Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Discentes: Lilian Campos Pires Marina Curado Valsechi

Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise

Discentes: Lilian Campos Pires Marina Curado Valsechi

Sistema Imune: Reações antígeno-

anticorpo

Células e tecidos

Reações químicas

Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico

localiza o antígeno tecidual

Conjugação de distintos marcadores, com moléculas de imunoglobulina, que com auxílio de um substrato específico

localiza o antígeno tecidual

Conjunto de métodos de detecção de antígenos em corte histológico

Processo de fixação

Detecção de estruturas bioquímicas;

Localização de antígenos em células utilizando anticorpos específicos;

Produto da reação é visível ao microscópio;

Antígeno: qualquer substância que sob condições apropriadas é capaz de estimular a formação de anticorpos.

Anticorpo: proteína que é formada em resposta à exposição de um antígeno e reage especificamente com esse formando imunocomplexos.

Determinante antigênico, o sítio exato de ligação do anticorpo na molécula do antígeno

Epítopo

Sítio de Ligação ao antígeno

Único clone de célula produtora de anticorpos

Possuem sítios de ligação ao antígeno idênticos

MonoclonalMonoclonal PoliclonalPoliclonal

Múltiplos clones de célula produtora de anticorpos

Possuem diversas especificidade antigênicas

Reconhecimento do antígeno pelo anticorpo

Substâncias são utilizadas para “tingirem” essa ligação

Mecanismo Básico

Métodos utilizados para marcar anticorpos:

Conjugação com composto fluorescente;

Conjugação com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que dispensa elétrons (ouro ou prata);

Conjugação com uma enzima;

Peroxidase

Px + H2O2 Px. H2O2 + doador de elétrons (cromogênico)

Molécula colorida + Px + H2O

Cromógeno, mas o mais utilizado é o diaminobenzidina (DAB):

Específico para Peroxidase;

Origina um precipitado marrom, visível ao microscópio óptico;

Carcinoma ductal

Direto

Anticorpo primário é marcado diretamente por

uma enzima

Indireto

Anticorpo primário serve como antígeno para o anticorpo secundário

Anticorpo marcado

Anticorpo secundárioAnticorpo

Primário

1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase

Complexo Peroxidase-antiperoxidase: estáveis e sensíveis

Evitar a perda da peroxidase durante as lavagens com a solução tampão

Complexo PAP

Anticorpo secundário Produto final com DAB é

acastanhado

Produto final com DAB é

acastanhado

Sistema PAP contém anticorpos de alta afinidade para peroxidase

Aumento da eficiência

1. Método da Peroxidase-Antiperoxidase

2. Método Avidina-Biotina

Biotina Conjugada a anticorpo e enzimas

Anticorpo secundários

Complexo ABC

Biotina

Conjugados

Ligações entre o tecido ligados anticorpos primários e um complexo avidina-biotina-peroxidase

2. Método Avidina-Biotina

3. Método Streptavidina-Biotina

Anticorpo secudário biotinilado

Anticorpo primárioStreptavidina

conjugada com

peroxidase

Streptavidina conjugada

com peroxidase

Um anticorpo primário associado com múltiplas moléculas de peroxidase.

Grande razão enzima-anticorpo

Aumento de sensibilidade

3. Método Streptavidina-Biotina

Suspensões celulares

Procedimentos de imunohistoquímica:

Secções de parafina

Esfregaço

1. Coleta e fixação do material

Fixação

Preservar a morfologia e imunorreatividade;

Prevenir o deslocamento do antígeno durante as etapas que seguem a fixação;

Não interferir com as reações subseqüentes na localização do antígeno;

Preservar a morfologia e imunorreatividade;

Prevenir o deslocamento do antígeno durante as etapas que seguem a fixação;

Não interferir com as reações subseqüentes na localização do antígeno;

Características de um fixador

Formol

Soluções fixadoras

AldeídicasPontes Covalentes

Formaldeído 4-10%Paraformaldeído 4%PLP Periodato-lisina-formaldeídoGlutaraldeído

AldeídicasPontes Covalentes

Formaldeído 4-10%Paraformaldeído 4%PLP Periodato-lisina-formaldeídoGlutaraldeído

AlcóolicasCoagulação de

Proteínas

Carnoy 70% etanol 20% clorofórmio 10% ac. acético

Metacarn 70% metanol 20% clorofórmio 10% ac. acético glacial

AlcóolicasCoagulação de

Proteínas

Carnoy 70% etanol 20% clorofórmio 10% ac. acético

Metacarn 70% metanol 20% clorofórmio 10% ac. acético glacial

Com adição de Metais Pesados

Zinco: antígenos de membrana

Mercúrio-B5: Ig intracelulares

Com adição de Metais Pesados

Zinco: antígenos de membrana

Mercúrio-B5: Ig intracelulares

2. Corte e Identificação do Material

Corte

Cassete

Identificação

3. Desidratação

4. Clarificação

5. Inclusão

Pouco efeito na imunorreatividade da maioria dos antígenos.

