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8/14/2019 Dielectric Property Skin

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P r o c . N a t . A c a d . S c i . USAV o l . 6 9 , N o . 1 2 , p p . 3 5 6 1 - 3 5 6 6 , December 1 9 7 2

F o r m a t i o n o f B i m o l e c u l a r Membranes f r o m L i p i d M o n o l a y e r s a n d a S t u d yo f T h e i r E l e c t r i c a l P r o p e r t i e s

(membrane s t r u c t u r e / m e m b r a n e r e c o n s t i t u t i o n / a s y m m e t r i c m e m b r a n e s / l i p i d b i l a y e r s )M. MONTAL* AND P . M U E L L E R t j* D e p a r t a m e n t o d e B i o q u i m i c a , C e n t r o d e I n v e s t i g a c i o n y d e E s t u d i o s A v a n z a d o s d e l I . P . N . , M e x i c o 1 4 , D . F . M e x i c o ;a n d t D e p a r t m e n t o f B a s i c R e s e a r c h , E a s t e r n P e n n s y l v a n i a P s y c h i a t r i c I n s t i t u t e , P h i l a d e l p h i a , P a . 1 9 1 2 9C o m m u n i c a t e d b y B r i t t o n C h a n c e , S e p t e m b e r 6 , 1 9 7 2ABSTRACT B i m o l e c u l a r m e m b r a n e s a r e formed fromtwo l i p i d monolayers a t a n a i r - w a t e r i n t e r f a c e by th e appo-s i t i o n o f t h e i r hydrocarbon c h a i n s w h e n a n a p e r t u r e i n aT e f l o n p a r t i t i o n s e p a r a t i n g two aqueo us p h a s e s i s l o w e r e dthrough th e i n t e r f a c e . Formation o f t h e m e m b r a n e i smonitored by a n i n c r e a s e o f t h e e l e c t r i c a l c a p a c i t y , a smeasured with a v o l t a g e c l a m p . E l e c t r ic a l r e s is t a n c e o f t h eu n m o d i f i e d m e m b r a n e i s analogous t o t h a t o f conven-t i o n a l p l a n a r b i l a y e r s ( b l a c k l i p i d membranes) p r e p a r e di n t h e p r e s e n c e o f a hydrocarbon s o l v e n t , i . e . , 1 0 6 f 1 0 8 ohmc m 2 ; t h e r e s i s t a n c e ca n be l o w e r e d t o v a l u e s o f 1 0 3 ohm cm2by g r a m i c i d i n , a n a n t i b i o t i c t h a t m o d i f i e s th e conductanceo n l y w h e n t h e m e m b r a n e s a r e o f b i m o l e c u l a r t h i c k n e s s .I n c o n t r a s t t o th e r e s i s t a n c e , t h e r e i s a s i g n i f i c a n t d i f f e r -ence between th e c a p a c i t y o f b i l a y e r s m a d e f ro m m o no -l a y e r s a nd t h a t o f h y d r o c a r b o n - c o n t a i n i n g b i l a y e r s m a d eby p h a s e t r a n s i t i o n ; t h e a v e r a g e v a l u e s a r e 0 . 9 an d 0 . 4 5A F c m - 2 , r e s p e c t i v e l y . Th e v a l u e o f 0 . 9 u F cm-2 a p p r o x i -mates t h a t o f b i o l o g i c a l m e m b ra n e s . A s su m i n g a d i e l e c t r i cconstant o f 2 . 1 f o r t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n , t h e d i e l e c t r i ct h i c k n e s s , a s c a l c u l a t e d from a c a p a c i t y o f 0 . 9 1 F cm 2 , i s2 2 A . T h i s v a l u e i s 6 - 1 0 A s m a l l e r than t h e a c t u a l t h i c k n e s so f t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n o f b i l a y e r s and c e l l membranes,a s d e t e r m i n e d b y x - r a y d i f f r a c t i o n . Th e d i f f e r e n c e may bedue t o a l i m i t e d p e n e t r a t i o n o f water i n t o t h e hydrocarbonr e g i o n near t h e e s t e r groups t h a t would l o w e r t h e e l e c t r i c a lr e s i s t a n c e o f t h i s r e g i o n and r e d u c e t h e d i e l e c t r i c t h i c k -n e s s . Asymmetric m e m b r a n e s have been formed by a d j o i n -i n g two l i p i d monolayers o f d i f f e r e n t c h e m i c a l composi-t i o n .L i p i d b i l a y e r s , w h i c h a r e t h o u g h t t o b e t h e b a s i c s t r u c t u r a le l e m e n t o f c e l l m e m b r a n e s , a c c o u n t f o r many o f t h e i r p r o p e r -t i e s . T h e y c a n b e a s s e m b l e d f r o m l i p i d s e i t h e r a s s m a l lv e s i c l e s ( 1 ) o r a s s i n g l e p l a n a r s t r u c t u r e s t h a t s e p a r a t e t w oa q u e o u s p h a s e s ( 2 ) . B o t h m o d e l s c o m p l e m e n t e a c h o t h e r ,a n d e a c h h a s i t s own a d v a n t a g e s a n d s h o r t c o m i n g s . T h es p h e r i c a l b i l a y e r s a l l o w f l u x m e a s u re m e nt s w i t h r e l a t i v e e a s e ,a n d t h e a b s e n c e o f h y d r o c a r b o n s o l v e n t ma y b e a f a c t o ra i d i n g t h e i n c o r p o r a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s f o r f u n c t i o n a lr e c o n s t i t u t i o n s ( 3 - 5 ) . H o w e v e r , t h e i r i n n e r c o m p a r t m e n t i ss m a l l a n d i n a c c e s s i b l e t o c h e m i c a l m a n i p u l a t i o n a n d e l e c t r i c a lm e a s u r e m e n t s . I n p l a n a r b i l a y e r s , b o t h c o m p a r t m e n t s a r ee a s i l y a c c e s s i b l e , b u t t h e i r m o d e o f f o r m a t i o n a n d t h e p r es e nc eo f h y d r o c a r b o n s o l v e n t m ay b e r e s p o n s i b l e f o r r e p o r t e df a i l u r e s t o i n c o r p o r a t e l a r g e m e m b r a n e p r o t e i n s . I n a d d i t i o n ,t h e i r e l e c t r i c a l c a p a c i t y i s c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n t h a t o fc e l l m e m b r a n e s , i m p l y i n g a d i f f e r e n t s t r u c t u r e o r t h i c k n e s s o ft h e d i e l e c t r i c r e g i o n .F o r t h e s e r e a s o n s t h e f o r m a t i o n o f p l a n a r b i l a y e r s w i t h o u tt h e a i d o f a h y d r o c a r b o n s o l v e n t w o u l d b e d e s i r a b l e . We

r e p o r t h e r e t h e f o r m a t i o n o f p l a n a r b i l a y e r s s e p a r a t i n g t w oa q u e o u s p h a s e s , i n t h e a b s e n c e o f h y d r o c a r b o n s o l v e n t , b y t h eh y d r o p h o b i c a p p o s i t i o n o f t w o l i p i d m o n o l a y e r s a t a n a i r -w a t e r i n t e r f a c e , b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d u s e d b yT a k a g i , A z u m a , a n d K i s h i m o t o ( 6 ) t o f o r m " r h o d o p s i n mem-b r a n e s . " I t w i l l b e s h o w n t h a t t he e l e c t r i c a l c a p a c i t y o f t h e s eb i l a y e r s e x a c t l y m a t c h e s t h a t o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s , a n dt ha t t he s y s t e m a l l o w s t h e f o r m a t i o n o f a s y m m e t r i c mem-b r a n e s ; e v e n t u a l l y , t h i s t e c h n i q u e may a i d i n t h e i n c o r p o r a -t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o t h e l i p i d b i l a y e r .

MATERIALS AND METHODST h e f o l l o w i n g c h e m i c a l s w e r e u s e d : g l y c e r o l d i o l e a t e ( A r m a kC h e m i c a l s D i v i s i o n , P h i l a d e l p h i a , P a . a n d A p p l i e d S c i e n c eL a b o r a t o r i e s , I n c . , S t a t e C o l l e g e , P a . ) , o l e y o y l a c i d p h o s p h a t e( H o o k e r C h e m i c a l C o . , N i a g a r a F a l l s , N . Y . ) , e g g l e c i t h i n ,b o v i n e c a r d i o l i p i n , a n d p l a n t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( A p p l i e dS c i e n c e L a b o r a t o r i e s , I n c . ) , g r a m i c i d i n a n d c h o l e s t e r o l( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t L o u i s , M o ) . A n a l y t i c a l g r a d er e a g e n t s w e r e u s e d t h r o u g h o u t . W h i t e - m a t t e r l i p i d f r o mb r a i n w a s e x t r a c t e d a c c o r d i n g t o M u e l l e r e t a l . ( 7 ) o r b y t h em e t h o d o f L e u z i n g e r a n d S c h n e i d e r ( 8 ) .

