cols., 1995).
Rol del Ca2+
en la patogenia de la DMD
Observaciones tempranas, incluso previas al descubrimiento de la ausencia de distrofina,
indicaron aumentos del Ca2+
intracelular en fibras musculares distróficas (Bodensteiner y
Engel, 1978; Bertorini y cols., 1982). Posteriormente, estudios en distintas preparaciones de
células musculares deficientes en distrofina han confirmado el hallazgo de la acumulación
intracelular de Ca2+
bajo variadas condiciones. En estos estudios ha quedado establecido que
10
células musculares carentes de distrofina presentan un elevado flujo de entrada de Ca2+
y altas
concentraciones de Ca2+
intracelular, lo que genera efectos dañinos sobre los miocitos (Turner
y cols., 1988; Turner y cols., 1991). Una alteración en la vía de los IP3Rs en miotubos
derivados de ratones mdx, ha sido implicada en un incremento anormal del calcio
subsarcolemal inducido por un estímulo nicotínico (Basset y cols., 2004). Sin embargo, hasta
la fecha son variados los mecanismos propuestos que regularían la homeostasis anormal del
Ca2+
, así como los canales o receptores que operarían el flujo aumentado de Ca2+
(Gailly,
2002; Ruegg y cols., 2002; Constantin y cols., 2006).
Aparentemente, las proteínas involucradas en el acoplamiento excitación-contracción
(subunidades α1, α2 y β del DHPR, RyR tipo 1), así como la isoforma rápida de la Ca2+
-
ATPasa del retículo sarco(endo)plasmático (SERCA1), están expresadas normalmente en el
músculo esquelético deficiente en distrofina (Culligan y cols., 2002). Por otro lado, la cantidad
de IP3Rs así como la masa total de IP3 están aumentadas en una línea celular derivada de
músculo esquelético distrófico de ratones mdx, comparada con líneas celulares derivadas de
músculo esquelético murino normal (Liberona y cols., 1998). Además, la cantidad basal de IP3
está aumentada y el incremento en la masa de IP3 inducido por despolarización es de mayor
duración en una línea celular distrófica humana, comparada con células normales (Liberona y
cols., 1998). En estos modelos las vías de señalización relacionadas con IP3 parecen ser
responsables del aumento del Ca2+
, pero no hay información de cómo estas vías interaccionan
con la distrofina y el DGC. Los procesos de diferenciación y regeneración celular,
probablemente relacionados a las señales de Ca2+
dependientes de IP3 en miocélulas, están
alterados en las distrofias musculares. Asimismo, los perfiles de expresión génica se
encuentran modificados en distrofias (Chen y cols., 2000, Haslett y cols., 2003),
permaneciendo aún poco claros los mecanismos subyacentes a estas alteraciones.
11
Basados en esta evidencia y con el propósito de agregar información que permita relacionar
las alteraciones en la homeostasis intracelular del Ca2+
dependiente de los IP3Rs y la ausencia
de distrofina en músculo esquelético, estudiamos la distribución y localización intracelular de
los tres tipos de IP3Rs en músculo esquelético humano adulto normal y distrófico.
12
HIPÓTESIS
Los IP3Rs presentan una distribución diferencial según el tipo de fibra en el músculo
esquelético normal. Este patrón de distribución está alterado en el músculo esquelético
distrófico.
OBJETIVO GENERAL
Describir los patrones de distribución de los IP3Rs en músculo esquelético humano normal y
distrófico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar mediante inmunofluorescencia la presencia, distribución y localización
intracelular de los tres tipos de IP3Rs en cortes de músculo esquelético humano normal.
2. Determinar mediante inmunofluorescencia la presencia, distribución y localización
intracelular de los tres tipos de IP3Rs en cortes de músculo esquelético distrófico.
3. Comparar la distribución y localización de los IP3Rs entre el músculo esquelético humano
normal y distrófico.
13
MATERIALES Y MÉTODOS
Se realizó una descripción cualitativa de la distribución de los tres tipos de IP3Rs, mediante
inmunofluorescencia, en cortes histológicos de músculo esquelético humano normal y
distrófico. Se evaluó su patrón de distribución en relación a los tipos de fibras musculares,
caracterizados por la identificación inmunohistoquímica de las MHCs I (fibras tipo I, lentas) y
II (fibras tipo II, rápidas), además de su localización intracelular. Se caracterizó el patrón de
distribución en el músculo esquelético normal y se comparó con el músculo distrófico.
Muestras de tejidos
Se obtuvo muestras de tejido muscular esquelético normal (músculos cuádriceps femoral y
sartorio), de tres pacientes adultos voluntarios sometidos a cirugía ortopédica, no relacionada
con miopatías, en el Hospital Clínico Universidad de Chile. El consentimiento informado de
los pacientes fue obtenido mediante un cuestionario previamente aprobado por el Comité de
Ética del Hospital. Las muestras fueron recibidas en pabellón sobre gasa humedecida con
suero fisiológico, mantenida en frío en placa Petri sobre hielo, y transportadas rápidamente (en
menos de 30 min.) al Laboratorio de Fisiología Celular de Músculo, Centro de Estudios
Moleculares de la Célula, Facultad de Medicina. Se las sometió a congelación rápida (30 seg.)
en isopentano enfriado en nitrógeno líquido, de acuerdo a como ha sido descrito previamente
(Dubowitz, 1985; Loughlin, 1993), y fueron almacenadas a -70ºC hasta su uso.
