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Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine von Marchantia polymorpha L. (Brunnenlebermoos):

Identifizierung und Charakterisierung der sie codierenden Genfamilie

Dissertation

zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades

- Dr. rer. nat. -

dem Fachbereich Biologie/Chemie der

Universität Bremen

vorgelegt von

Dipl.-Biol. Ina Groke

aus Ahlden (Aller)

Bremen

Januar 2002

Die Arbeiten wurden in der Zeit von September 1998 bis Januar 2002 in der Arbeitsgruppe von

Prof. Dr. F. Koe nig an der Universität Bremen und in der Arbeitsgruppe von Dr. S. Jansson an

der Universität Umeå (Schweden) durchgeführt.

Erster Gutachter: Prof. Dr. F. Koenig (Universität Bremen)

Zweiter Gutachter: Prof. Dr. H. Grimme (Universität Bremen)

Tag des öffentlichen Kolloqiums: 08.02.2002

für Lena

4

INHALT

1 EINLEITUNG ________________________________________________________ 10

1.1 Oxygene Photosynthese________________________________________________ 10

1.2 Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen_________________ 11

1.2.1 Struktur und Funktion__________________________________________________12

1.2.2 Antennensystemtypen und ihre Verbreitung _________________________________15

1.3 Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen_____________ 15

1.3.1 Chlorophyll a/b bindende Proteine ________________________________________17

1.3.1.1 Struktur ___________________________________________________________18

1.3.1.2 Ausgewählte Eigenschaften____________________________________________20

1.3.1.3 Genfamilie der CAB-Proteine __________________________________________23

1.4 Fragestellung und Zielsetzung __________________________________________ 25

2 MATERIAL UND METHODEN _________________________________________ 27

2.1 Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht ___________________________________ 27

2.1.1 Thalluskulturen von M. polymorpha_______________________________________27

2.1.1.1 Kulturbedingungen __________________________________________________27

2.1.1.2 Anlage von Sterilkulturen _____________________________________________28

2.1.1.3 Starklichtexposition__________________________________________________29

2.2 Pigmentanalytik______________________________________________________ 29

2.2.1 Chlorophyllbestimmung ________________________________________________29

2.3 Molekularbiologische Methoden_________________________________________ 30

2.3.1 Bakterienstämme und Vektoren __________________________________________30

2.3.1.1 Anzucht der Bakterien________________________________________________31

2.3.1.2 Dauerkulturen von Bakterien___________________________________________31

2.3.2 Isolierung von Nukleinsäuren ____________________________________________32

2.3.2.1 RNA _____________________________________________________________32

2.3.2.2 Plasmid -DNA ______________________________________________________33

2.3.2.2.1 Präparation von Plasmiden mit geringerem Reinheitsgrad (Boiling-Methode) _____33

2.3.2.2.2 Präparation von Plasmiden mit hohem Reinheitsgrad _______________________33

Inhaltsverzeichnis 5

2.3.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren _______________________________________34

2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen____________________________34

2.3.5 Agarosegelelektrophorese_______________________________________________35

2.3.5.1 Auftrennung von DNA _______________________________________________35

2.3.5.2 Auftrennung von RNA________________________________________________35

2.3.5.2.1 Gelelektrophorese von mit Glyoxal denaturierter RNA ______________________36

2.3.5.2.2 Gelelektrophorese von mit Formaldehyd denaturierter RNA __________________36

2.3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ________________________________________37

2.3.6.1 Oligonukleotidprimer ________________________________________________37

2.3.7 RT-PCR ____________________________________________________________38

2.3.7.1 Reverse Transkription (RT) ____________________________________________38

2.3.7.2 Standardbedingungen für die PCR _______________________________________38

2.3.7.3 PCR für die Amplifikation von DNA-Sonden ______________________________39

2.3.8 Klonierung von DNA-Fragmenten ________________________________________40

2.3.8.1 Isolierung der Insert-DNA _____________________________________________40

2.3.8.2 Vorbereitung des Vektors _____________________________________________40

2.3.8.3 Ligation___________________________________________________________41

2.3.8.4 Herstellung kompetenter Zellen_________________________________________41

2.3.8.5 Transformation von E. coli ____________________________________________41

2.3.8.6 Blau-weiß Selektion _________________________________________________42

2.3.9 DNA-Sequenzierung __________________________________________________42

2.3.10 Northernblot-Analyse _________________________________________________43

2.3.10.1 Transfer von RNA auf Nylonmembranen_________________________________43

2.3.10.2 Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden ___________________________44

2.3.10.3 Hybridisierung_____________________________________________________44

2.3.10.4 Detektion von Hybridisierungen mittels Autoradiographie ____________________45

2.3.10.5 Entfernen radioaktiver Signale vor einer erneuten Hybridisierung ______________45

2.3.11 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels ESTs ________________________45

2.3.11.1 cDNA Bibliotheken _________________________________________________46

2.3.11.1.1 Herstellung ______________________________________________________47

2.3.11.1.2 Titerbestimmung__________________________________________________49

2.3.11.2 In vivo-Excision von pTriplEx2 aus λTriplEx2 ____________________________50

2.3.11.3 Anzucht der EST-Klone______________________________________________51

2.3.11.4 Sequenzierung aus EST-Klonen isolierter Plasmid -DNA _____________________51

2.3.11.5 Verarbeitung von Sequenzdaten: Bioinformatik ____________________________52


ERGEBNISSE ___________________________________________________________ 54

3.1 Strategien zur Identifizierung einzelner Mitglieder der cab-Genfamilie _________ 54

3.1.1 RT-PCR ____________________________________________________________55

3.1.2 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels „expressed sequence tags“_________58

3.1.2.1 Bioinformatische Analyse der EST-Sequenzen _____________________________59

3.1.2.2 ESTs mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen __________________________________60

3.2 Zusammensetzung der cab-Genfamilie von M. polymorpha ___________________ 62

3.2.1 Proteine des LHCI ____________________________________________________65

3.2.2 Proteine des LHCII____________________________________________________67

3.2.2.1 Lhcb1-3___________________________________________________________67

3.2.2.2 Lhcb4-Lhcb6 _______________________________________________________76

3.2.3 Verwandte der cab-Genfamilie ___________________________________________82

3.2.3.1 PsbS _____________________________________________________________82

3.2.3.2 Sep1 ähnliches Protein________________________________________________83

3.2.4 Analyse der Expression einzelner cab-Gene _________________________________84

3.2.4.1 diurnale Expression einzelner cab-Gene __________________________________85

3.2.4.2 Auswirkung von Lichtstress auf die Genexpression des Sep1-ähnlichen Gens ______86

4 DISKUSSION_________________________________________________________ 88

4.1 Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha __________ 88

4.2 Analyse der CAB-Proteinsequenzen______________________________________ 92

4.2.1 Lhca4 ______________________________________________________________93

4.2.2 LHCII1.1-1.4, Lhcb2, Lhcb3 ____________________________________________94

4.2.3 Lhcb4-6 ____________________________________________________________96

4.2.4 Verwandte der cab-Genfamilie ___________________________________________97

4.3 Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha__________________________ 99

4.3.1 Diurnale Expression ___________________________________________________99

4.3.2 Veränderte Expression des Sep1-ähnlichen Gens bei Lichtstress _________________101

4.4 Ausblick ___________________________________________________________ 101

5 ZUSAMMENFASSUNG _______________________________________________ 103


6 LITERATURVERZEICHNIS___________________________________________ 105

7 ANHANG ___________________________________________________________ 119

DANKSAGUNG_________________________________________________________ 127

8

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

A. bidest - deionisiertes, dann 2x destilliertes Wasser

Amp, Ampr - Ampicillin, ampicillinresistent

A. thaliana - Arabidopsis thaliana

ATP - Adenosintriphosphat

BNN132 - Bakterienstamm (E. coli)

bp - Basenpaare

CAB - Chlorophyll a/b bindendes Protein

cDNA - complementary DNA - komplementäre DNA

Chl - Chlorophyll

CP - Chlorophyll-bindendes Protein

Cyt b6/f - Cytochrom b6/f-Komplex

DEPC - Diethylpyrocarbonat

DMSO - Dimethylsulfoxid

DMF - N,N’-Dimethylformamid

DNA - Desoxyribonucleicacid – Desoxyribonukleinsäure

E. coli - Escherichia coli

EDTA - Ethylentetraamineessigsäure

ELIP - early light inducible protein - frühes lichtinduziertes Protein

EST - expressed sequence tags – exprimierte Sequenzbereiche

HLIP - high light inducible protein - Starklicht induziertes Protein

IPTG - Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

K - Kelvin

Kan, Kanr - Kanamycin, kanamycinresistent

kDa - Kilodalton

LB - Luria-Bertani (Medium für Bakterien)

Lil - light harvesting like

LHC-Protein - light harvesting complex – Lichtsammelkomplex

M. polymorpha - Marchantia polymorpha

mRNA - messenger RNA - Boten-RNA

MCS - multiple cloning site - Polylinker

MOPS - Morpholinopropansulfonsäure

MSK2 - Nährmedium zur Kultur von Pflanzen

NPQ - nicht photochemisches Quenching

9

OD - optische Dichte

PCR - polymerase chain reaction - Polymerasekettenreaktion

pfu - plaque forming unit - Plaque-bildende Einheit

PSI - Photosystem I

PSII - Photosystem II

RNA - ribonucleiacid - Ribonukleinsäure

rpm - rotations per minute - Umdrehungen pro Minute

RT - Reverse Transkription

SDS - sodium dodecyl sulfate - Natriumdodecylsulfat

SMART - switch mechanism at the 5’ end of RNA transcripts

SSC - standard saline-citrate

TAE - Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Tet, Tetr - Tetracyklin, tetracyklinresistent

U - unit - Einheit der Enzymaktivität

UV - Ultraviolett

X-GAL - 5-Bromo-4-chloro-3- indoyl-β-D-galctopyranosid

XL1-Blue - Bakterienstamm (E. coli)

XL1-Blue MRF’ - Bakterienstamm (E. coli)

V - Volt

10

1 Einleitung

1.1 Oxygene Photosynthese

Photoautotrophe Organismen vermögen die Lichtenergie der Sonne in chemisch gebundene

Energie umzuwandeln. Bei diesem als Photosynthese bezeichneten Prozeß werden aus einfachen

anorganischen Substanzen mit Hilfe der Energie absorbierter Strahlung energetisch höherwertige

organische Moleküle synthetisiert. Bei der cyanobakteriellen und pflanzlichen Photosynthese ist

die Reduktion von Kohlendioxid zu Kohlehydraten mit der photoinduzierten Oxidation von

Wasser unter Freisetzung von molekularem Sauerstoff gekoppelt. Für den Gesamtvorgang ergibt

sich die folgende Gleichung (Formel 1):

6 CO2 + 12 H2O � C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2 ÄG° = 2868 kJ Formel 1

Grundvoraussetzung für die Fähigkeit zur photoinduzierten Oxidation von Wasser ist die

Erzeugung eines genügend hohen Redoxpotentials. Dies ist bei Cyanobakterien und Pflanzen

durch das Hintereinanderschalten von zwei in Serie arbeitenden Photosystemen verwirklicht.

Photosysteme sind membrangebundene Multiproteinkomplexe, die sich aus einem Kernkomplex

mit integralem Reaktionszentrum und einem Lichtsammlerkomplex zusammensetzen.

Gemeinsam mit zwei weiteren membrangebundenen Multiproteinkomplexen dem

Cytochrom b6/f-Komplex (Cyt b6/f) und der ATP-Synthase vermitteln die Photosysteme I (PSI)

und II (PSII) unter Einbezug von beweglichen Elektronenüberträgern (Plastochinon,

Plastocyanin, Ferredoxin), die einzelnen Reaktionsschritte des photochemischen Teilprozesses

der oxgenen Photosynthese (Abb. 1).

