Discente: Ketherson Rodrigues Silva

Orientador: Prof. Dr. Hélio José Montassier

IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial

por meio de técnicas imunológicas.

Busca: Anticorpo ou Antígeno no organismo vertebrado

suspeito de estar infectado usando-se ensaios de

Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento,

Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags

marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac

com conjugados ligantes, como Imunofluorescência,

Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos,

Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência

Outros testes: Hipersensibilidade a Antígenos: Reações

intradérmicas e percutâneas (Testes in vivo).

É uma associação biomolecular semelhante à

interação de enzimas com seus substratos ou de

hormônios com seus receptores, com uma distinção

bem evidente o Anticorpo não provoca nenhuma

alteração química irreversível na molécula de Ag,

podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se

dissociar nos seus 2 componentes Ag e Ac livres

/solução/suspensão.

Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)

• A interação entre Ag e Ac envolve a ocorrência de

várias forças não covalentes entre o determinante

antigênico (epítopo) da molécula do Ag e o sítio

combinatório (parátopo) da molécula do Ac,

constituído pelas regiões (domínios) variáveis de

cadeia L e de cadeia H (VL / VH) e particularmente

pelas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes

de complementaridade (CDRs) de VH e de VL.

A elevada especificidade das interações Ag e Ac

possibilitou:

1) O desenvolvimento de uma grande variedade de ensaios

ou reações sorológicas

2) As reações sorológicas podem detectar / identificar /

mensurar tanto Ags como Acs.

3) As reações sorológicas revestem-se de uma enorme

importância para:

3.1) O diagnóstico laboratorial de enfermidades

infecciosas

3.2) O monitoramento da intensidade de respostas

humorais pós-vacinação e também para detectar / mensurar /

identificar imunoquimicamente moléculas de interesse

biológico ou médico

4) Os ensaios sorológicos podem diferir em parâmetros

como limiar de detecção, sensibilidade, especificidade,

reprodutibilidade e alguns podem ser quantitativos enquanto

outros são qualitativos.

ENSAIOS SOROLÓGICOS

Primários detectam a interação direta entre

antígeno e anticorpo: Ex. Radioimnoensaio,

Imunofluorescência, ELISA

Secundários detectam conseqüências da interação

entre antígeno e anticorpo mudanças no estado

físico do antígeno: Imunodifusão, Aglutinação,

Fixação de Complemento.

Van Oss, 2000; Janeway, 2001

Ac + Ag Ac-Ag K1

K2

K1 = 1010 M-1 alta afinidade

Metodologias que utilizam reagentes não marcados:

•Precipitação

•Aglutinação

•Hemólise (Fixação de Complemento)

Metodologias que utilizam reagentes marcados:

•Radioimunoensaios

•ELISA

•Imunofluorescência

•Western Blotting

•Citometria de Fluxo.

• Conceito de chave e fechadura

• Ligações não-covalentes

– Pontes de Hidrogênio

– Ligações Eletrostáticas

– Forças de Van der Waals

– Ligações Hidrofóbicas

• Reversível

• Ligações Múltiplas

Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J.,

Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000

http://www.med.sc.edu:85/chime2/lyso-abfr.htm

O complexo Ag-Ac tende

a se manter unidos

Ac

Ag

Alta

Afinidade Ac

Ag

baixa

Afinidade

Afinidade

• Refere-se à força da interação entre um determinante

antigênico e o parátopo de um Ac homólogo.

Os complexo Ag-Ac

tende a se dissociar

Ag + Ac Ag-Ac

K = [AgAc]

[Ag] x [Ac]

Aplicando a Lei de Ação de Massa

Avidez • A força total de ligação entre um Ag com

vários determinantes e Acs multivalentes.

Keq = 104

Afinidade

106

Avidez

1010

Avidez

É a habilidade de um anticorpo reagir por meio do seu sitio combinatório com somente um determinante antigênico

Outros autores definem: É a habilidade de uma população de

moléculas de anticorpos reagirem fortemente com um antígeno e fracamente com outro Ag de estrutura semelhante.

Reatividade Cruzada • É a habilidade de um Ac reagir através de seu

parátopo com mais que um determinante

antigênico.

• É a habilidade de uma população de moléculas

de Acs reagirem com mais de um Ag

Anti-A

Ac

Ag A

Anti-A

Ac

Ag B

Epítopo

compartilhado

Anti-A

Ac

Ag C

Epítopo similar

Reações cruzadas

Fatores que Afetam as Reações Ag/Ac

• Afinidade

• Avidez

• Relação [Ag]:[Ac]

• Forma física do Ag

(solúvel ou particulado)

Excesso de Ac Excesso de Ag

Equivalência – formação de rede

Fig. 2.11. Different antibodies bind to distinct epitopes on an antigen molecule.

Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac dependerão da formação de rede ou eles terão de utilizar outras vias para detectar pequenos complexos imunes

Todos testes baseados nas reações Ag/Ac podem ser usados para detectar o Ag ou Ac

SINAL

Resultado da integração de impulsos elementares oriundos da reação do anticorpo com o seu epítopo

É de natureza variável segundo a técnica utilizada.

