Upload
georgio25
View
32
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Masarykova univerzita
Přírodovědecká fakulta
Ústav biochemie
STUDIUM FUNKCE TRANSKRIPČNÍCH REGULÁTORŮ FnrP, NNR A NarR U
BAKTERIE PARACOCCUS DENITRIFICANS
Diplomová práce
Bc. Iva Struhárová Brno, 2009
2
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením prof. RNDr.
Igora Kučery, DrSc., a Mgr. Pavla Bouchala, PhD., a že jsem uvedla veškerou použitou
literaturu a další informační zdroje.
V Brně 30. 04. 2009 ...........................................
Iva Struhárová
3
OBSAH
Seznam použitých zkratek a symbolů ................................................................................. 5
I. TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................... 7
1. Paracoccus denitrificans .................................................................................... 7
1. 2 Aerobní respirace ...................................................................................... 7 1. 2. 1 Terminální oxidasy ........................................................................ 8 1. 2. 1. 1 Cytochrom c oxidasa aa3 ............................................................ 9 1. 2. 1. 2 Cytochrom c oxidasa cbb3 ......................................................... 9 1. 2. 1. 3 Chinoloxidasa .......................................................................... 10
1. 3 Anaerobní dýchací řetězec ...................................................................... 11 1. 3. 1 Nitrátreduktasa ............................................................................. 11 1. 3. 2 Nitritreduktasa .............................................................................. 12 1. 3. 3 NO reduktasa ............................................................................... 13 1. 3. 4 N2O reduktasa .............................................................................. 13
1.4 Regulace aerobního dýchacího řetězce ................................................... 14 1. 4. 1 FnrP .............................................................................................. 14 1. 4. 2 NNR ............................................................................................. 16 1. 4. 3 NarR ............................................................................................. 18
2. Dvourozměrná elektroforéza ............................................................................ 19
2. 1 Příprava vzorku ....................................................................................... 19
2. 2 Isoelektrická fokusace ............................................................................. 20
2. 3 SDS-PAGE ............................................................................................. 21
2. 4 Detekce proteinů ..................................................................................... 23
2. 5 Analýza 2-D obrazu ................................................................................ 24
2. 6 Identifikace proteinů ............................................................................... 24
3. Kvantitativní real-time PCR ............................................................................. 26
3. 1 Izolace RNA ............................................................................................ 26
3. 2 Reverzní transkripce ............................................................................... 27
3. 3 PCR ......................................................................................................... 27
3. 4 Kvantitativní real-time PCR ................................................................... 28
II. CÍLE PRÁCE .......................................................................................................... 33
III. MATERIÁL A METODY ...................................................................................... 34
1. Bakteriální kmeny ............................................................................................ 34
2. Proteomová analýza ......................................................................................... 34
2. 1 Experiment na bázi 2-D elektroforézy .................................................... 34
4
2. 2 Obrazová a statistická analýza 2-D gelů ................................................. 34
2. 3 Příprava mikropreparativních gelů ......................................................... 35 2. 3. 1 Příprava vzorku ............................................................................ 35 2. 3. 2 Isoelektrická fokusace .................................................................. 35 2. 3. 3 Ekvilibrace ................................................................................... 36 2. 3. 4 SDS-PAGE .................................................................................. 36 2. 3. 5 Barvení gelů SYPRO Ruby ......................................................... 36 2. 3. 6 Analýza 2-D obrazu ..................................................................... 36 2. 3. 7 Vyřezání spotů a MS identifikace ................................................ 37
3. Měření hladin mRNA vybraných transkriptů pomocí qRT-PCR ..................... 37
3. 1 Izolace RNA ............................................................................................ 37
3. 2 Reverzní transkripce ............................................................................... 38
3. 3 Kvantitativní real-time PCR ................................................................... 39
IV. VÝSLEDKY............................................................................................................ 42
1. Proteomová analýza ......................................................................................... 42
1. 1 Proteiny ovlivněné růstovými podmínkami ............................................ 42
1. 2 Proteiny ovlivněné mutací v transkripčním regulátoru ........................... 46
1. 3 Srovnání exprese vybraných genů na úrovni proteinu a cDNA ............. 48
V. DISKUZE ................................................................................................................ 55
Pokrytí proteomu P. denitrificans ........................................................................... 55
Proteiny obsahující ve svém promotoru FNR-box .................................................. 55
Proteiny, jejichž geny se nacházejí v blízkosti genu pro transkripční faktor jiného typu .......................................................................... 57
Potvrzení operonu .................................................................................................... 59
„TonB-dependent receptors“ ................................................................................... 59
VI. SOUHRN ................................................................................................................. 61
VII. SUMMARY ............................................................................................................ 62
VIII. LITERATURA ........................................................................................................ 63
5
Seznam použitých zkratek a symbolů
2-D dvourozměrný
2-DE dvourozměrná elektroforéza
C7BzO 3-((4-heptyl)phenyl-3-
hydroxypropyl)dimethylammoniopropansulfonát
CBB Coomasie Brilliant Blue
CCD zařízení s vázanými náboji (charge-coupled device)
Cco cytochrom cbb3
Ccp cytochrom c peroxidasa
cDNA komplementární DNA (vzniklá reverzní transkripcí)
CID kolizí indukovaná disociace (collision-induced dissociation)
Ct počet cyklů nutný k vygenerování signálu (cycle threshold)
DIGE diferenční gelová elektroforéza
dNTP deoxynukleosidtrifosfát
DTE dithioerythiol
DTT dithiothreitol
ESI ionizace elektrosprejem
Fe-S klastr železosirný klastr
FNR rodina regulačních proteinů fumarát- a nitrátreduktasy
FnrP regulační protein fumarátreduktasy a nitrátreduktasy
HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie
CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonát
IEF isoelektrická fokusace
IPG imobilizovaný pH gradient
lacZ gen pro β-galaktosidasu
m/z poměr hmotnosti a náboje
MALDI ionizace laserem za přítomnosti matrice (matrix assisted laser
desorption/ionization)
MGD molybdopteringuanosindifosfátový kofaktor
MS hmotnostní spektrometrie
6
Nap periplazmatická nitrátreduktasa
Nar respirační nitrátreduktasa
NarR regulační protein nitrátreduktasy
Nir nitritreduktasa
NNR regulační protein dusičnanu a NO
Nor NO reduktasa
Nos N2O reduktasa
PMF peptidové mapování (peptide mass fingerprinting)
Q ubichinon
Qox chinoloxidasa
qRT-PCR kvantitativní real-time PCR
SDS dodecylsulfát sodný
SDS-PAGE polyakrylamidová elektroforéza v přítomnosti dodecylsulfátu
sodného
TOF průletový analyzátor (time-of-flight)
Triton X-100 polyethylenglykol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenylether
wt divoký typ
7
I. TEORETICKÁ ČÁST
1. Paracoccus denitrificans
Paracoccus denitrificans je půdní mikroorganismus náležící mezi fakultativně
anaerobní striktně respirující bakterie s gram-negativním typem buněčné stěny.
P. denitrificans je schopen růst jak heterotrofně s celou řadou zdrojů organického
uhlíku a volné energie, tak autotrofně s využitím vodíku nebo tzv. C1 substrátů
(methylamin nebo methanol). Řetězec pro transport elektronů využívaný při aerobním
heterotrofním růstu obsahuje celou sadu proteinů s analogy v dýchacím řetězci
mitochondrií. P. denitrificans je schopen redukovat molekulární kyslík v širokém
rozmezí jeho koncentrace, což je umožněno jeho schopností syntetizovat tři terminální
oxidasy 1. Za nízké hladiny kyslíku v okolí přechází na anaerobní respiraci za využití
enzymů denitrifikační dráhy a oxidů dusíku jako alternativních akceptorů elektronů.
1. 2 Aerobní respirace
Bakterie P. denitrificans je striktně respirující organismus, což znamená, že nikdy
nefermentuje. Dýchací řetězec je velmi rozvětvený, což umožňuje růst za rozdílných
koncentrací kyslíku.
Při aerobní respiraci elektrony putují z NADH dehydrogenasy na tzv. Q-pool
(redoxní pár ubichinon/ubichinol), odkud mohou elektrony putovat jak na cytochrom bc1,
tak na chinoloxidasu ba3. Z cytochromu bc1 putují elektrony přes cytochrom c550 nebo
c520 na cytochrom c oxidasu typu aa3 nebo cbb3. Efektivita přeměny volné energie
v průběhu oxidativní fosforylace závisí na dráze přenosu elektronů.
Na produkci ATP je využíván H+-ATPasový komplex, který vyžaduje na
membráně protonový elektrochemický gradient, který vzniká translokací elektronů přes
membránu. Na každé dva elektrony, které jsou přeneseny na kyslík, jsou přes membránu
převedeny čtyři kladné náboje NADH dehydrogenasou a čtyři náboje cytochromem bc1.
Na straně cytochromu ba3 (chinoloxidasy) a cytochromu aa3 jsou přes membránu
převedeny dva náboje na dva elektrony činností protonové pumpy. Co se týče
cytochromu cbb3, stechiometrie není doposud jasná. V průběhu transportu elektronů přes
8
cytochrom ba3 je účinnost vzniku protonového gradientu nižší, než při dráze přes
cytochromu aa3, která zahrnuje komplex cytochromu bc1 2.
Obrázek č. 1: Schéma dýchacího řetězce P. denitrificans za aerobních podmínek 4
Distribuce elektronů různými drahami závisí jak na kinetických vlastnostech
komponent, které tvoří dýchací řetězec, tak na redoxním stavu Q-poolu. Cytochrom cbb3,
který má vysokou afinitu ke kyslíku, je exprimován převážně při nízkých koncentracích
kyslíku, zatímco cytochrom aa3, jež má ke kyslíku nižší afinitu, je exprimován za
atmosférické koncentrace kyslíku. Pokud vzroste stupeň redukce Q-poolu, stává se
aktivní dráha k cytochromu cbb3. Zdá se proto, že relativní úroveň exprese jednotlivých
drah může být mírně přizpůsobována vnitřním a vnějším podmínkám 2.
1. 2. 1 Terminální oxidasy
V dýchacím řetězci P. denitrificans se exprimují až 3 terminální oxidasy.
Cytochrom c oxidasy aa3 a cbb3 i chinoloxidasa náleží do skupiny Cu-hemových oxidas.
Tyto oxidasy obsahují binukleární centrum v podjednotce I, které se skládá
z vysokospinového hemu a CuB místa, kde dochází k redukci kyslíku. V podjednotce I se
nachází i druhá hemová složka. Všechny Cu-hemové oxidasy pumpují protony přes
membránu proti elektrochemickému gradientu a generují tak proton-motivní sílu.
9
Cu-hemové oxidasy se dělí na dvě skupiny dle jejich donoru elektronů
(jednoelektronový přenašeč cytochrom c a dvouelektronový přenašeč ubichinol).
Strukturně se tyto skupiny liší v podjednotce II. Cytochrom c oxidasy obsahují v této
podjednotce CuA místo u typu aa3, zatímco typ cbb3 obsahuje dvě další podjednotky
s hemem c. Chinoloxidasy postrádají v podjednotce II jakékoli kovové centrum. Zdá se,
že mechanismus redukce kyslíku je u obou typů enzymů shodný 3.
1. 2. 1. 1 Cytochrom c oxidasa aa3
Jedná se o nejlépe charakterizovanou terminální oxidasu, enzym se čtyřmi
podjednotkami.
Podjednotka I obsahuje jako prostetickou skupinu hemy a a a3, které společně
s CuB tvoří aktivní místo. Tato podjednotka je přepisována z genu ctaDII.
Geny kódující podjednotky II a III se nacházejí na operonu ctaCB-ORF1-ctaGE.
Podjednotka II (CtaC) obsahuje CuA centrum, které je vstupním místem elektronů na
holoenzym aa3, ačkoli se uvažuje i o alternativních elektronových drahách. Podjednotka
III (CtaE) je integrální membránový protein o neznámé funkci. Dva zbývající cta geny
v operonu kódují enzymy zapojené posttranslačních úprav podjednotky I.
Čtvrtá podjednotka je kódována genem ctaH. Delece tohoto genu nemá žádný
efekt na poskládání dalších tří podjednotek nebo jejich prostetických skupin, ani na jejich
aktivitu in vitro, tudíž tomuto polypeptidu nebyla přiřazena žádná role a uvažuje se, že je
to jen evoluční pozůstatek 4.
1. 2. 1. 2 Cytochrom c oxidasa cbb3
Oxidasa má tři podjednotky (CcoN, CcoO a CcoP), které jsou kódovány skupinou
genů ccoNOQP. CcoN je katalytická podjednotka I se dvěma hemy a iontem mědi. Zbylé
dvě podjednotky jsou membránově vázané cytochromy typu c s jedním, respektive
dvěma hemy.
Oxidasa cbb3 je schopna pumpovat protony. Analýzy schopnosti růstu divokých
kmenů a kmenů s dvojnásobnou mutací v oxidase ukázaly, že oxidasa cbb3 převádí
volnou energii se stejnou účinností jako oxidasa aa3, ačkoli aminokyselinové zbytky
zahrnuté do dráhy pumpovaných a chemických protonů, které jsou v cytochromu aa3 a
10
chinoloxidase bo3 konzervovány, nejsou na odpovídajících pozicích oxidasy cbb3
přítomny. Zdá se tudíž, že protonový kanál oxidasy cbb3 je složen z jiných zbytků, než u
ostatních typů 4.
1. 2. 1. 3 Chinoloxidasa
Chinoloxidasa je kódována 4 geny, které tvoří operon qoxABCD. Podjednotka I
(QoxB) nese jako redoxní aktivní skupiny hem b, hem a a jeden atom mědi. Hem a a
atom mědi představují binukleární centrum redukce kyslíku. Přítomnost pouze jediného
atomu mědi v enzymu odráží fakt, že chinoloxidasy nemají v homologu podjednotky II
binukleární CuA centrum. Hemové uspořádání ba3 je pro tuto oxidasu nezbytné pro
udržení její katalytické aktivity. Přesto se stále vyskytují rozporné studie o uspořádání
hemu chinoloxidasy založené na analýze hemu z membrán cytochrom aa3 mutantů.
Z blízké příbuznosti chinoloxidasy P. denitrificans a jejího homologu v E. coli lze
odvodit podobné prostorové uspořádání. Známkou podobnosti jejich prostorového
uspořádání je zachování jisté enzymatické aktivity (okolo 20 % jak v membránách, tak
v izolovaném komplexu v porovnání s nativní chinoloxidasou P. denitrificans) po
zaměnění genu qoxA kódujícího podjednotku II P. denitrificans za ekvivalentní gen cyoA
z chinoloxidasy bo3 E. coli. Dosud není jasné, zda chimérické chinoloxidase zůstává
schopnost translokovat přes membránu jeden proton na elektron přenesený na kyslík, jak
je tomu u původní chinoloxidasy.
Oblast qox promotoru obsahuje FNR-box. Přítomnost vazebného místa pro
transkripční regulátor z rodiny FNR signalizuje regulaci transkripce v závislosti na
hladině kyslíku nebo na změnách redoxního potenciálu, ačkoli nebyl pozorován žádný
významný pokles v expresi se syntetickým promotorem/reportérovým genem, když byly
měřeny hladiny reportéru za aerobních a anaerobních podmínek růstu. Stejná studie
překvapivě ukázala pozitivní vliv nitrátu a nitritu (přidaného do růstového média) na
expresi chinoloxidasy za aerobních podmínek 4.