T h e m e m b r a n e s w e r e f o r m e d i n i t i a l l y w i t h a m o d i f i e dv e r s i o n o f t h e a p p a r a t u s d e s c r i b e d b y T a k a g i ( 9 ) ( s e e F i g . l a ) .I t c o n s i s t s e s s e n t i a l l y o f t w o m o n o l a y e r t r o u g h s ( 1 8 X 1 2 c m )s e p a r a t e d b y a v e r t i c a l l y m o v a b l e s e p t u m c o n t a i n i n g i n i t sc e n t e r a h o l e o f 1 . 0 c m ( d i a m e t e r ) c o v e r e d b y a t h i n T e f l o n( t e t r a f l u o r o e t h y l e n e ) f i l m ( 2 5 Mm t h i c k ) , o b t a i n e d f r o mY e l l o w S p r i n g s I n s t r u m e n t s , Y e l l o w S p r i n g s , O h i o ( M e m -b r a n e K i t n o . 5 9 3 7 ) ; t h i s f i l m c o n t a i n s a s m a l l a p e r t u r e ( s e eF i g . l a ) . T h e s e p t u m i s s e a l e d w i t h s i l i c o n e g r e a s e t o t h e w a l l so f t h e t r o u g h a n d i n s u l a t e s t h e t w o w a t e r c o m p a r t m e n t s e l e c -t r i c a l l y . I t c a n b e r m o v e d b y a m o t o r a t a p r e s e t s p e e d d o w n -w a r d s , s o t h a t t h e a p e r t u r e m o v e s f r o m a b o v e t o b e l o w t h ew a t e r s u r f a c e . T h e t r o u g h s a n d s e p t u m w e r e m a d e f r o mT e f l o n . T h e a p e r t u r e i n t h e t h i n T e f l o n f i l m w a s f o r m e d e i t h e rb y a n e l e c t r i c a l l y h e a t e d p l a t i n u m w i r e , w h i c h w a s g r o u n d t oa s h a r p p o i n t , o r b y a p u n c h m a d e f r o m a t u b e r c u l i n - s y r i n g en e e d l e b y b e v e l i n g i t s w a l l . I n a s i m p l i f i e d v e r s i o n o f t h i sm e t h o d , t h e t hi n T e f l o n f i l m w i t h t h e a p er t u re w a s c l a m p e db e t w e e n t w o h a l v e s o f a t r o u g h a n d k e p t s t a t i o n a r y . T h em e m b r a n e w a s f o rm e d b y f i l l i n g t h e t w o c o m p a r t m e n t s w i t hw a t e r o r s a l i n e t o b e l o w t h e a p e r t u r e a n d , a f t e r s p r e a d i n g al i p i d m o n o l a y e r o n e a c h s i d e , r a i s i n g f i r s t o n e , t h e n t h e o t h e rw a t e r l e v e l s l o w l y a b o v e t h e a p e r t u r e b y g r a v i t y f l o w .I t i s i m p o r t a n t t h a t t h e f i l m c o n t a i n i n g t h e a p e r t u r e h a v e ah y d r o p h o b i c s u r f a c e ; t h i s f a v o r s c o n t a c t w i t h t h e l i p i d h y d r o -c a r b o n c h a i n s . O f s e v e r a l m a t e r i a l s t e s t e d , o n l y T e f l o n a n d

3 5 6 1$ To w h o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .


2/6

3 5 6 2 B i o c h e m i s t r y : M o n t a l a n d M u e l l e ra

TEFLON F I L MAPERTURE n

b

D I R E C T I O N OFDISPLACEMENTSEPTUM

A I R

0z3 - )

F I G . 1 . ( a ) S i m p l i f i e d d i a g r a m o f t h e apparatus f o r membranef o r m a t i o n . D i m e n s i o n s a r e n o t d r a w n t o s c a l e . ( b ) C i r c u i t d i a -gram o f t h e c u r r e n t a n d v o l t a g e c l a m p . The two o p e r a t i o n a l am-p l i f i e r s KM48 a n d TOA 8 7 4 1 were o b t a i n e d f r o m P o l y t r o n De-v i c e s , I n c . , P a t t er s o n , N . J . a n d T r a n s i t r o n , W a k e f i e l d M a s s . ,r e s p e c t i v e l y . The c i r c u i t can b e s w i t c h e d b e t w e e n t h e c o n s t a n t -c u r r e n t a n d c o n s t a n t - v o l t a g e m o d e s a s i n d i c a t e d . C u r r e n t a n dv o l t a g e s w e r e c o n t r o l l e d b y p u l s e s f r o m a p u l s e g e n e r a t o r t h a tw e r e a p p l i e d t o t h e command i n p u t s . O u t p u t c u r r e n t a n d v o l t -a g e w e r e d i s p l a y e d on a d u a l - b e a m s t o r a g e o s c i l l o s c o p e . Th es c op e s w ee p s were s y n c h r o n i z e d w i t h t h e command p u l s e s .P a r a f i l m ( A m e r i c a n Ca n C o . , N e e n a h , W i s . ) p e r f o r m e ds a t i s f a c t o r i l y . More h y d r o p h i l i c m a t e r i a l s s u c h a s S a r a n(Dow C h e m i c a l C o . ) c a n b e u s e d p r o v i d e d t h e i r s u r f a c e i s pre-c o n d i t i o n e d b y w i p i n g i t w i t h a 2 % s o l u t i o n o f p e t r o l e u mj e l l y i n p e n t a n e o r f e r r i c s t e a r a t e i n c h l o r o f o r m - m e t h a n o l .H i g h i o n i c s t r en g t h ( > 0 . 1 M ) i n t h e w a t e r p h a s e a n d a l s o ah i g h h u m i d i t y o f t h e room a t m o s p h e r e seem t o h a v e a d v e r s ee f f e c t s on membrane s t a b i l i t y d u r i n g f o r m a t i o n . A l l e x p e r i -m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t room t e m p e r a t u r e .Th e m o n o l a y e r s were s p r e a d on a c l e a n s u r f a c e as c o n -d e n s e d f i l m s a t t h e i r own l e n s p res su re f r o m l i p i d s o l u t i o n s i ne t h a n o l , c h l o r o f o r m , p e n t a n e , o r h e x a n e ; t h e s o l u t i o n s w e r ea p p l i e d t o t h e s i d e o f t h e t r o u g h n e a r t h e s e p t u m so t h a t t h em o n o l a y e r s w e p t a l o n g t h e s e p t u m a n d r e m o v e d a n y s u r f a c ei m p u r i t i e s . The e f f e c t s o f m o n o l a y e r s u r f a c e p res su re onmembrane f o r m a t i o n h a v e n o t b e e n e v a l u a t e d . M e c h a n i c a lc o m p r e s s i o n o f t h e m o n o l a y e r d u r i n g membrane f o r m a t i o nh a d no b e n e f i c i a l e f f e c t s .

F o r t h e e l e c t r i c a l m e a s u r e m e n t s , t h e t w o t r o u g h s werec o n n e c t e d w i t h c a l o m e l e l e c t r o d e s ( B e c k m a n no . 3 9 2 7 0 ) t ot h e c i r c u i t shown i n F i g . l b . Th e f o r m a t i o n o f t h e m e m b r a n ewas f o l l o w e d b y r a p i d a n d r e p e a t e d ( 3 - 5 s e c ' ) measurements

o f t h e m e m b r a n e c a p a c i t y b y a p p l i c a t i o n o f a c o n s t a n tv o l t a g e p u l s e , a n d d i s p l a y o f t h e c a p a ci t a t i v e c u rr en t o n as t o r a g e o s c i l l o s c o p e . A f t e r f o rm a ti o n, t h e membrane r e s i s t a n c ew a s m e a s u r e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f a c a l i b r a t e d c o n s t a n t -c u r r e n t p u l s e a n d d i s p l a y o f t h e r e s u l t i n g m e m b r a n e p o t e n t i a l .T h e c l a m p i n g c i r c u i t s h o w n i n F i g . l b a l l o w s s w i t c h i n gb e t w e e n c o n s t a n t c u r r e n t a n d c o n s t a n t v o l t a g e m o d e s a n da d j u s t m e n t o f t h e c u r r e n t m e a s u r i n g t i m e c o n s t a n t i n t h ec o n s t a n t v o l t a g e m o d e .