SINAL X RUÍDO

RUÍDO

Qualquer reatividade inespecífica

resultante de outras causas, que

não a reação antígeno-anticorpo, e

que pode interferir na capacidade

discriminativa do teste sorológico.

SINAL X RUÍDO

Menor número de impulsos

elementares necessários para o

desenvolvimento de um sinal

discriminatório, correspondendo a um

resultado positivo

LIMIAR DE DETECÇÃO

DE UM TESTE

SOROLÓGICO

Fatores que afetam a medição de reações antígeno-anticorpo

1. Afinidade

Quanto maior a afinidade do Ac pelo Ag, mais estável será a interação. Nesse

caso, a facilidade com que se pode detectar a interação é maior

2. Avidez

Reações entre antígenos multivalentes e anticorpos multivalentes são mais

estáveis e portanto mais fáceis de detectar

3. Razão entre antígeno e anticorpo

A razão entre o antígeno e o anticorpo influencia a detecção dos complexos

antígeno-anticorpo porque o tamanho dos complexos está relacionado com a

concentração do antígeno e do anticorpo

4. Forma física do antígeno

A forma física do antígeno influencia em como se detecta a reação AgAc. Se o

Ag é particulado, geralmente se observa a aglutinação do Ag pelo Ac. Se o Ag

é solúvel, geralmente se pesquisa a precipitação de um antígeno após a

produção de grandes complexos AgAc insolúveis.

LIMIAR DE DETECÇÃO OU

SENSIBILIDADE ANALÍTICA

DE ALGUMAS REAÇÕES

SOROLÓGICAS

LIMIAR DE DETECÇÃO OU

SENSIBILIDADE ANALÍTICA

DE ALGUMAS REAÇÕES

SOROLÓGICAS

TESTES DE LIGAÇÃO

PRIMÁRIA

• RIE 0,00005 g/ml

• ELISA 0,0005 g/ml

TESTES DE LIGAÇÃO

SECUNDÁRIA

• HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 g /ml

• RFC 0,05 g/ml

• AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 g /ml

• PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 g/ml

Formação de rede

3) Testes de Aglutinação: – simples, baratos, um pouco

mais sensíveis!

Existem Vários Tipos:

a) Hemaglutinação dos Eritrócitos

b) Aglutinação Bacteriana

c) Aglutinação Passiva

d) Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação – HI)

Determinação de Grupos

Sanguíneos – Sistema ABO

Aglutinação/Hemaglutinação

• Definição - testes que têm como seu ponto final a

aglutinação de um antígeno de natureza particulado

(células procarióticas ou eucarióticas)

– Acs: Aglutinina/hemaglutinina, principalmente do

isótipo IgM* e IgG

+

• Teste de aglutinação qualitativa

– Podem ser pesquisados Ag ou Ac (*Via de regra é o

Ag, Ex; tipagem de grupos sanguíneos)

• Aplicações

– Tipagem de sangue

– Infecções Bacterianas

• Considerações Práticas

– Fácil

– Semi-quantitativo

1/2

1/4

1/8

1/1

6

1/3

2

1/6

4

1/1

28

1/2

56

1/5

12

Teste de aglutinação quantitativa

◦ Título: recíproca da > diluição com resultado +

◦ Efeito Prozona 1

/2

1/4

1/8

1/1

6

1/3

2

1/6

4

1/1

28

1/2

56

1/5

12

1/1

02

4

Po

s.

Neg

.

Título

64

8

512

<2

32

128

32

4

Paciente

1

2

3

4

5

6

7

8

FIGURE 6-7

Demonstration of humaglutination using Ab against sheep

red blood cells (SRBCs): a constant # of SRBCs plus serial two-fold

dilutions of anti-SRBC serum

4. Agglutination Reactions

+ + + (control)

-visible clumping by interaction between Ab & a particulate antigen suchas RBC,

latex beads.

-depend on the crosslinking of polyvalent antigens, similar to precipitation rxns

(lgM is a good agglutinin)

-provide a way to type bacteria with a panel of typing antisera.

-routinely performed to type RBCs for blood transfusion.

Definição – teste de aglutinação feito com um

antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por

ex. Cels./hemácias ou partículas de látex)

+

Aplicações

– Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)

Aglutinação Passiva

• As particulas são revestidas com Ags,

• Partículas mais usadas Eritrócitos, látex, bentonita

ou carvão.

-Aglutinação Bacteriana

-As infecções bacterianas frequentemente induzem a

produção de Acs séricos específicos para Ags de

superfície das Bactérias.

-A presença de tais Acs pode ser detectada pelas

reações de aglutinação bacteriana.

-Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito

é definido como a recíproca da maior diluição do

soro que produz uma reação positiva de aglutinação.

-O título aglutinante de um soro pode ser usado para

o diagnóstico de infecções bacterianas.