11
1. 3 Anaerobní dýchací řetězec
Striktně respirující P. denitrificans využívá za anaerobních podmínek jako
akceptorů elektronů oxidy dusíku. Proces, při němž může být dusičnan (NO3-) redukován
až na molekulární dusík, se nazývá denitrifikace a je zajišťován čtyřmi enzymy.
Obrázek č. 2: Schéma denitrifikační dráhy P. denitrificans 4
Denitrifikační geny kódující proteiny pro respiraci dusičnanu (nar), dusitanu (nir),
oxidu dusnatého (nor) a oxidu dusného (nos) jsou uspořádány v klastrech. Geny nir a nor
jsou spolu úzce spojeny, obsahují 4 až 5 rozeznatelných transkripčních jednotek a nesou
strukturní informace o obou reduktasách, o zpracování kovu, syntéze kofaktorů, zrání
proteinu a regulaci. Předpokládaným operonem je genová sekvence norCBQDEF 5.
1. 3. 1 Nitrátreduktasa
Úplný denitrifikační proces vedoucí k N2 začíná komplexem, který redukuje
dusičnan. P. denitrificans má tři typy nitrátreduktas: rozpustnou asimilační a 2
disimilační - respirační (membránově vázanou) a periplazmatickou. Respirační
nitrátreduktasa je kódována operonem narKGHJI. narG kóduje velkou (α) podjednotku o
velikosti 127 kDa, která obsahuje Mo ve formě molybdopteringuanosindifosfátového
12
kofaktoru (MGD). Tento kofaktor je zároveň aktivním místem reduktasy. Malá (β)
podjednotka o velikosti 61 kDa je kódována genem narH a jako prostetickou skupinu
obsahuje železosirný klastr. Gen narI kóduje třetí (γ) podjednotku, která ukotvuje
komplex podjednotek α a β na cytoplazmatické straně membrány 5. Produkt genu narK je
nezbytný pro transport dusíkatých oxoaniontů přes cytoplazmatickou membránu 6.
Periplazmatická nitrátreduktasa je molybdopterinový protein obsahující hemové i
nehemové Fe. Skládá se ze dvou podjednotek (93 a 16 kDa), které jsou kódovány geny
napAB z genového klastru napEDABC. Jako kofaktory se zde uplatňují opět Mo a Fe-S
klastr (NapA podjednotka) a v NapB podjednotce byly nalezeny dvě vazebná místa pro
hem c. Možná funkce NapC spočívá v transportu elektronů mezi chinolem a
periplazmatickou nitrátreduktasou. Fuknce NapD a NapE nejsou známy.
Zatímco membránově vázaná nitrátreduktasa je exprimována pouze za
anaerobních podmínek, periplazmatická nitrátreduktasa je aktivní i v přítomnosti kyslíku,
je tudíž exprimována konstitutivně. Fyziologická funkce periplazmatické nitrátreduktasy
spočívá pravděpodobně v rozptýlení nadbytku redukčních ekvivalentů. Přitom může také
působit při přechodu z aerobních do anaerobních podmínek, jelikož O2 pravděpodobně
inhibuje transport dusičnanu 5.
1. 3. 2 Nitritreduktasa
Redukci dusitanu na oxid dusnatý lze považovat za klíčový krok pro denitrifikaci,
protože je při něm převáděna iontová forma dusíku na formu neiontovou 4.
K tomuto kroku jsou denitrifikačními bakteriemi využívány dva, co se týče
struktury a prostetické skupiny, naprosto odlišné enzymy. Menšinou kmenů je využíván
enzym obsahující měď. P. denitrificans náleží mezi druhou skupinu využívající
cytochrom cd1. Ten je kódován genem nirS, který je součástí klastru, jenž současně
obsahuje i geny pro biosyntézu hemu d1. Klastry nir jsou postupně spojeny s geny
kódujícími proteiny pro redukci NO.
Enzym je homodimer s podjednotkami velkými 61,2 kDa. Prostetickými
skupinami jsou hem c a hem d1, přičemž oba se nacházejí v každé z podjednotek, takže
cytochrom cd1 představuje tetrahemový protein 5.
13
Donory elektronů pro nitritreduktasu jsou cytochrom c550 a měď obsahující
pseudoazurin. Existence dvou donorů se dvěma odlišnými kovovými centry
pravděpodobně dovoluje organismu udržovat transport elektronů při proměnlivých
dostupnostech těchto mikroelementů 4.
1. 3. 3 NO reduktasa
Mezi významné chemické vlastnosti NO patří přítomnost nepárového elektronu,
reaktivita s O2 a O2▪ -, relativně dlouhý biologický poločas života a hydrofobicita, která
usnadňuje mezimembránovou a transmembránovou difúzi. V nadbytku je však NO
toxický jak pro bakterie, tak i pro houby, mikrobiální parazity, nádorové buňky a viry.
Ačkoli je metabolismus NO denitrifikujícím organismům vlastní, je tato látka toxická i
pro ně. Toxicita je způsobena především reaktivitou s proteiny obsahující přechodné
kovy a kyslík a jeho schopností tvořit adukty s aminy a thioly. Hlavním místem zásahu
do buněčných pochodů jsou hemové i nehemové Fe a měď obsahující enzymy.
NO reduktasa má dvě podjednotky (17,5 a 38 kDa), které jsou kódovány geny
norC a norB. Větší podjednotka NorB je vysoce hydrofobní cytochrom b, který obsahuje
2 hemy b a nehemové Fe, které ale není součástí Fe-S klastru. Menší podjednotka NorC
je cyrochrom c 5. Geny norCB jsou transkribovány společně se 4 dalšími geny
(norQDEF), které jsou nezbytné pro zrání NO reduktasy. Jejich konkrétní funkce ale
zatím nejsou známy.
Menší podjednotka je kotvena k membráně prostřednictvím jednoduchého
α-helixu a doména hemu c vystupuje jako rozpustný periplazmatický polypeptid. Větší
podjednotka je pomocí 12 transmembránových α-helixů ukotvena v membráně. I přes
podobnost s terminálními oxidasami, které působí jako protonové pumpy, NO reduktasa
se na vytváření protonového gradientu sama nepodílí 4.
1. 3. 4 N2O reduktasa
Konverze N2O na N2 je posledním krokem úplné denitrifikační dráhy a
představuje respiraci ve své podstatě. Do procesu redukce N2O je zapojen i komplex
cytochromu bc1. Transfer elektronů tímto cytochromem je doprovázen transportem
14
protonů přes membránu. Redukce N2O tudíž uchovává energii, i když N2O reduktasa je
rozpustný enzym.
N2O reduktasa je kódována genem nosZ a jedná se o homodimer s molekulovou
hmotností 132 kDa. Každá podjednotka obsahuje 4 atomy Cu, které tvoří 2 binukleární
centra CuA a CuZ. CuA je místem vstupu elektronů z přirozeného donoru N2O reduktasy a
CuZ je místem pro vazbu substrátu (N2O) 5.
1.4 Regulace aerobního dýchacího řetězce
Hlavními vnějšími faktory, které indukují syntézu denitrifikační dráhy, jsou nízký
tlak kyslíku a přítomnost sloučeniny dusíku. Regulační odpovědi vyvolávají i ionty kovů.
Fe, Cu a Mo mohou přímo nebo nepřímo ovlivňovat biosyntézu denitrifikačních
komponent, které závisí na těchto kovech 5. Regulace genů při přechodu z aerobního
růstu k denitrifikaci je regulována také na úrovni transkripce, a sice třemi regulačními
proteiny z rodiny FNR (regulační proteiny fumarát- a nitrátreduktasy). Jsou jimi FnrP,
NNR a NarR. Ty se po aktivaci vážou na specifické sekvence (FNR-boxy) v cílových
promotorech. Jakmile dojde k fyzickému kontaktu mezi transkripčním faktorem a σ
faktorem RNA polymerasy, rozběhne se transkripce. Specifita těchto regulátorů je určena
částečně povahou FNR-boxu a částečně sekvencí po směru transkripce za FNR-boxem 7.
1. 4. 1 FnrP
Nejvýznamnějším proteinem, který je zapojen do regulace exprese terminálních
oxidas v P. denitrificans, je regulátor transkripce FnrP. Tento protein, stejně jako jeho
analog u E. coli FNR, má čtyři důležité funkční domény:
1. N-koncová doména obsahuje tři cysteinové zbytky. Spolu se čtvrtým cysteinovým
zbytkem umístěným v centrální doméně můžou vázat klastr [4Fe-4S]
2. Sekvence zbytků v centrální doméně tvoří smyčkovou strukturu, která je v kontaktu
s RNA polymerasou.
3. FnrP obsahuje α helikální doménu obklopující Asp154, který je pravděpodobně
zapojen do procesu dimerizace.
15
4. C-konec obsahuje DNA vazebný motiv helix-otáčka-helix, který rozpoznává cílové
místo DNA s konzervativní sekvencí TTGAT-N4-ATCAA (FNR-box).
Anaerobní aktivace transkripce pomocí FnrP závisí na přítomnosti klastru [4Fe-
4S]. Při vystavení kyslíku je tento klastr rychle oxidativně destruován, proto se dá
očekávat vzrůstající aktivace FNR při klesající koncentraci kyslíku. V aktivní formě FNR
dimerizuje a silně se váže na sekvenci FNR-boxu v promotorových oblastech cílových
genů 4.
Obrázek č. 3: Model regulace aktivity FNR 8. „Neaktivní“ označuje formu FNR, která převládá
za aerobních podmínek a vykazuje sníženou aktivitu vazby na DNA. „Aktivní“ označuje formu, která
vykazuje zvýšenou aktivitu vazby na DNA a převládá za anaerobních podmínek.
FNR-box, cílové místo FnrP o palindromatické sekvenci TTGAT-N4-ATCAA, se
nachází preferenčně -41,5 nukleotidů od místa počátku transkripce pozitivně
regulovaného promotoru. Vzdálenost může být i větší, ale vyžaduje topologickou změnu
v uspořádání C-koncové domény α podjednotky RNA-polymerasy a FNR. V závislosti na
umístění tohoto boxu může FNR vystupovat jako aktivátor i jako represor transkripce 5.
FNR-box o sekvenci 5’-TTGAC-N4-ATCAA-3’, je mimo jiné přítomný
v promotoru genového klastru qoxABC (chinoloxidasa), ccoNOQP (cytochrom cbb3) a
ccp (cytochrom c peroxidasa). V qox promotoru leží FNR-box ve vazebném místě pro
RNA-polymerasu, což vysvětluje pozorovanou represi transkripce qox pomocí FnrP. Ve
skutečnosti tedy aktivní FnrP tlumí qox promotor a stimuluje promotory cco a ccp, což
vede ke snížení exprese cytochromu ba3 a ke zvýšení úrovně exprese cytochromu cbb3 a
cytochrom c peroxidasy. FNR-box se nachází také v promotoru samotného genu fnr, což
znamená, že jeho exprese je autoregulována, stejně jako v případě fnr u E. coli.
16
FnrP je blízce podobný FNR E. coli v tom, že obsahuje shodné cysteinové
uspořádání pro vazbu klastru [4Fe-4S]. U E. coli je nejdůležitějším faktorem pro
modulaci aktivity FNR koncentrace molekulárního kyslíku. Experimenty in vitro ukazují,
že klastr [4Fe-4S] je rychle ničen molekulárním kyslíkem, což vede k inaktivaci FNR.
FnrP u P. denitrificans je ale stále schopný aktivace transkripce jeho cílových genů i za
podmínek aerobního růstu. Zdá se, že za takových podmínek aktivita FnrP vzrůstá se
vzrůstajícím stupněm redukce komponent respiračního řetězce. Tato pozorování
naznačují, že klastr [4Fe-4S] FnrP vyžaduje redukci pro svou plnou aktivaci a že je méně
citlivý ke koncentraci molekulárního kyslíku než FNR u E. coli 4.
1. 4. 2 NNR
Dalším členem rodiny FNR transkripčních regulátorů je NNR, který specificky
aktivuje transkripci genových klastrů nir a nor 9 jako odpověď na respiraci dusičnanu 10.
Redukce dusitanu probíhá pouze tehdy, pokud je zajištěna další redukce NO vzájemně
závislou expresí a regulací aktivit nitrit- a NO reduktasy. NO je produkován jako signální
molekula pomocí aktivity nitritreduktasy a je pravděpodobně induktorem své vlastní
reduktasy ]. NNR je tedy jedním z proteinů, který řídí expresi NO produkujících a NO
spotřebovávajících enzymů 10.
Signálem pro expresi zprostředkovanou NNR v průběhu denitrifikace je NO 10 a
NNR je také sensorem pro O2, jelikož aktivita NNR in vivo je inhibována signálem
aerobního metabolismu 11. Na regulaci transkripce samotného nnr se nepodílí NNR ani
FnrP 10. Studie na objasnění mechanismu aktivace NO ukázaly, že odstranění aktivačního
signálu nevede k okamžité a rychlé inaktivaci NNR. Dále bylo prokázáno, že NNR je
inaktivován v důsledku přechodu na aerobní podmínky růstu, což může být vysvětleno
přímou inaktivací NNR kyslíkem nebo rychlým odstraněním aktivačního signálu
v přítomnosti kyslíku 11.
NNR obsahuje až na jednu všechny součásti homologů FNR: neobsahuje [4Fe-
4S] klastr 9. Gen nnr se nachází blízko místa, které obklopuje genové klastry nir a nor.
17
Obrázek č. 4: Genový klastr denitrifikačních genů P. denitrificans 5
Mutace v genu nnr má za následek neschopnost syntézy nitritreduktasy a exprese
NO reduktasy je snížena asi na čtvrtinu oproti nemutovanému organismu. Exprese
dalších genových klastrů (ccoNOQP, qoxABCD, narGHJI a ccp) nebyla touto mutací
ovlivněna. DNA vazebná místa pro NNR, která jsou prakticky identická s vazebnými
místy pro FnrP, byla nalezena u obou typů genových klastrů 4. V promotoru genu nirS se
však vazebná sekvence poměrně významně odlišuje (TTAACaaagGTCAA), což může
vysvětlovat to, proč je tento box specificky rozeznáván právě NNR. Naopak ale vazebné
sekvence pro NNR u norCB promotoru a pro FnrP u ccp a narK promotoru jsou velmi
podobné, což může znamenat, že existuje ještě nějaký další mechanismus zodpovědný za
specifitu NNR a FnrP k jejich promotorům 7. Navzdory vysokému stupni shodnosti však
nebyly FnrP a NNR schopny převzít navzájem své role při regulaci genů v průběhu
denitrifikace. Pravděpodobně proto, že exprese jednotlivých cílových genů vyžaduje další
transkripční faktory, které jsou určeny buď pro NNR nebo FnrP.
Související studie řady homologů FNR z různých bakterií vedly k návrhu na
rozdělení této skupiny regulátorů do tří, více či méně samostatných, kategorií, kdy každá
zahrnuje proteiny se specifickými a neměnnými aminokyselinovými zbytky uvnitř jejich
funkční skupiny. Taková specifita na výsledném kontaktním místě RNA polymerasy
může tudíž odrážet specificitu proteinů z každé kategorie pro jednotlivý σ faktor. Sigma
faktory jsou proteiny, které se reverzibilně vážou na katalyticky aktivní jádro RNA
polymerasy a jsou nutné pro iniciaci transkripce. Jelikož NNR a FnrP spadají do dvou
odlišných kategorií, může to znamenat, že dané transkripční faktory navrhované pro
NNR a FnrP jsou specifické sigma faktory 4.