Pigmente der Lichtsammlersysteme (Antennen) absorbieren Lichtquanten des sichtbaren

Bereichs des Lichtspektrums und leiten deren Energie schnell und effizient in Form von

Excitonen an die photochemischen Reaktionszentren weiter. An speziellen Chlorophyllen in den

Reaktionszentren (special pair) findet die primäre Ladungstrennung statt, und freigesetzte

Elektronen werden über eine Reihe verschie dener Elektronenakzeptoren bzw.

Elektronendonatoren weitergeleitet und schließlich in Form von Reduktionsäquivalenten

festgelegt. Das während des lichtgetriebenen Elektronenflusses durch den Protonentransport und

den sich dadurch aufbauenden Protonengradie nten gebildete elektrochemische Potential über der

Membran wird für die Synthese von Energieäquivalenten in Form von Adenosintriphosphat

(ATP) genutzt.

Einleitung 11

____________________ 1) Für die freien Substanzen wird im folgenden die Bezeichnung Chromophor verwendet, für die Chromophor-Protein-Komplexe der Begriff Pigment.

Bei Pflanzen sind die Multiproteinkomplexe des Photosyntheseapparates in das Thylakoid-

system der Chloroplasten eingebettet und auf unterschiedliche Bereiche dieses Membransystems

verteilt (ANDERSON & ANDERSON, 1988). Während sich das PSII vor allem in den dicht

gestapelten Granathylakoiden befindet, sind das PSI und die ATP-Synthase bevorzugt in den

Stromathylakoiden lokalisiert. Der Cyt b6/f-Komplex ist auf die beiden Membrandomänen

relativ gleich verteilt.

Abb. 1: Vereinfachte Darstellung des photosynthetischen Elektronentransportes bei Pflanzen. Grau: plastidenkodierte Proteine, weiß: kernkodierte Proteine. Die einzelnen Komponenten der Multiprotein-komplexe tragen die Bezeichnung des für sie kodierenden Gens, einige auch die des Proteins (Schema vereinfacht nach HERRMANN 1996).

1.2 Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen

Der überwiegende Teil der an der Photosynthese beteiligten Chromophore ist in den Antennen

organisiert. Dadurch erhöhen Antennen den Absorptionsquerschnitt der Reaktionszentren um ein

Vielfaches. Drei Klassen von Chromophoren sind für die Absorption von Lichtquanten und die

Weiterleitung der Energie in Antennen oxygener photosynthetischer Organismen von

Bedeutung: die Chlorophylle, die Phycobiline und die Carotinoide. Alle diese Chromophore sind

in Form wohl definierter Chromophor -Protein-Komplexe organisiert1.

Durch die Zahl und die spektralen Eigenschaften der enthaltenen Chromophore erlauben

Antennen eine flexible Anpassung des Photosyntheseapparates an unterschiedliche

Einleitung 12

Lichtbedingungen. Somit stellen sie das wesentliche adaptive Element dar, das dem

Photosyntheseapparat ermöglicht, möglichst effizient zu arbeiten.

In Anbetracht der Bedeutung der Photosynthese für die heutige Vielfalt an Lebensformen auf der

Erde ist es wichtig, ein möglichst umfassendes Verständnis zur Funktionsweise

photosynthetischer Antennensysteme zu entwickeln.

1.2.1 Struktur und Funktion

Ein Vergleich der heute bekannten photosynthetischen Systeme zeigt, daß die Evolution mehrere

verschiedene Lichtsammlersysteme hervorgebracht hat. Die funktionellen Anforderungen an die

verschiedenen Antennen sind jedoch gleich. Jede photosynthetische Antenne muß:

(i) Lichtenergie effizient absorbieren,

(ii) die Anregungsenergie schnell und möglichst verlustfrei an die photochemischen

Reaktionszentren weiterleiten bzw. auf diese verteilen,

(iii) überschüssige Lichtenergie zum Schutz vor photooxidativen Schäden ableiten.

Vielfalt herrscht vor allem bei den äußeren Antennensystemen. Neben den mit den

Kernkomplexen der Photosysteme assoziierten lichtsammelnden Komplexen (äußere Antennen),

beteiligen sich auch Pigmente der Kernkomplexe selbst an der Weiterleitung von

Anregungsenergie an die Reaktionszentren. Diese Lichtsammelproteine der Kernkomplexe,

werden als innere Antennen bezeichnet. Bei Pflanzen bilden die eng mit dem Reaktionszentrum

assoziierten Kernkomplexuntereinheiten CP43 und CP47, die innere Antenne des PSII. Sie

binden neben Carotinoiden vorwiegend Chlorophyll a (Chl a). Beim PSI hingegen ist die innere

Antenne integraler Bestandteil der Reaktionszentrumsuntereinheiten PsaA/B.

Die Organisation der Antennenchromophore in wohl definierten Chromophor-Protein-

Komplexen ist von enormer Bedeutung für ihre funktionellen Eigenschaften. Durch die Bindung

an Proteine, nicht kovalent (Chlorophylle und Carotinoide) oder kovalent (Phycobiline), werden

die spektralen Eigenschaften der Chromophore beeinflusst, sowie deren räumliche Anordnung

festgelegt (SIMPSON & KNOETZEL, 1996). Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die wichtigsten

Charakteristika der Gruppen photosynthetischer Chromophore oxygener Phototropher.

Einleitung 13

Tab. 1: Vorkommen und ausgewählte Charakteristika der Chromophore oxygener Phototropher.

Chromophor Organismen Vorkommen (RC, Kernantennen, periphere Antennen)

Funktion Absλmax [nm]1)

Emλmax [nm]1)

Chl a Cyanobakterien, Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen

� RC, Kernantennen � alle Komplexe � alle Komplexe � alle Komplexe � alle Komplexe

Lichtsammlung, Ladungstrennung in den RC

~ 440, ~ 670

680-730

Chl b Prochlorophyten Grünalgen Moose, Farne, Höhere Pflanzen

periphere Antennen

Lichtsammlung

~ 460, ~650

~ 660

Chl c Prochlorophyten Cryptophyten Chromophyten

periphere Antennen

Lichtsammlung

~ 400, (500-600)

~ 620

Chl d Prochlorophyten, Rotalgen

periphere (?) Antennen

Lichtsammlung

~ 440, ~ 690

~ 700

β-Carotin Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen

alle Komplexe

Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie

420-480

~ 700

Xanthophylle Pflanzen

periphere Antenne

Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie

400-500

1 ) in vivo

Die präzise Abstimmung der Abstände und Orientierungen der Antennenchromophore

zueinander ist insbesonders für den strahlungslosen Energietransfer an die Reaktionszentren

entscheidend.

Anregungsenergie muß in den Antennen über Distanzen von mehreren 100 Å transferriert

werden. Grundsätzlich kann die Weiterleitung von Excitonen in photosynthetischen Antennen

über zwei Mechanismen erfolgen, über den Förster- oder den Dexter-Mechanismus. Während

der Förster-Mechanismus einen Energietransfer über Entfernungen von bis zu 100 Å erlaubt, ist

über den Dexter-Mechanismus nur ein Transfer über kürzere Entfernungen von bis zu 20 Å

möglich (SAUER 1986, VAN GRONDELLE et al. 1994).

Dem Förster-Mechanismus liegt eine Resonanzinduktion von Dipolen ohne die wirkliche

Verschiebung von Elektronen zugrunde, der Mechanismus des Dexter-Transfers hingegen ist ein

vollständig anderer (Abb. 2). Hier werden Elektronen zwischen einem Donor-Chromophor und

einem Akzeptor-Chromophor getauscht („Austauschmechanismus“). Aus dem angeregten

Zustand des Donors wechselt ein Elektron zum angeregten Zustand des Akzeptors, während ein

Elektron aus dem Grundzustand des Akzeptors zum Grundzustand des Donors wechselt

(HOLZWARTH 1999). Antennen müssen nicht nur in der Lage sein, Lichtenergie effizient zu

Einleitung 14

absorbieren und weiterzuleiten, sondern sie müssen auch überschüssige Energie wieder abgeben

können. Wird mehr Lichtenergie von den Antennen absorbiert als durch den

Photosyntheseapparat genutzt werden kann, kommt es infolge eines zu hohen Reduktionsgrades

der Elektronentransportkette zur Verminderung der Quantenausbeute. Die relativ lange

Lebensdauer der angeregten Zustände in den Chromophoren, die ja einerseits entscheidend für

die Effizienz der Lichtabsorption ist, birgt zugleich die Gefahr der Bildung von

Triplettzuständen. Chlorophylle im Triplettzustand führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffe wie

Singulett-Sauerstoff, die die oxidative Zerstörung von Pigmenten und Proteinen bedingen

(HOLZWARTH 1999).

Eine große Bedeutung bei der Dissipitation überschüssiger Energie wird den Carotinoiden

zugeschrieben (SIEFERMANN-HARMS 1987, DEMMING-ADAMS 1990, YOUNG 1991, NIYOGI

1999). Carotinoide sind sowohl in photosynthetischen Antennen als auch in den

Reaktionszentren vorhanden. Sie vermögen nic ht nur als Lichtsammlerpigmente zu fungieren,

sondern auch mit Triplett-Chlorophyll oder Singulett-Sauerstoff zu reagieren und die

übernommene Energie als Wärme abzugeben (SIEFERMANN-HARMS 1987, YAMAMOTO & BASSI

1996). Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus, der in den Antennen das Umschalten

zwischen Energietransfer und Energiedissipitaion steuert, ist aber noch nicht verstanden

(HORTON, 1996).

Auch durch die variable Umverteilung von Anregungsenergie zwischen den Photosystemen kann

ein zu hoher Energietransfer zu den Reaktionszentren verhindert werden. Die Phosphorylierung

der Trimere bildenden Lichtsammelproteine Lhcb1 und Lhcb2 im N-terminalen Bereich

(BENNETT 1991, ALLEN 1992, ALLEN & NIELSON 1997) führt bei Pflanzen zur Ablösung dieser

Abb. 2 : Mechanismen des Energie-transfers in photosynthetischen Antennen. a): Förster-Mechanismus. B): Dexter-Mechanismus. Die kurzen, roten Pfeile symbolisieren die Spin-Zustände der beteiligten Elektronen in den ent-sprechenden Molekülorbitalen bzw. Elek-tronenzuständen (horizontale Linien). Die roten gebogenen Pfeile geben den Übergang der entsprechenden Elektronen an, die beim Energietransfer beteiligt sind.

Einleitung 15

_____________________________ 1) der LHCII ist die periphere Antenne des PSII bei Pflanzen (siehe auch 1.3)

Proteine von der peripheren Antenne des PSII (SCHUSTER et al. 1986). Diese Proteine migrieren

dann von den Grana- in die Stromabereiche des Thylakoidsystems und lagern sich dort an das

PSI an (MCCORMAC et al. 1994), wo sie wieder als Antennen fungieren. Die Veränderung der

Verteilung der Trimere des Lichsammelkomplexes II (LHCII)1) zwischen den Photosystemen

wird auch als state transitions bezeichnet (ANDERSON 1986, ANDERSON & ANDERSON 1988,

MELIS 1991, ALLEN 2001).

1.2.2 Antennensystemtypen und ihre Verbreitung

Äußere Antennen lassen sich generell in membranextrinsiche und membranintrinsische

Antennen unterscheiden.

Membranextrinsiche Phycobilinantennen finden sich in Cyanobakterien, Cryptophyceen und

Rotalgen. Nur durch einen kleinen Membrananker sind diese Antennen mit den

photosynthetischen Membranen verbunden. Aufgrund der spektralen Eigenschaften der

gebundenen Phycobiline können membranextrinsische Antennen grünes Licht effizienter nutzen,

als dies membranintrinsischen Antennen vermögen.