Biopsias de músculo cuádriceps de tres pacientes pediátricos, de entre 6 y 7 años, con el
diagnóstico clínico de DMD y tres controles normales de la misma edad fueron enviadas desde
el Instituto de Investigaciones Neurológicas, Fundación para la Lucha contra las
Enfermedades Neurológicas de la Infancia (FLENI), Buenos Aires, Argentina. Cortes de
14
biopsias de músculo cuádriceps de tres niños entre 6 y 7 años con el diagnóstico de DMD y
tres controles pareados por edad, se obtuvieron desde el Departamento de Anatomía
Patológica, Pontificia Universidad Católica de Chile, Santiago, Chile. El diagnóstico
histopatológico de DMD fue realizado por un patólogo experimentado de cada institución; la
ausencia completa de distrofina fue demostrada por inmunohistoquímica. Las muestras
pediátricas normales y distróficas, de Argentina y Chile, se obtuvieron de archivos de tejidos
congelados, se realizaron cortes en criostato en su lugar de origen y fueron enviadas en
conjuntos de 6 cortes transversales seriados de 10 µm de espesor por caso, adheridos a
portaobjetos, y se las almacenó a -70ºC hasta su uso. Sólo se completó el procesamiento y
análisis de resultados de las muestras procedentes de Argentina (controles, n = 3; casos DMD,
n = 3); no se completó el análisis de las muestras obtenidas en Chile. Es de interés completar
el estudio de estas muestras en una próxima etapa de la investigación, para ampliar el número
de controles y casos, y evaluar una posible influencia de variables preanalíticas (obtención,
conservación y transporte de las muestras) en los resultados.
Reactivos
Los anticuerpos primarios utilizados en el estudio inmunohistoquímico fueron los siguientes:
anticuerpo policlonal producido en conejos dirigido contra un péptido correspondiente a los
residuos 1829-1848 del IP3R tipo 1 humano (1:100, PA1-901; Affinity Bioreagents, Golden,
CO, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos, purificado por afinidad, dirigido
contra los 19 residuos del extremo carboxilo-terminal del IP3R tipo 1 de ratón (1:500, PCD6;
Research Genetics, Huntsville, AL, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en conejos
dirigido contra un péptido del IP3R tipo 1 (1:100, CC1; Department of Physiology, University
of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en cabras
15
dirigido contra un péptido del extremo carboxilo-terminal del IP3R tipo 2 humano (1:25, C-20;
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.); anticuerpo policlonal producido en
conejos dirigido contra un péptido del extremo amino-terminal del IP3R tipo 2 (1:25, CC2N;
Department of Physiology, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, EE.UU.); anticuerpo
policlonal producido en conejos dirigido contra un péptido correspondiente a los aminoácidos
del extremo carboxilo-terminal (CRRQRLGFVDVQNCMSR) del IP3R tipo 3 de rata,
proporcionado por el Dr. G. A. Mignery (1:50, T3NH; Loyola University Chicago, Maywood,
IL, EE.UU.); anticuerpos monoclonales dirigidos contra las MHCs I y II (1:100; Sigma, St.
Louis, MO, EE.UU.). En resumen, se dispuso de tres anticuerpos diferentes para el IP3R tipo 1
(PA1-901, PCD6 y CC1), dos para el IP3R tipo 2 (C-20 y CC2N), y uno para el IP3R tipo 3
(T3NH). Los anticuerpos PA1-901, C-20 y T3NH fueron ampliamente probados en
experimentos de inmunofluorescencia, en miotubos en cultivo primario (Powell y cols., 2001;
Cárdenas y cols., 2005) y músculo adulto de ratón (Powell y cols., 2003). Anticuerpos
conjugados con Alexa 488 dirigidos contra inmunoglobulinas G de conejo y cabra, y
anticuerpo conjugado con Alexa 633 dirigido contra inmunoglobulina G de ratón (1:500;
Molecular Probes, Eugene, OR, EE.UU.), fueron utilizados como anticuerpos secundarios.
Medio de montaje hidrófilo, no adhesivo, preservador de fluorescencia (Vectashield), se
obtuvo de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EE.UU.). Otros reactivos utilizados fueron
de calidad proanálisis.
16
Inmunofluorescencia
El procedimiento inmunohistoquímico se realizó como ha sido descrito previamente (Barbier
y cols., 2004), con algunas modificaciones. Cortes transversales seriados y longitudinales de
músculo adulto normal, de 10 µm de grosor, fueron obtenidos en criostato, adheridos a
portaobjetos limpios y almacenados a -70ºC hasta su uso.
Para el análisis de inmunofluorescencia, los cortes fueron fijados en paraformaldehído al 4%
p/v disuelto en tampón fosfato salino (phosphate-buffered saline, PBS: Na2HPO4 0,1 M,
Na2H2PO4·H2O 0,1 M, NaCl 0,88% p/v, pH 7,3), por 20 min. a temperatura ambiente. Luego
fueron permeabilizados en solución de Triton X-100 al 0,05% v/v en PBS, por 15 min. a
temperatura ambiente. El bloqueo de uniones inespecíficas se realizó incubando los cortes en
albúmina sérica bovina (bovine serum albumin, BSA), disuelta al 1% p/v en PBS (solución
bloqueadora), durante 1 hora a temperatura ambiente. Los cortes fueron incubados toda la
noche a 4ºC con los anticuerpos primarios diluidos en solución bloqueadora. Para
experimentos de doble marcaje, los dos anticuerpos primarios fueron mezclados juntos y
utilizados como se describió más arriba. Luego de tres lavados con PBS de 5 min. cada uno, se
realizó la incubación con los anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos en solución
bloqueadora, por 1 hora a temperatura ambiente. Se lavó los cortes con PBS, tres veces por 5
min., fueron montados en Vectashield y sellados para su examen microscópico. Se llevó
controles negativos paralelos incubando cortes con los anticuerpos secundarios en ausencia de
los anticuerpos primarios, en su lugar se usó solución bloqueadora.
17
Examen microscópico y adquisición de imágenes
El examen microscópico y la adquisición de imágenes se realizó en un microscopio láser
confocal Carl Zeiss LSM 5 3.2, Axiovert 200 (Carl Zeiss, Jena, Alemania), usando el software
de captura y análisis de imágenes Pascal 5. Se utilizó el láser argón de 488 nm y el láser helio-
neón de 633 nm para excitar los fluoróforos Alexa 488 y Alexa 633 respectivamente.