18
1. 4. 3 NarR
Enzym, který katalyzuje první krok denitrifikace – redukci dusičnanu –
nitrátreduktasa, je kódován genovým klastrem narKGHJI. V protisměru od směru
transkripce se nachází gen narR, který kóduje třetí transkripční regulátor z rodiny FNR, a
sice NarR.
Gen narR je transkribován rozdílně od ostatních nar genů. Mezi dvěmi protein
kódujícími oblastmi narR a narK je rozpětí o velikosti 251 bází. Zde se nacházejí dvě
konsensuální sekvence FNR-boxů, které jsou umístěny dostatečně daleko od sebe, aby
umožňovaly vazbu FnrP, NNR a/nebo NarR, a tím případnou regulaci exprese narR a
narK.
Obrázek č. 5: Oblast narR a klastru narKGHJI 6. Oblast mezi narR a narK je zvýrazněna, dva
FNR-boxy jsou v rámečku.
NarR je nutný pro maximální expresi genů membránově vázané nitrátreduktasy
(NAR) a narK, ale nemá žádnou další regulační funkci spojenou s denitrifikací. Do
regulace NAR je pravděpodobně zapojen také FnrP, jelikož mutant fnrP- vykazuje asi jen
30 % aktivity NAR divokého kmene. Pro aktivaci genové exprese za anaerobních
podmínek vyžaduje NarR přítomnost dusičnanu a/nebo dusitanu.
Promotor narR je negativně autoregulován a je reprimován za anaerobních
podmínek, pravděpodobně pomocí FnrP. Indukce exprese strukturních genů
nitrátreduktasy pomocí NarR tedy není jen následkem úrovně exprese samotného NarR,
ale existuje nějaký biochemický signál, na který NarR odpovídá.
19
Na rozdíl od FnrP N-koncová oblast proteinu NarR neobsahuje cysteinové zbytky,
jež jsou nezbytné pro vytvoření na kyslík citlivých železosirných klastrů. NarR také
v aminokyselinové sekvenci postrádá glycin (u FnrP je to G85) klíčový pro interakci
FNR regulátorů s podjednotkou σ70 RNA polymerasy, což naznačuje, že transkripční
aktivace pomocí NarR je nezávislá na tomto specifickém kontaktu protein-protein 6.
2. Dvourozměrná elektroforéza
2-D elektroforéza je metoda, která zahrnuje isoelektrickou fokusaci (IEF)
v prvním rozměru a polyakrylamidovou elektroforézu v přítomnosti dodecylsulfátu
sodného (SDS-PAGE) v druhém rozměru. Umožňuje tak separaci komplexních směsí
proteinů dle jejich isoelektrického bodu (pI), molekulové hmotnosti (Mr), rozpustnosti a
relativního výskytu. V závislosti na velikosti gelu a použitého pH gradientu je možno
současně rozlišit až 5000 proteinů. Poskytuje také mapu intaktních proteinů, která odráží
změny v úrovni exprese proteinů, isoformách a posttranslačních modifikacích.
2. 1 Příprava vzorku
K rozrušení buněk může být použita lyze osmotická, enzymatická nebo za pomoci
detergentu, dále sonikace, French press, cyklické zmrazování a rozmrazování,
homogenizace se skleněnými kuličkami, rozemletí s (nebo bez) dusíkem nebo
homogenizátor s rotujícím ostřím. Tyto metody mohou být použity jak samostatně, tak
v kombinaci. Během přípravy vzorku je třeba odstranit nebo inaktivovat interferující
sloučeniny, jako například proteolytické enzymy, soli, lipidy, nukleové kyseliny,
polysacharidy nebo vysoce abundantní proteiny.
Pro získání vysokého rozlišení je třeba proteiny ve vzorku denaturovat, redukovat
a solubilizovat, aby se zajistilo kompletní rozrušení molekulárních interakcí a aby tím
pádem v každém spotu byl obsažen jednotlivý polypeptid. Solubilizace vzorku se provádí
obvykle v pufru, který obsahuje chaotropní sloučeniny (močovina a/nebo thiomočovina),
neionogenní a/nebo zwitteriontové detergenty (C7BzO, Triton X-100 nebo CHAPS),
redukční činidla (DTT, DTE) a dle typu vzorku i inhibitory proteas.
20
Chaotropy způsobují především přerušení vodíkových vazeb, což vede k rozbalení
proteinu a jeho denaturaci. Určitý problém spojený s použitím močoviny jako chaotropu
spočívá v tom, že ve vodných roztocích existuje v rovnováze s (iso)kyanátem amonným,
který může reagovat s α-amino skupinami N-konce a ε-amino skupinami lysinových
zbytků, čímž dochází k blokování N-konce a zavádění nábojové heterogenity. Aby se
zabránilo karbamylační reakci, je třeba nezahřívat vzorek nad 37 °C; někdy se přidává
k roztoku močoviny karbonátdehydratasa, která kyanáty odstraňuje.
Detergenty slouží k zabránění hydrofobních interakcí mezi hydrofobními
doménami proteinů, čímž se zamezí ztrátám proteinů kvůli jejich agregaci a precipitaci.
Redukce a zabránění re-oxidace disulfidických vazeb je také klíčovým krokem při
přípravě vzorku. Redukční činidla jsou nezbytná pro odstranění intra- a
intermolekulárních disulfidických vazeb, aby se dosáhlo kompletního rozbalení proteinu.
Mezi nejčastěji používaná činidla patří DTT nebo DTE 12.
2. 2 Isoelektrická fokusace
Proteiny jsou amfoterní molekuly obsahující kyselé a bazické skupiny, které jsou
protonovány a deprotonovány v závislosti na okolním pH. Po aplikaci elektrického pole
začnou proteiny migrovat k opačně nabité elektrodě, než je jejich výsledný náboj. V bodě
svého pI, kdy protein nemá žádný výsledný náboj, přestane migrovat 13. Této vlastnosti
proteinů se využívá v prvním rozměru separace – isoelektrické fokusaci.
V dnešní době se užívá imobilizovaných pH gradientů (IPG) na tzv. stripech
(proužcích). Ty jsou založeny na použití bifunkčních reagentů, sérii 10 chemicky přesně
definovaných akrylamidových derivátů s obecnou strukturou CH2=CH-CO-NH-R, kde R
obsahuje jak karboxylovou, tak amidovou skupinu. Tyto skupiny tvoří sérii pufrů
s různou hodnotou pK mezi 1 a 13. Jelikož je reaktivní konec kopolymerován
s akrylamidovou matrix, vytvoří se extrémně stabilní pH gradienty.
Existují dva způsoby nanášení vzorku na IPG stripy. V prvním případě je strip
rehydratován pufrem obsahujícím rozpuštěný vzorek (tzv. in-gel rehydration), ve druhém
případě v rehydratačním pufru vzorek rozpuštěn není a po rehydrataci stripu tak následuje
aplikace vzorku (tzv. cup-loading) 12. Existuje ještě lehká modifikace prvního způsobu
21
zvaná aktivní nanášení vzorku, kdy se v průběhu dehydratace stripu aplikuje malé napětí
(typicky 50 V). Tento postup více usnadňuje vstup proteinů s vysokou Mr 13.
Nastavení samotné fokusace je obvykle limitováno proudem 50 µA na strip, aby
nedošlo k tvorbě Joulova tepla, protože na počátku je kvůli přítomnosti solí vysoká
vodivost 12. Doba, po kterou byl vzorek vystaven napětí, se udává ve volthodinách (Vh),
což vyjadřuje velikost napětí ve voltech aplikovaného po určitý čas. Takto (rozdílnou
expozicí ve Vh) se upravují podmínky pro rozdílné vodivosti na různých stripech
způsobené jiným proteinovým složením a množství solí 14. V průběhu expozice ionty solí
migrují k elektrodám, což vede ke snížení vodivosti, a lze tak aplikovat vyšší napětí. Je
třeba také vhodně zvolit dobu fokusace. Příliš krátká doba vede k horizontálním pruhům
na výsledném gelu a je třeba se také vyhnout přehnaně dlouhým časům, což by mohlo
vést k deformovaným spotům. Velký vliv na výsledný 2-DE gel má i teplota při IEF,
jelikož pozice spotů se mohou lišit na ose pH při různých teplotách. Pro
reprodukovatelnost je tedy nezbytně nutné provádět separace za kontrolované teploty,
optimální se jeví teplota 20 °C.
Před separací ve druhém rozměru je třeba IPG stripy ekvilibrovat, aby došlo
k plné interakci mezi separovanými proteiny a SDS. Ekvilibrace probíhá ve dvou krocích.
V prvním kroku jsou pomocí DTT redukovány zafokusované proteiny, ekvilibrační
roztok také mimo jiné obsahuje 2-10% (w/v) SDS, močovinu a glycerol. Ve druhém
kroku ekvilibrační roztok obsahuje místo DTT jodoacetamid, který alkyluje
sulfohydrylové skupiny a zabraňuje jejich reoxidaci. Další funkce jodoacetamidu spočívá
v tom, že alkyluje jakékoli volné DTT, protože jinak by docházelo k jeho migraci při
SDS-PAGE a vzniku pruhů na gelu 12.
2. 3 SDS-PAGE
Druhý rozměr 2-DE separuje proteiny na základě jejich molekulových hmotností
v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS. Ten je v tomto kroku inkorporován do
komplexů s proteiny v poměru přibližně 1,4 g SDS/g proteinu. SDS tak „zamaskuje“
náboj samotných proteinů a tyto anionické komplexy vytvářejí víceméně konstantní
celkový náboj na jednotku hmotnosti. Tudíž elektroforetická mobilita takto upravených
22
proteinů závisí na molekulové hmotnosti proteinu. Při určité koncentraci polyakrylamidu
existuje přibližně lineární vztah mezi logaritmem molekulární hmotnosti a relativní
migrační vzdáleností SDS-polypeptidových komplexů.
Standardní pufrovací systém pro druhý rozměr SDS-PAGE je založen na systému
Tris-chlorid/Tris-gylcin 25. Při 2-DE není nutno, na rozdíl od klasické procedury, použít
koncentrační gel, jelikož proteiny už jsou předseparovány pomocí IEF a migrují
z jednoho gelu do druhého a nikoli z kapalné fáze do gelu. Pro speciální účely se
používají i jiné pufrovací systémy, například borátové pufry pro separaci vysoce
glykosylovaných proteinů nebo tricinový systém pro separaci malých (< 15 kDa)
proteinů.
Velikost gelu pochopitelně ovlivňuje konečné rozlišení proteinů. Obvyklé 2-DE
gely jsou 1-1,5 mm tlusté o rozměrech 20x20 cm a jsou schopny rozlišit až 1500
proteinů. Distribuce spotů na ose y gelu závisí na délce, hustotě a pH gelu v druhém
rozměru. Vhodná koncentrace akrylamidu je kolem12 %. Nižší koncentrace zhoršují
rozlišení a vyšší (15 %) ztěžují extrakci proteinů pro další studium. Pro zvýšení
koncentrace proteinů pro následnou charakterizaci (hmotnostní spektrometrie, jiná
analytická metoda) slouží tzv. preparativní gely. V prvním rozměru je aplikováno větší
množství vzorku, čímž se získá proteinová mapa obsahující větší množství proteinů 12.
Obrázek č. 6: Typický 2-D gel proteinů barvených stříbrem 13
23
2. 4 Detekce proteinů
Po 2-DE je třeba separované proteiny vizualizovat, ať už univerzálními nebo
specifickými barvicími metodami. Mezi nejdůležitější vlastností barvicích metod patří
vysoká citlivost (nízký detekční limit), vysoký lineární dynamický rozsah,
reprodukovatelnost a kompatibilita s následnými metodami identifikace proteinů, např.
MS. Žádná z barvicích metod ovšem nevyhovuje současně všem požadavkům
proteomové analýzy. V praxi se nejčastěji uplatňují metody Coomasie Brilliant Blue
(CBB), barvení stříbrem a fluorescenční barvení.
Metoda CBB se stala velmi rozšířenou díky nízké ceně, jednoduchosti a
kompatibilitě s většinou následných analýz a charakterizací proteinů. Avšak základní
limitací této metody je nedostatečná citlivost, která neumožňuje detekci proteinů
s nízkým zastoupením (limit detekce je 200-500 ng proteinu na spot). Tudíž obvykle
nelze vizualizovat více než několik set spotů, i když na počátku bylo na gel vloženo
miligramové množství. Barvení pomocí koloidní CBB je sice citlivější, ale stále
nedosahuje úrovně ostatních barvicích proteomických metod.
Barvení stříbrem je z těchto metod nejcitlivější, limit detekce je kolem 0,5 ng na
spot 14. Kvůli subjektivnímu určení konce barvení je mnohém méně reprodukovatelná než
CBB, což dělá tuto metodu méně vhodnou pro kvantitativní analýzu. Další nevýhodou je
pracnost a složitost a metoda také neumožňuje následnou analýzu pomocí MS.
Co se týče citlivosti a lineárního dynamického rozsahu, nejlepší výsledky se
dosahují u metod využívajících fluorescenční látky nebo značení proteinů radioizotopy.
Pro fluorescenční detekci proteinů existují dva hlavní přístupy – prvním z nich je
kovalentní derivatizace proteinů fluorofory před IEF. Tato metoda se nazývá DIGE
(difference gel electrophoresis) a nejznámějšími typy fluorescenčních barev jsou barvy
založené na cyaninu (Cy2, Cy3, Cy5). Druhým přístupem je barvení proteinů interkalací
fluoroforů do micel tvořených SDS po elektroforéze. Hlavním zástupcem této skupiny je
rutheniová barva SYPRO Ruby – barvení trvá jen pár hodin a probíhá jednokrokově,
čehož se využívá v automatizovaných systémech. Detekční limit je asi 1-2 ng na spot.
Výhodou fluorescenčního barvení je také kompatibilita s následnou identifikací proteinů
pomocí MS 12.
24
2. 5 Analýza 2-D obrazu
Jedním z klíčových úkolů proteomiky je identifikace rozdílné exprese mezi
kontrolním a pokusným vzorkem. K tomuto účelu je třeba počítačová analýza obrazu.
Obrázek č. 7: Schematické znázornění 2-D gelů znázorňujících různá stadia
proteomu 13. Aktivované a reprimované geny (kvantitaivní a kvalitativní změny) jsou znázorněny
šipkami.
K získání 2-D obrazu gelu existuje mnoho zařízení, jako například laserové
densitometry, CCD kamery, fluorescenční a fosforové skenery. Obdržené obrazy jsou
poté podrobeny počítačové analýze. K vyhodnocení obrazu využívá software obvykle
následující postup: a) předzpracování obrazu – oříznutí a odečtení pozadí, b) detekce a
kvantifikace spotů, c) „matching“ – automatické přiřazení zbývajících spotů, d)
normalizace – před srovnáním intenzit spotů na různých gelech jsou tyto intenzity
normalizovány (např. na celkovou intenzitu všech spotů v gelu nebo metodou tzv. local
regression model), tento krok koriguje případné chyby při pipetování vzorku a efektivitu
barvení, e) identifikace rozdílně exprimovaných spotů, f) zpracování a interpretace dat.