Diese hingegen benötigen viel weniger Protein pro Chromophor als membranextrinsiche

Antennen und können aufgrund ihres hohen Chromophor zu Protein-Verhältnisses mit relativ

geringem Aufwand an Proteinsynthese hohe Absorptionskapazitäten erreichen.

Die Chromophoren membranintrinsischer Antennen sind verschiedene Chlorophylle und

Carotinoide. Membranintrinsische Chlorophyll a/b bindende Antennen sind für prokaryotische

Prochlorophyten sowie für eukaryotische Chlorophyten, Moose, Farnpflanzen und Höhere

Pflanzen charakteristisch. Fucoxanthin Chlorophyll a/c bindende Antennensysteme finden sich

in Chromophyten.

1.3 Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen

Lichtsammelproteine mit drei membrandurchspannenden Helices bilden die mit den

Kernkomplexen der Photosysteme der Pflanzen assoziierten Lichtsammelkomplexe, die als

LHCs (light harvesting complexes) bezeichnet werden. Die kerncodierten, verschiedene

Chlorophylle und Carotinoide bindenden Lichtsammelproteine dieser LHC-Komplexe zeichnen

sich durch einen hohen Grad an Sequenzhomologie aus. Deshalb werden sie als eine

Proteinfamilie und die zugehörigen Gene als Genfamilie angesehen (GREEN et al. 1991, GREEN

& DURNFORD 1996). Die Kurzbezeichnung für die Mitglieder der Proteinfamilie lautet Lhc-

Einleitung 16

Proteine, abgeleitet von der englischen Bezeichnung Light harvesting chlorophyll proteins

(PICHERSKY & JANSSON 1996). Zu bedenken ist, daß der Begriff Lhc-Proteine weiter gefaßt ist

und ebenfalls die chloroplastencodierten Chl a bindenden Lichtsammelproteine der

Kernkomplexe (innere Antennen), die einer eigenen Proteinfamilie zugehören, mit einschließt.

Die strukturellen und funktionellen Gemeinsamkeiten der kerncodierten Lhc-Proteine lassen die

Entwicklung aus einem gemeinsamen Vorläufer vermuten (DURNFORD et al. 1999).

MULKIDJANIAN & JUNGE (1997) postulieren die Entwicklung der Reaktionszentren und

membranintrinsicher Lichtsammelproteine aus einem Vorläuferprotein mit zehn

membrandurchspannenden Helices, wie es noch im Reaktionszentrum der Heliobacteriaceae

konserviert ist. Dieses Protein soll ursprünglich als UV-Protektor fungiert haben.

Nach der Endosymbiontentheorie sind Chloroplasten aus von Eukaryoten inkorporierten

Cyanobakterien hervorgegangen. Ob LHCs bzw. ihre Proteine bereits in Cyanobakterien

entwickelt wurden, ist unklar. Die charakteristischen Antennen der Cyanobakterien, die

Phycobilisomen, sind membranextrinsiche Antennen. Zwar wurden in Cyanobakterien erst

kürzlich zusätzliche membranintrinsiche Antennen um das PSI nachgewiesen (BOEKEMA et al.

2001, BIBBY et al. 2001) , bei diesen handelt es sich jedoch nicht um LHCs. Die

Proteinkomponente dieser unter Eisenmangelbedingungen identifizierten intrinsischen Antenne

bindet Chl a und weist starke Sequenzhomologie zur CP43 Untereinheit der Kernantenne um das

PSII auf.

Bei Rotalgen jedoch, die ebenfalls Phycobilisomen als äußere Antennen nutzen, konnten LHCs

nachgewiesen werden (WOLFE et al. 1994, TAN et al. 1997 a, TAN et al. 1997 b). Diese sind

spezifisch mit dem PSI assoziiert (MARQUARDT & RHIEL 1997). Die Proteine dieser LHCs lassen

sich aufgrund der vorhandenen Sequenzhomologie der Proteinfamilie der kerncodierten Lhc-

Proteine zuordnen. Dies läßt vermuten, daß diese Proteine vor der getrennten Entwicklung der

Rot- und Grünalgen entstanden sind. Die Coexistenz von Phycobilisomen und LHCs unterstützt

allerdings nachhaltig den gemeinsamen evolutionären Ursprung aller Chloroplasten (DURNFORD

et al. 1999). Auch die erst vor wenigen Jahren entdeckten, zu den Cyanobakterien zählenden

Prochlorophyten weisen aufgrund ihrer Chromophorzusammensetzung auf eine direkte

Verwandschaft der Cyanobakterien und Chloroplasten hin. Prochlorophyten besitzen anstelle

von Phycobilisomen Chlorophyll a/b bindende Antennen (PALENIK & HASELKORN 1992,

MATTHIJS et al. 1994, POST & BULLERJAHN 1994). Allerdings handelt es sich nicht um LHCs.

Die Chlorophyll a/b bindenden Proteine dieser Antennen weisen starke Sequenzhomologie zu

den Proteinen der IsiA Gene des Cyanobakteriums Synechococcus sp. PCC7942 auf (LA ROCHE

et al. 1996). Diese wiederum sind dem Chl a bindenden CP43 Protein Höherer Pflanzen

verwandt.

Einleitung 17

1.3.1 Chlorophyll a/b bindende Proteine

Seit der ersten Isolierung eines Chlorophyll a/b bindenden (CAB) Proteins durch THORNBER

(1975) sind zahlreiche CAB-Proteine einschließlich der sie codierenden Gene (cab-Gene)

beschrieben und charakterisiert worden.

Zehn verschiedene Typen lassen sich unterscheiden (JANSSON et al. 1992, JANSSON 1994),

wovon vier ausschließlich mit PSI und sechs in der Regel mit PSII assoziiert sind. Sie sind die

Genprodukte der kerncodierten Lhc-Gene und tragen die Bezeichnung Lhca1-Lhca4 für die mit

PSI bzw. Lhcb1-Lhcb6 für die mit PSII assoziierten Proteine. Zwei weitere Gensequenzen,

Lhca5 und Lhca6, wurden für Arabidopsis thaliana beschriebenen und lassen die Existenz

weiterer CAB-Proteine vom Lhca-Typ vermuten (JANSSON 1999).

Abbildung 3 zeigt die derzeitigen Modellvorstellungen zur Organisation der verschiedenen

Antennenpigmente des PSI bzw. des PSII bei Höheren Pflanzen. Zahlreiche verschiedene

Nomenklaturen haben sich im Zuge der Erforschung der CAB-Proteine ergeben, die leider nur

unnötig verwirren. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über die verschiedenen Nomenklaturen. In der

vorliegenden Arbeit wird in der Regel die Nomenklatur von JANSSON (1994) verwendet.

Tab. 2: Nomenklaturen für die zehn verschiedenen Typen von CAB-Proteinen

Gen GREEN et al. 1991 THORNBER et al. 1991 BASSI et al. 1990 JANSSON 1994

Lhca1 Type I LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca1

Lhca2 Type II LHCI ? LHCI-680 Lhca2

Lhca3 Type II LHCI LHC Ia LHCI-680 Lhca3

Lhca4 Type IV LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca4

Lhcb1 Type I LHCII LHC IIb 28 kDa LHCII Lhcb1

Lhcb2 Type II LHCII LHC IIb 27 kDa LHCII Lhcb2

Lhcb3 Type II LHCII LHC IIb 25 kDa LHCIIa Lhcb3

Lhcb4 Type II CP29 LHC IIa CP29 Lhcb4

Lhcb5 Type I CP29 LHC IIc CP26 Lhcb5

Lhcb6 CP24 LHC IId CP24 Lhcb6

Einleitung 18

A B

Abb. 3: Modellvorstellung zur Organisation der Antennenproteine des PSI (A) bzw. PSII (B) am Beispiel Höherer Pflanzen (A: aus SCHELLER et al. 2001; B: aus JANSSON 1994).

1.3.1.1 Struktur

Jedes der zehn verschiedenen CAB-Proteine besitzt vier α-helicale Domänen: drei

membrandurchspannende, von denen die erste und die dritte homolog zueinander sind und eine

vierte, viel kürzere und Lumen exponierte. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der

Struktur des Lhcb1-Proteins der Erbse, dessen atomare Struktur von KÜHLBRANDT und

Mitarbeitern (1994) durch Elektronenbeugung an zweidimensionalen Kristallen bestimmt wurde.

Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung der verschiedenen CAB-Proteine wird diese

Kristallstruktur als Strukturmodell für alle CAB-Proteine herangezogen.

Die erste und die dritte Helix durchspannen die Thylakoidmembran in einem Winkel von

ca. 45 ° zueinander und werden durch Arginin -Glutamin Salzbrücken zusammengehalten. Eine

Folge von 22 Aminosäuren, die auch als „LHC-Motiv“ bezeichnet wird, ist in diesen Helices

hoch konserviert. Die Konsenssussequenz für dieses Sequenzmotiv lautet:

ELINGRLAMLGFGFLVPELIT. Fast sämtliche an der Chlorophyllbindung beteiligten

Aminosäuren sind in dieser hydrophoben Region lokalisiert. Bei der Chlorophyllbindung selbst

spielen neben Koordinationen mit den Aminosäuren Histidin, Glutamin und Asparagin auch

Einleitung 19

______________________________ 1) Die 1.-4. transmembrane Helix der CAB-Proteine werden vom Strukturmodell der Erbse abgeleitet und auch wie folgt bezeichnet: 1. Helix = B, 2. Helix = C, 3. Helix = A, 4. Helix = D.

Pigment/Pigment-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Eine weitere Bindungsstelle für

Chlorophylle, vermutlich für Chl b ist in der vierten, Lumen exponierten Helix lokalisiert

(KÜHLBRANDT et al. 1994).

Zwei eng mit den Helices eins und drei assoziierte Carotinoid-Moleküle stabilisieren die

Gesamtstruktur.1) Bei diesen handelt es sich um zwei Lutein-Moleküle (BASSI et al. 1993,

KÜHLBRAND et al. 1994).

Abb. 4: Schematische Darstellung der Struktur des Lhb1-Moleküls nach KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994). Die schraubenförmigen Bänder stellen die α-helicalen Bereiche des Proteins dar, dünne Fäden die verbindenden Loops. Der N-Terminus ist links oben und dem Stroma zugewandt, der C-Terminus links unten und dem Thylakoidlumen zugewandt. Die Zuordnung der Chlorophylle (Chl a schwarz, Chl b rot) und ihre Orientierungen sind bisher noch nicht gesichert.

CAB-Proteine besitzen außer den beiden Bindungstellen in der ersten und der dritten

transmembranen Helix noch weitere Carotinoid-Bindungsstellen, die zum Teil keine ausgeprägte

Spezifität für ein bestimmtes Carotinoid zeigen. Neben β-Carotin können sie die Xanthophylle

Neoxanthin, Violaxanthin und Lutein binden (SIEFERMANN-HARMS 1985, BASSI et al. 1993,

YAMAMOTO & BASSI 1996, BASSI & CAFFARRI 2000). Unterschiede zwischen verschiedenen

CAB-Proteinen bestehen sowohl was die Anzahl der gebundenen Chlorophylle als auch die Art

der gebundenen Carotinoide betrifft. So enthält ein Lhcb1-Molekül mindestens 12 Chlorophylle:

7 Chl a und 5 Chl b Moleküle (KÜHLBRANDT et al. 1994), während ein Lhcb4 Polypeptid nur

8 Chlorophylle bindet (6 Chl a, 2 Chl b) (SANDONA et al. 1998).

Einleitung 20

1.3.1.2 Ausgewählte Eigenschaften

In Anbetracht der ca. 350 Millionen Jahren konservierten, sehr komplexen Organisation der

Antennensysteme liegt die Vermutung nahe, daß jedem einzelnen CAB-Protein eine besondere

Funktion zukommt (JANSSON 1994). Seitens der differenzierten Funktionen der einzelnen CAB-

Proteine besteht jedoch noch ein enormer Aufklärungsbedarf. Es folgt eine kurze

Zusammenstellung ausgewählter Eigenschaften der verschiedenen Mitglieder der CAB-

Proteinfamilie.