T h e c a p a c i t y w a s c a l c u l a t e d f r o m t h e c u rr en t r ec o rd s b y:C f r I d tAV

w h e r e I i s t h e c u r r e n t a n d AV t h e a m p l i t u d e o f t h e c o n s t a ntv o l t a g e p u l s e . T h e c o n s i s t e n c y o f t h e m e t h o d w a s c h e c k e d b yr e p l a c i n g t h e m e m b r a n e b y a c a l i b r a t e d RC c i r c u i t . I n t h ec o n s t a n t v o l t a g e m o d e t h e t i m e c o n s t a n t a n d g a i n o f t h e c u r -r e n t r e c o r d d e p e n d s o n t h e v a l u e o f t h e f e e d b a c k r e s i s t o r i n t h ec u r r e n t m e a s u r i n g a m p l i f i e r . B e c a u s e t h e c a p a c it y c u r r e n t sa r e s m a l l , t h e f e e d b a c k r e s i s t a n c e w a s k e p t a b o u t 1 0 0 k g . Thec o r r e s p o n d i n g a m p l i f i e r t i m e c o n s t a n t i nt r o d uc e s a p h a s e s h i f tb e t w e e n t h e c u r r e n t r e c o r d a n d t h e membrane p o t e n t i a l s u c ht ha t t he r e c o r d ( b u t n o t t h e a c t u a l m e m b r a n e c u r r e n t ) o u t -l a s t s t h e r i s e t i m e o f t h e p o t e n t i a l , w h i c h i s d e t e r m i n e d o n l yb y t h e m e m b r a n e c a p a c i t y a n d t h e s e r i e s r e s i s t a n c e o f t h ee l e c t r o d e s a n d t h e a q u e o u s p h a s e (-3 X 1 0 1 Q ) a n d w a st y p i c a l l y 5 - 1 0 M s e c . T h e a m p l i f i e r t i m e c o n s t a n t a l s o c a us es ad e v i a t i o n o f t h e r e c o r d e d i n i t i a l p e a k c u r r e n t f r o m i t s t h e o r e t -i c a l v a l u e o f V/R ( V = a p p l i e d p o t e n t i a l s t e p ; R = s e r i e sr e s i s t a n c e ) . I n s t e a d , t h e p e a k c u r r e n t i n c r e a s e s n o n l i n e a r l yw i t h t h e c a p a c i t y . H o w e v e r , t h e s e e f f e c t s d o n o t a l t e r t h er e c o r d e d c u r r e n t i n t e g r a l a n d d o n o t i n v a l i d a t e t h e c a p a c i t ym e a s u r e m e n t s .

RESULTSM e m b r a n e f o r m a t i o n a n d e l e c t r i c a l p r o p e r t i e sWhen t h e a p e r t u r e d e s c e n d s b e l o w t h e w a t e r l e v e l , t h e t w om o n o l a y e r s come i n c o n t a c t a n d b e g i n t o f o r m a b i l a y e r b yj o i n i n g t h e i r h y d r o c a r b o n c h a i n s . T h e p r o c e s s i s p r e s e n t e dd i a g r a m m a t i c a l l y i n F i g . 2 . A t t h e s a m e t i m e , t h e c a p a c i t y ,m e a s u r e d b y v o l t a g e c l a m p , i n c r e a s e s p r o g r e s s i v e l y a b o v e t h eb a c k g r o u n d l e v e l o f t h e t h i n T e f l o n f i l m a n d r e a c h e s a f i n a ls t a b l e v a l u e o n c e t h e a p e r t u r e i s e n t i r e l y s u b m e r g e d ( F i g . 3 a ) .T h e r a t e a t w h i c h t h e m e m b r a n e f o r m s i s u s u a l l y f a s t e r t h a nt h e m e c h a n i c a l r a t e o f s u b m e r s i o n o f t h e a p e r t u r e . F o r exam-p l e , i n F i g . 3 a , w h e r e t h e a p e r t u r e d i a m e t e r wa s 0 . 2 5 mm, t h ef i n a l c a p a c i t y w a s r e a c he d w i t hi n 4 s e c , w h e r e a s t h e r a t e o fs u b m e r s i o n w a s 0 . 5 m m / m i n . V i s u a l o b s e r v a t i o n s h o w s t h a tt h i s d i s c r e p a n c y i s c a u s e d b y a r a p i d r i s e o f t h e w a t e r l e v e l d u et o c a l ) i l l a r i t y t h a t o c c u r s o f t e n b u t n o t a l w a y s w h e n t h e l e v e lr e a c h e s t h e l o w e r r i m o f t h e a p e r t u r e . D u r i n g m e m b r a n e f o r -m a t i o n , t h e r e l a t i v e s p e e d b e t w e e n a p e r t u r e a n d w a t e r s u r f a c es h o u l d n o t b e much l a r g e r t h a n 0 . 5 m m / m i n . T h e m e m b r a n e sa r e m o s t p r o n e t o b r e a k a g e d u r i n g t h e f i r s t f e w s e c o n d s a f t e rt h e i r f o r m a t i o n . O n c e s t a b l e , t h e y h a v e b e e n o b s e r v e d t o l a s tf o r s e v e r a l h o u r s . T h e u p p e r a n d l o w e r l i m i t s o f t h e a p e r t u r ed i a m e t e r w i t h w h i c h s t a b l e m e m b r a n e s c a n b e f o rm e d h a v en o t b e e n e x p l o r e d .F o r a g i v e n l i p i d , t h e f i n a l v a l u e o f t h e m e m b r a n e c a p a c i t yd e p e n d s o n l y o n t h e a r e a o f t h e a p e r t u r e , a n d h a s a t y p i c a ls p e c i f i c v a l u e o f 0 . 9 + 0 . 1 1 A F c m - 2 f o r t h e l i p i d s s t u d i e dt h u s f a r . T h i s v a l u e i s a l m o s t t w i c e a s l a r g e a s t h e c a p a c i t y o f

P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 6 9 ( 1 9 7 2 )


3/6

L i p i d B i l a y e r s f r o m M o n o l a y e r s 3 5 6 3

TEFLON FILM/ I /AIR

T a b l e 1 s u m m a r i z e s t h e p r o p e r t i e s a n d c h a r a c t e r i s t i c s o ft h e b i l a y e r s d e r i v e d f r o m m o n o l a y e r s , a n d t h o s e o f c e l lm e m b r a n e s a n d h y d r o c a r b o n s o l v e n t - c o n t a i n i n g b i l a y e r s .

v V5OmV

1 0 0 p s e c

b C

5XI-A 5 x l 1 0 " A I

V5QmV

F I G . 2 . P r i n c i p l e o f b i l a y e r f o r m a t i o n by t h e a p p o s it i on o ftw o l i p i d m o n o l a y e r s a t an a i r - w a t e r i n t e r f a c e . Th e s h a d i n g o ft h e p o l a r - h e a d groups o f o n e m o n o l a y e r i n d i c a t e s a d i f f e r e n tc h e m i c a l c o m p o s i t i o n , and t h e c o n s e q u e n t f o r m a t i o n o f an asym-m e t r i c b i l a y e r . No t drawn t o s c a l e .

p l a n a r b i l a y e r s f o r m e d f r o m l i p i d s i n h y d r o c a r b o n s o l v e n t s ,a n d i d e n t i c a l t o t h e t y p i c a l v a l u e r e p o r t e d f o r c e l l m e m b r a n e s .F i g . 3 b a n d c s h o w a c o m p a r i s o n o f t h e c a p a c it y c u r r e n t s o ft w o m e m b r a n e s f o r m e d on t h e same a p e r t u r e f r o m t h e samel i p i d m i x t u r e ( g l y c e r o l d i o l e a t e - c h o l e s t e r o l - o l e y o y l a c i d p h o s -p h a t e ) , e i t h e r b y b r u s h i n g an o c t a n e s o l u t i o n o f t h i s l i p i do v e r t h e a p e r t u r e ( F i g . 3 b ) o r b y t h e a p p o s i t i o n o f t w om o n o l a y e r s ( F i g . 3 c ) .

I n c o n t r a s t t o t h e d i f f e r e n t c a p a c i t i e s , t h e r e s i s t a n c e s o f t h et w o m e m b r a n e s a re i d e n t i c a l a n d r a n g e b e t w e e n 1 0 6 a n d 1 0 8o hm c m 2 , a s i l l u s t r a t e d i n F i g . 4 a a n d b . Membranes f o r m e df r o m b r a i n - l i p i d m o n o l a y e r s t e n d t o s h o w t h e h i g h e s t r e s i s -t a n c e s . T h e d i e l e c t r i c b r e a k d o w n o ccu rs a t v o l t a g e s b e t w e e n1 5 0 a n d 5 0 0 mV.