Imágenes de experimentos de doble marcaje fueron adquiridas en el modo multicanal. En el
canal 1 se registró la fluorescencia de Alexa 488, con longitudes de excitación/emisión
(λexc/λem) = 488/505-530 nm, y en el canal 2 se registró el Alexa 633, λexc/λem = 635/>650
nm. Imágenes de experimentos en que se aplicó sólo un anticuerpo por corte fueron capturadas
en el modo de canal único. Se aseguró que la intensidad de la fluorescencia (I) adquirida no
estuviera saturada y que el fondo de la imagen fuera ligeramente superior a cero. Para eso se
ajustó la potencia del láser, la ganancia del detector y el offset (punto de calibración de I). Con
el objetivo de comparar las imágenes obtenidas se mantuvieron constantes las siguientes
variables: potencia del láser, ganancia del detector, grosor óptico y ajuste de brillo/contraste.
Análisis de cuantificación de fluorescencia
Cortes transversales seriados de músculo cuádriceps normal, fueron inmunomarcados con
anticuerpo dirigido contra el IP3R tipo 1 (PCD6), se utilizó un anticuerpo secundario
conjugado con Alexa 488. Series de imágenes confocales fueron adquiridas en el microscopio
descrito, utilizando un objetivo Plan-Neofluar 40x/1.3 Oil DIC. Las series de imágenes fueron
capturadas en el modo de canal único (Alexa 488), λexc/λem = 488/505-530 nm. Se obtuvo
series de 10 cortes de 0,3 μm de grosor, para deconvolucionar las imágenes. Las imágenes
fueron deconvolucionadas con el programa Huygens Scripting (Scientific Volume Imaging,
18
Hilversum, Holanda). El procesamiento de imágenes se realizó sobre la base del Interactive
Data Language, IDL (ITT, CO, EE.UU.), perteneciente al Laboratorio de Análisis de
Imágenes Científicas, ICBM (www.scian.cl). Se delimitaron los bordes de las fibras
musculares mediante segmentación manual, utilizando como molde la imagen de luz
trasmitida, excluyendo los espacios intercelulares y núcleos. Se midió la intensidad de
fluorescencia del citoplasma de las fibras y el valor se dividió por la superficie respectiva
(I/μm2), para normalizar la fluorescencia por área. Se comparó la diferencia de intensidad de
fluorescencia citoplasmática entre fibras tipos I y II (identificadas con anticuerpos para MHC I
y II). Los resultados, expresados como promedio ± error estándar (E.E.), fueron analizados
utilizando la prueba t de Student para datos pareados, considerando un valor de p < 0,01 como
estadísticamente significativo.
19
RESULTADOS
Como se indicó en Materiales y Métodos, se contó con tres anticuerpos diferentes para el IP3R
tipo 1 (PA1-901, PCD6 y CC1), dos para el IP3R tipo 2 (C-20 y CC2N), y uno para el IP3R
tipo 3 (T3NH). Se utilizó distintos anticuerpos, porque los anticuerpos disponibles para los
IP3Rs, especialmente los comerciales, son de difícil manejo, pudiendo en no pocas ocasiones
ser dificultosa la obtención de las inmunotinciones. Esto es particularmente válido para el
anticuerpo C-20 (Santa Cruz Biotechnology), que generó las mayores dificultades para su
estandarización. Idealmente, todas las muestras de que se dispuso podrían haber sido probadas
con todos los anticuerpos disponibles, aunque esto no se realizó, se probó cada tipo de IP3R
con alguno de los anticuerpos disponibles en todas las muestras, tanto adulto y niño control,
como distrófico.
Distribución y localización intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en músculo
esquelético humano normal
La presencia, distribución y localización intracelular de las tres isoformas de los IP3Rs, fue
investigada mediante inmunofluorescencia indirecta y examen con microscopia confocal en
criocortes de músculo esquelético humano normal, de niños y adultos, utilizando anticuerpos
específicos dirigidos contra los tipos 1, 2 y 3 de los IP3Rs.
Cortes transversales seriados de músculo cuádriceps obtenido de un sujeto adulto control,
fueron inmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra el IP3R tipo 1 (PCD6), y las MHCs I
y II. La Figura 1 muestra que el IP3R tipo 1 está presente en músculo esquelético humano
normal, en un patrón de distribución diferencial del tipo “mosaico” o “tablero de ajedrez”, con
un predominio de la marca en las fibras musculares de tipo II. Se observa una marca intensa en
20
todas las fibras de tipo II, positivas para MHC II, y una marca débil en las fibras de tipo I,
positivas para MHC I. El IP3R tipo 1 presenta una localización citoplasmática en fibras tipo II,
organizado en un patrón “moteado” o “punteado”. Además, el IP3R tipo 1 se localiza en
estructuras situadas en la periferia de las fibras musculares, tanto las de tipo I como las de tipo
II, que podrían corresponder a núcleos celulares. En adelante, se identificará los tipos de fibras
musculares con uno u otro anticuerpo para las MHCs. En el músculo normal estos anticuerpos
discriminan completamente ambos tipos de fibras, en los tejidos normales estudiados no se
identificaron fibras que fueran positivas para ambos anticuerpos simultáneamente.
La Figura 2 muestra una serie de cortes transversales de músculo sartorio de un adulto control,
teñidos con los mismos anticuerpos de la figura 1 contra el IP3R tipo 1 (PCD6) y MHC II, con
el objetivo de evaluar el patrón descrito en un músculo alternativo. Se observa un patrón
similar de distribución y localización intracelular del IP3R tipo 1, al observado en cortes de
cuádriceps. Igualmente, todas las fibras tipo II expresan intensamente el IP3R tipo 1 en su
citoplasma.