1ª : álcool 70%2ª : álcool 80 %3ª : álcool 95 %

4ª : álcool absoluto (3X)

Xilol (2X)

Não se deve ultrapassar a temperatura de 60°C quando da inclusão em parafina.

Parafina (2X)

6. Corte histológico

Secagem na estufa

60°C por 24h

Desparafinização

Xilol IXilol IIEtanol absolutoEtanol 95%Etanol 70%

Xilol IXilol IIEtanol absolutoEtanol 95%Etanol 70%

Bloqueio da peroxidase endógena

Peróxido de hidrogênio 3%

Lavar as lâminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS) com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos

Peróxido de hidrogênio 3%

Lavar as lâminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS) com pH de 7,4 à 7,6 por 30 minutos

Recuperação Antigênica

Solução de tripsina 0,1% por 10 minutos à 37ºC em câmara úmida

Lavar as laminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS)

Solução de tripsina 0,1% por 10 minutos à 37ºC em câmara úmida

Lavar as laminas em água corrente e destilada e, em seguida, com solução salina tamponada (PBS)

Necessárias reações para bloqueio destas moléculas.

Bloqueio da Peroxidase Endógena

Pode ocorrer interferências pela ação de enzimas endógenas;

Ligação inespecífica de anticorpos com as proteínas do tecido;

Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e

indesejável em imunohistoquímica.

Principais causas de coloração de fundo sem especificidade e

indesejável em imunohistoquímica.

Recuperação Antigênica

Falhas nesse procedimento podem acarretar na total ausência de coloração específica.

Solução Tampão (Citrato) aquecida: 95°-99°C

30-40 min

Lâminas resfriarem

Incubação com anticorpo

Aplicação do Ac. Primário (1h à 37°C)

Aplicação do Ac. Secundário Biotinilado (30 min à 37°C)

Aplicação do Reagente Peroxidase (20min à 37°C)

Pinga o cromógeno, DAB, na lâmina

Contra-coloraçãoHematoxilina

Monta as Lâminas

Álcool 95%Álcool Absoluto

Xilol

Álcool 95%Álcool Absoluto

Xilol

Receptor de EstrogênioMarcação nuclear

Oncoproteína c-erbB-2Marcação de membrana

GFPAMarcação citoplasmática

http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.socimed.com/image/microscope%20L2000A-HGB.jpg&imgrefurl=http://sandra-bio12.blogspot.com/2007_10_01_archive.html&usg=__4EM94EeKml2zyrN9NiRXO19pPpM=&h=450&w=360&sz=59&hl=pt-BR&start=13&um=1&tbnid=yxz21mEa8QKs0M:&tbnh=127&tbnw=102&prev=/images?q=microsc%C3%B3pio+%C3%B3ptico&hl=pt-BR&rlz=1T4SKPB_pt-BRBR292BR292&sa=N&um=1

Expressão de E-caderina na membrana e citoplasma

Expressão de E-caderina em carcinoma mamário

É uma proteína que confere aderência às células e é de grande

importância na diferenciação epitelial.

É um potente supressor de invasão nos tumores mamários

e a perda da sua expressão tem relação com um prognóstico

ruim

E-caderina

Marcadores de proliferação celular

Ki-67 PCNA

Presente nas fases G1, S, G2 e mitose;

Proteína associada à cromatina;

Correlação positiva com metástase;

Mostra células em replicação;

Quanto maior a proliferação, mais agressiva é a lesão;

Presente nas fases G1, S, G2 e mitose;

Proteína associada à cromatina;

Correlação positiva com metástase;

Mostra células em replicação;

Quanto maior a proliferação, mais agressiva é a lesão;

Maior síntese na Fase S;

Proteína associada ao reparo de DNA;

Célula está em processo ativo de divisão celular ou em processo de reparo do DNA;;

Maior síntese na Fase S;

Proteína associada ao reparo de DNA;

Célula está em processo ativo de divisão celular ou em processo de reparo do DNA;;

Ki-67 PCNA

Marcadores de proliferação celularMarcadores de proliferação celular

Actina de musculo liso Citoqueratinas 5-6

Anticorpos para camada basal mioepitelial em tumor de mama

Ausência ou menos de 10% de imunopositividade na membrana citoplasmática das células tumorais:= 0 = Negativo

Imunopositividade fraca em parte da membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 1+ = Negativo

Imunopositividade fraca a moderada em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 2+ = Fracamente positivo

Imunopositividade intensa em toda a membrana citoplasmática em mais de 10% das células tumorais:= 3+ = Fortemente positivo

Como considerar positivo e como relatar o resultado???