E v i d e n c e t h a t t h e s e m e m b r a n e s ar e o f b i m o l e c u l a r t h i c k n e s si s d e r i v e d n o t o n l y f r o m t h e m a g n i t u d e o f t h e c a p a c i t y , b u ta l s o f r o m t h e o b se rv a t i o n t h a t t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 uM g r a m i -c i d i n t o o n e a q u e o u s c o m p a r t m e n t l o we r s t h e r e s i s t a n c e t o1 0 3 o hm c m 2 ( F i g . 4 c ) ; i n t h e p r e s e n c e o f a t r a n s m e m b r a n ei o n - g r a d i e n t , 0 . 1 A M M g r a m i c i d i n g e n e r a t e s a c a t i o n i c t r a n s -m e m b r a n e p o t e n t i a l a s i t d o e s i n h y d r o c a r b o n s o l v e n t -c o n t a i n i n g b i l a y e r s a n d c e l l m e m b r a n e s . G r a m i c i d i n i sknown n o t t o a c t on m e m b r a n e s t h a t a r e t h i c k e r t h a n oneb i l a y e r ( 1 0 , 1 1 ) .We h a v e a l s o f o r m e d m e m b r a n e s f r o m tw o m o n o l a y e r so f d i f f e r e n t c o m p o s i t i o n a n d c h a r g e , e . g . , g l y c e r o l d i o l e a t e -c a r d i o l i p i n , g l y c e r o l d i o l e a t e - p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , g l y c e r o l d i -o l e a t e - m i x e d b r a i n l i p i d s . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s o f r e s i s -t a n c e o r c a p a c i t y ( F i g . 3 d ) h a v e b e e n o b s e r v e d , nor d i d t h e s em e m b r a n e s s h o w r e c t i f i c a t i o n o r a s y m m e t r i c a l c a p a c i t i e s .

loopsec 1 0 0 p s e cF I G . 3 . ( a ) C a p a c i t y c u r r e n t s i n response t o a v o l t a g e s t e p o f

3 7 . 5 mV d u r i n g t h e f o r m a t i o n o f a b i l a y e r membrane. Lowert r a c e , v o l t a g e ; u p p e r t r a c e , c u r r e n t . Th e v o l t a g e t r a c e r e p r e s e n t st h e p o t e n t i a l a t t h e i n p u t t o t h e e l e c t r o de s and n o t t h e t r u e mem-b r a n e p o t e n t i a l w h i c h , n e g l e c t i n g t h e r e l a t i v e l y s m a l l s e r i e s r e s i s -t a n c e o f t h e e l e c t r o d e s and aqueo us p h a s e , h a s t h e same a m p l i t u d eb u t a l o n g e r r i s e t i m e ('10 M s e c . ) . For r e a s o n s d i s c u s s e d u i n d e rM e t h o d s , t h e c u r r e n t o u t l a s t s t h e r i s e time o f t h e p o t e n t i a l . P u l s e so f 1 0 - m s e c d u r a t i o n were a p p l i e d a t 3 0 0 - m s e c i n t e r v a l s , and t h er e s u l t i n g t r a c e s w e r e s u p e r i m p o s e d on an o s c i l l o s c o p e . Th e t i m ep rog resses f r o m t h e s m a l l e s t c u r r e n t r e c o r d , w h i c h c o r r e s p o n d s t ot h e c a p a c i t y o f t h e s u b m e r g e d p o r t i o n o f t h e t h i n T e f l o n f i l m , t ot h e l a r g e s t , w h i c h r e s u l t s f r o m t h e c a p a c i t y o f t h e c o m p l e t e d ( f u l l yf o r m e d ) m e m b r a n e . Th e i n t e r m e d i a t e t r a c e s a r e t h e c a p a c i t y c u r -r e n t s o f t h e p a r t i a l l y f o r m e d membrane when t h e a p e r t u r e i s n o ty e t c o m p l e t e l y s u b m e r g e d , as i l l u s t r a t e d i n F i g . 2 . Th e measuredv a l u e o f t h e c a p a c i t y was 1 . 0 1 A F c m - 2 . T h i s p a r t i c u l a rmembrane was f o r m e d f r o m tw o m o n o l a y e r s o f d i f f e r e n t com-p o s i t i o n ; o n e m o n o l a y e r c o n t a i n e d g l y c e r o l d i o l e a t e andc h o l e s t e r o l , i n a m o l a r r a t i o o f 1 . 0 t o 0 . 2 6 . Th e o t h e r m o n o l a y e rwas f o r m e d f r o m b e e f - h e a r t c a r d i o l i p i n . The a q u e o u s p h a s ec o n t a i n e d 0 . 0 1 M NaCl ( p H 5 . 5 ) . The a p e r t u r e a r e a was 0 . 0 4 8mm2. ( b ) C a p a c i t y c u r r e n t s f r o m a h y d r o c a r b o n s o l v e n t - c o n t a i n -i n g b i l a y e r , w h i c h was f o r m e d b y b r u s h i n g a g l y c e r o l d i o l e a t e -c h o l e s t e r o l - o l e y o y l a c i d p h o s p h a t e s o l u t i o n i n o c t a n e ( m o l a rr a t i o s 1 . 0 : 0 . 2 6 : 0 . 0 2 ) o v e r t h e s u b m e r g e d a p e r t u r e . The o l e y o y la c i d p h o s p h a t e was a d d e d t o i n c r e a s e t h e r a t e o f membranet h i n n i n g . Th e a p e r t u r e a r e a was a s i n a . The t i m e i n t e g r a l o f t h i sc u r r e n t c o r r e s p o n d s t o a c a p a c i t y o f 0 . 4 7 1 F c m - 2 , w h i c h i s at y p i c a l v a l u e f o r t h i s t y p e o f m e m b r a n e . C o m p o s i t i o n o f t h ea q u e ou s p h a s e a s i n a . ( c ) C a p a c i t y c u r r e n t s f r o m a b i l a y e r f o r m e db y a d j o i n i n g two m o n o l a y e r s s p r e a d f r o m a m i x t u r e o f l i p i d si d e n t i c a l i n c o m p o s i t i o n t o t h a t i n b , e x c e p t t h a t t h e o c t a n e wasr e p l a c e d b y p e n t a n e , w h i c h e v a p o r a t e d b e f o r e t h e membranewas f o r m e d . Th e c a p a c i t y o f t h i s m e m b r a n e i s 1 . 0 4 1 A F cm-2.C o m p o s i t i o n o f t h e a q u e ou s p h a s e a s i n a . ( d ) C a p a c i t y c u r r e n t sf o r v o l t a g e p u l s e s o f o p p o s i t e p o l a r i t y f r o m an a s y m m e t r i c mem-b r a n e . Th e c o m p o s i t i o n o f t h e m o n o l a y e r s a n d a q u e o u s p h a s ewas a s i n a . T h e r e i s no asymmetry o f t h e c a p a c i t y c u r r e n t s .

DIRECTION OFDISPLACEMENTI F t

APERTURE aL I P I DMONOLAYERS

I 1 1 ) ) / ,

WATER 1 0 0 O s e c

V50 m VII


I

. A


4/6

3 5 6 4 B i o c h e m i s t r y : M o n t a l a n d M u e l l e r

5OmV

I2 x 1 0 - A

t _5 sec

bv50 mV

2 x 1 0 - ' AI _

1 0 0 o A

V2 5 mV

1 0 0 m s e c

F I G . 4 . ( a ) Membrane p o t e n t i a l r e c o r d s a s a f u n c t i o n o f a p -p l i e d c o n s t a n t c u r r e n t s ( 2 0 p a m p ) o f a h y d r o c a r b o n - c o n t a i n i n gb i l a y e r o f c o m p o s i t i o n a s i n F i g . 3 b . From t h e s t e a d y - s t a t e v a l u eo f t h i s p o t e n t i a l , t h e m e m b r a n e r e s i s t a n c e w a s c a l c u l a t e d t o b e4 . 8 X 1 0 6 o hm c m 2 . T h e a p e r t u r e a r e a w a s 0 . 0 4 8 m m 2 . T h ea q u e o u s p h a s e c o n t a i n e d o . o i M N a C l a t p H 5 . 5 . ( b ) A s i n a ,e x c e p t t h a t t h e membrane w a s m a d e f r o m m o n o l a y e r s . T h e l i p i dc o m p o s i t i o n w a s i d e n t i c a l t o a , e x c e p t t h a t o c t a n e w a s r e p l a c e db y p e n t a n e . T h e a p e r t u r e a r e a w a s 0 . 0 3 9 m m 2 a n d t h e c a l c u l a t e dm e m b r a n e r e s i s t a n c e i s 3 . 4 X 1 0 6 o hm c m 2 . T h e t i m e c o n s t a n to f t h e c u r r e n t i s l a r g e r t h a n i n a b e c a u s e o f t h e l a r g e r s p e c i f i cmembrane c a p a c i t y . ( c ) Membrane c u r r e n t s a t c o n s t a nt v o l t a g ei n t h e p r e s e n c e o f g r a m i c i d i n . T h e membrane w a s f o r m e d a s i nF i g . 3 c f r o m t w o m o n o l a y e r s . 0 . 1 I A M G r a mi ci d in w a s t h e n a d d e dt o o n e o f t h e a q u e o u s c o m p a r t m e n t s . T h e a p er t u r e a re a w a s0 . 0 3 5 m m 2 . T h r e e s u c c e s s i v e v o l t a g e p u l s e s o f d i f f e r e n t a m p l i t u d ea r e s u p e r i m p o s e d . From t h e s e r e c o r d s , t h e m e m b r a n e r e s i s t a n c ew a s c a l c u l a t e d a s 4 . 4 X 1 0 ' o h m c m 2 . C o m p o s i t i o n o f t h e a q u e o u sp h a s e a s i n a . I n t h i s r e c o r d , t h e t i m e c o n s t a n t s o f t h e t r a n s i e n tc a p a c i t y c u rr en t s a r e l o n g e r t h a n i n F i g . 3 b e c a u s e t h e c l a m p i n gc i r c u i t w a s s e t t o a l o n g e r t i m e c o n s t a n t .