Para objetivar la expresión diferencial del IP3R tipo 1 entre fibras tipo I y II, se realizó un
análisis de cuantificación de intensidad de la fluorescencia citoplasmática en cortes
transversales de músculo cuádriceps normal, inmunomarcados para el IP3R tipo 1 (PCD6). En
la Figura 3 se grafican los resultados de este análisis. Se cuantificó un total de 102 fibras
musculares, 47 fibras tipo I y 55 fibras tipo II, según se detalló en Materiales y Métodos. La
intensidad de fluorescencia, expresada en unidades arbitrarias por área (I/m2), fue en
promedio de 1,32 en fibras tipo I (E.E. = 0,034) y de 4,8 en fibras tipo II (E.E. = 0,142). La
intensidad de la fluorescencia citoplasmática del IP3R tipo 1 fue 2,63 veces mayor en las fibras
21
de tipo II que en las de tipo I, correspondiente a una diferencia de 72,5%, que fue
estadísticamente significativa.
En la Figura 4 se presenta una serie de cortes transversales de músculo cuádriceps de un
control adulto, en que se realizó doble marcaje con anticuerpos dirigidos contra el IP3R tipo 1
(CC1, distinto al de las figuras 1 y 2), o el IP3R tipo 2 (CC2N), y un anticuerpo contra la MHC
I. El patrón de distribución del IP3R tipo 1 es similar al descrito con el anticuerpo PCD6
(mosaico en fibras tipo II, localización citoplasmática en patrón moteado, además de
localización en la periferia de las fibras). El IP3R tipo 2 se expresa en músculo cuádriceps,
también en un patrón de distribución diferencial predominante en las fibras tipo II, pero
aparentemente presenta una mayor marca relativa en las fibras tipo I, comparado con el IP3R
tipo 1. Su localización intracelular es citoplasmática, dispuesto en un patrón moteado similar
al IP3R tipo 1. Pero a diferencia de éste, el IP3R tipo 2 no presenta una clara localización en la
periferia de las fibras.
La Figura 5 muestra un análisis de co-tinción de los IP3Rs tipos 1 y 3, con los anticuerpos
PA1-901 y T3NH, y la MHC I, en criocortes de músculo sartorio de un control adulto. Se
observa el mismo patrón de distribución ya descrito para el IP3R tipo 1. El IP3R tipo 3 también
está presente en músculo sartorio, principalmente en las fibras tipo II. Presentó una
localización citoplasmática, organizado en un patrón más homogéneo que los otros tipos de
IP3Rs. Similar al IP3R tipo 1, presentó localización periférica, posiblemente nuclear, en ambos
tipos de fibras.
Se evaluó la distribución de los IP3Rs tipos 1, 2 y 3 en músculo esquelético de tres niños
normales, controles de las muestras de músculo distrófico. En la Figura 6 se muestra una
imagen representativa de los tres controles estudiados. En los paneles A-C se observan cortes
seriados de músculo cuádriceps de un niño control de 7 años, en los que se realizó co-
22
inmunotinción con los anticuerpos dirigidos contra los IP3Rs tipo 1 (PA1-901) y tipo 2 (C-20),
y anticuerpo contra la MHC II. En los paneles D y E se observa un área distinta de la misma
serie, marcada con anticuerpos para el IP3R tipo 3 (T3NH) y la MHC II. La Figura muestra
que los tres tipos de IP3Rs están presentes en músculo esquelético de niños control. La marca
de los IP3Rs se presenta en todas las fibras musculares, siendo más intensa en las fibras de tipo
II, positivas para MHC II. Los tres tipos de IP3Rs se distribuyen en un patrón diferencial del
tipo “mosaico” o “tablero de ajedrez”, con un predominio de la marca en las fibras musculares
de tipo II. Los tres tipos de IP3Rs presentan una localización citoplasmática en fibras tipo II,
en un patrón “moteado” o “punteado”. En la periferia de las fibras, para los IP3Rs tipos 1 y 3,
se identifica marca en estructuras que podrían corresponder a los núcleos celulares. En cortes
de músculo de niños control teñidos con anticuerpos para los IP3Rs y la MHC I, se observó
marca para los tres tipos de receptores, de mayor intensidad en las fibras tipo II, que no se
tiñeron con el anticuerpo para las MHC I (datos no mostrados).
En resumen, la inmunofluorescencia de los IP3Rs en cortes transversales mostró las tres
isoformas en músculo esquelético humano normal, de adultos y niños, presentándose en un
patrón de distribución de mosaico, con un predominio de la marca en las fibras musculares de
tipo II, las que fueron identificadas por presentar tinción positiva con anticuerpos dirigidos
contra la MHC II y ausencia de coloración con anticuerpos dirigidos contra la MHC I. Los tres
tipos de IP3Rs presentaron una localización intracelular en el citoplasma de las fibras
musculares, mostrando una potente marca en las fibras de tipo II y una marca débil, pero no
ausente, en las fibras de tipo I. La marca citoplasmática para los IP3Rs tipos 1 y 2 se distribuyó
en un patrón granular. El IP3R tipo 3 presentó un patrón de localización citoplasmática más
homogéneo que las otras dos isoformas. Los IP3Rs tipos 1 y 3 también se localizaron sobre
estructuras ubicadas en la periferia de las fibras musculares, que pudieran corresponder a
23
núcleos celulares. Esta marca periférica se distribuye en ambos tipos de fibras musculares. El
IP3R tipo 2 no mostró una localización periférica evidente.
La localización intracelular de los IP3Rs también fue evaluada mediante inmunomarcaje de
cortes longitudinales de músculo sartorio de un adulto control, con los anticuerpos PA1-901,
C-20 y T3NH. En la Figura 7 se observa que los tres tipos de IP3Rs desplegaron un patrón
estriado de localización intracelular, altamente sugerente del aspecto del retículo
sarcoplasmático. Los IP3Rs tipos 1 y 3 presentaron una localización periférica, compatible con
la localización de los núcleos celulares. Esta localización periférica no fue tan clara para el
IP3R tipo 2.
