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22/03/2010
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Disciplina Biologia Celular
Profª Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva
Curso de Biotecnologia
FISMA / FEA
Aula 2:Tecnologia da Biologia Celular
Parte I
Bio Cel Profª Cristina
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1- Confecção de cortes para microscopia
• Ao natural
• Preservadas
– Fixação:
• Evita Autólise e Proliferação bactérias
• Propicia endurecimento celular
• Aumenta afinidade a corantes e contrastes
• FORMOL e GLUTARALDEÍDO
• TETRÓXIDO DE ÓSMIO e GLUTARALDEÍDO
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– Microtomia
• Inclusão
• Corte espessura 1 a 6 μm
• Corantes
– Organelas transparentes
– Corantes Básicos :
• grupamento cromóforo catiônico (+ carga positiva)
• Afinidade por ácidos (aniônicos – carga negativa)
• DNA e RNA são basófilas
• Ex: azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina
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– Corantes Ácidos :
• grupamento cromóforo aniônico (: – carga negativa)
• Afinidade por bases (catiônicos: + carga positiva)
• Proteínas são acidófilas
• Ex: Eosina, Fucsina ácida e Orange G
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• Sinônimos para o microscópio óptico:
– Microscópio Comum
– Microscópio de Luz
– Microscópio Fotónico
– Microscópio de Campo Claro
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• Porção mecânica
• Porção óptica
– Sistema óptico de observação
– Sistema óptico de iluminação
O Princípio de funcionamento:
– Condensador: projeta cone luz material em observação
– Cone de luz atravessa o objeto e atinge a objetiva
– Objetiva: projeta imagem aumentada no plano focal da ocular
– Ocular – novamente aumenta o objeto
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Para uma leitura mais detalhada de como ocorre a formação da imagem no olho, consulte:
• MARQUES, G. C., UETA, N. Ótica da visão. Disponível em: http://efisica.if.usp.br/otica/basico/visao/olho/
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• Ampliação do microscópio= aumento da objetiva X aumento da ocular
• Poder de resolução: – capacidade de separar detalhes
• É medido pelo Limite de resolução– Menor distância que deve existir entre dois
pontos, para que eles apareçam individualizados
• O que determina a riqueza dos detalhes:
Poder de resolução
ou
Ampliação ??????
Compr. onda
objetiva
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Outros Microscópios Ópticos
• Microscópio de Polarização
• Microscópio de Contraste de Fase
• Microscópio Confocal
• Microscópio de Fluorescência
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Polarização
• Foco de luz polarizado
• Estruturas e substâncias celulares dividem o foco de luz em 2 (planos perpendiculares) = estruturas anisotrópica e são birrefrinfgentes - apresentam índice de refração diferentes conforme a incidência da luz
• Estruturas isotrópicas – não modificam o plano de polarização da luz
• Prismas: polarizador (condensador)
• analisador (objetiva)
Em planos
perpendiculares
permitem a
visualização apenas
das estruturas
birrefringentes
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reflexão
refração
Contraste de Fase
• Transforma as diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade luminosa.
• Fase escura (positiva) e fase clara (negativa)
• Estudo de células vivas
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Comparações
• A) Microscópio óptico comum, B) Contraste de fase POSITIVO, C) Microscopia interferencial segundo Normasky, D) Contraste de fase NEGATIVO
Contraste de fase
+
Luz polarizada
Confocal
• Células isoladas e cortes de tecidos – espessura superior ao plano de foco do microscópio óptico
• Na prática- com o movimento do micromético um plano entra em foco enquanto os demais saem de foco = PERDA DE NITIDEZ
• No confocal: varredura por feixe de laser, ponto a ponto = “CORTE ÓPTICO “– Resultado: apenas aquela fatia fará parte da formação da imagem =
maior nitidez
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Fluorescência
2-Microscópio Eletrônico
• Transmissão
• Varredura
• Melhor resolução
• Células não vivas
• Preparativos
• Eletrodensidade
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• Imagens, esquemas e fotos retirados dainternet, através do site:
http://images.google.com.br/imghp?hl=pt-BR&tab=wi
Para estudar:
• Junqueira, L.C., Carneiro, J. Biologia Celular e Molecular. Guanabara Koogan. 8ª ed. 2005.
– Capítulo 2, p.19-26