DISCUSSIONM e m b r a n e r e s i s t a n c e and c a p a c i t yO n e o f t h e a r g u m e n t s a g a i n s t t h e b i l a y e r m o d e l o f c e l l mem-b r a n e s h a s b e e n t h e l o w c a p a c i t y o f t h e m e m b r a n e s f o r m e df r o m l i p i d s o l u t i o n s i n h y d r o c a r b o n s o l v e n t s . T h i s d i f f i c u l t yi s r e s o l v e d b y t h e p re se nt e x p e r i m e n t s . A s s u m m a r i z e d i nT a b l e 1 , t h e p r o p e r t i e s o f t h e b i l a y e r s f o rm e d f r o m m o n o -l a y e r s a r e i d e n t i c a l i n e v e r y a s p e c t t o t h o s e o f b i o l o g i c a l mem-b r a n e s , e x c e p t f o r t h e m e m b r a n e r e s i s t a n c e , w h i c h i s g e n e r a l l ymuch l o w e r i n c e l l m e m b r a n e s - a n d i s t h e r e a t t r i b u t e d t ot h e p r e s e n c e o f s p e c i a l t r a n s l o c a t o r s t h a t l o c a l l y m o d i f y t h eb i l a y e r . H o w e v e r , t h e r e s i s t a n c e o f t h e e x p e r i m e n t a l mem-b r a n e s c a n a l s o b e l o w e r e d t o t h a t o f t h e c e l l m e m b r a n e b yt h e i n s e r t i o n o f t r a n s l o c a t o r p e p t i d e s a n d p r o t e i n s ( 1 2 , 1 3 ) .T h e h i g h v a l u e s o f t h e c a p a c it y c a n n o t b e a c c o u n t e d f o rs o l e l y o n t h e b a s i s o f t h e t h i c k n e s s o f t h e h y d r o c a r b o n r e g i o na s d e t e r m i n e d b y x - r a y d i f f r a c t i o n . T h e e f f e c t i v e d i e l e c t r i ct h i c k n e s s c a n b e e s t i m a t e d f r o m

C = A4 T r dw h e r e C i s t h e m e m b r a n e c a p a c i t y , 8 t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t , At h e m e m b r a n e a r e a , a n d d t h e d i e l e c t r i c t h i c k n e s s . W i t h 2 . 1 a sa n a v e r a g e v a l u e f o r t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f l o n g - c h a i nh y d r o c a r b o n s , t h e d i e l e c t r i c t h i c k n e s s f o r a c a p a c i t y o f 0 . 9 , Fc m - 2 w o u l d b e o n l y 2 1 A , w h e r e a s t h e a c t u a l t h i c k n e s s o f t h eh y d r o c a r b o n r e g i o n i n l i p i d b i l a y e r s a n d c e l l m e m b r a n e s l i e sb e t w e e n 2 8 a n d 3 5 A ( s e e T a b l e 1 ) . S i n c e t h e r e i s n o r e a s o n t oa s s u m e t h a t t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f t h e h y d r o c a r b o n s i n t h em e m b r a n e s i s d i f f e r e n t f r o m t h a t o f b u l k h y d r o c a r b o n s o f t h es a m e c h a i n - l e n g t h a n d s a t u r a t i o n , w e h a v e t o c o n c l u d e t h a tt h e e f f e c t i v e d i e l e c t r i c t h i c k n e s s o f t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n i sl e s s t h a n i t s p h y s i c a l d i m e n s i o n . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i se f f e c t w o u l d b e a l i m i t e d p e n e t r a t i o n o f w a t e r i n t o t h e h y d r o -c a r b o n r e g i o n , a i d e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e o x y g e n o f t h e e s t e rl i n k a g e s a n d d y n a m i c f l u c t u a t i o n s o f t h e f r e e v o l u m e i n t h e i rv i c i n i t y , t h a t may e x t e n d p e r h a p s a s f a r a s t h e f i r s t t h r e em e t h y l e n e g r o u p s . T h e d i s s o c i a t i o n o f t h i s w a t e r , a l b e i t l e s st h a n i n b u l k , w o u l d l o w e r t h e e l e c t r i c a l r e s i s t a n c e o f t h i sr e g i o n c o n s i d e r a b l y a n d , t h e r e f o r e , r e d u c e t h e t h i c k n e s s o f t h ed i e l e c t r i c . T h e p e n e t r a t i o n o f w a t e r m i g h t g o a s f a r a s 3 - 4 Ab e y o n d t h e p l a n e o f t h e g l y c e r o l s , r e d u c i n g t h e d i e l e c t r i ct h i c k n e s s b y 6 - 8 A , t o a v a l u e s u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h eo b s e r v e d c a p a c i t i e s . T h i s s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e -e v i d e n c e o f w a t e r p e n e t r a t i o n i n t o t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n o fd e t e r g e n t m i c e l l e s a s d e t e r m i n e d b y n u c l e a r m a g n e t i c r e s o -n a n c e (NMR) s p e c t r o s c o p y ( 1 4 - 1 7 ) . I t may a l s o e x p l a i n t h ea b n o r m a l l y h i g h c a p a c i t y v a l u e s ( 3 - 4 u F cm - 2 ) o f s m a l l l i p i dv e s i c l e s ( 1 8 ) , w h i c h f o r g e o m e t r i c a l r e a s o n s h a v e a l o w e r p a c k -i n g d e n s i t y a n d h i g h e r m o b i l i t y o f t h e i r o u t e r l i p i d l a y e r ( 1 9 ) .T h e l a r g e r f r e e v o l u m e w o u l d a l l o w a d e e p e r p e n e t r a t i o n o fw a t e r i n t o t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n a n d d e c r e a s e i t s a v e r a g ed i e l e c t r i c t h i c k n e s s . A c o n c o mi t a n t l o we r a c t i v a t i o n e n e r g y o fw a t e r p e r m e a t i o n c o u l d a l s o b e e x p e c t e d a n d h a s b e e n o b -s e r v e d ( 1 9 ) .T h e l o w e r c a p a c i t i e s o f t h e h y d r o c a r b o n l - c o n t a i n i n g b i -l a y e r s may b e a t t r i b u t e d t o a s t e r i c e x c l u s i o n o f t h i s w a t e r b yt h e i n t e r c a l a t e d h y d r o c a r b o n s o l v e n t , a l t h o u g h a n i n c r e a s e dm e m b r a n e t h i c k n e s s d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e h y d r o c a r b o nc a n n o t b e e x c l u d e d . No x - r a y d a t a a r e a v a i l a b l e f r o m s u c hm e m b r a n e s , b u t l i g h t - r e f l e c t a n c e m e a s u r e m e n t s ( 2 0 ) i n d i c a t ea m e m b r a n e t h i c k n e s s o f 6 2 A f o r l e c i t h i n i n d e c a n e .



5/6

L i p i d B i l a y e r s f r o m M o n o l a y e r s 3 5 6 5T A B L E 1 . C o m p a r i s o n o f t h e e l e c t r i c a l p r o p e r t i e s o f b i m o l e c u l a r l i p i d m e m b r a n e s i n t h ep r e s e n c e a n d a b s e n c e o f h y d r o c a r b o n s o l v e n t w i t h t h o s e o f c e l l m e m b r a n e s

B i l a y e r f r o mm o n o l a y e r sB i l a y e r ( n o h y d r o c a r b o nE l e c t r i c a l p r o p e r t y ( w i t h h y d r o c a r b o n s o l v e n t ) s o l v e n t ) C e l l m e m b r a n e s