Lhca1-4

Die vier CAB-Proteine Lhca1, Lhca2, Lhca3 und Lhca4 bilden den Lichtsammelkomplex I

(LHCI), die periphere Antenne des PSI von Pflanzen. Aufgrund der jeweils typischen Maxima

im Fluoreszenzemissionsspektrum bei 77 K wird zwischen zwei verschiedenen

Lichtsammelkomplexen unterschieden, dem LHCI-680 und dem LHCI-730. Die mit 22 kDa und

21 kDa zu den kleineren CAB-Proteinen zählenden Lhca1- und Lhca4-Proteine bilden

zusammen den Subkomplex LHCI-730. Die Bestandteile des LHCI-680 sind die

Antennenproteine Lhca2 und Lhca3 (KNOETZEL et al. 1992). Die exakte Position und die Anzahl

der Dimere an Lhca Proteinen, die den LHCI bilden, konnte jedoch bislang noch nicht ermittelt

werden (JANSSON 1999). Nach der derzeitigen Modellvorstellung sind sämtliche Lhca-Proteine

asymmetrisch auf einer Seite des PSI-Kernkomplexes lokalisiert (siehe Abb. 3).

Für die Ausbildung des Heterodimers aus Lhca1 und Lhca4 wird Chlorophyll b benötigt

(SCHMID et al. 1997). BOSSMANN und Mitarbeiter (1997) zeigten, daß Lhca4 als einziges LHCI-

Protein in der Chlorophyll b-freien Gerstenmutante chlorina-f2f2 nicht stabil ist. Das Lhca 4-

Protein gehört damit zusammen mit dem Lhcb1- und dem Lhcb6-Protein des PSII zu den

Antennenproteinen, die Chlorophyll b für die vollständige und stabile Insertion in die

Thylakoidmembran benötigen.

Lhcb1-3

Der Lichtsammelkomplex II (LHCII), der mit dem Kernkomplex des PSII assoziiert ist, wird

durch die Antennenproteine Lhcb1-Lhcb6 gebildet. Während Lhcb1 und Lhcb2 bzw. Lhcb1,

Lhcb2 und Lhcb3 gemischte Trimere bilden und an der Peripherie der äußeren PSII-Antenne

lokalisiert sind, gruppieren sich die als Monomere vorliegenden Antennenproteine Lhcb4, Lhcb5

und Lhcb6 eng um den Kernkomplex (PETER & THORNBER 1991a, BASSI et al. 1993). Trimerer

LHCII kann im Rahmen von den sogenannten state transitions, über welche die Verteilung der

Anregungsenergie unter den Photosystemen reguliert wird (WANG & MEYERS 1974) als Antenne

Einleitung 21

für beide Photosysteme fungieren. Alle rdings werden nur Homotrimere aus Lhcb1 sowie

Heterotrimere aus Lhcb1 und Lhcb2 von PSII abgekoppelt. Trimere, die Lhcb3 enthalten,

verbleiben an PSII (THORNBER et al. 1994, JANSSON 1999). Dies mag damit zusammenhängen,

daß Lhcb3 im Gegensatz zu Lhcb1 und Lhcb2 nicht phosphorylierbar ist.

Das Lhcb1-Protein ist das häufigste Protein in Thylakoidmembranen (JANSSON 1994) und bindet

rund die Hälfte aller an der Photosynthese beteiligten Pigmente (KÜHLBRANDT et al. 1994).

Lhcb4-6

Eng um den Kernkomplex des PSII gruppieren sich die Lichtsammelproteine Lhcb4, Lhcb5 und

Lhcb6. Diese CAB-Proteine binden insgesamt weniger Chlorophyll als der trimere LHCII, dafür

aber weitaus größere Mengen an Carotinoiden (Tab. 3). So werden von ihnen zB. 80 % des

gesamten Violaxanthins im PSII gebunden (BASSI et al. 1993). Aufgrund der hohen Anzahl an

gebundenen Carotinoiden kommt diesen CAB-Proteinen wahrscheinlich eine besondere

Funktion bei der Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie zu (BASSI et al. 1993,

GILMORE 1997, NIYOGI 1999).

Carotinoide vermögen sowohl Anregungsenergie auf Chlorophylle zu transferieren als auch

Anregungsenergie von Chlorophyllen im Triplettzustand zu übernehmen. Letzterer Eigenschaft

kommt im Zusammenhang mit dem Xanthophyllzyklus eine besondere Bedeutung zu. Beim

Xanthophyllzyklus wird in einem reversiblen, über den lumenalen pH regulierten Prozess

Violaxanthin über Antheraxanthin zu Zeaxanthin deepoxidiert. Der Triplettzustand des

Zeaxanthins liegt unter dem des Triplett-Chlorophylls und Zeaxanthin kann daher die

Anregungsenergie des Triplett-Chlorophylls übernehmen. Das Zeaxanthin, das durch die

Aktivität der Violaxanthin-Deepoxidase entsteht, wird zum Teil von den CAB-Proteinen Lhcb4

und Lhcb5 gebunden (VERHOEVEN et al. 1999). Ein Großteil verble ibt jedoch frei in der

Lipidphase, wo es Lipide vor der Peroxidation schützt (HAVAUX & NIYOGI 1999). Die Zunahme

des Gesamtgehaltes an Xanthophyllen bei Pflanzen, die sich an Starklichtstandorte anpassen,

legt eine protektive Funktion der Xanthophyllzykluspigmente nahe (THAYER & BJÖRKMANN

1990, SCHÄFER et al. 1994).

BERGANTINO und Mitarbeiter (1995) zeigten an Mais, daß das Lhcb4-Protein bei Licht- und

Kältestreß phosphoryliert. Da Mais-Linien mit einer geringeren Fähigkeit zur Phosphorylierung

des Lhcb4 auch empfindlicher auf Licht und Kältestress reagieren (MAURO et al. 1997) wird dem

Lhcb4 eine besondere Funktion bei der Anpassung an derartige Streßsituationen zu gesprochen.

Über die spezifischen Funktionen des Lhcb6 ist noch wenig bekannt.

Einleitung 22

Tab3: Anzahl der mit verschiedenen CAB-Proteinen des PSII assoziierten Chromophore (nach YAMAMOTO & BASSI 1996). Angegeben wurde die aus experimentellen Werten errechnete Anzahl der Moleküle pro Polypeptid.

Protein Chl a Chl b β-Carotin Lutein Neoxanthin Violaxanthin Referenz

Trimerer LHCII 7 5 - 2 0.4-0.1 0.05-0.02 a,b

Lhcb4 6 2 0.1 1.3 0.5 1.0 a,c

Lhcb5 6 3 0.1 1.3 0.4 0.5 a,d

Lhcb6 3 2 0.2 1.2 - 0.5 a,d

a) BASSI et al. 1993, b) KÜHLBRANDT et al. 1994, c) DE VITRY et al. (1984), d) PETER & THORNBER (1991a)

PsbS

Das ebensfalls Chl a und Chl b bindende PsbS-Protein des PSII weist einige Besonderheiten auf

und wird in der Regel deshalb als Verwandter der 10 CAB-Proteine bezeichnet:

- So zeichnet es sich durch vier transmembrane Helices statt der sonst typischen drei aus.

Drei dieser Helices weisen Homologie zu denen der CAB-Proteinen auf (GRIMM 1989).

- Das PsbS bindet Chl a und b (FUNK et al. 1995 a) in erheblich geringerer Menge

(4-6 Chlorophylle) als andere CAB-Proteine (FUNK et al. 1995 a) und ist aufgrund der geringen

energetischen Kopplung der gebundenen Chlorophylle wahrscheinlich nicht an der

Lichtsammlung selbst beteiligt.

- Im Gegensatz zu anderen CAB-Proteinen kann das PsbS auch bei Abwesenheit von

Chromophoren stabil in die Thylakoidmembran integriert werden (FUNK et al. 1995b).

Dem PsbS-Protein wird eine besondere Funktion beim nicht photochemischen Quenching (NPQ)

zugeschrieben. Hierunter wird weitläufig die Ableitung überschüssiger Anregungsenergie in

Form von Wärme und Fluoreszenz verstanden (OSMOND 1994). LI und Mitarbeiter (2000)

zeigten an einer Mutante von A. thaliana, daß die Deletion des psbS-Gens zu einer deutlichen

Abnahme des NPQ führt. Die Funktionsweise des PsbS-Proteins ist allerdings noch nicht

verstanden. Vorstellbar ist, daß über die Ansäuerung des Thylakoidlumens eine

Konformationsänderung des Proteins induziert wird. Diese Konformationsänderung bedingt, daß

benachbarte PSII-Untereinheiten ebenfalls ihre Konformation ändern. Durch die

Konformationsänderung verändern sic h die funktionellen Eigenschaften dieser Untereinheiten

dahingehend, daß sie dann in der Lage sind, überschüssige Anregungsenergie abzuleiten.

(BASSI & CAFFARI 2000).

Einleitung 23

1.3.1.3 Genfamilie der CAB-Proteine

Je nach Species kann die Zahl der Gene, die für ein CAB-Protein kodieren, stark variieren. Die

höchste Anzahl ist für das Lhcb1-Gen mit 5-18 Genen beschrieben worden (PICHERSKY &

JANSSON 1996), während für die übrigen CAB-Proteine jeweils nur ein oder wenige Gene

bekannt sind.

Neben den genannten 10 Typen an CAB-Proteinen umfaßt die Genfamilie der CAB-Proteine

zahlreiche weitere Mitglieder (Tab. 4). Auch die Gene der sogenannten high light induced

proteins (HLIPs) der prokaryotischen Cyanobakterien (DOLGANOV et al. 1995), der early light

induces proteins, kurz ELIPs (ADAMSKA et al. 1992) genannt und das PsbS-Protein (KIM et al.

1992, WEDEL et al. 1992) gehören dieser Genfamilie an (GREEN & PICHERSKY 1994). Durch eine

Analyse der zahlreichen für A. thaliana existierenden Sequenzen von EST-Klonen (EST =

„expressed sequence tags“) wurden weitere Mitglieder der Genfamilie identifiziert und diese

insgesamt zur „Super“-Genfamilie ausgeweitet (JANSSON 1999). Neben zwei neuen Lhca-Genen,

Lhca5 und Lhca6, wurden weitere Gene für Stress-induzierte Proteins (Seps) entdeckt. Aufgrund

der vorhandenen Sequenzhomologien (LHC-Motiv) in einer von zwei transmembranen Helices

sind die Gene dieser Proteine der Genfamilie der CAB-Proteine zuzuordnen. Auch ein als HLIP

bezeichnetes Protein mit einer transmembranen Helix wurde als neues Mitglied der Lhc-

Genfamilie von A. thaliana identifiziert (JANSSON 1999).

Die Nomenklatur der neuen Mitglieder sorgt für Verwirrung. So existieren synonyme

Bezeichnungen für die Gene der Sep-Proteine, die einerseits als Sep1-3 (ADAMSKA 2001), aber

auch als Lil3-5 (JANSSON 1999) bezeichnet werden. Gleiches gilt für die Gene der ELIPs 1 und

2, die einerseits als Elip1-2 (ADAMSKA 2001) andererseits als Lil 1-2 bezeichnet werden. Es sei

darauf verwiesen, daß in dieser Arbeit im folgenden die Nomenklatur von ADAMSKA (2001)

verwendet wird. ADAMSKA (2001) nimmt eine Gliederung der Familie der Elip-Proteine in drei

Gruppen vor:

(1) Proteine mit drei transmembranen Helices: ELIPs

(2) Proteine mit zwei transmembranen Helices: Seps

(3) Proteine mit einer transmembranen Helix: HLIPs, Scps (small cab like proteins), Ohps (one helix proteins)

Einleitung 24

Tab. 4: Mitglieder der cab-„Super“-Genfamilie von A. thaliana (JANSSON 1999).