2. 6 Identifikace proteinů
Hlavní metodou pro identifikaci proteinů se stala hmotnostní spektrometrie,
jelikož je velmi citlivá, vyžaduje malé množství vzorku a má kapacitu na zpracování
25
velkého množství vzorků. Pro většinu proteomických studií jsou využívány dva typy MS,
a sice MALDI-TOF a ESI –MS/MS.
1. MALDI-TOF: Analyzovaný vzorek se smíchá s matricí, která obvykle obsahuje
malé molekuly s vhodným chromoforem, který je schopen absorbovat světlo specifické
vlnové délky. Směs matrice a vzorku se odpaří a vznikne tak krystalová mřížka, ve které
je peptid ze vzorku integrován. Poté je destička se vzorkem ostřelována laserem a
dochází k ionizaci a uvolnění vzorku z matrice do plynné fáze. Každá molekula peptidu
se obvykle ionizuje pomocí jednoho protonu z matrix, a tudíž výsledné peptidové ionty
nesou jeden pozitivní náboj. Takto vytvořené ionty poté směřují do TOF analyzátoru. Ten
měří čas, za který ionty dorazí z jednoho konce analyzátoru na druhý, kde dopadají na
detektor. Rychlost, kterou ionty letí analyzátorem, je přímo úměrná hodnotě jejich m/z.
2. ESI-MS/MS: Zkratka znamená tandemová MS s ionizací elektrosprejem.
Tandemová proto, že analyzátory jsou schopny vykonávat dvoustupňovou analýzu iontů.
Analyzovaný vzorek se v tomto případě nachází ve vodném roztoku, takže peptidy se
vyskytují ve formě iontů. Nejčastěji se ESI provádí při kyselém pH, kdy peptidy nesou
kladný náboj, což usnadňuje jejich fragmentaci. Vzorek se dostává do zdroje proudem
(obvykle z HPLC) a prochází jehlou, která je pod vysokým napětím. Jak proud opouští
jehlu, rozstříkne se na malé kapičky, které obsahují jak peptidové ionty, tak komponenty
mobilní fáze z HPLC, které musí být odstraněny. Vzorek pak putuje do analyzátoru.
Nejčastěji se využívá tří druhů, a sice trojnásobně kvadrupólový, iontová past a
kvadrupólový TOF. I když se tyto analyzátory liší v tom, jak pracují, vykonávají všechny
stejný typ analýzy. Ze směsi peptidových iontů vygenerovaných ESI zdrojem se vybírají
jednotlivé třídy m/z. Tento ion je poté podroben kolizí indukované disociaci (tzv.
collision-induced dissociation, CID), která nafragmentuje peptid na fragmentované ionty.
Ty jsou pak analyzovány na základě jejich m/z. Informace obsažené v tomto MS/MS
spektru umožňují odvodit peptidovou sekvenci.
Primárním nástrojem pro identifikaci proteinů je metoda peptidového mapování
(peptide mass fingerprinting, PMF), která je založena na poznatku, že sady hmotností
peptidů získaných MS analýzou proteinových štěpů (obvykle trypsinem) poskytují
charakteristický „otisk“ tohoto proteinu. Protein je pak identifikován srovnáním
experimentálního „otisku“ a teoretických peptidových hmotností generovaných in silico
26
za použití proteinových a nukleotidových databází (SWISS-PROT, NCBInr, OWL).
Tento přístup je velmi efektivní při identifikaci proteinů z biologických druhů s malým,
kompletně osekvenovaným a dobře anotovaným genomem, ale není tak spolehlivý pro
genomy, které ještě nejsou zcela sekvenovány. Dalším problémem je identifikace
proteinů, jež jsou významně posttranslačně modifikovány, jelikož peptidy generované
z těchto proteinů nemusí odpovídat nemodifikovaným proteinům v databázi. Třetí
problém představuje přítomnost více než jednoho proteinu ve spotu. V takovýchto
případech je třeba získat aminokyselinovou sekvenci 15.
3. Kvantitativní real-time PCR
3. 1 Izolace RNA
K izolaci RNA se mimo jiné používá kit RNeasy Mini
(Qiagen). Technologie, která je v kitu využita, kombinuje
selektivní vlastnosti vazby mRNA na křemennou membránku a
mikrocentrifugace. Speciální pufr s vysokým obsahem solí
umožňuje vazbu až 100 µg RNA delší než 200 bází na membránu.
Vzorek je nejprve lyzován a homogenizován v přítomnosti vysoce
denaturujícího pufru obsahujícího guanidinthiokyanát, který
okamžitě inaktivuje RNasy, aby byla zajištěna purifikace intaktní
RNA. Pro zajištění správných vazebných podmínek se přidává
ethanol. Vzorek je poté umístěn na kolonku, kde se váže celková
RNA a kontaminanty jsou efektivně odstraněny (vymyty). Eluce
RNA se provádí 30-100 µl vody.
Obrázek č. 8: Schéma izolace RNA
27
3. 2 Reverzní transkripce
Reverzní transkripce je proces katalyzovaný enzymem RNA-dependentní-DNA-
polymerasa (reverzní transktriptasa), při němž se podle RNA (templát) syntetizuje
dvouřetězcová DNA. Reverzní transkripce se využívá v genovém inženýrství, neboť s její
pomocí lze využít funkční mRNA k syntéze cDNA. Přepisu buněčných mRNA do cDNA
a jejího následného namnožení pomocí polymerasové řetězové reakce se používá při
studiu exprese genetické informace 16.
3. 3 PCR
Polymerázová řetězová reakce (PCR) představuje rychlou a nenáročnou metodu
amplifikace specifických segmentů DNA až do velikosti 6 kb. Tepelně denaturovaná
DNA (s oddělenými řetězci) je inkubována v přístroji zvaném thermocycler s DNA
polymerasou, směsí deoxynukleosidtrifosfátů (dNTP) a dvěma primery
(oligonukleotidy), jejichž sekvence je komplementární k cílové oblasti DNA určené
k amplifikaci, takže směrují DNA polymerasu k syntéze nových řetězců. Cyklické
opakování tohoto procesu, kdy každý cyklus zdvojnásobí množství přítomné DNA,
amplifikuje DNA geometrickou řadou.
V každém cyklu jsou nejprve separovány řetězce DNA tepelnou denaturací při
95 °C, poté je teplota snížena, aby mohly primery přisednout na své komplementární
sekvence na DNA, a DNA polymerasa pak zajišťuje prodlužování řetězce. Užívá se
teplotně stabilních DNA polymeras, jako například Taq DNA polymerasa (z bakterie
Thermus aquaticus) nebo Pfu DNA polymerasa (z bakterie Pyrococcus furiosus), které
jsou stabilní při 95 °C. To eliminuje nutnost přidávat čerstvý enzym po každém
denaturačním kroku. Tudíž v přítomnosti dostatečného množství primerů a dNTP je PCR
prováděna jednoduše cyklickými změnami teploty 17.
28
Obrázek č. 9: Schéma cyklu PCR 18: (1) Denaturace při 94-96°C. (2) Nasedání primerů
(annealing) při 68°C. (3) Prodlužování řetězce při 72°C (P=DNA polymerasa). (4) První cyklus je ukončen.
Dva vzniklé řetězce DNA tvoří templát pro další cyklus. Takto tím pádem dochází ke zdvojnásobení
množství DNA při každém novém cyklu.
Převzato z http://www.juliantrubin.com/encyclopedia/biochemistry/pcr.html, leden 2009.
3. 4 Kvantitativní real-time PCR
Kvantitativní real-time PCR je spolehlivá metoda pro detekci a měření produktů
generovaných v průběhu každého cyklu PCR, které jsou přímo úměrné počátečnímu
množství templátu.
Pro uskutečnění této metody je třeba mít k dispozici způsob, jak detekovat
akumulaci produktu PCR, a přístroj, který má kromě vlastností thermocycleru i schopnost
zaznamenávat výsledky každého cyklu PCR v reálném čase. Nejjednodušším způsobem
detekce akumulovaného produktu je přidání takového barviva do směsi PCR, které
fluoreskuje po navázání na dvouřetězcovou DNA. Tento přístup však má své slabiny
spočívající v tvorbě falešných signálů, pokud se barvivo naváže na chybný produkt
reakce. Vyšší specifity lze proto dosáhnout použitím sond, které se vážou pouze na
specifický produkt 18.
Nejpoužívanějšími metodami pro generování fluorescenčního signálu jsou:
29
1. Sondy TaqManTM:
Jde o oligonukleotidy značené na obou koncích (tzv. Dual-Labeled Probes). Na 5´ konci
je navázán vhodný fluorofor (reporter) s krátkou vlnovou délkou emitovaného záření, na
3´ konci pak zhášeč (quencher) s delší vlnovou délkou záření. Fluorofor s kratší vlnovou
délkou předává energii zhášeči, jenž v důsledku toho emituje záření s delší vlnovou
délkou. Původní záření fluoroforu je utlumeno. Tento stav zůstává i po nasednutí sondy.
Sonda nasedá současně s primery, a to na komplementární sekvenci vzdálenou od 3´
konce primeru. Nově vytvářený řetězec je postupně prodlužován, až dosáhne místa, kde
je navázána sonda. Nyní se uplatní proces shodný s replikací DNA in vivo. Po uvolnění
několika vodíkových můstků, jejichž prostřednictvím je navázána sonda, a přiřazení
několika nukleotidů nově tvořeného řetězce se aktivuje exonukleasová podjednotka Taq
polymerasy a oddělovaná sonda podléhá exonukleasové aktivitě tohoto enzymu. Při
rozpadu sondy se uvolněný fluorofor vymaní z vlivu zhášeče a začne emitovat
fluorescenční záření krátké vlnové délky, které je registrováno jako fluorescenční signál.
Záření zhášeče (delší vlnové délky) pochopitelně ustane. Takto je registrován každý nově
tvořený řetězec 19.
Obrázek č. 10: Schéma typické TaqMan sondy 20
2. Molekulární majáky:
Jedná se o jednořetězcové oligonukleotidové hybridizační sondy s krátkými koncovými
sekvencemi k sobě navzájem komplementárními, takže tvoří vlastně „dvouřetězcový“
kmen, jejž spojuje jednořetězcová smyčka. V ní je úsek komplementární k hledané cílové
sekvenci vyšetřované nukleové kyseliny. Protože se tyto sondy používají k fluorescenční
detekci hybridizace, je na jednom konci oligonukleotidu (např. 5´) navázán fluorofor, na
30
druhém (3´) pak zhášeč. Díky vzájemné komplementaritě koncových sekvencí
oligonukleotidu, které spolu hybridizují, jsou v klidovém stavu oba (5´ i 3´) konce tak
blízko sebe, že fluorofor i nefluoreskující zhášeč přechodně sdílejí elektrony, čímž je
fluorescence eliminována. Sonda proto nesvítí. Pokud se však ke specifickému úseku
v jednořetězcové smyčce, který je podstatně delší než vzájemně komplementární úseky
kmene sondy, přiblíží komplementární cílová struktura nukleové kyseliny, dochází
ke spontánní hybridizaci, jejíž výsledek - hybrid - je delší a stabilnější než kmen sondy,
což vede k uvolnění vazeb kmene, a oba konce sondy se od sebe vzdálí. Tím se fluorofor
vymaní z vlivu zhášeče a nic nebrání emisi záření.
Obrázek č. 11: Schéma molekulárního majáku 20
Molekulární majáky jsou díky své stabilitě ve dvou fyzikálních stavech výhodné
pro zvýšení specifity reakce. Jsou navrhovány tak, aby helix tvořený kmenem sondy byl
méně stabilní než helix vytvořený hybridizací sondy a cílové sekvence při perfektní
vazbě nukleotidů. Rozdíl v komplementaritě jednoho jediného nukleotidu, např.
v důsledku bodové mutace, má za následek zachování stability kmene sondy. Emise
fluorescenčního signálu je tedy výhradně důsledkem přísně komplementární vazby sondy
na cílovou sekvenci 19.
3. Na DNA vázající se barvivo SYBR Green I:
Při použití této metody není třeba navrhovat třetí oligonukleotid nebo hybridizační sondu.
Fluorescenční signál vzniká po excitaci světlem jen tehdy, pokud je barvivo navázáno na
DNA (interkalace do malého žlábku dvojšroubovice). Je to nejlevnější metoda, která ale
vyžaduje optimalizaci, aby například nedocházelo k tvorbě dimerů primerů, jelikož
SYBR Green I nerozlišuje reálný templát od uměle vytvořených artefaktů 20.
31
Obrázek č. 12: Schéma real-time PCR s fluorescenční barvivem SYBR Green I.
Barvivo SYBR Green I (černé kosočtverce) začíná fluoreskovat (zelené kosočtverce) po navázání na
dvouřetězcovou DNA. Tímto poskytuje přímou metodu pro kvantifikaci produktů PCR v reálném čase.
Převzato z http://home.cc.umanitoba.ca/~umbouc00/PLNT7690/presentation/SYBRGreen.html, leden 2009
Reakce PCR generuje kopie templátové DNA exponenciálním způsobem. Vlivem
inhibitorů (omezení reagencií, akumulace pyrofosfátu) nakonec PCR reakce negeneruje
kopie templátu exponenciálně („plateau“ fáze) a některé reakce tudíž vygenerují více
produktu než jiné. Z tohoto důvodu je „end-point“ kvantifikace PCR produktů velmi
nespolehlivá. Protože existuje možnost měřit produkty PCR v reálném čase (tehdy, kdy
vznikají), je možné měřit množství PCR produktu v bodě, kdy je reakce stále
v exponenciální části. Právě toto je fáze PCR rekce, kdy můžeme zpětnou extrapolací
získat informace o původním množství templátu.
Při experimentu je v exponenciální fázi určen tzv. práh signálu fluorescence, při
kterém mohou být srovnány všechny vzorky. Tento práh je funkcí fluorescence pozadí a
je snímán při úrovni, kdy signál generovaný vzorkem je výrazně vyšší než je fluorescence
pozadí. Dílčí počet cyklů PCR, které jsou potřeba k vygenerování dostatečného signálu,
jež dosáhne tento práh, je nazýván Ct (cycle threshold). Hodnoty Ct jsou přímo úměrné
množství templátu na počátku reakce a jsou základem pro výpočet hladiny exprese
mRNA 20.
32
Obrázek č. 13: Detekce produktu real-time PCR a stanovení Ct hodnoty. Osa y
představuje počet kopií genu, osa x počet cyklů amplifikace. Převzato z http://www.rt-pcr.com, leden 2009.
Existují dvě základní metody kvantifikace: relativní kvantifikace a kvantifikace
pomocí kalibrační křivky. Používanější je metoda relativní kvantifikace, kde se provádí
srovnání exprese genu zájmu ve více vzorcích s kontrolním genem. Existují metody
s korekcí nebo bez korekce efektivity amplifikace. Metoda bez korekce efektivity
amplifikace (tzv. delta-delta metoda) předpokládá stejnou teoretickou efektivitu pro
amplifikaci cílového a kontrolního genu. Hodnota Ct kontrolního genu se odečte od Ct
genu zájmu a tak se získá rozdíl ∆Ct. Hodnota ∆Ct slouží poté jako exponent čísla 2,
jelikož při každém cyklu PCR dojde ke zdvojnásobení množství produktu. Výsledný
poměr exprese se celkově dá vyjádřit touto rovnicí:
TG
TG RG
RG
Ct (kontrola vzorek)( Ct Ct ) Ct
Ct (kontrola vzorek)poměr exprese
22 2
2
∆ −∆ −∆ ∆∆
∆ −= = = ,
kde TG znamená cílový gen a RG kontrolní gen 21.