Distribución y localización intracelular de las isoformas 1, 2 y 3 de los IP3Rs en músculo
esquelético humano distrófico
Se estudió la presencia, distribución y localización intracelular de las tres isoformas de los
IP3Rs, mediante inmunofluorescencia indirecta y examen con microscopia confocal, en
criocortes de músculo esquelético de niños con distrofia muscular de Duchenne, utilizando los
anticuerpos PA1-901, C-20 y T3NH, específicos contra los tipos 1, 2 y 3 de los IP3Rs
respectivamente, los mismos anticuerpos utilizados en los niños control. Se realizó ensayos de
doble inmunomarcaje con anticuerpos dirigidos contra la MHC I.
Se estudió tres casos distróficos con anticuerpos para los tres tipos de IP3Rs y MHC I. En la
Figura 8 se muestran imágenes representativas de cortes de músculo cuádriceps de los tres
casos. Cada tipo de IP3R se muestra en un corte de cada caso. Las alteraciones distróficas se
evidencian por la desorganización arquitectural del tejido: gran variabilidad en el diámetro de
las fibras, de bordes redondeados, y aumento del espacio interfibrilar, correspondiente a tejido
conjuntivo endomisial aumentado. La coloración para MHC I mostró una población
24
heterogénea de fibras musculares, con áreas en que no fue posible identificar los tipos de
fibras. Las imágenes seleccionadas corresponden a regiones donde se logró identificar
claramente dos poblaciones de fibras, tipo I y tipo II. En estas áreas en que se preservó el
patrón en mosaico de la MHC I, se observa que la distribución de la marca de las tres
isoformas de IP3Rs no muestra el patrón diferencial asociado al tipo de fibra identificado en el
músculo esquelético normal. En el músculo distrófico, la marca para los tres tipos de IP3Rs se
distribuyó de manera similar en ambos tipos de fibras. Se mantiene la localización intracelular
de los IP3Rs comparada con el músculo normal, las tres isoformas se localizan en el
citoplasma, IP3Rs tipos 1 y 2 con un patrón moteado, IP3R tipo 3 con una distribución más
homogénea. Los IP3Rs tipos 1 y 3 también presentan una localización en la periferia de las
fibras.
25
Figura 1. Distribución del IP3R tipo 1 en
músculo esquelético normal. Cortes seriados
de músculo cuádriceps de un sujeto adulto
control, inmunoteñidos con anticuerpos
dirigidos contra MHC II (A), IP3R tipo 1 (B) y
MHC I (C). I: fibra tipo I (lenta), II: fibra tipo
II (rápida). Asteriscos (*) indican la misma
fibra muscular en cada corte. Puntas de flecha
() indican sitios de localización periférica,
probablemente nuclear. Barra en B: 50 m.
26
Figura 2. Distribución del IP3R tipo 1 en músculo esquelético normal. Cortes seriados de
músculo sartorio de un sujeto adulto control, inmunoteñidos con anticuerpos dirigidos contra
el IP3R tipo 1 (A) y MHC II (B). I: fibra tipo I (lenta), II: fibra tipo II (rápida). Asteriscos (*)
indican la misma fibra muscular en cada corte. Flechas () indican sitios de localización
periférica, probablemente nuclear. Barra en B: 100 m.
27
Figura 3. Cuantificación de intensidad de la fluorescencia citoplasmática del IP3R tipo 1.
La intensidad de la fluorescencia citoplasmática normalizada por área (I/μm2) del IP3R tipo 1
es 2,63 veces mayor en las fibras tipo II que en las tipo I, correspondiente a una diferencia de
72,5%. Se cuantificó un total de 102 fibras musculares, 47 fibras tipo I y 55 fibras tipo II.
* p < 0,01. Valores corresponden a promedios ± E.E.
28
Figura 4. Distribución de los IP3Rs tipos 1 y
2 en músculo esquelético normal. Cortes
seriados de músculo cuádriceps de un sujeto
adulto control, comarcados con anticuerpos
dirigidos contra IP3R tipo 1 (A), IP3R tipo 2
(B) y MHC I (C). I: fibra tipo I (lenta), II:
fibra tipo II (rápida). Asteriscos (*) indican la
misma fibra muscular en cada corte. Puntas de
flecha () indican sitios de localización
periférica, probablemente nuclear. Barra en C:
50 m.
29
Figura 5. Distribución de los IP3Rs tipos 1 y 3 en músculo esquelético normal. Criocortes
de músculo sartorio de un adulto control comarcados con anticuerpos dirigidos contra MHC I
(A y D), IP3R tipo 1 (B) o IP3R tipo 3 (E). C: superposición de los paneles A y B. F:
superposición de los paneles D y E. Puntas de flecha () indican sitios de localización
periférica, probablemente nuclear. Barra en F: 50 μm.
30
Figura 6. Distribución de los IP3Rs tipos 1 y 2 en músculo esquelético pediátrico normal.
Cortes seriados de músculo cuádriceps de un niño normal de 7 años comarcados con
anticuerpos dirigidos contra MHC II (A, D), IP3R tipo 1 (B), IP3R tipo 2 (C) e IP3R tipo 3 (E).
Asteriscos () indican la misma fibra muscular en paneles A-C. En paneles D y E se delimitó
las fibras tipo II, que presentan una marca más intensa para el IP3R tipo 3. Barra en E: 50 μm.
31
Figura 7. Localización intracelular de los IP3Rs en cortes longitudinales de músculo
esquelético normal. Cortes longitudinales de músculo sartorio de un adulto normal
inmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra los IP3Rs tipos 1 (A), 2 (B) y 3 (C). Flechas
() indican estructuras compatibles con núcleos celulares. Barra en C: 10 μm.
32
Figura 8. Distribución de los IP3Rs en músculo esquelético de pacientes con distrofia
muscular de Duchenne. Criocortes de músculo cuádriceps de tres niños con distrofia co-
inmunomarcados con anticuerpos dirigidos contra MHC I (A, D y G), y los IP3Rs tipo 1 (B),
tipo 2 (E) y tipo 3 (H). C, F e I: superposición de paneles de la izquierda. Asteriscos ()
indican fibras musculares positivas para MHC I, pero negativas para IP3R. Cruces (+) indican
fibras musculares positivas tanto para MHC I, como para IP3R. Barra en I: 50 μm.