Gen Protein Aminosäuren des Proteins

mit Transitpeptid

Aminosäuren des Proteins

ohne Transitpeptid

Lhca1 Lhca1 241 197

Lhca2.1 Lhca2.1 271 213

Lhca3 Lhca3 252 232

Lhca4 Lhca4 255 199

Lhca5 Lhca5 277 211

Lhca6 Lhca6 267 220

Lhcb1.1 Lhcb1.1 267 232

Lhcb1.2 Lhcb1.2 267 232

Lhcb1.3 Lhcb1.3 267 232

Lhcb1.4 Lhcb1.4 266 231

Lhcb1.5 Lhcb1.5 265 232

Lhcb2.1 Lhcb2.1 265 228

Lhcb2.2 Lhcb2.2 265 228

Lhcb2.3 Lhcb2.3 266 228

Lhcb2.4 Lhcb2.4 265 228

Lhcb3 Lhcb3 290 223

Lhcb4.1 Lhcb4.1 288 258

Lhcb4.2 Lhcb4.2 276 256

Lhcb4.3 Lhcb4.3 280 244

Lhcb5 Lhcb5 258 243

Lhcb6 Lhcb6 265 211

PsbS PsbS 195 205

Elip1 ELIP1 193 149

Elip2 ELIP2 110 151

Hlip HLIP 262 69

Sep1 Sep1 146 103

Sep2 Sep2 202 181

Sep3 Sep3 262 223

Evolution der cab-Genfamilie

Die derzeitige Vorstellung zur evolutionären Entwicklung der cab-Genfamilie beruht auf der

Sequenzähnlichkeit in den Helix-Bereichen zwischen den cyanobakteriellen HLIPs einerseits

und den verschiedenen CAB-Proteinen andererseits (DOLGANOV et al. 1995). Ausgehend von

einem HLIP ähnlichen Protein (eine transmembranen Helix) soll durch zwei interne

Genduplikationen ein Protein mit vier Helices entstanden sein. Die Reduktion einer Helix im

Verlauf der Evolution habe dann zu den heutigen Lhc-Proteinen mit drei transmembranen

Einleitung 25

Helices geführt (GREEN & PICHERSKY 1994, MONTANE & KLOPPSTECH 2000). Ein CAB-Protein

mit vier transmembranen Helices ist das PsbS. Drei seiner Helices weisen Homologien zu den

Helices der CAB-Proteinen mit drei transmembranen Helices auf. Durch die Identifizierung der

Seps mit ihren zwei transmebranen Helices konnte inzwischen auch das letzte fehlende Glied, an

dem diese Modell bisher krankte, nachgewiesen werden.

1.4 Fragestellung und Zielsetzung

Untersuchungen zu Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteinen und ihrer Organisation in

den Antennenkomplexen erstreckten sich bisla ng vorwiegend auf Höhere Pflanzen und einige

wenige Algengruppen. Da sich in allen Höheren Pflanzen 10 verschiedene Typen an CAB-

Proteinen und ihre Gene finden, muß jedem Proteintyp wohl seit mehr als 350 Millionen Jahren

eine besondere Funktion innerhalb der Antennenkomplexe zukommen. Ansonsten wären im

Verlauf der Evolution wohl einige der verschiedenen Lhc-Gene verloren gegangen (JANSSON

1994). Welche differenzierten Funktionen ein jedes der CAB-Proteine innerhalb der

Antennenkomplexe erfüllt, ist jedoch erst ansatzweise verstanden. Zu einem besseren

Verständnis kann unter anderem das Wissen von der molekularen Evolution der sie codierenden

Genfamilie beitragen. Landpflanzen und Grünalgen begründen sich auf einen gemeinsamen

Ursprung und bilden eine monophyletische Gruppe (CAVALIER-SMITH 1981). Während eine

Fülle an Sequenzdaten für CAB-Proteine von Samenpflanzen vorliegen und auch für Grünalgen

vermehrt Nukleotidsequenzen gewonnen werden (TERAMOTO et al. 2001), existieren für

Bryophyten nur wenige Sequenzen. Für ein komplettes Bild zur Evolution der cab-Gene bedarf

es aber ebenfalls der Sequenzdaten von Bryophyten, insbesonders da sie erste Landpflanzen

repräsentieren (MISCHLER 1994, KENRICK et al. 1997).

Bryophyten spalteten sich in der phylogenetischen Entwicklung früh von den Farnpflanzen ab,

aus denen sich die Samenpflanzen entwickelten (KRANZ et al 1995, BHATTACHARAYA & MEDLIN

1998). Interessant ist es zwischen den Eigenschaften der CAB-Proteine der Grünalgen,

Bryophyten und der Samenpflanzen zu vergle ichen. Abweichende Eigenschaften könnten helfen

die differenzierten Funktionen der einzelnen Typen an CAB-Proteine besser zu verstehen. Ferner

ist es interessant zu wissen, wann die komplexe Organisation der Antennensysteme und die

Funktionen einzelner CAB-Proteine im Verlauf der Evolution festgelegt wurden.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es für das Lebermoos M. polymorpha die Zusammensetzung

der Genfamilie der kerncodierten Lhc-Gene zu ermitteln. Aufbauend auf Vorarbeiten von KILIAN

und Mitarbeitern (1998) die bereits mittels biochemischer Methoden wichtige Informationen zur

Antennenorganisation des PSII dieses Bryophyten sammeln konnten, sollte durch die

Einleitung 26

Klonierung, Sequenzierung und Analyse der Genexpression der einzelnen Mitglieder dieser cab-

Genfamilie zum einen das lückenhafte Wissen zur Evolution dieser Genfamilie komplementiert

werden. Weiterhin sollte auf molekularer Ebene Datenmaterial gewonnen werden, das das bisher

erlangte Verständnis zur Antennenorganisation dieses Bryophyten erweitert und untermauert.

27

2 Material und Methoden

2.1 Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht

2.1.1 Thalluskulturen von M. polymorpha

Alle Experimente wurden mit steril angezogenen in vitro Kulturen von M. polymorpha

durchgeführt. Das Ausgangsmaterial bildeten sterile Thalluskulturen, die Prof. Becker von der

Universität Saarbrücken freundlicherweise zur Verfügung gestellt hatte, bzw. eigens aus Sporen

angelegte Sterilkulturen. Diese Kulturen wurden kontinuierlich in Abständen von 10-14 Wochen

subkultiviert.

2.1.1.1 Kulturbedingungen

Stammkulturen von M. polymorpha wurden mixotroph angezogen, während für die Experimente

ausschließlich autotroph gewachsenes Pflanzenmaterial verwendet wurde. Die Anzucht erfolgte

unter den von ADAM (1992) ermittelten optimalen Wachstumsbedingungen. Als Kulturgefäße

dienten für mixotrophe Kulturen 250 ml Erlenmeyerkolben, die mit Cellulosestopfen und

Kappen aus Aluminiumfolie verschlossen waren. Die Kolben enthielten jeweils 70 ml mit

0.9 % (w/v) Agar Agar verfestigtes und mit 1 % (w/v) Saccharose angereichertes Nährmedium.

Als Nährmedium diente ein leicht modifiziertes GAMBORG-Medium (GAMBORG et al. 1968). Die

Veränderung gegenüber dem Originalmedium bestand im Austausch der

Spurenelementekonzentrationen gegen die des MSK2-Mediums von KATOH und Mitarbeitern

(1980).

Phototrophe Thalli wurden wie bei WÖLFEL (1998) beschrieben in transparenten Plastikgefäßen

(Lifeline, Osmotek, Rehovot, Israel) kultiviert, die mit transparenten Kunststoffdeckeln

verschlossen und mit 400 ml Nährmedium gefüllt waren (Abb. 5). Den Gasaustausch mit der

Umgebung ermöglichte eine in den Deckeln vorhandene, luftdurchlässige Membran. Zur

vegetativen Vermehrung der Kulturen wurden entweder 1-2 cm2 große Thallusstücke von einem

mindestens vier Wochen alten Thallus steril entnommen und in die Erlenmeyerkolben überführt

oder mehrere mit einer Pinzette vorsichtig von der Thallusoberseite entfernte Brutbecher auf das

Kulturmedium übertragen. Für die Anzucht phototrophen Pflanzenmaterials wurden vier ca.

10 mm2 große Thallusstücke randständig auf einer flüssigkeitsdurchlässigen Membran (Liferaft,

Osmotek, Rehovot, Israel) plaziert, die mit Hilfe eines Schwimmkörpers (Osmotek, Rehovot,

Israel) auf der Oberfläche der Nährlösung schwamm. Die Kultur erfolgte in einer Klimakammer

Material und Methoden 28

bei 20 °C unter Langtagbedingungen (16 h Licht, 8 h dunkel) bei einer konstanten

Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s-1. Die Lichteinstrahlung erfolgte durch Leuchtstoffröhren

(L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland) von oben. Die Lichtintensität wurde

mit Hilfe eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland) ermittelt. Dazu

wurde der Quantumsensor in die Kulturbehälter gelegt und diese mit dem entsprechenden

Deckel bzw. Stopfen verschlossen. Die für die Experimente verwendeten phototrophen Thalli

waren zwischen 4 und 6 Wochen alt.

Abb. 5: phototroph kultivierte M. polymorpha-Thalli. Die Thalluslappen sind durch die Rhizoide an einer auf der Nährlösung schwimmenden flüssigkeitsdurchlässigen Membran verankert.

2.1.1.2 Anlage von Sterilkulturen

Sporen im Innern einer Sporenkapsel liegen steril vor. Dies erweist sich als sehr vorteilhaft bei

der Anlage neuer Sterilkulturen aus Sporen. Sporenkapseln von M. polymorpha wurden auf dem

Gelä nde der Universität Bremen gesammelt und zur Oberflächensterilisierung für 10 min in

2 % (w/v) NaOCl-Lösung inkubiert. Nach mehrmaligem Spülen mit sterilem Wasser wurden die

Sporenkapseln unter aseptischen Bedingungen (Heraeus Lamin Air, TL3048, Heraeus

Instruments, Hanau, Deutschland) geöffnet und die Sporen auf sterilem, mit 0.9 % (w/v) Agar

Agar verfestigtem Nährmedium ausgesät. Die sich aus den Sporen entwickelnden Gametophyten

wurden in der zuvor beschriebenen Verfahrenweise (siehe 2.1.1.1) vegetativ vermehrt. Die neu

angelegte Sterilkultur unterschied sich weder im Habitus noch im Chlorophyll a/b Verhältnis von

den schon vorhandenen Sterilkulturen und zeigte ein vergleichbares Wachstumsverhalten.