Um exemplo de teste de soro-

aglutinação com partículas é o teste

de Látex de aglutinação ou de

aglutinação bacteriana.

Ag Bacteriano Acs Anti-bacterianos

(+) (-)

Testes de Precipitação

- Formação de rede

- Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis

- Principais Acs envolvidos: IgG* e IgM

- Formação de Precipitado dos

Imunocomplexos

- Maior formação de precipitado de

imunecomplexos na zona de equivalência

entre as concentrações de Ag e de Ac

1. Reações de Precipitação:

-Acs e Ags em soluções aquosas formam uma rede/malha =>

Precipitação

A formação da rede requer:

1) Acs polivalentes

2) Ags devem ser bivalentes / polivalentes

Testes de Precipitação: – simples, baratos, mas específicos!

e pouco sensíveis!!!

Não Precipitação Precipitação +

Reação de Imunodifusão

em Gel de Ágar

TESTE DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA

•Nem todo anticorpo que reagiu participa da geração de sinal

•Sensibilidade analítica = 30 µg / mL

TESTE DE ELEVADA

ESPECIFICIDADE ANALÍTICA

BAIXÍSSIMA OCORRÊNCIA DE RUÍDO

TESTE DE

EXECUÇÃO SIMPLES

BAIXO CUSTO

CURVA DE PRECIPITAÇÃO

QUANTITATIVA EM MEIO LÍQUIDO

ANTÍGENOS SOLÚVEIS

Curva de Precipitação

FATORES QUE AFETAM A DIFUSÃO

•CONCENTRAÇÃO D=K x C

•TEMPERATURA D=K x T

•PESO MOLECULAR D=K x 1/PM

•FORMATO MOLÉCULA D=Maior moléculas esféricas

•VISCOSIDADE DO MEIO D= K x 1/V

•TAMANHO DO PORO (gel) D=K x DIAM. PORO

4,5 mL GEL 1%

LÂMINA 24 X 76 mm ORIFÍCIO NO GEL

5 mm Diâmetro

40 µL

soro ou antígeno

ONDA DE DIFUSÃO

40 µL

soro

40 µL

antígeno

40 µL

soro

40 µL

antígeno

40 µL

soro

40 µL

antígeno

Antígeno e Anticorpo encontrando-se

em proporções ótimas

3. Precipitation Reactions

FIGURE 6-5

Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible precipitate forms in regions of Ab or Ag excess.

in the Ab-containing semisolid medium

The region of equivalence

-> The area is proportional to the conc. of Ag.

Técnica de Imunodifusão

Dupla em Gel deÁgar - IDGA

ANTÍGENO

A

ANTI- A

IDENTIDADE TOTAL SOROS

anti- A

ANTÍGENO- A

IDENTIDADE TOTAL ANTÍGENOS

ANTIGENO AB

IDENTIDADE PARCIAL SOROS

anti - A anti - AB

anti- AB

IDENTIDADE PARCIAL ANTÍGENOS

ANTÍGENO A ANTÍGENO AB

ANTÍGENOS

A + B

NÃO IDENTIDADE DE SOROS

anti- A anti- B

anti- A + anti B

NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS

ANTÍGENO A ANTÍGENO B

NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS

ANTÍGENO A ANTÍGENO B

-Formação de rede

-Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis

-Principais Acs envolvidos: IgG e IgM

-Formação de Precipitado dos

Imunocomplexos

-Maior formação de precipitado de

imunecomplexos na zona de equivalência

entre as concentrações de Ag e de Ac

Fig. 2.12. IDGA – IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE ÁGAR - Ouchterlony gel-

diffusion assay for antigen:antibody binding.

Antigen and antibody are placed in different wells of an agar gel. They diffuse toward each

other and precipitate where they meet at equivalence, forming a visible band. When serum

samples in two wells are tested against the same well of antigen, the relatedness of the

samples can be determined by the shape of the precipitin line formed (not shown).

Método

Interpretação

Qualitativa ◦ Concentração relativa

Método ◦ Ags sâo separados por eletroforese

• Interpretação – Precipitina representam os antígenos individuais

Ag

- +

Ag

Ac

Ag

Ac

– Ac é colocado dentro do agar cortado

Fig. 2.14. Immunoelectrophoresis reveals the presence of several

distinct immunoglobulin isotypes in normal human serum.

Método ◦ Ag e Ac migram em direção ao outro pela eletroforese

◦ Usado somente quando o Ag e o Ac têm cargas opostas

• Qualitativa –Rápida

Ag Ac

- +

Ensaios Baseados no

Complemento

Fixação de Complemento

– Ag misturado com soro teste para ser ensaiado pelo Ac

– Quantidade padrão de complemento é adicionado

– Eritrócitos cobertos com Acs é adicionado

– Determinação da quantidade de eritrócitos lisados

Ag

Soro de

paciente

Ag Sem Ag

Ag

• Metodologia

LIMIAR DE DETECÇÃO