Membrane r e s i s t a n c e ( o h m c m ' ) 1 0 6 - 1 0 8 ( 1 2 , 1 3 ) 1 0 6 - 1 0 8 < 1 0 6 ( 3 9 )E f f e c t o f g r a m i c i d i n o n m e m b r a n er e s i s t a n c e ( o h m c m 2 ) a t 0 . 1 uM 1 0 3 ( 1 2 , 1 3 ) 1 0 3 < 1 0 3 ( 4 0 ) ( i n f e r r e d )Membrane c a p a c i t y ( M F c m - 2 ) 0 . 4 5 d 0 . 0 5 ( 1 2 , 1 3 , 2 1 ) 0 . 9 0 . 1 R a n g e : 0 . 8 - 1 . 2 ( 2 1 )S q u i d g i a n t axon 0 . 9 - 1 . 1 ( 4 1 , 4 2 )N i t e l l a 0 . 9 4 ( 4 3 )T h i c k n e s s o f h y d r o c a r b o n r e g i o no b t a i n e d f r o m :( a ) C a p a c i t y d a t a * 4 2 A 2 2 A 1 6 - 2 4 A( b ) X - r a y d a t a - 2 9 A ( 4 4 t , 4 5 ) 2 8 A ( P h o t o r e c e p t o r ) ( 4 6 ) 43 3 A ( r e d c e l l ) ( 4 7 )3 5 A ( M y c o p l a s m a ) ( 4 8 , 4 9 )* A d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f 2 . 1 4 ( h e x a d e c a n e ) i s a s s u m e d ( s e e t e x t ) .t E x t r a c t e d f r o m t h e r e p o r t e d d i f f r a c t i o n p a t t e r n s .I T h e s e v a l u e s a r e o b t a i n e d b y s u b s t r a c t i o n o f 1 2 A ( c o r r e s p o n d i n g t o t h e p o l a r - h e a d t h i c k n e s s ) f r o m t h e r e p o r t e d r e p e a t s p a c i n g s .F e t t i p l a c e , A n d r e w s , a n d H a y d o n ( 2 1 ) h a v e f o r m e d mem-b r a n e s f r o m a l e c i t h i n s o l u t i o n i n h e x a d e c a n e t h a t e x h i b i tc a p a c i t i e s o f 0 . 6 - 0 . 7 , u F c m , - 2 a n d t ha t w e r e a s s u m e d t oe x c l u d e t h e s o l v e n t . F o r t h e s e m e m b r a n e s , t h e y c a l c u l a t e d at h i c k n e s s o f t h e h y d r o c a r b o n r e g i o n o f 3 0 A a n d c o n c l u d e dt h a t c e l l m e m b r a n e s , d u e t o t h e i r h i g h e r c a p a c i t i e s o f 1 . 0 , u Fcm - 2 , m u s t h a v e a h y d r o c a r b o n t h i c k n e s s o f 2 0 A , a n d ac o r r e s p o n d i n g l y l e s s - d e n s e p a c k i n g o f t h e i r p o l a r g r o u p s ,e f f e c t s t h a t w e r e a t t r i b u t e d t o t h e i n t e r a c t i o n o f t h e h y d r o -c a r b o n c h a i n s w i t h p r o t e i n . T h e f a c t t h a t p u r e l i p i d b i l a y e r sh a v e t h e s a m e c a p a c i t y a s c e l l m e m b r a n e s m a k e s t h e s ea s s u m p t i o n s u n n e c e s s a r y . F u r t h e r m o r e , t h e a v a i l a b l e x - r a yd a t a d o n o t g i v e e v i d e n c e f o r s u c h a t h i n h y d r o c a r b o n r e g i o n .

M e m b r a n e asymmetryO n e o f t h e a t t r a c t i v e p o s s i b i l i t i e s o f f e r e d b y t h i s m e t h o d i s t h ef o r m a t i o n o f a s y m m e t r i c m e m b r a n e s b y t h e a p p o s i t i o n o f t w om o n o l a y e r s o f d i f f e r e n t c o m p o s i t i o n , b e c a u s e c e l l m e m b r a n e sw i t h a s y m m e t r i c a l l y a r r a n g e d l i p i d s may p l a y a r o l e i n r e d o xa n d p h o t o - e n e r g y t r a n s d u c t i o n s ( 2 2 - 2 4 ) . S e v e r a l m e t h o d s t oa c c o m p l i s h t h i s h a v e b e e n p r o p o s e d ( 2 5 - 2 8 ) , b u t n o e x p e r i -m e n t a l r e s u l t s h a v e b e e n p u b l i s h e d . T h e a s y m m e t r i c mem-b r a n e s a s s t u d i e d t h u s f a r h a v e n o t s h o w n a n y a s y m m e t r i e s o fc a p a c i t y a n d r e s i s t a n c e , a n d n o n e c a n b e e x p e c t e d u n l e s s t h ef i e l d i n d u c e s a c h a n g e o f t h e m e m b r a n e s t r u c t u r e o r u n l e s s t h el i p i d s f o r m a s y m m e t r i c a l l y c h a r g e d p o r e s b y l o c a l m i c e l l i z a -t i o n .

T h e r e i s t h e p o s s i b i l i t y t ha t t he t w o l i p i d t y p e s m i x d u r i n gm e m b r a n e f o r m a t i o n , b u t i n l i g h t o f t h e d a t a o f K o r nb e r g a n dM c C o n n e l l ( 2 9 ) - w h o r e p o r t e d h a l f - t i m e s o f many h o u r s -t h i s p r o c e s s w o u l d b e much t o o s l o w . N e v e r t h e l e s s , u n t i l t h ea s y m m e t r y i s e s t a b l i s h e d b y o t h e r m e a n s , s u c h a s d i f f e r e n c e si n t h e a d s o r p t i o n o f m u l t i v a l e n t i o n s ( 3 0 ) , t h i s q u e s t i o n m u s tb e k e p t o p e n .R e c o n s t i t u t i o n o f m e m b r a n e sI n t r o d u c t i o n o f s m a l l p e p t i d e s a n d m e m b r a n e - a c t i v e a n t i -b i o t i c s i n t o p l a n a r b i l a y e r s c o n t a i n i n g h y d r o c a r b o n s o l v e n t sh a s l e d t o f u n c t i o n a l l y a c t i v e m e m b r a n e s t h a t d i s p l a y i o n

s e l e c t i v i t y a n d e l e c t r i c a l e x c i t a b i l i t y ( 1 2 ) . I n c o n t r a s t ,a t t e m p t s t o i n t r o d u c e l a r g e a n d d e f i n e d m e m b r a n e p r o t e i n s i na f u n c t i o n a l l y a c t i v e s t a t e h a v e m e t w i t h c o n s i d e r a b l ed i f f i c u l t i e s ( 3 1 , 3 2 ) , a l t h o u g h r e c e n t l y t h e r e h a v e b e e nr e p o r t s o f s o m e p r o m i s i n g a d v a n c e s ( 8 , 3 3 - 3 5 ) . T h e f a i l u r e sm a y e i t h e r b e a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f h y d r o c a r b o n s o r t ot h e i n a b i l i t y o f t h e p r o t e i n s t o a p p r o p r i a t e l y i n t e r a c t w i t h ap r e f o r m e d b i l a y e r , e s p e c i a l l y s i n c e m e m b r a n e p r o t e i n s a r eo n l y s o l u b l e i n t h e p r e s e n c e o f d e t e r g e n t s [ f o r a r e v i e w s e eR a z i n ( 3 6 ) ] .T h e p r e s e n t m e t h o d a l l o w s , a t l e a s t i n p r i n c i p l e , t h e s i m u l -t a n e o u s a s s e m b l y o f l i p i d a n d p r o t e i n i n t o a b i l a y e r a f t e r b o t hc o m p o n e n t s a r e s p r e a d a s a m o n o l a y e r a t a n a i r - w a t e r i n t e r -f a c e , o r a f t e r t h e p r o t e i n s a r e a l l o w e d t o p e n e t r a t e a n e x p a n d e dm o n o l a y e r . T h i s s i m u l t a n e o u s a s s e m b l y may r e s e m b l e m o r ec l o s e l y t h e n a t u ra l f o r m a t i o n o f c e l l m e m b r a n e s , i n w h i c h t h em e m b r a n e p r o t e i n s a r e p r o b a b l y i n s e r t e d i n t o t h e l i p i dm a t r i x d u r i n g t h e i r s y n t h e s i s . H o w e v e r , p o s s i b l e a d v e r s ee f f e c t s o f s u r f a c e d e n a t u r a t i o n s t i l l m u s t b e e v a l u a t e d . T h em e t h o d w o u l d a l s o a l l o w t h e a s y m m e t r i c d i s t r i b u t i o n o f t h ep r o t e i n s w i t h r e s p e c t t o t h e b i l a y e r .T h e f a c t t h a t b i l a y e r s c a n b e f o r m e d f r o m m o n o l a y e r s a l s os u g g e s t s t h a t t h i s p r i n c i p l e m i g h t h a v e p l a y e d a r o l e i np r e b i o t i c e v o l u t i o n , a s s u g g e s t e d b y G o l d a c r e ( 3 7 ) , s i n c e l o n g -c h a i n f a t t y a c i d s h a v e b e e n s y n t h e s i z e d u n d e r a b i o t i c c o n d i -t i o n s ( 3 8 ) .We a r e i n d e b t e d t o D r s . J . K . B l a s i e , C . G i t l e r , B . A . P e t h i c a ,a n d D . 0 . R u d i n f o r many s u g g e s t i o n s , d i s c u s s i o n s , a n d c r i t i c i s m sa n d t o M r . R . S a l a z a r f o r t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e a p p a r a t u s f o rmembrane f o r m a t i o n . T h e v o l t a g e c l a m p w a s d e s i g n e d a n d b u i l tb y R . K a t z a n d D . B e l a m y a n d w a s k i n d l y s u p p l i e d b y H .G r u n d f e s t . We a l s o a c k n o w l e d g e t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f Y . C .C h o c k ; M. E w a l d , L . D u n l a p , a n d H . F r e i f e l d e r . T h i s r e s e a r c hw a s s u p p o r t e d i n p a r t b y a g r a n t f r o m t h e R e s e a r c h C o r p . , Ne wY o r k t o M. M. a n d b y G r a n t GB 8 1 4 4 f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c eF o u n d a t i o n t o P . M.