2.1.1.3 Starklichtexposition

Bei der Untersuchung von Starklichteffekten an der intakten Pflanze ist zu berücksichtigen, daß

Effekte meist inhomogen auf das Gewebe verteilt sind. Mit zunehmender Tiefe im pflanzlichen

Gewebe nimmt die Lichtintensität exponentiell ab. Des weiteren können sich einzelne Bereiche

der Pflanze bei der Belichtung gegenseitig beschatten. Auch die Gefahr der Austrocknung bei

hohen Lichtintensitäten erschwert die Untersuchung von Starklichteffekten, insbesondere wenn

die zu untersuchenden Pflanzen an feuchte Standorte angewiesen sind, wie M. polymorpha. Die

Wirkungen von Trocken- und Lichtstreß könnten sich überlagern und nicht unterschieden

werden. Der Gefahr der Austrocknung wurde durch das gewählte Kulturverfahren (siehe 2.1.1.1)

begegnet, durch das die ausreichende Versorgung der Thalli mit Nährlösung auch während einer

Starklichtexposition gewährleistet blieb. Des weiteren wurde nur Thallusmaterial, das möglichst

unbeschattet war, für die Experimente verwendet. Zur Untersuchung von Starklichteffekten

wurden vier Wochen alte Thalli in einer auf 20 °C temperierten Klimakammer einer

Quantenflußdichte von 300 µmol m -2 s-1 ausgesetzt. Die Lichtintensität war damit 10 x höher als

bei der Anzucht der Thalli (2.1.1.1). Als Lichtquelle dienten Halogen-Metalldampflampen vom

Typ MT 400 DL IBM (Yor k International, York, USA). Parallel zu den Starklicht exponierten

Thalli wurden Thalli einer Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s-1 in der schattierbaren

Klimakammer ausgesetzt. Effekte nur aufgrund unterschiedlicher Lichtquellen (Anzucht:

Leuchtstoffröhren L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland und

Starklichtexperiment: Halogen-Metalldampflampen vom Typ MT 400 DL IBM, York

International, York, USA) sollten so ausgeschlossen werden. Zur gleichmäßigeren Beleuchtung

wurden die Deckel der Kultur gefäße durch Deckel mit einer klaren und durch ein zentrales

kleines Membranfeld luftdurchlässigen Suncap-Folie (Sigma-Aldrich, Deisenhofen,

Deutschland) ausgetauscht. Lichtintensitäten wurden in den Kulturgefäßen, denen die Deckel

aufgesetzt waren, mittels eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland)

bestimmt. Als Bezugsgröße diente der Chlorophyllgehalt der Thalli, der bei jeder Probennahme

bestimmt wurde (2.2.1).

2.2 Pigmentanalytik

2.2.1 Chlorophyllbestimmung

Chlorophyllgehalte der Thalli wurden photometrisch anhand von Pigmentextrakten mit N,N-

Dimethylformamid (DMF) bestimmt. Die Chlorophyllkonzentration wurde aus den


Absorptionen bei 646.8, 663.8 und 750 nm anhand der folgenden Gleichungen berechnet (PORRA

et al. 1989):

Chl a = 12.00 (A663.8 – A750) – 3.11 (A646.8 – A750)

Chl b = 20.78 (A646.8 – A750) – 4.88 (A663.8 – A750)

Chl a+b = 17.67 (A646.8 – A750) + 7.12 (A663.8 – A750)

Aus den Thalli wurden Scheibchen mit einem Frischgewicht von 10-20 mg (Ø 5-7 mm)

ausgestanzt und mit 1 ml DMF versetzt. Die Extraktion der Pigmente erfolgte im Dunkeln bei

4 °C über 24 h. Die Thallusstücke entfärbten sich über diesen Zeitraum vollständig.

Anschließend wurden die Extrakte zentrifugiert (14000 x g, 5 min) und die Überstände für die

Absorptionsmessungen verwendet.

2.3 Molekularbiologische Methoden

Wenn nicht anders vermerkt, wurden Chemikalien und Feinchemikalien für die

molekularbiologischen Arbeiten von den Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland),

oder Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alle Arbeiten wurden unter sterilen

Bedingungen durchgeführt.

2.3.1 Bakterienstämme und Vektoren

Für die Klonierung von cDNA wurden die Phagemid-Vektoren pBluescript II SK(+) und

λTriplEx2™ verwendet. Angaben zu den wichtigsten genetischen Eigenschaften der Vektoren

sowie der zur Vermehrung der Vektoren verwendeten Escherichia coli K12 Derivate finden sich

in der Tabelle 5.

Tab. 5: Eigenschaften der verwendeten Vektoren und Bakterienstämme.

Vektor besondere Eigenschaften Referenz

pBluescript II SK (+)a) Amp r, lacZ’ , high copy number Phagemid-Vektor (2.96 kb)

SHORT et al. (1988) Genebank® # X52328[SK(+)]

λTriplEx2™ b) Amp r, lacZ’ , loxP, Phagemid-Vektor (42.3 kb), einfache und effiziente cre-lox Konversion zum Plasmidvektor pTriplEx2 (3.59 kb, high copy number Vektor), regulierte Expression der klonierten Insert-DNA möglich

Clontech (Palo Alto, USA)


a) Stratagene, Heidelberg, Deutschland b) Komponente des ”SMAR cDNA Library Construction Kit ”, Clontech, Palo Alto, USA c) erhalten von Dr. T. Hiltonen, Universität Umeå, Schweden

2.3.1.1 Anzucht der Bakterien

Die verschiedenen E. coli Stämme wurden in LB-Medium (1 % (w/v) Bacto-Tryptone,

0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, pH 7.0 mit NaOH) angezogen, dem bei Bedarf nach

dem Autoklavieren und Abkühlen auf mindestens 50 °C Antibiotika zugesetzt wurden (Tab. 6).

Für die Herstellung von Platten wurde das LB-Medium mit 0.8 % (w/v) Agar Agar verfestigt.

Zur Anzucht von E.coli XL1-Blue für die Transduktion von λ-Phagen und die Titerbestimmung

der cDNA Banken enthielt das LB-Medium zusätzlich 10 mM MgSO4 und 0.2 % (w/v) Maltose.

Je nach Präparationsart wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA 1.5 ml LB-Medium in 96 well-

Kulturplatten (automatisierte Plasmidisolierung, 2.3.2.2.2) oder 2. 5 – 5 ml LB-Medium in 13 ml

Kunststoffröhrchen mit jeweils einer einzelnen Bakterienkolonie inokuliert. Platten und

Flüssigkulturen mit Bakterien wurden über Nacht (12-16 h) bei 37 °C inkubiert, mit Ausnahme

der Kulturen von E. coli BNN132, die bei 30 °C inkubiert wurden. Flüssigkulturen wurden

zusätzlich bei 220 rpm geschüttelt.

Tab. 6: Konzentrationen der zur Selektion eingesetzten Antibiotika.

Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration

Ampicillin (Amp) 100 mg ml-1 in A. bidest., sterilfiltriert 100 µg ml-1

Tetrazyklin (Tet) 50 mg ml-1 in Ethanol 15 µg ml-1

Kanamycin (Kan) 50 mg ml-1 in A. bidest., sterilfiltriert 50 µg ml-1

2.3.1.2 Dauerkulturen von Bakterien

Zur längerfristigen Lagerung eines Bakterienstammes wurden Stammkulturen in Glycerin

angelegt. Die Zellsuspension einer gut gewachsenen Übernachtkultur wurde dazu mit 15 % (v/v)

Glycerin versetzt, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Derartige

Stammkulturen wurden bei – 80 °C gelagert. Geringe Mengen wurden bei Bedarf entnommen

und auf selektierendem Medium ausgestrichen.

Bakterienstamm Genotyp Referenz E.coli XL1-Blue a) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44

relA1 lac [F’ proAB lacIqZ ∆M15 Tn10 (Tetr)]c BULLOCK et al. (1987)

E.coli XL1-Blue MRF’ a) ∆(mcrA)183 ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac[F’proAB lacIqZ ∆M15 Tn10 (Tetr)] c

JERPSETH et al. (1992)

E.coli BNN132 c) endA1 gyr96 hsdR17 relA1 ∆(lac-proAB) (F’ traD36 proA+ proB+ lacIqZ M15) λKC (Kanr-cre)

ELLEDGE et al. (1988)


2.3.2 Isolierung von Nukleinsäuren

2.3.2.1 RNA

Wäßrige Lösungen zur RNA-Präparation wurden vor dem Autoklavieren mit 0.1 % (v/v)

Diethylpyrocarbonat (DEPC) versetzt und über Nacht gerührt. Dies sollte den Abbau von RNA

durch allgegenwärtige Nukleasen verhindern. Weitere Vorsichtsmaßnahmen umfaßten das

Sterilisieren von Glasgefäßen, Mörsern und Pistillen über Nacht bei 180 °C. Mehrweggefäße wie

Zentrifugenröhrchen wurden vor dem Autoklavieren mit 0.1 M NaOH, 1 mM EDTA und RNase

freiem A. bidest. gespült.

2.3.2.1.1 Präparation von Gesamt-RNA

Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus M. polymorpha wurde nach der von CHANG und

Mitarbeitern 1993 beschriebenen Methode zur Isolierung von RNA aus Kiefern verfahren.

3 g Thallusgewebe wurden in flüssigem Stickstoff mit Hilfe von Mörser und Pistill zerrieben.

Das sehr feine, gefrorene Pulver wurde anschließend zügig in die mit 15 ml Extraktionspuffer

gefüllten, auf 65 °C temperierten Zentrifugenröhrchen überführt. Nach sorgfältigem Mischen

wurde die RNA durch Zugabe von einem Volumen Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) und

anschließender Zentrifugation mit 9500 x g für 20 min bei Raumtemperatur extrahiert. Die

wäßrige Phase wurde abgenommen und die Extraktion noch einmal wiederholt. Durch Zugabe

von einem Viertel des Volumens 10 M Lithiumchlorid zur wäßrigen Phase wurde die RNA über

Nacht bei 4 °C präzipitiert und durch Zentrifugation für 20 min bei 9500 x g und 4°C

sedimentiert. Die sedimentierte RNA wurde in 500 µl 0.5 % (w/v) SDS gelöst und in ein

Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Nach erneuter Extraktion der RNA mit einem Volumen

Chloroform : Isoamylalkohol (24:1) und Zentrifugation bei 4°C mit 9500 x g für 10 min,

erfolgte die Präzipitation der RNA für mindestens 2 h bei – 20 °C nach Zugabe des zweifachen

Volumens an Ethanol zur wässrigen Phase. Die präzipitierte RNA wurde anschließend durch

Zentrifugation für 20 min bei 10.000 x g und 4°C sedimentiert und in einem angemessenen

Volumen an A. bidest. aufgenommen. Die Lagerung von Gesamt-RNA erfolgte nach dem

Schockgefrieren der RNA in flüssigem Stickstoff bei –80°C. Aus 3 g Thallusgewebe wurden

durchschnittlich 70 µg Gesamt-RNA gewonnen.


2.3.2.1.2 Präparation von mRNA

mRNA wurde aus Gesamt-RNA mit Hilfe des Nucleo Trap Nucleic Acid Purification Kit der

Fa. Clontech (Palo Alto, USA) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert. Das

Aufreinigungsprinzip basiert auf der spezifischen Bindung von poly A+-RNA an oligo(dT)-Latex

Partikel, von denen die mRNA nach mehreren Waschschritten wieder eluiert wird. Aus 200 µg

Gesamt-RNA wurden pro Isolierungsreaktion durchschnittlich 10 µg mRNA gewonnen. Die

RNA-Konzentration wurde spektralphotometrisch bestimmt und die RNA, sofern sie nicht sofort

weiterverarbeitet wurde, bei –80 °C gelagert.

2.3.2.2 Plasmid-DNA

Je nach Reinheitsgrad der benötigten DNA wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA

verschiedene Methoden verwendet.

2.3.2.2.1 Präparation von Plasmiden mit geringerem Reinheitsgrad (Boiling-Methode)

Dieses Verfahren wurde meist für das Screening von Bakterienkolonien nach einer

Transformation eingesetzt. Zur Überprüfung des Restriktionsendonukleaseschnittmusters von

DNA werden nur geringe Mengen an DNA benötigt, deren Reinheitsgrad nicht ausgesprochen

hoch sein muß. Die Boiling-Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA lieferte ca. 4 µg DNA

geringerer Reinheit je Milliliter eingesetzter Bakteriensuspension. Die Durchführung erfolgte

wie bei SAMBROOK und Mitarbeitern 1989 beschrieben.