*
* *
* * *
* * *
33
DISCUSIÓN
Los IP3Rs presentan una distribución diferencial en el músculo esquelético humano
normal
En este estudio hemos reportado, utilizando inmunofluorescencia, que los tres tipos de IP3Rs
están abundantemente expresados en músculo esquelético humano. Las tres isoformas de
IP3Rs se distribuyen de una manera organizada tanto en el nivel tisular, como celular. La
distribución tisular de los IP3Rs está diferenciada según el tipo de fibra muscular, las tres
isoformas de receptores se expresan preferentemente en las fibras tipo II. Todas las fibras
musculares tipo II, identificadas por la presencia de MHC II, expresan las tres isoformas de
IP3Rs. En cuanto a la localización intracelular, los tres tipos de IP3Rs fueron identificados en
el citoplasma de las fibras musculares, en un patrón que sugiere una ubicación en el retículo
sarcoplasmático. Además, los IP3Rs tipos 1 y 3 presentan una localización en la periferia de
las fibras musculares, compatible con las regiones de los núcleos celulares.
La localización intracelular de los IP3Rs quedó planteada en términos de sugerencia, puesto
que se propone por ubicación y morfología de las marcas, pero no se confirmó realizando
análisis de colocalización con marcadores específicos de las estructuras celulares propuestas.
La probable localización nuclear de los IP3Rs pudo ser mostrada utilizando una contratinción
fluorescente del DNA nuclear con, por ejemplo, DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol) o
Hoechst 33342. Mostrada la localización nuclear, el análisis de colocalización de los IP3Rs
con un marcador específico de la membrana interna de la envoltura nuclear, como LAP2
(lamin-associated polypeptide 2), entregaría información si estos se ubican en envoltura
nuclear o nucleoplasma. Para identificar la proporción de la probable localización nuclear que
corresponde a mionúcleos o núcleos de células satélites, se debe utilizar algún marcador
34
específico de estas últimas, como la proteína PAX7. La probable localización citoplasmática
de los IP3Rs en el retículo sarcoplasmático, sugerida por los patrones citoplasmáticos
identificados tanto en cortes transversales (moteado) como longitudinales (estriado), también
debe ser confirmada por ensayos de colocalización con marcadores específicos de este
organelo, por ejemplo, SERCA1 o calreticulina (proteína tampón de Ca2+
localizada al interior
de las cisternas del retículo). Eventualmente, podría avanzarse en la localización subcelular de
los IP3Rs, en cortes longitudinales o fibras aisladas, con marcadores específicos de estructuras
organizadas en un patrón estriado, como se ha descrito en cultivos primarios y en músculo de
ratón: línea Z (desmina, α-actinina), banda A (MyHCs), cisternas terminales del retículo
(SERCA1), tríadas (subunidad α1 del DHPR, RyR). En forma preliminar, se utilizó los
marcadores LAP2, calreticulina y α-actinina para confirmar la localización intracelular de los
IP3Rs, pero los datos disponibles aún no son concluyentes. Al menos, es necesario mostrar la
localización en retículo sarcoplasmático y núcleos con ensayos de colocalización, lo que
deberá realizarse en una etapa próxima de la investigación.
Hasta la fecha no se han publicado reportes que describan la distribución de los IP3Rs en
músculo esquelético humano adulto. La presencia de los IP3Rs en músculo esquelético
humano normal fue descrita en la línea celular RCMH, originada de músculo cuádriceps de un
donante adulto, mediante ensayos de unión de 3H-IP3 (Liberona y cols., 1997). Reportes de la
localización de los IP3Rs en músculo esquelético adulto han sido realizados en rata (Moschella
y cols., 1995) y ratón (Salanova y cols., 2002; Powell y cols., 2003). Moschella y cols. (1995)
describieron mediante inmunohistoquímica, utilizando un anticuerpo policlonal purificado por
afinidad que reconocería las tres isoformas de IP3Rs, la distribución diferencial de los IP3Rs en
fibras musculares esqueléticas tipos I (lentas, oxidativas) y IIA (rápidas, oxidativo-glicolíticas)
de rata. Además, mediante ensayos de unión de 3H-IP3 observaron una mayor cantidad de
35
IP3Rs en un músculo lento comparado con uno rápido. En músculo esquelético de ratón no ha
sido descrita la distribución de los IP3Rs con relación a los tipos de fibras musculares.
Salanova y cols. (2002), en cortes longitudinales de músculo esquelético de ratón, describieron
la localización de los IP3Rs en un patrón estriado coincidente con las líneas Z, que
correspondería a retículo sarcoplasmático, similar a lo descrito previamente en miotubos
(Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols., 2001). También en músculo esquelético de ratón,
Powell y cols. (2003) describieron que el IP3R tipo 1 se localiza en el citoplasma de las fibras,
en estriaciones que se corresponden con las líneas Z. Además, el IP3R tipo 1 se identificó en
las células satélites y en componentes postsinápticos de las uniones neuromusculares.
Por otro lado, la localización de las tres isoformas de IP3Rs ha sido ampliamente descrita en
células musculares esqueléticas en cultivo primario (Jaimovich y cols., 2000; Powell y cols.,
2001; Cárdenas y cols., 2005), como fue indicado en la Introducción. Recientemente se ha
mostrado la localización intracelular de los tres tipos de IP3Rs en células RCMH (Cárdenas y
cols., 2008). El IP3R tipo 1 presentó una fuerte marca perinuclear, en un patrón longitudinal; el
IP3R tipo 2 se localizó en la envoltura nuclear y en algunas estriaciones perinucleares, y el
IP3R tipo 3 se concentró en el núcleo, con una marca débil y difusa en el citoplasma. La
localización intracelular sugerida en el presente trabajo es concordante con estos reportes
previos. La distribución diferencial de los IP3Rs en el músculo normal quedó bien establecida
en esta investigación y permite proponer una hipótesis explicativa funcional para este patrón
de distribución, que se desarrolla a continuación.