A

B C

A. 1+

B. 2+

C. 3+

Negativo

Positivo

Positivo

Oncoproteína c-erbB-2

Receptor para o fator de crescimento epitelial (EGF-R).

0

+1

+2

+3

Câncer de mama

Imunohistoquímica e CâncerImunohistoquímica e Câncer

“O Câncer é, em essência, uma doença genética”.

Kenneth W. Kinzler e Bert Vogelstein


Carcinógeno

Lesão ao DNA

Célula Normal

Apoptose

Luz solar

Radiação

Derivados de petróleo

Corantes e conservantes

Hormônios

Fumo

Poluição

Vírus, etc...

Reparo

ReparoX

Reparo e apoptose ineficientes

Mutações adicionais


Câncer

Células tumorais benignas crescem

localmente e não têm capacidade invasiva

Células tumorais agressivas invadem tecidos vizinhos, caem

na corrente sanguínea e colonizam diferentes sítios

Mutação inativa

supressor de tumor

Proliferação celular

Mutação inativa

genes do reparo

Proto-oncogene

Oncogene

Mais mutaçõesMais instabilidade

genética

Metástases



Aplicações em câncer

Diagnóstico de tumores indiferenciados;

Diagnóstico diferencial entre tumores e estados

reacionais a inflamações;

Determinação de fatores preditivos de neoplasias;

Determinação de fatores prognósticos de neoplasias;

Determinação de sítio primário de metástases;

Determinação de subtipos de leucemias e linfomas.


Imunohistoquímica no diagnóstico de câncer de pulmão

Carcinoma de células

escamosas

Carcinoma neuroendócrino

adenocarcinoma

Carcinoma de grandes células

Câncer de pulmão

Baixo grau

Alto grau

Cromogranina no citoplasma

Sinaptofisina no citoplasma

CK5 CK6 de alto peso

molecular 34βE12

CK5 CK6

Citoqueratinas de

baixo peso molecular

35βH11

Negativos para

p65

Positivos

CK5 CK6

CK7

SP-A


Imunohistoquímica no prognóstico de câncer de pulmão

p53 Adenocarcinoma

c-erbB-1 Carcinoma de células escamosas Expressão relacionada com pior prognóstico

C-erbB-2 Adenocarcinoma Expressão relacionada com prognóstico favorável

VEGF Carcinoma não-pequenas células


Adenocarcinoma – citoqueratinas de alto e baixo

peso molecular

Adenocarcinoma – citoqueratina CK7

Tumor carcinóide


Adenocarcinoma primário

Origem mesenquimal


EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DOS MARCADORES PCNA,

Ki67 E P53 EM CARCINOMAS EPIDERMÓIDES DO TRATO

AERODIGESTIVO SUPERIOR

Revista do Colégio Brasileiro de Cirurgiões — Vol. 27 – no 5 — 327

Parâmetros usados para classificar este tipo de tumor são muito subjetivos e os tumores apresentam

comportamento muito heterogêneo

Necessidade de se encontrar novos

procedimentos capazes de melhor classificar este tipo

tumoral

IHQ para os genes

PCNA, Ki67 e P53


Correlacionar a expressão

IHQ dos marcadores de proliferação

PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros

prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas

epidermóides

do trato aerodigestivo superior.

Correlacionar a expressão

IHQ dos marcadores de proliferação

PCNA e Ki67 e de supressão tumoral P53, com parâmetros

prognósticos clínicos e patológicos em carcinomas

epidermóides

do trato aerodigestivo superior.

OBJETIVOOBJETIVO


MÉTODOMÉTODO

Controles negativosLâminas sem anticorpoControles negativosLâminas sem anticorpo

Controles positivos

Carcinoma de mamaKi67 e P53

Adenocarcinoma gástricoPCNA

Controles positivos

Carcinoma de mamaKi67 e P53

Adenocarcinoma gástricoPCNA

Correlação de PearsonCorrelação de Pearson

Grupo como um todo

Grupo A –laringe e hipofaringe

Grupo B – cavidade oral e orofaringe

Pesquisador único

Periferia do tumor

200 células núcleos positivos

Pesquisador único

Periferia do tumor

200 células núcleos positivos


RESULTADOSRESULTADOS

Ki67

Expressão em todos os tumores

5,5% a 95% dos núcleos positivos

46,5% Total

58,5 % Grupo A

35% Grupo B

P53

Expressão em 44 tumores (86.27%)

0,5% a 96,5% dos núcleos positivos

36,5% Total

37% Grupo A

35,5% Grupo B

PCNA

Expressão em todos os tumores

10,5% a 98% dos núcleos positivos

66,5% Total

69% Grupo A

64% Grupo B


CONCLUSÃOCONCLUSÃO

A determinação imunohistoquímica do Ki67 e

PCNA pode subsidiar as informações prognósticas do TNM

(AJCC) e do grau de malignidade histológico, como eficientes

indicadores de proliferação celular nestes tipos de tumores.