1 . B a n g h a m , A . D . ( 1 9 6 8 ) i n P r o g r e s s i n B i o p h y s i c s a n d M o l e c -u l a r B i o l o g y , e d s . B u t l e r , J . A . V . & N o b l e , D . ( P e r g a m o nP r e s s , Ne w Y o r k ) , p p . 2 9 - 9 5 .2 . M u e l l e r , P . , R u d i n , D . O . , T i e n , H . T . & W e s c o t t , W. C .

P r o c . ' N a t . A c a d . S c i . USA 6 9 ( 1 9 7 2 )


6/6

3 5 6 6 B i o c h e m i s t r y : M o n t a l a n d M u e l l e r( 1 9 6 2 ) " R e c o n s t i t u t i o n o f c e l l m e m b r a n e s t r u c t u r e i n v i t r oa n d i t s t r a n s f o r m a t i o n i n t o a n e x c i t a b l e s y s t e m , " N a t u r e1 9 4 , 9 7 9 - 9 8 0 .3 . K a g a w a , Y . & R a c k e r , E . ( 1 9 7 1 ) " P a r t i a l r e s o l u t i o n o f t h eenzymes c a t a l y z i n g o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . XXV. R e -c o n s t i t u t i o n o f v e s i c l e s c a t a l y z i n g 3 2 P i - a d e n o s i n e t r i p h o s -p h a t e e x c h a n g e , " J . B i o l . C h e m . 2 4 6 , 5 4 7 7 - 5 4 8 7 .4 . H i n k l e , P . C . , K i m , J . J . & R a c k e r , E . ( 1 9 7 2 ) " I o n t r a n s p o r ta n d r e s p i r a t o r y c o n t r o l i n v e s i c l e s f o r m e d f r o m c y t o c h r o m eo x i d a s e a n d p h o s p h o l i p i d s , " J . B i o l . C h e m . 2 4 7 , 1 3 3 8 - 1 3 3 9 .

5 . M a r t o n o s i , A . ( 1 9 6 8 ) " S a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m . I V . S o l u b i l i -z a t i o n o f m i c r o s o m a l a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e , " J . B i o l .C h e m . 2 4 3 , 7 1 - 8 1 .6 . T a k a g i , M . , A z u m a , K . & K is hi m o t o , U . ( 1 9 6 5 ) " A newm e t h o d f o r t h e f o r m a t i o n o f b i l a y e r m e m b r a n e s i n aqueouss o l u t i o n , " A n n u . R e p . B i o l . W o r k s F a c . S c i . O s a k a U n i v . 1 3 ,1 0 7 - 1 1 0 .7 . M u e l l e r , P . , R u d i n , D . O . , T i e n , H . T . & W e s c o t t , W . C .( 1 9 6 3 ) " M e t h o d s f o r t h e f o r m a t i o n o f s i n g l e b i m o l e c u l a r l i p i dm e m b r a n e s i n aqueous s o l u t i o n , " J . P h y s . C h e m . 6 7 , 5 3 4 -5 3 5 .8 . L e u z i n g e r , W. & S c h n e i d e r , M . ( 1 9 7 2 ) " A c e t y l c h o l i n e - i n -d u c e d e x c i t a t i o n i n b i l a y e r s , " E x p e r i e n t i a 2 8 , 2 5 6 - 2 5 7 .9 . T a k a g i , M . ( 1 9 6 7 ) i n E x p e r i m e n t a l T e c h n i q u e s in B i o m e m -b r a n e R e s e a r c h ( i n J a p a n e s e ) , e d . O h n i s h i , T . ( N a n k o d oP u b l . C o . , L t d . , T o k y o ) , p p . 3 8 5 - 3 9 2 .1 0 . M u e l l e r , P . & R u d i n , D . 0. ( 1 9 6 7 ) " D e v e l o p m e n t o f K+-Na + d i s c r i m i n a t i o n i n e x p e r i m e n t a l b i m o l e c u l a r l i p i d mem-b r a n e s b y m a c r o c y c l i c a n t i b i o t i c s , " B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .Commun. 2 6 , 3 9 8 - 4 0 4 .1 1 . G o o d a l l , M . C . ( 1 9 7 1 ) " T h i c k n e s s d e p e n d e n c e i n t h e a c t i o no f g r a m i c i d i n A on l i p i d b i l a y e r s , " A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s .1 4 7 , 1 2 9 - 1 3 5 .1 2 . M u e l l e r , P . & R u d i n , D . 0. ( 1 9 6 9 ) i n C u r r e n t T o p i c s i nB i o e n e r g e t i c s , e d . S a n a d i , D . R . ( A c a d e m i c P r e s s I n c . , Ne wY o r k ) , V o l . 3 , p p . 1 5 7 - 2 4 9 .1 3 . T h o m p s o n , T . E . & H e n n , F . A . ( 1 9 7 0 ) i n Membranes o f M i -t o c h o n d r i a a n d C h l o r o p l a s t s , e d . R a c k e r ( V a n N o s t r a n dR e i n h o l d C o . , Ne w Y o r k ) , ACS M o n o g r a p h 1 6 5 , p p . 1 - 5 1 .1 4 . C l i f f o r d , J . ( 1 9 6 5 ) " P r o p e r t i e s o f m i c e l l a r s o l u t i o n s . P a r t 4 .S p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s o f h y d r o c a r b o n c h a i n p r o t o n si n s o l u t i o n s o f s o d i u m a l k y l s u l p h a t e s , " T r a n s . F a r a d a y S o c .6 1 , 1 2 7 6 - 1 2 8 2 .1 5 . C l i f f o r d , J . & P e t h i c a , B . A . ( 1 9 6 5 ) " P r o p e r t i e s o f m i c e l l a rs o l u t i o n s . P a r t 3 . S p i n - l a t t i c e r e l a x a t i o n t i m e s o f water p r o -

t o n s i n s o l u t i o n s o f s o d i u m a l k y l s u l p h a t e s , " T r a n s . F a r a d a yS o c . 6 1 , 1 8 2 - 1 8 9 .1 6 . M u l l e r , N . & B i r k h a m , R . H . ( 1 9 6 8 ) " I n v e s t i g a t i o n o f m i -c e l l e s t r u c t u r e b y f l u o r i n e m a g n e t i c r e s o n a n c e . I I - E f f e c t s o ft e m p e r a t u r e c h a n g e s , a d d e d e l e c t r o l y t e s a n d c o u n t e r i o ns i z e , " J . P h y s . C h e m . 7 2 , 5 8 3 - 5 9 0 .1 7 . M u l l e r , N . & S i n s o h n , H . ( 1 9 7 1 ) " I n v e s t i g a t i o n o f m i c e l l es t r u c t u r e b y f l u o r i n e m a g n e t i c r e s o n a n c e . V . S o d i u m p e r f l u -o r o o c t a n o a t e , " J . P h y s . C h e m . 7 5 , 9 4 2 - 9 4 5 .1 8 . R e d w o o d , W . R . , T a k a s h i m a , S . , S c h w a n , H . P . & Thompson,T . E . ( 1 9 7 2 ) " D i e l e c t r i c s t u d i e s on h o m o g e n e o u s p h o s p h a -t i d y l c h o l i n e v e s i c l e s , " B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 2 5 5 , 5 5 7 - 5 6 6 .1 9 . S h e e t z , M . P . & C h a n , S . I . ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m i s t r y , i n p r e s s .2 0 . C h e r r y , R . J . & C h a p m a n , D . ( 1 9 6 9 ) " O p t i c a l p r o p e r t i e s o fb l a c k l e c i t h i n f i l m s , " J . M o l . B i o l . 4 0 , 1 9 - 3 2 .2 1 . F e t t i p l a c e , R . , A n d r e w s , D . M. & H a y d o n , D . A . ( 1 9 7 1 )" T h e t h i c k n e s s , c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f some l i p i d b i -

l a y e r s a n d n a t u r a l m e m b r a n e s , " J . M e m b r a n e B i o l . 5 , 2 7 7 T -2 9 6 .2 2 . C a l v i n , M. ( 1 9 5 9 ) "From m i c r o s t r u c t u r e t o macrostructurea n d f u n c t i o n i n t h e p h o t o c h e m i c a l a p p a r a t u s , " B r o o k h a v e nS y m p . B i o l . 1 1 , 1 6 0 - 1 7 9 .2 3 . D r a t z , E . , G a w , J . E . , S c h w a r t z , S . & C h i n g , W. M . ( 1 9 7 2 )" M o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n o f p h o t o r e c e p t o r membranes o f r o do u t e r s e g m e n t s , " N a t u r e Ne w B i o l . 2 3 7 , 9 9 - 1 0 2 .2 4 . B r e t s c h e r , M. ( 1 9 7 2 ) " A s y m m e t r i c a l l i p i d b i l a y e r s t r u c t u r eo f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s , " N a t u r e Ne w B i o l . 2 3 6 , 1 1 - 1 2 .