En modelos celulares de músculo esquelético, se ha establecido que los IP3Rs participan en la
generación de señales de Ca2+
gatilladas por despolarización de la membrana plasmática, que
están asociadas con la expresión génica. Las señales intracelulares de Ca2+
originadas en los
IP3Rs regulan los factores de transcripción CREB (cAMP/Ca2+
-response element-binding
36
protein; Powell y cols., 2001; Carrasco y cols., 2003; Cárdenas y cols., 2004 y 2005), AP-1
(activator protein-1) y NF-κB (nuclear factor κB; Juretić y cols., 2006; Valdés y cols., 2007).
La activación de CREB es inducida a través de proteína quinasa Cα (PKCα; Cárdenas y cols.,
2004). Al mismo tiempo, las señales de Ca2+
dependientes de IP3 están involucradas en la
activación transcripcional de los genes tempranos c-fos, c-jun y egr-1 (Araya y cols., 2003;
Carrasco y cols., 2003), y regulan la expresión génica de IL-6 y troponina I (Juretić y cols.,
2006 y 2007). Además, la señal lenta de Ca2+
induce la activación de las MAPK ERK1/2
(mitogen-activated protein kinase, extracellular signal-regulated kinase 1/2; Powell y cols.,
2001; Carrasco y cols., 2003; Cárdenas y cols., 2004), que tienen un rol como reguladores
transcripcionales en programas de plasticidad celular (Schiaffino y cols., 2007).
Recientemente, se ha descrito la señal lenta de Ca2+
y la activación de ERK1/2 asociada a ella
en la línea celular humana RCMH (Cárdenas y cols., 2008).
El músculo esquelético adulto está compuesto de múltiples tipos de fibras que difieren en sus
capacidades de contracción y formas predominantes de metabolismo energético. La frecuencia
relativa de cada tipo de fibra en un músculo define sus capacidades funcionales globales. En
respuesta a una variedad de estímulos ambientales, los músculos modifican sus características
funcionales cambiando sus tipos de fibras, este es el fenómeno de plasticidad celular (Pette y
Staron, 2001; Bassel-Duby y Olson, 2006; Schiaffino y cols., 2007). El músculo esquelético es
un tejido altamente plástico, pero los mecanismos moleculares responsables de la
diversificación de fibras permanecen poco claros. El perfil de tipos de fibras y la expresión
génica muscular son controlados por la actividad nerviosa, a través de la modulación de vías
de señalización específicas, como las asociadas a las señales intracelulares de Ca2+
(Bassel-
Duby y Olson, 2006; Schiaffino y cols., 2007).
37
En este contexto, se ha descrito en un modelo de fibras musculares de ave en cultivo primario,
que el IP3R tipo 1 es más abundante en fibras rápidas que lentas, que el bloqueo de su
actividad por inhibidores selectivos induce la expresión de una isoforma lenta de MHC en
fibras rápidas y la transición del tipo de fibra, de rápido a lento (Jordan y cols., 2005). En el
mismo modelo celular, se reportó que la sobrexpresión de PKCα reprimió la expresión de
MHC lenta y la inhibición de PKCα indujo la expresión de MHC lenta (DiMario, 2001).
La actividad de la fosfata regulada por Ca2+
calcineurina ha sido asociada al mantenimiento de
un fenotipo lento en fibras musculares esqueléticas (Schiaffino y Serrano, 2002). En miotubos
de rata en cultivo primario, se mostró que la activación del factor de transcripción NFAT
(nuclear factor of activated T cells), efector final de la vía de señalización de calcineurina, no
está asociada a la regulación por señales de Ca2+
dependientes de IP3 (Valdés y cols., 2008).
No obstante, en este mismo modelo celular, se observó que la expresión de troponina I,
esquelética lenta 1, proteína sarcomérica de fenotipo lento, es regulada por la señal de Ca2+
generada por los IP3Rs (Juretić y cols., 2007).
Por otro lado, recientemente se ha reportado una expresión diferencial de ERK1/2 en fibras
musculares esqueléticas de ratón y rata, siendo más abundantes en fibras tipo II. ERK1/2
activadas son necesarias para preservar el fenotipo de fibra rápida y reprimir el fenotipo lento.
La activación de ERK1/2 estimuló la expresión de genes de un programa rápido y su
inhibición indujo el fenotipo de fibra lenta (Shi y cols., 2008). La activación de ERK1/2 en
músculo esquelético está asociada a la señal lenta de Ca2+
dependiente de IP3, como se expuso
anteriormente.
Esta evidencia en su conjunto sugiere una participación de las señales de Ca2+
generadas por
los IP3Rs en la modulación de la expresión génica asociada a la plasticidad muscular,
probablemente regulando la expresión de un programa transcripcional de fibra rápida. La
38
distribución diferencial de los IP3Rs en distintos tipos de fibras musculares esqueléticas, en el
caso del músculo humano en fibras tipo II, permite sostener la hipótesis que pueden existir
diferentes cinéticas de la señal lenta de Ca2+
en los distintos tipos de fibras. En fibras
musculares esqueléticas adultas de ratón también se ha descrito la señal lenta de Ca2+
dependiente de IP3 gatillada por estímulo eléctrico y una distribución diferencial del IP3R tipo
1, preferentemente en una subpoblación de fibras tipo II (Casas y Jaimovich, 2008). Las
probables cinéticas diversas de las señales de Ca2+
mediadas por los IP3Rs, podrían tener un
rol en la expresión de programas transcripcionales específicos relacionados con la
diferenciación del tipo de fibra muscular.