33
II. CÍLE PRÁCE
1. Charakterizovat regulační sítě, jejichž řízení je zprostředkováno transkripčními
regulátory FnrP, NNR a NarR u bakterie Paracoccus denitrificans na globální
proteomové úrovni.
2. Získané výsledky validovat na transkriptomové a genomové úrovni pomocí qRT-
PCR a analýz genomové sekvence.
3. Rozšířit webovou 2-DE proteomovou databázi P. denitrificans s využitím
kompletní sekvence genomu bakterie.
34
III. MATERIÁL A METODY
1. Bakteriální kmeny
V práci byly používány následující kmeny P. denitrificans:
Kmeny s mutací v příslušném transkripčním faktoru:
1222 divoký typ (wt)
2921 FnrP mutant (FnrP-)
7721 NNR mutant (NNR-)
11021 NarR mutant (NarR-)
2. Proteomová analýza
2. 1 Experiment na bázi 2-D elektroforézy
Bylo připraveno 36 2-D gelů z buněčných lyzátů P. denitrificans (kmeny wt, FnrP-, NNR-
a NarR-) rostlých za třech podmínek – aerobně, semiaerobně a semiaerobně
s dusičnanem, vždy v triplikátech 22. Příprava těchto gelů nebyla součástí této diplomové
práce.
2. 2 Obrazová a statistická analýza 2-D gelů
Experiment byl vyhodnocován pomocí software PDQuest 8.0 (Bio-Rad, USA). Byla
provedena detekce spotů (metoda lokálního regresního modelu), odečet pozadí,
normalizace a matching (vzájemné přiřazení spotů na jednotlivých gelech a master
gelu)22. Dále byla provedena důkladná vizuální inspekce dat. Byly vytvořeny analytické
sety, které poskytly výsledky v podobě seznamu spotů, které splňují podmínku
kvantitativní změny (zvýšení 2x, resp. snížení na polovinu) a současně podmínku
statistické významnosti (p<0,05; Studentův t-test) mezi dvěma biologickými stavy. Takto
byly finálně vyhodnoceny spoty, které mění svoji intenzitu v závislosti na růstové
podmínce či v závislosti na přítomnosti mutace v transkripčním faktoru.
35
2. 3 Příprava mikropreparativních gelů
Byly vyrobeny 4 preparativní gely, a sice ze všech kmenů P. denitrificans (wt, FnrP-,
NNR- a NarR-) pěstovaných za podmínek aerobních, semiaerobních a semiaerobních
s dusičnanem. Spoty z těchto gelů byly vybrány k MS identifikaci.
2. 3. 1 Příprava vzorku
Objem buněčného lyzátu v lyzačním pufru o složení 7 M močovina, 2 M thiomočovina,
1% (w/v) C7BzO, 40 mM Tris, 70 mM DTT, 2% (v/v) Pharmalyte 3/10, 25 mM NaF, 0,2
mM NaVO3, CompleteMini Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Německo, jedna tableta
na 10 ml lyzačního pufru) a 150 U benzonasy (Sigma-Aldrich, USA) odpovídající
400 µg bílkoviny byl smíchán se 7,5násobkem (obj.) acetonu vychlazeného na -20 °C +
0,2% (w/v) DTT, následovala inkubace 1,5 hod./ -20 °C a centrifugace
16000g/20 min./4 °C, supernatant byl odlit. Poté bylo opět přidáno 200 µl acetonu +
0,2% DTT, následovala inkubace 20 min./-20 °C a centrifugace 16000g/20min./4 °C.
Supernatant byl odlit a vzorek byl vysušen ve SpeedVacu (SPD11V, Thermo Scientific,
USA) po dobu asi 5 min. Vzorek byl nakonec resolubilizován v 350 µl rehydratačního
pufru (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 1% (w/v) C7BzO, 40 mM Tris, 70 mM DTT
and 2% (v/v) Pharmalyte 3/10 ) inkubací za mírného třepání 75 min./ 20 °C, následovala
centrifugace 16000g/20min/15 °C.
2. 3. 2 Isoelektrická fokusace
Na elektrody fokusační vaničky (PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad, USA) byly přiloženy
elektrodové papírky napuštěné 8 µl vody (anoda), respektive 8 µl 50 mM DTT (katoda).
Bylo naneseno 350 µl vzorku a byl přiložen strip (imobilizovaný pH gradient 3-10 NL,
18 cm, Bio-Rad, USA), který byl poté zalit 3 ml minerálního oleje. Byl spuštěn
předvolený program, vždy při 150, 300, 650, 1200 a 1500 kVh došlo k výměně
elektrodových papírků, poté se fokusace nechala probíhat přes noc, celkově bylo
aplikováno 100 kVh.
36
2. 3. 3 Ekvilibrace (uváděná množství jsou na 1 gel/strip)
IPG stripy byly ekvilibrovány ve dvou stupních vždy po 12 minutách nejprve v roztoku o
složení 50 mM TRIS/HCl pH 8,8; 6 M močovina; 2% (w/v) SDS a 30% (v/v) glycerol a
1% (w/v) DTT, poté v roztoku o stejném složení s výjimkou DTT, které bylo nahrazeno
2,5% (w/v) jodacetamidem.
2. 3. 4 SDS-PAGE
Elektroforéza byla prováděna na aparatuře PROTEAN Plus Dodeca Cell (Bio-Rad,
USA), systém podle Laemmliho 25. Na povrch předem připravených gelů (12%
akrylamid) bylo napipetováno 750 µl agarosy a ihned byl přiložen strip na povrch gelu
tak, aby mezi gelem a stripem nezůstala žádná bublina. Gely byly umístěny do
elektroforetického zařízení a do elektrodového prostoru byl nalit vnitřní/horní pufr
(0,12 M Tris; 0,96 M glycin; 17 mM SDS a 0,15 mM NaN3).
Elektroforéza běžela nejprve při napětí 50 V po dobu asi 2 hodin, poté při
100 V přes noc, dokud modrá linie nedoputovala několik milimetrů od okraje gelu.
2. 3. 5 Barvení gelů SYPRO Ruby
Gely byly fixovány v roztoku 50% ethanolu a 3% kys. octové po dobu 30 minut. Barvení
probíhalo ve vaně s 500 ml barvy, kam byly umístěny vždy 2 gely. Vany byly zakryty
hliníkovou fólií umístěny na třepačku, kde byly třepány přes noc. Poté byly gely
přeneseny do čisté vany s odbarvovacím roztokem: 10% ethanol a 7% kys. octová. Vany
byly zakryty hliníkovou fólií a umístěny na třepačku po dobu 30 minut. Gely byly
uchovávány ve vanách s 250 ml vody + 2,5 ml 1% NaN3 v ledničce.
2. 3. 6 Analýza 2-D obrazu
Gely byly naskenovány pomocí fluoroimageru Pharos FX Plus (Bio-Rad, USA) a
analyzovány pomocí software PDQuest 8.0 (Bio-Rad, USA). Všechny 4 gely byly
přidány k experimentu se 36 původními gely. Nejprve bylo odečteno pozadí a program
provedl automatickou detekci spotů. Následoval matching spotů s původními gely.
37
2. 3. 7 Vyřezání spotů a MS identifikace
Vybrané spoty byly vyřezány pomocí přístroje EXQuest spot cutter (Bio-Rad, USA) a
předány laboratoři Funkční genomiky a proteomiky, MU (doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal,
Dr.) k MS identifikaci. Proteiny byly štěpeny trypsinem; nejprve byly provedeny analýzy
MALDI-MS a MS/MS na hmotnostním spektrometru Ultraflex III (Bruker Daltonik,
Německo). U nejednoznačných výsledků a u proteinů zájmu (měnící svoji intenzitu
v závislosti na růstové podmínce či v závislosti na přítomnosti mutace v transkripčním
faktoru) byla dále provedena LC-MS/MS analýza: systém HPLC skládající se
z gradientové pumpy (Ultimate), automatického dávkovače (Famos) a přepínače kolon
(Switchos; LC Packings, Holandsko) byl on-line propojen s hmotnostním spektrometrem
HCTultra PTM Discovery System ion trap mass spectrometer (Bruker Daltonik,
Německo).
Zpracování MS a MS/MS dat bylo provedeno pomocí programu MASCOT 2.0
(MatrixScience, Velká Británie). Bylo hledáno jak proti databázi NCBI (verze 20080502
nebo pozdější), tak i proti databázi genomu P. denitrificans, verze 2006
(http://genome.ornl.nih.gov/pden).
3. Měření hladin mRNA vybraných transkriptů pomocí qRT-PCR
3. 1 Izolace RNA
Izolace RNA byla provedena pomocí kitu RNeasy Mini kit (Qiagen). Celkem bylo
provedeno 36 izolací (4 kmeny, 3 růstové podmínky, 3 biologické replikáty). 2 µl
bakteriálního peletu byly rozsuspendovány ve 100 µl TE pufru (10 mM Tris/HCl pH 8,0;
1 mM EDTA) obsahujícím 400 µg.ml-1 lysozymu. Směs byla inkubována 5 min při lab.
teplotě. Poté bylo přidáno 350 µl RLT pufru (obsahujícího 2-merkaptoethanol), řádně
promícháno, centrifugováno 14000 g/2 min a dále bylo pracováno jen se supernatantem.
K supernatantu bylo přidáno 250 µl ethanolu, promícháno pipetou. Celý obsah byl
přenesen na kolonku umístěnou ve sběrací zkumavce, cetrifugace 11500 g/15 s. Dále
bylo na kolonku pipetováno 700 µl RW1 pufru, cetrifugace 11500 g/15 s. Kolonka byla
poté umístěna do nové sběrací zkumavky, bylo přidáno dvakrát 500 µl RPE pufru, poprvé
centrifugace 11500 g/15 s, pak 11500 g/2 min. Eluce byla provedena 40 µl vody, poté
38
byla eluce opakována pomocí prvního eluátu. Případná kontaminace DNA byla
odstraněna pomocí setu RNase-Free DNase (Qiagen) přídavkem 3,4 Kunitzových
jednotek 27 DNasy (na 30 µl izolátu) a inkubací při 30 °C/30 min., poté byla DNasa
tepelně inaktivována (95 °C/10 min). Kvalita a kvantita vyizolované RNA byla určena
měřením na nanodropu (NanoPhotometerTM, Implen, Německo).
3. 2 Reverzní transkripce
Syntéza cDNA reverzní transkripcí byla provedena setem společnosti Promega. Tři
biologické replikáty byly smíchány tak, aby směs na reverzní transkripci obsahovala
stejnou výchozí hmotnost RNA, viz následující tabulka:
Tabulka I: Koncentrace vyizolované mRNA a její zpracování pro reverzní traksripci
c RNA [ng/µl]
ng RNA
80 µl reakce
c RNA [ng/µl]
ng RNA
80 µl reakce
Vzorek [µl]
Voda [µl]
Vzorek [µl]
Voda [µl]
wt A 1 108,0 350 4,3 NarR- S 2 137,0 350 3,4
wt A 2 89,2 350 5,2 NarR- S 3 246,0 350 1,9 7,5
wt A 3 141,0 350 3,3 3,1 NNR- S 1 95,2 350 4,9
FnrP-A 1 99,6 350 4,7 NNR- S 2 132,0 350 3,5
FnrP-A 2 238,0 350 2,0 NNR- S 3 156,0 350 3,0 4,6
FnrP-A 3 205,0 350 2,3 7,1 wt N 1 109,0 350 4,3
NarR-A 1 122,0 350 3,8 wt N 2 242,0 350 1,9
NarR-A 2 348,0 350 1,3 wt N 3 154,0 350 3,0 6,8
NarR-A 3 204,0 350 2,3 8,5 FnrP- N 1 47,2 350 9,9
NNR-A 1 80,0 350 5,8 FnrP- N 2 173,0 350 2,7
NNR-A 2 237,0 350 2,0 FnrP- N 3 174,0 350 2,7 0,7
NNR-A 3 308,0 350 1,5 6,7 NarR- N 1 60,4 350 7,7
wt S 1 144,0 350 3,2 NarR- N 2 174,0 350 2,7
wt S 2 185,0 350 2,5 NarR- N 3 147,0 350 3,2 2,4
wt S 3 241,0 350 1,9 8,3 NNR- N 1 174,0 350 2,7
FnrP-S 1 82,8 350 5,6 NNR- N 2 75,0 350 6,2
FnrP-S 2 135,0 350 3,5 NNR- N 3 155,0 350 3,0 4,1
FnrP-S 3 318,0 350 1,5 5,4
39
Ke každému vzorku byly přidány 4 µl směsi náhodných primerů, směs byla inkubována 5
min při 75 °C, pak zchlazena na 4 °C a přidána ke směsi, jejíž složení uvádí tabulka:
Tabulka II: Složení reakční směsi pro reverzní transkripci
objem [µl] výsledná koncentrace 22,4 voda 16 1X ImProm-IITM 5X Reaction Buffer 9,6 3 mM MgCl2 4 0,5 mM dNTP mix 4 1 U/µl Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 4 Improm-IITM Reverse Transcriptase
Reakční směs o celkovém objemu 80 µl byla podrobena reverzní transkripci: annealing
25 °C/5 min, prodlužování prvního řetězce 42 °C/60 min a inaktivace reverzní
transkriptasy 70 °C/15 min.
3. 3 Kvantitativní real-time PCR
Kvantitativní real-time PCR byla provedena v triplikátech na přístroji 7300 Real Time
PCR System (Applied Biosystems, USA) za použití flourescenčního barviva SYBR
Green. Jednotlivá reakce obsahovala:
Tabulka III: Složení směsi pro real-time PCR
7,5 µl Power SYBR® Green PCR Master Mix 4,2 µl voda 0,9 µl F primer (5 µM) 0,9 µl R primer (5 µM) 1,5 µl cDNA
40
Tabulka IV: Použité primery
SSP Contig a číslo genu
Jméno Sekvence primerů Tm Délka
amplikonu
5710 ct74_4235
A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit
F: 5-CGTACCCGAGGACTGGATCA-3 60 119
R: 5-CATACCAGACCATCGGCAGG-3 60
2701 ct74_4219
A1B9T9 Nitrous-oxide reductase
F: 5-AACAAGGTGCGGGTCTACATG-3 59 127
R: 5-CATGCGTCAGATCGTCGATCT-3 59
4107, 5105
ct74_3636
A1B859 OmpW family protein F: 5-AATATCGGCATCGAGGTGCT-3 58
124 R: 5-GCGCGTCAAAGTGATATTGC-3 58
1701 ct130_2487
Q51700 Nitrite reductase
F: 5-GGAAAACGACTGGGATCTGG-3 58 138
R: 5-GACATGCGGCTGATATGCAC-3 59
1311 ct73_4984
A1BC00 Transketolase, central region
F: 5-AACGACCCGGTGATCTTCCT-3 59 136
R: 5-CATAGGTGACGATGGTTGCG-3 59
1406 ct73_4983
A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold
F: 5-CAAGGATCAGTCGCTGGTCAG-3 59 92
R: 5-CCAGTTCGGTCAGGAAGTCC-3 58
3203 ct73_4982
A1BBZ8 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
F: 5-GCAGGTCAAGCAGTTCAACG-3 62 68
R: 5-CCATGGCATTCACGTCCA-3 62
804 ct130_2610
A1B5A3 TonB-dependent receptor
F: 5-GGGAAGGTGCAGAACACCTTT-3 59 137
R: 5-CTGGTCGAGAAGTTGCGGTAA-3 59
1814 ct74_3007
A1B6E6 TonB-dependent siderophore receptor
F: 5-CCACACCGACGGCTATTATTC-3 58 131
R: 5-GGTTGTTGACATAGGCGAAGG-3 58
3211 ct130_1849
A1B352 UspA domain protein
F: 5-CAGAAGCAACTCGATTCGGC-3 60 147
R: 5-GGCCTTGTCGATGGATTCCT-3 60
8417 ct74_3407
A1B7I4 ABC transporter related
F: 5-CTGTTCCTGTTCGACGAGCC-3 59 98
R: 5-GAGGCGTTCAGATCCTGGTG-3 59
5202 ct130_2604
A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein
F: 5-TATGCGGCCTTCGAACAGTG-3 61 152
R: 5-CATTCATCATCCTCGCCGG-3 61
6421 ct74_4465
Q9X7H5 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
F: 5-GCTGAAGGGCATCCTAGGCTATA-3 60 146
R: 5-ACTCGTTGTCATACCAGGTCAGG-3 60
Míra genové exprese byla určena pomocí metody relativní kvantifikace. Jako kontrolní
gen sloužila glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa (GAPDH). Z trojice Ct analytických
replikátů byl spočten průměr a určena směrodatná odchylka. Od Ct sledovaného genu
bylo odečteno Ct GAPDH a tak byly získány hodnoty ∆Ct pro jednotlivé geny. Exprese
41
daného genu pak byla vztažena na divoký kmen za aerobních podmínek (wt A), tzn.
odečtením této hodnoty ∆Ct od hodnoty daných kmenů za všech podmínek se spočetly
tzv. ∆∆Ct hodnoty, které po výpočtu hodnoty 2-∆∆Ct vyjadřují relativní expresi daného
genu vůči wt A.