2.3.2.2.2 Präparation von Plasmiden mit hohem Reinheitsgrad

Sehr reine Plasmid-DNA wurde für die Sequenzierung oder Klonierung benötigt. Sie wurde mit

dem Plasmid Mini Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) isoliert, wenn Plasmid-DNA aus

einer geringen Anzahl von Bakterienkolonien isoliert werden sollte. Die Plasmidisolierung für

die Sequenzierung der EST-Klone erfolgte hingegen maschinell mittels der Biomek 2000

laboratory automatic workstation (Beckman Instruments, Fullerton, USA), da so sehr viele

Proben parallel bearbeitet werden konnten. Es wurde hierzu der Nucleo Spin Robot 96-B Kit der

Fa. Macherey und Nagel (Düren, Deutschland) verwendet.


2.3.3 Quantifizierung von Nukleinsäuren

Für die Quantifizierung von Nukleinsäuren wurde die optische Dichte (OD) der

Nukleinsäurelösungen be i einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm bestimmt (UV/VIS-

Zweistrahl-Spektralphotometer, Hitachi U-3000, Tokyo, Japan). Eine OD bei 260 nm von 1 bei

einer Schichtdicke von 1 cm entspricht ungefähr einer Nukleinsäurekonzentration von 50 µg/ml

bei doppelsträngiger DNA und 40 µg/ml bei einzelsträngiger DNA oder RNA. Das Ergebnis der

photometrischen Quantifizierung von DNA wurde durch eine anschließende

Agarosegelelektrophorese und Vergleich mit einem Standard verifiziert. Aufschluß über die

Reinheit einer Nukleinsäurelösung gibt das Verhältnis der OD bei 260 nm zu der OD bei

280 nm. Für reine, nicht mit Protein verunreinigte Nukleinsäurelösungen sollte das Verhältnis

zwischen 1.7 und 2.0 liegen.

2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Plasmid -DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen entsprechend den Empfehlungen des

Herstellers gespalten. Die Reaktionsansätze wurden mindestens 3 h lang bei der jeweils

optimalen Temperatur inkubiert und die Enzyme stets im Überschuß zugesetzt. Damit sollte die

Spaltung der DNA an sämtlichen für die Enzyme vorhandenen Schnittstellen gewährleistet sein.

In der Regel wurden 200 ng an Plasmid-DNA eingesetzt (Reaktionsvolumen 20 µl). Der Erfolg

der hydrolytischen Spaltung wurde stets mittels Agarosegelelektrophorese überprüft. Die

Tabelle 7 gibt eine Übersicht über die verwendeten Restriktionsendonukleasen. Sämtliche

Enzyme wurden von der Fa. MBI Fermentas (St. Leon-Roth, Deutschland) bezogen.

Tab. 7: Verwendete Restriktionsendonukleasen.

Enzym Reaktionspuffer Erkennungssequenzen BamH I BamH I + 5’-G�GATCC-3’

3’-CCTAG�G-5’ EcoR I EcoR I + 5’-G�AATTC-3’

3’-CTTAA�G-5’ Pst I Puffer 0+ 5’-CTGCA�G-3’

3’-G�AGCGT-5’ Sfi I Sfi I + 5’ GGCCATTA�AGG-3’

3’-CCGGT�AATACC-5’ Xho I Puffer 0+ 5’-C�TCGAG-3’

3’-GAGCT�C-5’


2.3.5 Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung von Nukleinsäuren erfolgte in horizontalen Agarosegelen. Zwei verschiedene

Gelsysteme (Eigenbau, BRC, Szeged, Ungarn) der Größe 8.0 x 6.0 cm und 20.9 x 16.8 cm

wurden je nach gewünschter Auftrennungsstrecke eingesetzt.

2.3.5.1 Auftrennung von DNA

Je nach Größe der aufzutrennenden DNA-Fragmente wurden 0.8-1.2 % (w/v) Agarose durch

kurzes Erhitzen in 0.5 x TAE-Puffer gelöst. Nachdem sie auf ca. 50 °C abgekühlt war, wurde

Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 µg/ml) zugesetzt. Dies ermöglichte es, auch schon

während der Elektrophorese mittels einer UV-Handlampe die Auftrennung der DNA zu

beobachten. Die Agaroselösung wurde anschließend in den Gelträger, dem ein Kamm

aufgesteckt war, gegossen und der Gelträger nach dem Erstarren der Gelmatrix in die mit

0.5 x TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer gelegt. Zur Erhöhung der Dichte wurden die

DNA-Proben mit 0.1 Volumen Auftragspuffer (20 % (w/v) Ficoll400, 125 mM EDTA (pH 8.0),

0.25 % (w/v) Bromphenolblau, 0.25 % (w/v) Xylencyanol FF) versetzt, nach dem Entfernen des

Kammes in die Geltaschen pipettiert und bei einer Spannung von 70-100 V (1 V/cm)

elektrophoretisch aufgetrennt. Der Grad der Auftrennung wurde anhand der Farbstoffe im

Auftragspuffer verfolgt. Ein DNA-Größenstandard (Smart-Ladder, Eurogentech, Holland) wurde

stets zum Vergleich mit aufgetragen. Zur Visualisierung der DNA-Banden nach Beendigung der

Elektrophorese wurden die Gele auf einem Transluminator (Bachofer, Reutlingen, Deutschland)

mit UV-Licht der Wellenlänge 312 nm durchleuchtet. Zur photographischen Dokumentation

wurde eine Polaroid-Kamera (Polyroid Filme: Typ 667, Polaroid Ltd, Hertfordshire, England)

eingesetzt.

2.3.5.2 Auftrennung von RNA

Intramolekulare Sekundärstrukturen beeinträchtigen das Laufverhalten von RNA bei der

Gelelektrophorese. Entweder durch die Denaturierung der RNA mittels Glyoxal (Universität

Umeå, Schweden) oder mittels Formaldehyd (Universität Bremen, Deutschland) wurde die

Ausbildung solcher Sekundärstrukturen verhindert. Die Elektrophorese erfolgte in

Flachbettgelkammern, die ausschließlich nur für die elektophoretische Auftrennung von RNA

benutzt wurden. Die Laufpuffer wurden vor dem Gebrauch mit 0.1 % (v/v) DEPC versetzt, über

Nacht gerührt und autoklaviert.


2.3.5.2.1 Gelelektrophorese von mit Glyoxal denaturierter RNA

Zur Herstellung der Gelmatrix wurden 1.2-1.5 % (w/v) Agarose in 0.01 M Natriumphosphat-

puffer (pH 6.0) durch kurzzeitiges Erhitzen gelöst, nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C mit

Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 µg/ml) versetzt und zum Erstarren in den Gelträger

gegossen. Der Gelträger wurde anschließend in die mit 0.01 M Natriumphosphatpuffer gefüllte

Gelkammer gelegt.

Die RNA-Proben wurden in der Zwischenzeit in Gegenwart von Glyoxal und DMSO

denaturiert. 5 µg RNA (1 µg/µl) wurden im Verhältnis 1:3 mit dem Denaturierungsreagenz

(65 % (v/v) DMSO, 30 % (w/v) Glyoxal, 0.01 M Natriumphosphatpuffer pH 6.0) versetzt und

für 1 h bei 50 °C inkubiert. Glyoxal vermag leicht an der Luft zu Glyoxalsäure oxidieren. Diese

vermag RNA zu hydrolysieren. Zur Entfernung von Glyoxalsäure wurden Lösungen von

Glyoxal deshalb vor dem Gebrauch durch ein Mischbett-Harz gemäß den Angaben des

Herstellers laufengelassen (Bio-Rad-AG 501 x 1, Biorad, München, Deutschland). Das

deionisierte Glyoxal wurde in kleinen Portionen in gut verschlossenen Reaktionsgefäßen bei

-20 °C bis zum Gebrauch gelagert.

Vor dem Beladen des Gels wurde für 5 min eine Spannung von 100 V angelegt. Dann wurden

die denaturierten RNA-Proben mit 0.05 Volumen Auftragspuffer (0.25 % (w/v) Xylencyanol FF,

0.25 % (w/v) Bromphenolblau, 0.01 M Natriumphosphatpuffer pH 6.0) versetzt und auf das Gel

aufgetragen. So konnte der Verlauf der Elektrophorese anhand der Farbstoffe verfolgt werden

und die Dichte der Proben wurde erhöht. Die Elektrophorese erfolgte bei 100 V für ca. 4-5 h. Da

Glyoxal bei einem pH über 8.0 von der RNA dissoziiert, wurde der Laufpuffer während der

Elektrophorese mittels einer Pumpe umgewälzt. Das Umwälzen des Puffers diente dazu den pH-

Wert aufrechtzuerhalten. Die Gele wurden im Anschluß an die Elektrophorese mit UV-Licht

(312 nm) durchleuchtet und photographiert.

2.3.5.2.2 Gelelektrophorese von mit Formaldehyd denaturierter RNA

Für ein 7.5 cm x 5 cm großes Gel wurden 1.2 % (w/v) Agarose in mit 0.1 % (v/v) DEPC

behandeltem A. bidest. durch kurzes Erhitzen gelöst und die Lösung nach Abkühlen auf

ca. 50 °C mit 10 x MOPS-Puffer (0.02 M MOPS, 0.05 M Na-Acetat pH 7.0, 0.01 M EDTA,

Endkonzentration 1 x), Formaldehyd (Endkonzentration 6% (v/v)) und Ethidiumbromid

(Endkonzentration 1µg/ml) versetzt.

Durch vorsichtiges Schwenken wurde der Ansatz gut gemischt und in den vorbereiteten

Gelträger, dem ein Kamm aufgesteckt war, gegossen. Die Arbeiten wurden aufgrund der

Flüchtigkeit und gesundheitsgefährdenden Wirkung des Formaldehyds unter einem Abzug

ausgeführt. Nach dem Erstarren der Gelmatrix wurde der Gelträger in die mit 1x MOPS-Puffer


gefüllte Flachbettkammer gelegt und vor der Beladung des Geles für 5 min eine Spannung von

40 V (5 V/cm) angelegt. Zur Denaturierung der RNA und um die Dichte der RNA-Proben zu

erhöhen, wurden sie vor dem Auftrag auf das Gel im Verhältnis 1:1 mit Denaturierungspuffer

(50 % (w/v) Formamid (deionisiert), 10 x MOPS-Puffer, 2 % (w/v) Formaldehyd, 7 % (w/v)

Glycerin, 0.01 % (w/v) Bromphenolblau) versetzt. Anschließend wurden die Proben für 5 min

bei 65 °C inkubiert und dann für 5 min auf Eis gestellt.

Die Elektrophorese erfolgte für ca. 2 h bei einer konstanten Spannung von 40 V (5 V/cm). Der

Verlauf der Elektrophorese ließ sich anhand der blauen Lauffront, verursacht durch den

Farbstoff Bromphenolblau im Denaturierungspuffer beobachten.

Zur Dokumentation wurden die Formaldehydgele nach der Elektrophorese auf einem

Transilluminator mit UV-Licht durchleuchtet und photographiert.

2.3.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

2.3.6.1 Oligonukleotidprimer

In Tabelle 8 sind alle Oligonukleotidprimer aufgeführt, die für die Amplifikation von DNA

eingesetzt wurden. Alle Primer mit Ausnahme von CDSIII/3’ und SMARTIII, die Bestandteil

des Kits zur Herstellung der cDNA-Bibliotheken waren, wurden von der Fa. Life Technologies

(Karlsruhe, Deutschland) synthetisiert.

Tab. 8:Für PCR-Reaktionen verwendete Oligonukleotidprimer.