La distribución diferencial de los IP3Rs se pierde en el músculo esquelético distrófico
La expresión de las MHCs no es alterada por la distrofia, por lo que la conservación del patrón
en mosaico de la expresión de miosina lenta (MHC I), en áreas mayoritarias de los tejidos
distróficos, se interpretó como indicador del buen estado de conservación de los tejidos, así
como marcador de preservación de la identidad celular de las fibras musculares. Las áreas en
que no se observó el patrón en mosaico de la MCH I corresponderían a focos de fibras
degenerativas y necróticas, sobre las que se produce un depósito artefactual de anticuerpos, y
focos de fibras regenerativas, caracterizadas por su pequeño diámetro, con núcleo grande
central. Esta población de fibras regenerativas, que no se consideró para el análisis de
distribución de los IP3Rs en los casos distróficos (sólo se consideró áreas en que se conservó el
mosaico de la miosina), podría expresar tanto MHC I como MHC II, característica que no fue
evaluada, y este aspecto debe estudiarse con el uso de anticuerpos tanto para MHC I como
MHC II. Asociada, podría realizarse una caracterización más precisa de esta población celular
con, por ejemplo, marcadores de células satélites activadas, como el factor de transcripción
39
miogénico MyoD. En cortes de músculo distrófico distróficos se probó algunos anticuerpos de
distribución conocida, como LAP2 (región de la envoltura nuclear) y α-actinina (líneas Z,
patrón punteado grueso en corte transversal y estriado en corte longitudinal), observándose
marca con ambos anticuerpos en los patrones esperados. Estos dos marcadores, junto a la
miosina, dan cuenta de una buena conservación de los tejidos y que la alteración de la
expresión génica asociada a la distrofia pudiera no ser tan grave ni generalizada, al menos no
para afectar la expresión de estos marcadores en particular. Otros marcadores cuya
distribución no es afectada por la enfermedad y que pudieron utilizarse son mioglobina y
desmina, que darían cuenta del fenotipo muscular esquelético conservado, de la viabilidad del
tejido, y permitirían comparar con el músculo normal.
En músculo esquelético de pacientes con distrofia muscular de Duchenne, observamos una
pérdida de la distribución diferencial de los IP3Rs observada en el músculo normal. Esta
pérdida del patrón normal de distribución podría ser tanto causa como consecuencia de la
distrofia, y las alteraciones en la expresión génica y en la arquitectura celular que genera. La
aproximación experimental utilizada en esta investigación no permite resolver esta
interrogante. Pero sí permite comentar que la modificación observada en la distribución de los
IP3Rs pudiera no deberse a una mala conservación del tejido o una alteración extensa de la
expresión proteica del músculo.
Alternativamente, la alteración en la distribución de los IP3Rs pudiera tener un rol patogénico,
mediado por una desregulación de las señales de Ca2+
dependientes de IP3 y la consiguiente
alteración en la expresión génica modulada por estas señales. Existe alguna evidencia que
permitiría construir una hipótesis orientada en este sentido.
En la línea celular RCDMD, derivada de músculo cuádriceps de un niño con distrofia
muscular de Duchenne (Caviedes y cols., 1994), los niveles basales de IP3 están aumentados y
40
el incremento en la masa de IP3 inducido por despolarización es de mayor duración,
comparada con su contraparte normal RCMH. Además, la cantidad de IP3Rs, medida por la
unión específica de 3H-IP3, y la masa de IP3 son mayores en células distróficas de ratón
comparadas con células normales (Liberona y cols., 1998). En células RCDMD se ha descrito
últimamente una serie de alteraciones en los IP3Rs y los eventos regulados por las señales de
Ca2+
dependientes de IP3, comparadas con células RCMH (Cárdenas y cols., 2008). La
expresión de IP3Rs se encuentra alterada, con un incremento del IP3R tipo 2 y una disminución
del IP3R tipo 3. También se modifica la localización de los IP3Rs: el tipo 1 cambia del
perinuclear/retículo sarcoplasmático al núcleo (envoltura nuclear y nucleoplasma), IP3R tipo 2
aparece sobrexpresado y localizado en el nucleoplasma, e IP3R tipo 3 cambia del núcleo al
retículo sarcoplasmático. La señal de Ca2+
dependiente de IP3, gatillada por estímulo eléctrico,
es más rápida y de mayor amplitud en células RCDMD. La activación de ERK1/2 observada
en células RCMH no se produce en células RCDMD. Finalmente, el perfil global de expresión
génica inducida por despolarización está alterado en la línea celular distrófica.
No ha sido descrita una relación directa entre los IP3Rs y la distrofina, sin embargo, se ha
reportado que la transfección de minidistrofina (una forma truncada de la proteína distrofina)
modula las señales de Ca2+
dependientes de IP3. La despolarización de la membrana
plasmática induce señales de Ca2+
, dependientes de IP3 y proteína G, de mayor amplitud en
células distróficas que en células transfectadas con minidistrofina (Balghi y cols., 2006a).
Además, la cantidad de sitios de liberación de Ca2+
intracelular en reposo es mayor en células
distróficas comparadas con células que expresan minidistrofina. El número de estos sitios de
liberación se redujo al inhibir la vía del IP3 (Balghi y cols., 2006b). Estos datos dan cuenta de
una sobre-regulación de las señales de Ca2+
mediadas por IP3Rs en células distróficas, tanto en
reposo como bajo estimulación, y de un efecto inhibitorio de la minidistrofina sobre ellas.
41
La liberación de Ca2+
desde el retículo sarcoplasmático y las señales de Ca2+
generadas en los
IP3Rs podrían tener un rol central en la desregulación del Ca2+
intracelular, descrita como
evento patogénico fundamental en la distrofia muscular de Duchenne. Se ha propuesto que la
distrofina constituye la base de un complejo andamiaje molecular y de señalización en que
están insertos los canales de Ca2+
. La ausencia de distrofina generaría la pérdida de esta
asociación molecular y la alteración en la homeostasis del Ca2+
(Constantin y cols., 2006). La
pérdida del patrón de distribución normal de los IP3Rs en el músculo distrófico y las
modificaciones descritas en las células RCDMD, sugieren que las alteraciones de las señales
de Ca2+
dependientes de IP3 y de la expresión génica modulada por ellas participarían en la
patogenia de la enfermedad.
42
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