42
IV. VÝSLEDKY
1. Proteomová analýza
Bylo analyzováno 36 2-DE gelů bakterie P. denitrificans (kmeny wt, FnrP-, NNR-
a NarR- kultivované za podmínek aerobních, semiaerobních a semiaerobních
s dusičnanem, vždy v triplikátech). Z celkového počtu 737 spotů na master gelu
(počítačem vytvořený gel obsahující spoty ze všech experimentálních gelů) bylo vybráno
544 spotů, jež měly dostatečnou kvantitu a kvalitu, k identifikaci pomocí hmotnostní
spektrometrie. Podařilo se identifikovat 525 spotů, které obsahovaly celkem 640 různých
genových produktů. Výsledky identifikace budou přístupné on-line na adrese
http://web.mpiib-berlin.mpg.de/cgi-bin/pdbs/2d-page/extern/index.cgi. Jelikož se jedná o
data připravovaná k publikaci, jsou v současnosti umístěna na neveřejné části webu na
adrese http://141.14.152.84/cgi-bin/1681278/Bouchal_Paracoccus/index.cgi. Sada 297
spotů obsahovala jen jeden identifikovaný protein, a byla proto základem pro biologickou
interpretaci proteinové exprese. U 228 případů se jednalo o směs dvou a více proteinů;
tyto spoty byly proto vyřazeny z biologické interpretace.
Jelikož v průběhu času dochází ke změnám anotace osekvenovaných proteinů
v genomové databázi P. denitrificans, je třeba zmínit, že data uvedená v této práci
odpovídají anotaci genů z 15. 3. 2009. Názvy obsahují přístupová čísla do databáze
UniProt a také číslo genu, jež umožňuje vyhledávání v genomu P.denitrificans on-line
(http://genome.ornl.gov/microbial/pden a http://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism
?org=pde).
Exprese 12 vybraných genů byla validována pomocí qRT-PCR. Jako
housekeeping gen byla použita glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasa, jejíž konstitutivní
exprese byla ověřena jak na úrovni proteinu (spot 6421), tak na úrovni mRNA.
1. 1 Proteiny ovlivněné růstovými podmínkami
Dvě níže uvedené tabulky (tabulka V a VI) obsahují spoty s jediným
identifikovaným proteinem, které vykazovaly změny při růstu za podmínek
semiaerobních a semiaerobních s dusičnanem v porovnání s růstem divokého kmene za
aerobních podmínek.
43
Tabulka V obsahuje 19 spotů se zvýšenou expresí a 2 spoty se sníženou expresí za
semiaerobních podmínek ve srovnání s aerobními u divokého kmene. Nezávisle na
přítomnosti mutace byla exprese současně a významně zvýšena u 9 spotů, u zbývajících
12 nedošlo k významné změně exprese alespoň u jednoho mutantního kmene.
Tabulka VI obsahuje 15 spotů se zvýšenou expresí a 1 spot se sníženou expresí za
semiaerobních podmínek s dusičnanem ve srovnání s aerobními u divokého kmene.
Nezávisle na přítomnosti mutace byla exprese současně zvýšena u 7 spotů, u zbývajících
9 nedošlo k významné změně exprese alespoň u jednoho mutantního kmene.
Je zřejmé, že většina proteinů (12 z 19) se zvýšenou expresí za semiaerobních
podmínek měla stejně tak zvýšenou expresi i za semiaerobních podmínek s dusičnanem.
Za povšimnutí z této skupiny proteinů stojí denitrifikační enzymy nitritreduktasa (spot
1701) a N2O reduktasa (spot 2701), dále například OmpW protein (spoty 4107 a 5105),
TonB dependent recepror (spot 0806), dehydrogenase/reductase SDR proteins (spoty
2206 and 7104) a SSU ribosomal protein S30P/sigma 54 modulation protein (spot 5202).
Hladina β-podjednotky nitrátreduktasy (spot 5710) byla s použitím uvedených kritérií
zvýšena pouze při růstu za semiaerobních podmínek s dusičnanem.
Tabulka V (následující strana): Spoty vykazující změnu v expresi při růstu za
podmínek semiaerobních v porovnání s růstem za aerobních podmínek divokého
kmene. Je také ukázána exprese dalších kmenů. Číselné hodnoty tučně znamenají
významnou statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické významnosti a obyčejný
font – významnost nebyla testována.
44
wt FnrP NNR NarR všechny kmeny
SSP Contig/číslo genu Název proteinu změna násobek změny (S/A)
změna násobek změny (S/A)
změna násobek změny (S/A)
změna násobek změny (S/A)
změna násobek změny (S/A)
501 ct130_gene_2152 A1B400 Extracellular solute-binding protein, family 1
� 2,7 � 2,8 � 2,2 � 2,2 � 2,5
806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 3,4 � 4,9 � 2,9 � 1,5 � 3,3
1106 ct130_gene_2287 A1B4D4 Membrane protein of uknown function UCP014873
� 324,2 � 820,1 � 169,8 � 548,6 � 368,4
1114 ct74_gene_3673 A1B896 Transcriptional activator, TenA family
� 3,3 � 947,0 � 650,0 � 1,7 � 4,7
1406 ct73_gene_4983 A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold � 5,9 � 1,1 � 5,5 � 272,8 � 4,0 1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 28,9 � 10,4 � 21,1 � 9,4 � 16,5
2206 ct130_gene_0206 A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
� 415,4 � 1205,0 � 258,9 � 1066,3 � 558,7
2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 48,7 � 21,7 � 17,8 � 26,9 � 25,4
2808 ct130_gene_2497 A1B4Z0 Catalase-peroxidase � 2,9 � 1,4 � 1,2 � 3,8 � 2,1
3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 6,0 � 4,7 � 4,0 � 6,2 � 5,2
3802 ct130_gene_0062 A1AY35 ATPase AAA-2 domain protein
� 7,2 � 3,8 � 5,6 � 10 � 6,0
3807 ct130_gene_0062 A1AY35 ATPase AAA-2 domain protein
� 36,6 � 13,3 � 28,2 � 156 � 23,9
4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 9,4 � 4,3 � 7,7 � 10,6 � 8,7 5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 1297,2 � 3,7 � 1469,6 � 4187,2 � 1555,0
5202 ct130_gene_2604 A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein
� 2,5 � 2,9 � 2,5 � 3,8 � 2,9
5507 ct130_gene_0686 A1AZV4 TolB, N-terminal domain protein
� 2,7 � 5,2 � 4,6 � 4,1 � 3,9
5703 ct74_gene_4030 A1B9A2 2-isopropylmalate synthase � 4,2 � 3,1 � 1,8 � 5,3 � 3,4
5706 ct130_gene_1697 A1B2Q0 Transketolase � 26,5 � 130,2 � 17,7 � 81,1 � 45,7
7104 ct130_gene_2377 A1B4M3 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
� 8,1 � 12,6 � 5,1 � 7,1 � 8,1
8701 ct74_gene_2871 A1B611 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase
� 2,3 � 1,4 � 1,7 � 2,4 � 1,9
1110 ct130_gene_0745 A1B013 50S ribosomal protein L10 � 0,4 � 0,5 � 0,6 � 0,4 � 0,5
1121 ct130_gene_0657 A1AZS5 Putative uncharacterized protein
� 0,1 � 0,2 � 0,1 � 0,1 � 0,1
45
Tabulka VI: Spoty vykazující změnu v expresi při růstu za podmínek semiaerobních s dusičnanem v porovnání s růstem za
aerobních podmínek divokého kmene. Je také ukázána exprese dalších kmenů. Číselné hodnoty tučně znamenají významnou
statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické významnosti a obyčejný font – významnost nebyla testována.
wt FnrP NNR NarR všechny kmeny
SSP Contig/číslo genu Název proteinu změna násobek změny (N/A)
změna násobek změny (N/A)
změna násobek změny (N/A)
změna násobek změny (N/A)
změna násobek změny (N/A)
804 ct130_gene_2610 A1B5A3 TonB-dependent receptor � 2,9 � 1,1 � 1,4 � 1,9 � 1,8
806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 18,3 � 4,0 � 1,8 � 5,6 � 7,1
1114 ct74_gene_3673 A1B896 Transcriptional activator, TenA family
� 8,5 � 3729,2 � 1026,0 � 4,6 � 11,8
1406 ct73_gene_4983 A1BBZ9 Alpha/beta hydrolase fold � 10,1 � 1,5 � 6,0 � 165,4 � 4,8
1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 29,2 � 15,5 � 47,4 � 68,3 � 35,0
2206 ct130_gene_0206 A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
� 266,1 � 978,9 � 311,1 � 1168,3 � 508,2
2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 29,3 � 85,4 � 15,4 � 28,6 � 24,7
3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 2,1 � 4,5 � 3,5 � 5,3 � 3,7
3802 ct130_gene_0062 A1AY35 ATPase AAA-2 domain protein
� 4,5 � 1,4 � 2,6 � 5,3 � 3,0
4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 4,9 � 3,8 � 5,8 � 9,0 � 6,2
5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 371,6 � 1,4 � 880,2 � 2220,2 � 756,0
5202 ct130_gene_2604 A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein
� 2,3 � 2,6 � 2,1 � 3,0 � 2,5
5710 ct74_gene_4235 A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit
� 5,9 � 2,1 � 24,9 � 5,6 � 5,2
7104 ct130_gene_2377 A1B4M3 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR
� 8,2 � 10,2 � 4,2 � 5,7 � 6,9
7114 ct74_gene_3025 A1B6G4 Putative uncharacterized protein
� 22,0 � 2,6 � 44,8 � 146,7 � 7,3
8417 ct74_gene_3407 A1B7I4 ABC transporter related � 3,0 � 3,3 � 1,0 � 0,8 � 1,7
1121 ct130_gene_0657 A1AZS5 Putative uncharacterized protein
� 0,3 � 0,3 � 0,2 � 0,2 � 0,2
46
1. 2 Proteiny ovlivněné mutací v transkripčním regulátoru
Na základě statistické analýzy byly nalezeny spoty, které se lišily mezi mutantními
kmeny a divokým kmenem za jednotlivé růstové podmínky. Tyto proteiny jsou uvedeny
v tabulce VII. Za aerobních podmínek nebyl nalezen žádný takovýto protein. Za
semiaerobních podmínek vykazovaly 4 spoty snížení u FnrP- mutanta v porovnání s divokým
kmenem. Jsou to N2O reduktasa (spot 2701), UspA domain protein (spot 3211) a OmpW
family protein (spoty 4105 a 5105).
Za podmínek semiaerobních s dusičnanem je situace mnohem zajímavější. Sníženou
expresi u FnrP- mutanta oproti divokému kmeni vykazovaly 4 spoty: OmpW family protein
(spoty 4105 a 5105), β-podjednotka respirační nitrátreduktasy (spot 5710) a TonB dependent
receptor (spot 804). Sníženou expresi u mutanta NNR- vykazovaly 3 spoty: TonB dependent
receptor (spot 804), β-podjednotka respirační nitrátreduktasy (spot 5710) a ABC transporter
related protein (spoty 8417). U mutanta NarR- byla exprese snížena jen u jednoho proteinu, a
sice β-podjednotky respirační nitrátreduktasy (spot 5710). U jisté skupiny spotů došlo také ke
zvýšení exprese u mutanta NarR-. Jedná se o spoty identifikované jako Membrane protein of
uknown function UCP014873 (spot 1106), nitritreduktasa (1701), N2O reduktasa (spot 2701),
a UspA domain protein (spot 3211).
47
Tabulka VII: Spoty s jediným identifikovaným proteinem vykazující změnu v závislosti
na přítomnosti mutace v transkripčním faktoru za dané růstové podmínky. Číselné
hodnoty tučně znamenají významnou statistickou změnu, kurzíva – změnu bez statistické
významnosti a obyčejný font – významnost nebyla testována.
FnrP/wt NarR/wt NNR/wt
změna násobek změny
změna násobek změny
změna násobek změny
podmínky semiaerobní
2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 0,1 1,3 1,2
3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 0,4 0,9 0,8
4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,1 1,0 1,1
5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,0 1,3 1,3
podmínky semiaerobní s dusičnanem
804 ct130_gene_2610 A1B5A3 TonB-dependent receptor � 0,4 � 0,6 � 0,5
806 ct130_gene_2046 A1B3P4 TonB-dependent receptor � 0,2 � 0,2 � 0,1
1106 ct130_gene_2287 A1B4D4 Membrane protein of uknown function UCP014873 � 1,8 � 9,3 � 6,2
1701 ct130_gene_2487 Q51700 Nitrite reductase � 1,0 � 2,0 � 1,7
2701 ct74_gene_4219 A1B9T9 Nitrous-oxide reductase � 0,9 � 2,3 � 1,8
3211 ct130_gene_1849 A1B352 UspA domain protein � 1,1 � 2,1 � 1,9
4107 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,2 � 1,7 � 1,6
5105 ct74_gene_3636 A1B859 OmpW family protein � 0,0 � 2,3 � 2,7
5710 ct74_gene_4235 A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit � 0,2 � 0,2 � 0,2
8417 ct74_gene_3407 A1B7I4 ABC transporter related 0,3 � 0,4 � 0,6 �
48
1. 3 Srovnání exprese vybraných genů na úrovni proteinu a cDNA
Exprese vybraných proteinů byla validována pomocí qRT-PCR, tedy hladiny mRNA
(transkriptu). Níže uvedené grafy představují srovnání hladiny proteinu (graf představující
průměrnou kvantitu spotu) a hladiny transkriptu genu pro daný protein – hladinu mRNA
(graf představující poměr exprese transkriptu oproti divokému kmeni za aerobních
podmínek).