2 5 . I s o f i n a , L . M . , L i b e r m a n , E . A . & B a b a k o v , A . U . ( 1 9 6 6 )" P r o d u c t i o n o f b i m o l e c u l a r p r o t e i n - l i p i d m e m b r a n e s i na q u e o u s s o l u t i o n , " N a t u r e 2 1 2 , 6 8 1 - 6 8 3 .2 6 . T r a u b l e , H . & G r e l l , E . ( 1 9 7 1 ) " T h e f o r m a t i o n o f a s y m m e t -r i c a l s p h e r i c a l l e c i t h i n v e s i c l e s , " N e u r o s c i . R e s . P r o g r a mB u l l . 9 , 3 7 3 - 3 8 0 .2 7 . M o r m a n n , W . & K u h n , H . ( 1 9 6 9 ) " S e i f e n l a m e l l e n m i t D o p -p e l s a n d w i c h s t r u k t u r , " Z . N a t u r f o r s c h . B 2 4 , 1 3 4 0 - 1 3 4 1 .2 8 . H e nd ri c k s o n , H . S . & S c a t t e r g o o d , E . M . ( 1 9 7 2 ) " T h e a c t i o no f p h o s p h o l i p a s e C o n b l a c k f i l m b i l a y e r m e m b r a n e s , " B i o -c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 6 , 1 9 6 1 - 1 9 6 9 .2 9 . K o r n b e r g , R . D . & M c C o nn e l l , H . M . ( 1 9 7 1 ) " I n s i d e - o u t s i d et r a n s i t i o n s o f p h o s p h o l i p i d s i n v e s i c l e m e m b r a n e s , " B i o -c h e m i s t r y 1 0 , 1 1 1 1 - 1 1 2 0 .3 0 . M o n t a l , M . ( 1 9 7 2 ) " L i p i d - p o l y p e p t i d e i n t e r a c t i o n s i n b i l a y e rl i p i d m e m b r a n e s , " J . Memb r a n e B i o l . 7 , 2 4 5 - 2 6 6 .3 1 . J a i n , M . K . , S t r i c k h o l m , A . & C o r d e s , E . H . ( 1 9 6 9 ) " R e c o n -s t i t u t i o n o f a n A T P - m e d i a t e d a c t i v e t r a n s p o r t s y s t e m a c r o s sb l a c k l i p i d m e m b r a n e s , " N a t u r e 2 2 2 , 8 7 1 - 8 7 2 .3 2 . R e d w o o d , W. R . , M u l d n e r , H . & T h o m p s o n , T . E . ( 1 9 6 9 )" I n t e r a c t i o n o f a b a c t e r i a l a d e no s i ne - t ri p ho s p h a t a s e w it hp h o s p h o l i p i d b i l a y e r s , " P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 6 4 , 9 8 9 -

9 9 6 .3 3 . G i t l e r , C . & M o n t a l , M . ( 1 9 7 2 ) " T h i n p r o t e o l i p i d f i l m s : Anew a p p r o a c h t o t h e r e c o n s t i t u t i o n o f b i o l o g i c a l mem-b r a n e s , " B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 7 , 1 4 8 6 - 1 4 9 1 .3 4 . V a s q u e z , C . , P a r i s i , M . & D e R o b e r t i s , E . ( 1 9 7 1 ) " F i n e s t r u c -t u r e o f u l t r a t h i n a r t i f i c i a l m e m b r a n e s . I . C h a n g e s b y a c e t y l -c h o l i n e a d d i t i o n i n l i p i d p r o t e o l i p i d m e m b r a n e s , " J . M em-b r a n e B i o l . 6 , 3 5 3 - 3 6 7 .3 5 . O c h o a , E . , F i s z e r d e P l a z a s , S . & D e R o b e r t i s , E . ( 1 9 7 2 )" C o n d u c t a n c e c h a n g e s p ro d u c ed b y l - n o r e p i n e p h r i n e o nl i p i d m e m b r a n e s c o n t a i n i n g a p r o t e o l i p i d f r o m b o v i n e - s p l e e nc a p s u l e , " M o l e c u l a r P h a r m a c o l . 8 , 2 1 5 - 2 2 1 .3 6 . R a z i n , S . ( 1 9 7 2 ) " R e c o n s t i t u t i o n o f b i o l o g i c a l m e m b r a n e s , "B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 6 5 , 2 4 1 - 2 9 6 .3 7 . G o l d a c r e , R . J . ( 1 9 5 8 ) i n S u r f a c e P h e n o m e n a i n C h e m i s t r ya n d B i o l o g y , e d s . D a n i e l l i , J . F . , P a n k h u r s t , K . G . A . & R i d -d i f o r d , A . C . ( P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d ) , p p . 2 7 8 - 2 9 8 .3 8 . A l l e n , W . V . & P o n n a m p e r u m a , C . ( 1 9 6 7 ) " A p o s s i b l e p r e -b i o t i c s y n t h e s i s o f m o n o c a r b o x y l i c a c i d s , " C u r r . M o d . B i o l .1 , 2 4 - 2 8 .3 9 . C o l e , K . S . ( 1 9 6 8 ) M e m b r a n e s , I o n s a n d I m p u l s e s ( U n i v .C a l i f o r n i a P r e s s , B e r k e l e y , C a l i f ) .4 0 . C h a n c e , B . & M o n t a l , M . ( 1 9 7 1 ) i n C u r r e n t T o p i c s i n Mem-b r a n e s a n d T r a n s p o r t , e d s . B r o n n e r , F . & K l e i n z e l l e r , A .( A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k ) , V o l . 2 , p p . 9 9 - 1 5 6 .4 1 . H o d g k i n , A . L . , H u x l e y, A . F . & K a t z , B . ( 1 9 5 2 ) " M e a s u r e -m e n t o f c u r r e n t - v o l t a g e r e l a t i o n s i n t h e membrane o f t h eg i a n t a x o n o f L o l i g o , " J . P h y s i o l . 1 1 6 , 4 2 4 - 4 4 8 .4 2 . P a l t i , Y . & A d e l m a n , J . W. ( 1 9 6 9 ) " M e a s u r e m e n t o f a x o n a lmembrane c o n d u c t a n c e s a n d c a p a c i t y b y m e a n s o f v a r y i n gp o t e n t i a l c o n t r o l v o l t a g e c l a m p , " J . Membrane B i o l . 1 ,4 3 1 - 4 5 8 .4 3 . C u r t i s , H . J . & C o l e , K . S . ( 1 9 3 7 ) " T r a n s v e r s e e l e c t r i c a l i m -p e d a n c e o f N i t e l l a , " J . G e n . P h y s i o l . 2 1 , 1 8 9 - 2 0 1 .4 4 . L e v i n e , Y . K . & W i l k i n s , M. H . F . ( 1 9 7 1 ) " S t r u c t u r e o f o r -i e n t e d l i p i d b i l a y e r s , " N a t u r e Ne w B i o l . 2 3 0 , 6 9 - 7 2 .4 5 . C a i n , J . , S a n t i l l a n , G . & B l a s i e , J . K . ( 1 9 7 2 ) i n MembraneR e s e a r c h , P r o c e e d i n g s o t 1 9 7 2 ICN-UCLA S y m p . M o l . B i o l .e d . F o x , C . F . ( A c a d e m i c P r e s s , Ne w Y o r k ) , i n p r e s s .4 6 . B l a u r o c k , A . E . & W i l k i n s , M. H . F . ( 1 9 6 9 ) " S t r u c t u r e o f

f r o g p h o t o r e c e p t o r m e m b r a n e s , " N a t u r e 2 2 3 , 9 0 6 - 9 0 9 .4 7 . E n g e l m a n , D . ( 1 9 6 9 ) " S u r f a c e a r e a p e r l i p i d m o l e c u l e i n t h ei n t a c t m e m b r a n e o t t h e human r e d c e l l , " N a t u r e 2 2 3 , 1 2 7 9 -1 2 8 0 .4 8 . E n g e l m a n , D . ( 1 9 7 0 ) " X - R a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s o f p h a s et r a n s i t i o n s i n t h e membrane o f M y c o p l a s m a l a i d l a w i i , " J .M o l . B i o l . 4 7 , 1 1 5 - 1 1 7 .4 9 . W i l k i n s , M. H . F . , B l a u r o c k , A . E . & E n g e l m a n , D . M.( 1 9 7 1 ) " B i l a y e r s t r u c t u r e i n m e m b r a n e s , " N a t u r e Ne w B i o l .2 3 0 , 7 2 - 7 6 .


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