Impacto prognóstico da expressão imuno-histoquímica

do BRCA1 nos carcinomas mamários esporádicosJ Bras Patol Med Lab • v. 41 • n. 3 • p. 197-203 • junho 2005


BRCA1BRCA1

Gene supressor tumoral

Participa da regulação do ciclo celular nas células da glândula mamária

Mutações nesse gene levam a defeito no reparo do DNA e instabilidade

genética

Pacientes com mutações no BRCA1Pacientes com mutações no BRCA1

• Menor tempo de sobrevida livre de doença

• Perfil fenotípico característico Carcinoma pouco diferenciado

Alta taxa de proliferação


Analisar a expressão

IHQ do BRCA1 em carcinomas

mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos

com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica,

incluindo a expressão de receptores hormonais,

p53, c-erbB-2 e Ki67.

Analisar a expressão

IHQ do BRCA1 em carcinomas

mamários esporádicos e comparar os resultados obtidos

com dados clínicos e histopatológicos de importância prognóstica,

incluindo a expressão de receptores hormonais,

p53, c-erbB-2 e Ki67.

OBJETIVOOBJETIVO


MATERIAL E MÉTODOMATERIAL E MÉTODO

Amostras – Carcinomas ductais invasivos

Grau I bem diferenciado (34)

Grau II moderadamente diferenciado (39)

Grau III pouco diferenciado (29)

Sem qualquer outro tratamento adjuvante

Sem história familiar

Sem qualquer outro tratamento adjuvante

Sem história familiar

Método avidina-biotina-peroxidase

BRCA1, P53, c-erbB2, Ki67


RESULTADOSRESULTADOS

BRCA1

Epitélio normal - somente nuclear

Carcinomas - nuclear e citoplasmática

Expressão maior nos tumores bem diferenciados



51% dos carcinomas baixa expressão do BRCA1

• Alto grau histológico

• Alta taxa proliferativa alta expressão do Ki67

• Negativos para receptores de estrógeno e progesterona

• Positivos para c-erbB2

• Menor sobrevida global

• Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva)

• Alto grau histológico

• Alta taxa proliferativa alta expressão do Ki67

• Negativos para receptores de estrógeno e progesterona

• Positivos para c-erbB2

• Menor sobrevida global

• Menor tempo livre de doença ( metástases e recidiva)

A baixa expressão do BRCA1 está associada a ocorrência de metástases

Papel na progressão tumoral do carcinoma esporádico



A IHQ do BRCA1 pode representar um método de

identificação deste gene que pode ser considerado um

marcador útil na identificação de mulheres portadoras

de carcinoma esporádico de mau prognóstico e alto

risco de recorrência precoce.


A baixa imunoexpressão desta proteína nesses tumores e

a sua correlação com fatores de mau prognóstico indicam

que o grau de expressão deste gene pode desempenhar

importante papel na tumorigênese mamária


Versos negros (mas nem tanto...)Carlos Drummond de Andrade

“ Ao levantar, muito cuidado, amigo.Não ponha os pés no chão. Corre perigoSe há nylon no tapete: ele dá câncer.

Pise somente no ar, mas com cautela.Uma pesquisa nos revelaEsta triste verdade: o ar dá câncer.

À hora do café, não seja pato,Pois tanto açúcar como ciclamatoE xícara e colher, sorry: dão câncer.

O banho de chuveiro? Não tomá-lo.O de imersão, também. Sinto informa-loDo despacho londrino: água dá câncer.

Não se vista, meu caro ou minha caraUm cientista famoso eis que declara:Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...”

Versos negros (mas nem tanto...)Carlos Drummond de Andrade

“ Ao levantar, muito cuidado, amigo.Não ponha os pés no chão. Corre perigoSe há nylon no tapete: ele dá câncer.

Pise somente no ar, mas com cautela.Uma pesquisa nos revelaEsta triste verdade: o ar dá câncer.

À hora do café, não seja pato,Pois tanto açúcar como ciclamatoE xícara e colher, sorry: dão câncer.

O banho de chuveiro? Não tomá-lo.O de imersão, também. Sinto informa-loDo despacho londrino: água dá câncer.

Não se vista, meu caro ou minha caraUm cientista famoso eis que declara:Na roupa, qualquer roupa, dorme o câncer...”

OBRIGADA !!OBRIGADA !!

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Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Discentes: Lilian Campos Pires Marina Curado Valsechi