Obrázky č. 14 a 15: A1B352 UspA domain protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 3211, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 1849, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců je u obou obrázků stejné: zleva wt A, wt S, wt N, FnrP- A, FnrP- S, FnrP- N, NNR- A, NNR- S, NNR- N, NarR- A, NarR- S, NarR- N (A = aerobní podmínky, S = semiaerobní podmínky, N = podmínky semiaerobní s dusičnanem).
0
5
10
15
1
2-∆∆Ct
49
0
1
2
4
5
1
2-∆∆Ct
Obrázky č. 16 a 17: A1B9V5 Respiratory nitrate reductase beta subunit. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5710, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 4235, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
Obrázky č. 18 a 19: Q51700 Nitrite reductase. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 1701, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 2487, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
-1
2
4
6
8
10
12
1
2-∆∆Ct
50
Obrázky č. 20 a 21: A1B9T9 Nitrous-oxide reductase. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 2701, graf obrázek znázorňuje profil transkriptu genu 4219, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
Obrázky č. 22 a 23: A1B859 OmpW family protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 4107, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3636, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
-1
5
11
16
1
2-∆∆Ct
-1
1
3
5
7
9
11
1
2-∆∆Ct
51
Obrázky č. 24 a 25: A1B859 OmpW family protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5105, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3636, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
Obrázky č. 26 a 27: A1B597 SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation protein. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 5202, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 2604, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
-1
1
3
5
7
9
11
1
2-∆∆Ct
0
2
4
6
8
1
2-∆∆Ct
52
Obrázky č. 28 a 29: A1B7I4 ABC transporter related. Obrázek vlevo znázorňuje průměrnou intenzitu spotu 8417, obrázek vpravo znázorňuje profil transkriptu genu 3407, přičemž hodnota 2-∆∆Ct vyjadřuje, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.
0
10
20
30
40
50
1
2-∆∆Ct
53
Obrázky č. 30, 31, 32: Potvrzení operonu. Obrázky znázorňují průměrnou intenzitu spotů (zleva) 3203, 1406 a 1301, které odpovídají genům 4982, 4983 a 4984. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
Obrázky č. 33, 34, 35: Potvrzení operonu. Obrázky znázorňují profil transkriptů genů (zleva) 4982, 4983 a 4984, přičemž osa y představuje hodnotu 2-∆∆Ct vyjadřující kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str.48.
0
50
100
150
200
1 0
20
40
60
80
100
1 0
100
200
300
400
500
600
1
54
Obrázky č. 36, 37, 38: TonB-dependent receptors. Obrázky znázorňují průměrnou intenzitu spotů (bráno zleva) 804 (A1B5A3 TonB-dependent receptor), 806 (A1B3P4 TonB-dependent receptor) a směsného spotu 1814 (A1B6E6 TonB-dependent siderophore receptor a A1B3P4 TonB-dependent receptor). Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.
Obrázky č. 39, 40, 41: TonB-dependent receptors. Obrázky znázorňují profily transkriptů genů (zleva) 2610 (odpovídá spotu 804), 3007 (odpovídá převažujícímu proteinu ve směsném spotu 1814) a 3527 (odpovídá minoritnímu proteinu ve směsném spotu 1814). Osa y představuje hodnotu 2-∆∆Ct vyjadřující, kolikrát je hladina mRNA vyšší u ostatních kmenů a růstových podmínek v porovnání s divokým kmenem za aerobních podmínek. Chybové úsečky představují směrodatnou odchylku ze tří měření. Pořadí sloupců viz legendu k obrázkům č. 14 a 15., str. 48.
-2
1
3
5
7
9
1
0
50
100
150
200
250
300
1
0
50
100
150
200
250
1
55
V. DISKUZE
Pokrytí proteomu P. denitrificans
V rámci diplomové práce se podařilo významně rozšířit pokrytí proteomu bakterie
Paracoccus denitrificans. Díky kompletnímu osekvenování genomu došlo ke zvýšení
efektivity identifikace z 2-D gelu oproti předchozí proteomické studii P. denitrificans 23 ze
4 genových produktů až na 640. Genom bakterie obsahuje 5134 genů kódujících proteiny, je
tedy zřejmé, že pomocí námi zvoleného přístupu jsme schopni detekovat jen něco přes 12 %
teoretických genových produktů. Na druhou stranu lze předpokládat, že zdaleka ne všechny
geny jsou za zvolených podmínek exprimovány. Limitace použité technologie spočívá
zejména ve spektru detekovaných proteinů, kdy pomocí 2-DE detekujeme zejména proteiny
s nejvyššími hladinami exprese, které jsou současně hydrofilní. Hydrofobní membránové
proteiny s více než jednou transmembránovou doménou touto metodou zpravidla není možné
analyzovat 24, což v našem experimentu pěkně dokumentuje membránově vázaný enzym
nitrátreduktasa, kdy jsme dle našeho očekávání detekovali jen její nejméně hydrofobní α a
β-podjednotky.
Proteiny obsahující ve svém promotoru FNR-box
Protein identifikovaný ve spotu 3211 je produkt genu 1849 reprezentující „UspA
domain protein“. Univerzální stresový protein A je malý cytoplazmatický protein, jehož
exprese je zvýšena při vystavení buňky stresovým vlivům. Výrazně zvyšuje míru přežití
buněk při delším působení těchto vlivů a aktivuje pochody vedoucí k obecné odolnosti vůči
stresu 33. Gen pro tento protein se u P. denitrificans nachází přímo vedle genu pro samotný
transkripční faktor FnrP (gen 1850). Také na základě profilu jeho exprese (obrázek č. 14) se
dá předpokládat, že se nachází ve stejném operonu jako FnrP. Tento fakt byl potvrzen na
úrovni mRNA (obrázek č. 15) – exprese tohoto genu je výrazně potlačena u FnrP- mutanta za
všech růstových podmínek ve srovnání s ostatními kmeny. Expresní profily tohoto genového
produktu tedy biologicky validují celý experiment od konstrukce FnrP- mutanta až po
kvantifikaci a identifikaci proteinu.
56
Jelikož do syntézy denitrifikačních enzymů jsou podle současných znalostí zapojeny
všechny 3 regulační proteiny (FnrP, NNR a NarR), kvantitativní změny těchto enzymů slouží
jako vnitřní kontrola zjištěných dat. Je totiž známo, že geny všech těchto enzymů obsahují ve
svém promotoru vazebnou sekvenci pro FNR proteiny. Ve spotu 5710 se podařilo
identifikovat nejméně hydrofobní β-podjednotku membránové nitrátreduktasy. Jak je vidět
z obrázku č. 16, exprese za aerobních podmínek je dle očekávání vždy nejnižší oproti zbylým
dvěma podmínkám v rámci daného kmene, navíc u mutanta NarR- je exprese za podmínek
semiaerobních a semiaerobních s dusičnanem vždy nižší ve srovnání se stejnou růstovou
podmínkou u jiných kmenů, což potvrzuje fakt, že NarR aktivuje expresi daného enzymu. Na
úrovni cDNA (obrázek č. 17) je také patrná nižší hladina transkriptu příslušného genu u
mutanta NarR- oproti kmenu divokému. Zejména však z tabulky VII vyplývá výrazné snížení
exprese u všech mutantních kmenů za semiaerobních podmínek s dusičnanem, což je
v případě kmenů FnrP- a NarR- v souladu s publikovanými daty 6. Zajímavé je snížení
exprese i u kmene NNR-, což poukazuje na možnost větší provázanosti regulačních procesů,
než se dosud předpokládalo. Nitritreduktasa (spot 1701) vykazuje za aerobních podmínek
totéž očekávané chování jako ostatní denitrifikační enzymy, a sice velmi nízkou expresi
(obrázek č. 18). Ovlivnění tohoto enzymu pomocí NNR 9 se ale nepodařilo na úrovni
proteinu potvrdit. Na úrovni cDNA (obrázek č. 19) jsou změny v hladinách transkriptů tak
malé, že z nich taktéž nelze učinit žádný závěr. Ve spotu 2701 byla identifikována N2O
reduktasa. Doposud nebylo studováno, kterým ze tří transkripčních faktorů je exprese tohoto
enzymu regulována, nicméně v promotoru příslušného genu se nachází FNR-box o sekvenci
5´-TTGACCTAAGTCAA-3´ 26. Naše výsledky naznačují, že pozitivním regulátorem by
mohl být FnrP, jelikož u na úrovni proteinu dochází ke snížení exprese u mutanta FnrP- za
semiaerobních podmínek (tabulka VII, obrázek č. 20). Data na úrovni cDNA toto chování za
semiaerobních podmínek potvrzují (obrázek č. 21). Čtvrtý enzym denitrifikační dráhy, NO
reduktasa, byla identifikována pouze ve směsném spotu, informace o jejím proteinovém
expresním profilu proto nemůžeme z tohoto experimentu získat.
Sníženou expresi u FnrP- mutanta za všech podmínek vykazoval protein „OmpW
family protein” (spoty 4107 a 5105, gen 3636, obrázky č. 22-25), což by nasvědčovalo
pozitivní regulaci pomocí FnrP. Pomocí bioinformatické analýzy byl v promotoru tohoto
57
genu nalezen FNR-box o sekvenci 5´-TTGATCCAGATCAA-3´ v pozici -41,5 od počátku
transkripce, což tuto myšlenku o pozitivní regulaci pomocí FnrP plně potvrzuje. Navíc
existuje i analogie u E.coli, u níž se v operonu ompW také nachází sekvence FNR-boxu a
tento operon je pozitivně regulován 28. OmpW patří do rodiny malých proteinů vnější
membrány, jež jsou rozšířeny u gram-negativních bakterií. Jejich funkce není známa, ale
současné studie naznačují, že se mohou podílet na ochraně bakterií před stresovými vlivy
vnějšího prostředí (jak to bylo prokázáno u původce cholery Vibrio cholerae 29) a také na
transportu malých hydrofobních molekul skrz vnější membránu 30. U E. coli je ompW za
normálních růstových podmínek exprimován jen v malé míře a slouží jako receptor pro
kolicin S4 31, což je protein produkovaný některými kmeny E. coli a zároveň je pro některé
kmeny této bakterie toxický.
Spot 7104 byl identifikován jako produkt genu 2377 (A1B4M3 Short-chain
dehydrogenase/reductase SDR). FNR-box (5´-TTGACGGGTGTTAA-3´) se v tomto
případě nachází v promotoru genu 2387. Tento gen leží už poměrně daleko od námi
identifikovaného genu, je tedy otázkou, zda je i tento gen regulován pomocí některého
z transkripčních faktorů typu FNR. Homologní protein byl nalezen ve spotu 2206 (gen 0206,
A1AYH6 Short-chain dehydrogenase/reductase SDR), který vykazuje stejné chování jako
spot 7104 (tabulky V a VI). U tohoto genu jsem nalezla v promotorové oblasti sekvenci
podobnou FNR-boxu (5´-GTGATCGACATCAA-3´). Nelze však s jistotou tvrdit, že je tato
sekvence proteiny typu FNR rozpoznávána a že se tudíž jedná o opravdový FNR-box, což by
znamenalo, že exprese tohoto proteinu je pomocí některého těchto proteinů regulována.
Proteiny, jejichž geny se nacházejí v blízkosti genu pro transkripční faktor jiného typu
U transkripčních regulátorů (TR) typu FNR se gen pro samotný regulátor mnohdy
nachází v blízkosti genu, jehož expresi reguluje, což má svůj význam z hlediska
synchronizace exprese, kdy tyto TR často regulují i expresi sebe samých. Proto jsme se
snažili u genů, jejichž exprese se významně měnila v závislosti na růstových podmínkách,
hledat v jejich okolí gen i pro TR jiného typu. Bohužel názvy těchto proteinů odkazují jen na
jejich strukturu a motiv DNA vazebné domény, nikoli na to, jaké geny regulují.
U 3 genů se v blízkosti nacházel TR ze superrodiny s DNA vazebnou doménou
„winged helix“, konkrétně tedy „two component transcription regulator, winged helix
58
family“. Dvoukomponentní regulační systémy jsou obvykle spojeny s odpovědí na změny
vnějšího prostředí a uplatňují se také při regulaci exprese virulentních znaků. Skládají se ze
senzoru v podobě kinasy a odpovídajícího regulátoru, který je fosforylován senzorovou
kinasou prostřednictvím signálu, který následuje po vnějším stimulu 32. Spot 8417, jenž
vykazuje sníženou expresi u NNR- mutanta za semiaerobních podmínek s dusičnanem
(tabulka VII, obrázek č. 28), byl identifikován jako gen 3407, „ABC transporter related“, a
TR je kódován genem 3403. Snížení exprese u NNR- mutanta za semiaerobních podmínek
s dusičnanem bylo potvrzeno i na úrovni mRNA (obrázek č. 29). Ve druhém případě jde o
„Short-chain dehydrogenase/reductase SDR“ (spot 7104, gen 2377), TR je kódován genem
2374. U posledního genu 2604 kódující „SSU ribosomal protein S30P / sigma 54 modulation
protein“ (spot 5202) se v okolí nachází kromě výše zmíněného TR (gen 2600) i TR z rodiny
MarR (gen 2601), který také náleží do superrodiny „winged helix“.
U dvou genů se v blízkosti nacházel TR z rodiny GntR. Tato rodina náleží opět do
superrodiny „winged helix“, na N-konci obsahuje vazebnou doménu helix-otáčka-helix, na
C-konci se nachází doména pro vazbu efektoru 33. Jedná se o protein „Transcriptional
activator, TenA family“ (spot 1114, gen 3673), který je sám o sobě transkripčním
regulátorem, navíc gen 3677 kóduje TR z rodiny GntR. Ve druhém případě jde o „TolB, N-
terminal domain protein“ (spot 5507,gen 0686), kde je TR kódován genem 0680.
Dalším typem TR, který byl nalezen v blízkosti lokusu 2 genů, je TR z rodiny LysR.
Většina proteinů z této rodiny jsou transkripčními aktivátory a zároveň negativně regulují
svoji vlastní expresi. V blízkosti N-konce obsahují vazebnou doménu helix-otáčka-helix 33.
Prvním genem je gen 0206 pro „Short-chain dehydrogenase/reductase SDR“ (spot 2206), kde
je TR z rodiny LysR kódován genem 0209. Druhým je gen 1697 kódující transketolasu (spot
5706), zde je TR kódován genem 1694.
TR z rodiny MerR kódovaný genem 2867 se nachází v blízkosti genu 2871 pro 3-
hydroxyacyl-CoA-dehydrogenasu (spot 8701). TR z této rodiny zprostředkovávají indukci
operonu pro rezistenci ke rtuti 33. Dalším nalezeným TR je transkripční antiterminační
protein NusG (gen 0742) v blízkosti genu 0745 pro „50S ribosomal protein L10“ (spot 1110).
Protein NusG je součásti transkripčního komplexu a ovlivňuje terminaci transkripce, navíc
interaguje s terminačním ρ-faktorem a RNA polymerasou 33. TR z rodiny AsnC (gen 0653)
59
se nachází nedaleko genu 0657 pro „Putative uncharacterized protein“ (spot 1121). Rodina
těchto TR se podílí na regulaci metabolismu aminokyselin a s tím spojenými procesy 33.
Hned vedle genu 3025 pro „Putative uncharacterized protein“ (spot 7114) se nachází TR
BadM z rodiny Rrf2. Některé proteiny z této rodiny se uplatňují jako represory, konkrétně u
BadM bylo prokázáno, že u bakterie Rhodopseudomonas palustris působí jako represor
exprese benzoyl-CoA-reduktasy 34.
Potvrzení operonu
Pomocí MS byly ve spotech identifikovány produkty genů 4982, 4983 a 4984, jež se
v genomu nacházejí za sebou. Profil exprese proteinů ve spotech byl stejný (obrázky č. 30-
32), dalo by se tedy předpokládat, že jsou přepisovány v jednom operonu, a tím pádem stejně
regulovány. Toto jsme validovali i na úrovni mRNA. Jak je vidět z obrázků č. 33-35, trendy
se opět shodují, až na hodnotu pro gen 4984 u NNR- S, kde se může jednat o odlehlý
výsledek.
„TonB-dependent receptors“
Protein s názvem „TonB-dependent receptor“ byl nalezen jako produkt různých genů
v několika spotech ve formě homologních proteinů. TonB je protein buněčné stěny gram-
negativních bakterií, který se podílí na transportu komplexů kovů (převážně sideroforů) přes
vnější membránu za spotřeby energie 35. Na TonB závislé transportéry (TonB-dependent
transporters) aktivně pumpují cheláty iontů železa (siderofory) přes vnější membránu do
buňky. Energie pro tyto transportéry je dodávána komplexem tří proteinů (TonB – in vivo
vytváří dimer, ExbB a ExbD), které využívají protonový gradient udržovaný na
cytoplazmatické membráně. Přesný mechanismus využití elektrochemického potenciálu
k importu sideroforů není jasný. Do této různorodé skupiny proteinů náleží například
transportéry pro citrát železitý (FecA), ferrichrom (FhuA), železitý enterobactin (FepA), další
organokovové sloučeniny, jako vitamin B12 (BtuB) 36, a také některé koliciny 37. Všechny
spoty obsahující „TonB-dependent receptor“ vykazovaly stejný trend, kdy exprese za
aerobních podmínek byla u všech mutantů výrazně snížená (tabulky V a VI), u divokého
60
kmene byla navíc exprese výrazně zvýšená za semiaerobních podmínek s dusičnanem ve
srovnání s ostatními kmeny za dané podmínky (tabulka VII, obrázky č. 36-38). Stejné trendy
se podařilo potvrdit i na úrovni transkriptů příslušných genů (obrázky č. 39-41).
V promotorech odpovídajících genů jsme nenalezli žádný FNR box, takže se dá
předpokládat, že mechanismus regulace nebude přímo závislý na FNR regulátorech.
V souhrnu lze říci, že denitrifikační enzymy a jejich regulace pomocí FNR proteinů je
jasně popsaná a dává fyziologický smysl. V případě proteinu „TonB-dependent receptor“ by
se dalo uvažovat o zapojení do transportu železa, které je stavební složkou denitrifikačních
enzymů. Fyziologická souvislost funkce detekovaných proteinů, jejichž promotory
neobsahují FNR-box, a předpokládaná regulace jejich genové exprese však jasná není a je
otázkou, zda je důsledkem prosté biologické variability, zda se jedná o evoluční pozůstatek,
anebo jde o regulaci za účasti proteinů s dosud neobjasněnou funkcí. Jako možné vysvětlení
se jeví také analogie s bakterií Pseudomonas aeruginosa 32, kde byly za využití
bioinformatické analýzy genomu popsány regulační sítě s různou hierarchií transkripčních
regulátorů. Regulátory z rodiny FNR proteinů přitom hrály dominantní roli, přičemž byly
prokázány regulace cílových proteinů prostřednictvím podřízených transkripčních regulátorů,
například z rodiny LysR nebo GntR. Pro detailní objasnění těchto hypotéz by však byla třeba
řada dalších analýz. Naše výsledky přitom prokazují použitelnost proteomických technik
k tomuto účelu.
61
VI. SOUHRN
Za využití 2-DE experimentu byl studován účinek regulačních proteinů typu FNR
(FnrP, NNR a NarR) bakterie P. denitrificans na globální proteomové úrovni. Proteomová
analýza potvrdila řadu známých mechanismů, které byly validovány jednak vyhledáním
FNR-boxů (rekogniční DNA sekvence FNR regulačních proteinů), jednak metodou
kvantitativní real-time PCR. To potvrzuje, že řádně designovaný a provedený proteomický
experiment je schopen takovéto regulace odhalit. Statistickou analýzou 2-DE gelů byly
nalezeny proteiny, jejichž exprese se mění v závislosti na růstových podmínkách (aerobní,
semiaerobní a semiaerobní s dusičnanem) nebo v závislosti na přítomnosti mutace v genu pro
regulační protein. Ne u všech takto zjištěných proteinů je ale jasná jejich biologická funkce.
Na základě kvantitativní analýzy spotů obsahující proteiny kódované geny 4982,
4983 a 4984, které vykazovaly stejný profil exprese, a následně na základě real-time PCR
(stanovení hladiny transkriptů daných genů) se podařilo potvrdit, že tyto geny jsou
přepisovány z jednoho operonu.
Zajímavá změna v expresi byla odhalena u proteinů s názvem „TonB-dependent
receptor“, které jsou součástí transportního systému pro kovy (železo) přes vnější membránu
bakterií. Je zde zřejmá jistá regulace v expresi, která byla potvrzena i pomocí real-time PCR.
Regulace těchto proteinů ale pravděpodobně nebude přímo závislá na regulátorech typu
FNR.
V tzv. „postgenomové“ éře, kdy už existuje osekvenovaný genom daného organismu,
nejde jen o to pochopit funkce všech proteinů anotovaných v genomu, ale další výzvou je
bezesporu porozumění globální regulaci exprese těchto proteinů. Při přechodu z aerobního
metabolismu P. denitrificans k denitrifikaci se na regulaci exprese zcela jistě nepodílí jen
samotné transkripční regulátory FnrP, NNR a NarR. Tato regulace bude určitě složitější. Je
také pravděpodobné, že pro různé proteiny se budou uplatňovat různé mechanismy regulace.
62
VII. SUMMARY
A role of FNR-type regulation proteins (FnrP, NNR and NarR) in the bacterium
Paracoccus denitrificans was studied on the global proteomic level using 2-DE experiment.
Proteomic analysis confirmed several known mechanisms that were validated by both
searching of FNR-boxes (DNA recognition sequence motif of FNR-type regulators) and
quantitative real-time PCR method. It certifies that a properly designed and realized
proteomic experiment is able to reveal such regulations. There were proteins found by the
statistical analysis of 2-DE gels whose expression is altered depending on either growth
conditions (aerobic, semiaerobic and semiaerobic with nitrate) or a mutation of the gene of
the regulation protein. However the biological role of some of these proteins remains unclear.
Based on the quantitative analysis of the spots containing the proteins encoded by
genes 4982, 4983 and 4984, that exhibited the same expression profile, and subsequently
based on real-time PCR (determination of particular gene transcripts level), it was
acknowledged that these genes are transcribed in the same operon.
There was an interesting altered expression of proteins called TonB-dependent
receptor revealed. Such proteins are part of the metal (especially iron) transport systems
across the outer membrane of the bacteria. Regulation of the expression is evident and it was
validated by real-time PCR. But regulation of these proteins is probably not FNR-type
regulators dependent.
In the so called “postgenomic” age as there is a genome of particular organism
sequenced it is not only the understanding the proteins function itself but another challenge
there is the understanding of the global regulation of the proteins expression. During the shift
from aerobic metabolism to denitrification in P. denitrificans there are surely more effects
than only transcription regulators FnrP, NNR and NarR participating in the regulation of the
expression. This regulation is certainly more complex, it is probable that for different
proteins there are different regulation mechanisms involved.
63
VIII. LITERATURA
1. Otten M.F., van der Oost J., Reijnders W.N.M., Westerhoff H.V., Ludwig B. and van
Spanning R.J.M. (2001), Cytochromes c550, c552 and c1 in the electron transport network
of Paracoccus denitrificans: Redundant or subtly different in function?, J. Bacteriol.,
183, 7017 – 7026
2. Otten M. F., Stork D. M., Reijnders W. N. M., Westerhoff H. V. and van Spanning R. J.
M., (2001), Regulation of expression of terminal oxidases in Paracoccus denitrificans.,
Eur. J. Biochem., 268, 2486-2497
3. Zickermann I., Anemüller S., Richter H. O.-M., Tautu S.O., Link A.T., Ludwig B., (1996),
Biochemical and spectroscopic properties of four-subunit quinol oxidase (cytochrome
ba3) from Paracoccus denitrificans., Biochim. Biophys. Acta, 1277, 93 – 102
4. Baker S.C., Ferguson S.J., Ludwig B., Page M. D., Richter H. O.-M. and van Spanning R J
M., (1998), Molecular genetics of the genus Paracoccus: Metabolically versatile bacteria
with bioenergetic flexibility., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1046-1078
5. Zumft W. G., (1997), Cell biology and molecular basis of denitrification, Microbiol.
Mol. Biol. Rev., 61(4), 533-616.
6. Wood N. J., Alizadeh T., Bennett S., Pearce J., Ferguson S. J., Richardson D. J. and Moir
J. W. B., (2001), Maximal expression of membrane-bound nitrate reductase in
Paracoccus is induced by nitrate via a third FNR-like regulator named NarR, J.
Bacteriol., 183(12), 3606-13
7. Veldman R., Reijnders W. N. M., van Spanning R. J. M., (2006), Specificity of FNR-type
regulators in Paracoccus denitrificans, Biochem. Soc. Trans., 34(Pt 1), 94-6
64
8. Lazazzera A. B., Beinert H., Khoroshilova N., Kennedy M. C., Kiley P. J., DNA binding
and dimerization of the Fe–S-containing FNR protein from Escherichia coli are
regulated by oxygen, J. Biol. Chem., 271, 2762-2768
9. van Spanning R. J. M., De Boer A. P. N., Reijnders W. N. M., Spiro S., Westerhoff H. V.,
Stouthamer A. H. a van der Oost J., (1995), Nitrite and nitric oxide reduction in
Paracoccus denitrificans is under the control of NNR, a regulatory protein that belongs
to the FNR family of transcriptional activators, FEBS Lett., 360(2), 151-4
10. van Spanning R. J. M., Houben E., Reijnders W. N. M, Spiro S., Westerhoff H. V. and
Saunders N., (1999), Nitric oxide is a signal for NNR-mediated transcription activation
in Paracoccus denitrificans, J. Bacteriol., 181(13), 4129-32
11. Lee Y. Y., Shearer N and Spiro S., (2006), Transcription factor NNR from Paracoccus
denitrificans is a sensor of both nitric oxide and oxygen: isolation of nnr* alleles
encoding effector-independent proteins and evidence for a haem-based sensing
mechanism, Microbiology, 152(Pt 5), 1461-70
12. Görg A., Weiss W., Dunn J. M., (2004), Current two-dimensional electrophoresis
technology for proteomics, Proteomics, 4, 3663-3685
13. López J. L., (2007), Two-dimensional electrophoresis in proteome expression
analysis, J. Chromatogr. B, 849, 190-202
14. Westermeier R., Naven T., (2002), Proteomics in practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH,
Weinheim, ISBN 3-527-30354-5, 43
15. Liebler D. C., (2002), Introduction to proteomics: tools for the new biology, Humana
Press Inc., ISBN 0-89603-991-9, 55-69
65
16. Kodíček M., (2007), transkripce reversní. Biochemické pojmy: výkladový slovník,
Praha, VŠCHT , http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002/ebook.html?p=transkripce_reversni,
20.1.2009
17. Voet D., Voet G. J., (2004), Biochemistry, 3rd edition, ISBN 0-471-19350-x, 113
18. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Kostíková J., (2005), Metody
molekulární biologie, 124-125
19. Pavlík E., Pavlíková A., (2004), Molekulárně biologické techniky pro
mikrobiologickou diagnostiku – část 11, Labor Aktuell, 3, 10-13
20. Ginzinger G. D., (2002), Gene quantification using real-time quantitative PCR: An
emerging technology hits the mainstream, Exp. Hematol., 30(6), 503-512
21. Antonín Libra, Kvantifikace genové exprese pomocí real-time PCR, http://mat.skola-
biotechnologie.cz/2006/III.workshop/Q_PCR.pdf, 22.2. 2009
22. Tereza Vyhlídalová, (2007), Metabolická odezva bakterie Paracoccus denitrificans na
změny redoxního stavu prostředí, diplomová práce, MU, Brno
23. Bouchal P., Přecechtělová P., Zdráhal Z., Kučera I., (2004), Protein composition of
Paracoccus denitrificans cells grown on various electron acceptors and in the presence
of azide. Proteomics, 4, 2662-2671
24. Santoni V., Molloy M., Rabilloud T., (2000), Membrane proteins and proteomics: un
amour impossible?, Electrophoresis, 21(6), 1054-70
25. Läemmli U. K, (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4, Nature, 227(5259), 680-5
66
26. van Spanning R. J. M., Vrije Universiteit Amsterdam, nepublikovaná data
27. Kunitz, M., (1950), Crystalline desoxyribonuclease; isolation and general properties;
spectrophotometric method for the measurement of desoxyribonuclease activity, J. Gen.
Physiol., 33(4), 349-362
28. Constantinidou C., Hobman J. L., Griffiths L., Patel M. D., Penn C. W., Cole J. A.,
Overton T.W., (2006), A reassessment of the FNR regulon and transcriptomic analysis of
the effects of nitrate, nitrite, NarXL, and NarQP as Escherichia coli K12 adapts from
aerobic to anaerobic growth, J. Biol. Chem., 281(8), 4802-15
29. Nandi B., Nandy R. K., Sarkar A., Ghose A. C., (2005), Structural features, properties
and regulation of the outer-membrane protein W (OmpW) of Vibrio cholerae,
Microbiology, 151(9), 2975-86
30. Hong H., Patel D. R., Tamm L. K., van den Berg B., (2006), The outer membrane
protein OmpW forms an eight-stranded beta-barrel with a hydrophobic channel, J.
Biol. Chem., 281(11), 7568-77
31. Pilsl H., Šmajs D., Braun V., (1999), Characterization of colicin S4 and its receptor,
OmpW, a minor protein of the Escherichia coli outer membrane, J. Bacteriol., 181(11),
3578-81
32. Potvin E., Sanschagrin F., Levesque R. C., (2008), Sigma factors in Pseudomonas
aeruginosa, FEMS Microbiol. Rev., 32(1), 38-55
33. http://pfam.sanger.ac.uk, 12.4. 2009
67
34. Peres C. M., Harwood C. S., (2006), BadM Is a Transcriptional Repressor and One of
Three Regulators That Control Benzoyl Coenzyme A Reductase Gene Expression in
Rhodopseudomonas palustris, J. Bacteriol., 188(24), 8662–8665
35. Kaserer W. A., Jiang X., Xiao Q., Scott D. C., Bauler M., Copeland D., Newton S. M.,
Klebba P. E., (2008), Insight from TonB hybrid proteins into the mechanism of iron
transport through the outer membrane, J. Bacteriol., 190(11), 4001-16
36. Ferguson A. D., Amezcua C. A., Halabi N. M., Chelliah Y., Rosen M. K., Ranganathan
R., Deisenhofer J., (2007), Signal transduction pathway of TonB-dependent transporters,
Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 104(2), 513-18
37. Mikalová L., (2007), Produkce specifických antibakteriálních agens u Salmonella
enterica, diplomová práce, MU, Brno