Primerbezeichnung bp Oligonukleotidsequenz

oligo(dT)17 31 5’-CTGCATGCGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTT

Lhcb4-I 24 5’-CAGAACYTSGCTAAGAAGGAGTTC-3’

Lhcb4-II 21 5’-AACGAGTTCGGWGAYGTSATC-3’

Lhcb6-I 29 5’-TTGAATTCACCAAGAAGGTBGCYGCY-3’

T31) 20 5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’

T71) 21 5’-GTAATACGACTCACTATAGGG-3’

M13 reverse1) 18 5’-GGAAACAGCTATGACCAT -3’

M13 universe1) 14 5’-GTAAAACGACCAGT-3’

CDS III/3’ 57 5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-(dT)30N-1N-3’

SMARTIII 39 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’

1) auch in CY5-Fluorensz gelabelter Form verwendet


2.3.7 RT-PCR

2.3.7.1 Reverse Transkription (RT)

Die Reverse Transkription von RNA zu cDNA erfolgte mit M-MuLV-Reverser Transkriptase

(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) und wurde gemäß der Anleitung des Herstellers

durchgeführt. In A. bidest. gelöste Gesamt-RNA in wurde mit oligo(dT)17-Primer versetzt

(Reaktionsvolumen 11 µl), für 5 min bei 70 °C denaturiert und anschließend kurz auf Eis

gekühlt. Nach Zugabe der weiteren Reaktionskomponenten (Tab. 8) bis auf das Enzym wurde

der Reaktionsansatz für 5 min bei 37 °C inkubiert. Nach Zusatz der Reversen Transkriptase

(20 U) erfolgte eine einstündige Inkubation bei 37 °C, gefolgt vom Erhitzen für 10 min auf

70 °C zum Abstoppen der Reaktion. Jeweils 10 % des Ansatzes wurden direkt für die

anschließende Amplifikation der gewünschten cDNA mittels PCR eingesetzt.

Tab. 9 Reaktionsansatz für die Reverse Transkription.

Reaktionskomponente Menge / Konzentration

Gesamt -RNA 1-1.5 µg

oligo(dT)17-Primer 200 pmol

5 x Reaktionspuffer 1 x

10 mM dNTP-Mix 200 µM

RNAsin (40 U/µl) 1 U

A. bidest. (steril) ad 20 µl

2.3.7.2 Standardbedingungen für die PCR

Für die präparative Amplifikation der gewünschten cDNA nach vorangegangener Reverser

Transkription von RNA in cDNA wurde Pwo-Polymerase eingesetzt. Pwo-Polymerase zeichnet

sich wegen ihrer 3’-5’-Exonuklease-Funktion gegenüber herkömmlicher Taq-Polymerase durch

eine gesteigerte Ablesegenauigkeit aus und besitzt eine erheblich bessere Temperaturstabilität.

Die PCR-Ansätze wurden in den auf 95 °C vorgeheizten Thermoblock des Thermocyclers

(Personal Cycler, Biometra, Göttingen, Deutschland) gestellt und das folgende

Temperaturprogramm durchlaufen:

Schritt 1 95 °C 5 min Schritt 2 94 °C 30 s Schritt 3 optimale Hybridisierungstemperatur 60 s 29 x Schritt 4 72 °C 90 s Schritt 5 72 °C 10 min Schritt 6 4 °C bis zur Weiterverarbeitung


Die PCR erfolgte mit einem sogenannten hot start: in der ersten fünfminütigen

Denaturierungsphase wurde das Thermoprogramm kurz unterbrochen und erst dann die

entsprechende Menge an Pwo-Polymerase hinzupipettiert. Dieser Schritt soll unspezifische

Paarungen der Primer vor Beginn der Synthese-Reaktion minimieren. Die Zusammensetzung der

Reaktionsansätze für die PCR ist Tabelle 10 zu entnehmen. Ein Überschichten der PCR-Proben,

z.B. mit Mineralöl entfiel, da der eingesetzte Thermocycler über einen temperierbaren Deckel

verfügte, dessen Temperatur während eines Thermoprogrammes auf 105 °C eingestellt wurde.

Tab. 10: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für die PCR mit Pwo-Polymerase.

Reaktionskomponente Zusammensetzung Menge

Reaktionsansatz der Erststrangsynthese siehe 2.3.7.1.1 2 µl

10 x PCR-Puffer 100 mM Tris -HCl (pH 8.85), 250 mM KCl, 50 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4

10 µl

DMSO 10 µl

dNTP-Mix 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP, 10 mM dTTP in A. bidest.

2 µl

Primer1: oligo(dT)17 20 pmol / ul in A bidest. 1 µl Primer 2: sequenzspezifischer Primer 20 pmol/ ul in A bidest. 1 µl A. bidest. (steril) 28 µl Pwo-Polymerase Konzentration: 5U/µl

in 20 mM Tris -HCl pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA 0.5% (v/v) Nonidet P40, 0.5 % (v/v) TWEEN 20, 50 % (w/v) Glycerin

1 µl

Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte durch die gelelektrophoretische Auftrennung von einem

Fünftel der PCR-Ansätze in 0.8-1.2 % (w/v) Agarosegelen (2.3.5). Einzelne DNA-Banden

wurden aus den Gelen mittels des Qiaquick Gel Extraktion Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland)

eluiert und entweder in einen Vektor kloniert (2.3.8) oder einer Reamplifikation durch erneute

PCR unterzogen.

2.3.7.3 PCR für die Amplifikation von DNA-Sonden

In den Vektor pTriplEx2 klonierte Lhc-Gene aus M. polmyorpha wurden für den Einsatz als

Sonden bei der Northernblot-Analyse mittels PCR amplifiziert. Die Zusammensetzung der PCR-

Ansätze ist Tabelle 11 zu entnehmen. Folgendes Thermoprogramm wurde durchlaufen:

Schritt 1 94 °C 5 min Schritt 2 94 °C 30 s Schritt 3 55 °C 1 min 25 x Schritt 4 72 °C 1 min Schritt 5 72 °C 7 min Schritt 6 4 °C bis zur Weiterverarbeitung


Im Anschluß an die PCR wurden die Amplifizierungsprodukte direkt aus den PCR-Ansätzen

mittels des PCR Product Purification Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) präpariert.

Tab. 11: Zusammensetzung der Reaktionsansätze für die Amplifikation von DNA-Sonden.

Reaktionskomponente Zusammensetzung / Konzentration Menge DNA in A. bidest. 250 ng – 1 µg 10 x PCR-Puffer 100 mM Tris -HCl (pH 8.85), 250 mM KCl,

50 mM (NH4)2SO4 5 µl

MgCl2 25 mM 10 µl dNTP-Mix 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP,

10 mM dTTP in A. bidest. 2 µl

Primer1 10 pmol/µl in A bidest. 1 µl Primer 2 10 pmol/µl in A bidest. 1 µl Taq-Polymerase Konzentration: 5U/µl 0.4 µl A. bidest. (steril) ad 50µl

2.3.8 Klonierung von DNA-Fragmenten

PCR-Produkte wurden in den Vektor pBluescript II SK(+) kloniert und anschließend

sequenziert.

2.3.8.1 Isolierung der Insert-DNA

Die zu klonierenden DNA-Fragmente wurden mit Restriktionsendonukleasen hydrolysiert

(2.3.4) und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Mit Hilfe eines Skalpells wurden die mittels UV-

Licht (312 nm) sichtbar gemachten DNA-Banden aus dem mit Ethidiumbromid versetzten

Agarosegel ausgeschnitten und extrahiert. Zur Extraktion der DNA aus dem Gel wurde das

QiaEx II Gel Extraktions Kit der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland) gemäß den Angaben des

Herstellers verwendet.

2.3.8.2 Vorbereitung des Vektors

Der Vektor pBluescript II SK(+) wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten, wie

das zu klonierende DNA-Fragment. Zusätzlich wurde der Vektor dephosphoryliert um die

intramolekulare Ligation der Vektor-DNA zu vermeiden, wenn nur mit einem

Restriktionsenzym geschnitten wurde. Endständige 5’-Phosphatgruppen wurden mit alkalischer

Phosphatase aus Kalbsthymus (CIAP, EF0341, MBI-Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland)

entfernt. Anschließend wurde der Ansatz einer Phenol-Chloroform-Extraktion unterzogen und

die Vektor-DNA mit Ethanol präzipitiert.


2.3.8.3 Ligation

Die Ligation von Insert-DNA und Vektor-DNA wurde mit Hilfe einer T4-DNA-Ligase (MBI

Fermentas, St. Leon-Roth, Deutschland) gemäß der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Zur

Erhöhung der Ausbeute an rekombinanter DNA erwies sich ein DNA-Massenverhältnis Insert-

DNA zu Vektor-DNA von 3:1 als sehr geeignet. Dieses wurde mittels folgender Formel

ermittelt:

ng Plasmid x kb Insertgröße x Mol Insert = ng Insert kb Plasmidgröße Mol Plasmid

Ligationsansätze wurden über Nacht bei 14 °C inkubiert und anschließend entweder sofort in

den E. coli Stamm XL1-Blue MRF’ transformiert (2.3.8.5) oder bei –20 °C eingefroren.

2.3.8.4 Herstellung kompetenter Zellen

Für die effiziente Transformation von E .coli ist es nötig, die Bakterienzellen vorzubehandeln, so

daß sie leichter in Lösung befindliche DNA aufzunehmen vermögen. Die Herstellung

kompetenter E. coli XL-1 Blue MRF’-Zellen erfolgte nach der Mehr -Ionen Technik von

HANAHAN (1995) nach einem von der Fa. Promega (1996) veränderten Protokoll. 250 ml mit

20 mM MgSO4 supplementiertes LB-Medium wurde mit 1 % (v/v) einer über Nacht

gewachsenen Bakterienkultur inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln (250 rpm) inkubiert. War

eine OD600 von 0.4-0.6 erreicht, wurden die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 4500 x g

bei 4 °C sedimentiert und in 100 ml TFB1 (30 mM Kaliumacetat, 10 mM CaCl2, 50 mM MnCl2,

100 mM RbCl, 15 % (w/v) Glycerin) resuspendiert. Nach einer Inkubation der resuspendierten

Zellen von 5 min auf Eis wurden sie wie zuvor sedimentiert und vorsichtig in 10 ml TFB2

(10 mM MOPS pH 8,5, 75 mM CaCl2, 10 mM RbCl, 15 % (w/v) Glycerin) aufgenommen. Nach

45 min Inkubation auf Eis wurden Aliquots von 200 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren

und anschließend bei – 80 °C gelagert. Derart behandelte E. coli Zellen waren für ca. 6 Monate

kompetent.

2.3.8.5 Transformation von E. coli

Für die Transformation von E. coli XL1-Blue-MRF’ wurden 200 µl kompetente Bakterienzellen

auf Eis aufgetaut und 10-50 ng der Vektor-DNA in einem kleinen Volumen (<10 µl) zugesetzt.

Es folgte nach kurzem Mischen durch vorsichtiges Schwenken eine Inkubation für 30 min auf

Eis und eine 45 s lange Wärmebehandlung bei 42 °C im Wasserbad. Nach kurzem Abkühlen auf


Eis für 2 min wurden die Zellen mit 3 ml LB-Medium verdünnt und zur Entwicklung der auf

dem Vektor codierten Antibiotika-Resistenz 1 h bei 37 °C mit 150 rpm geschüttelt. Als

Negativkontrolle für die Transformation dienten 200 µl kompetente Bakterienzellen, die in der

zuvor beschriebenen Weise behandelt worden waren, jedoch ohne Zusatz von Vektor-DNA.

2.3.8.6 Blau-weiß Selektion

Die Selektion der Transformanten erfolgte auf Ampicillin und Tetrazyklin haltigen LB-Platten,

auf denen zuvor je 40 µl Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid (IPTG, 2 % (w/v) in A. bidest.,

strerilfiltriert) und 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal, 2 % (w/v) in

DMF) verteilt worden waren. 100-200 µl der Transformationsansätze wurden auf derartige LB-

Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bei erfolgreicher Integration von

Insert-DNA in den Vektor entwickelten sich weiße Kolonien, da das lacZ-Gen des Vektors

inaktiviert wurde. Blaue Kolonien hingegen waren ein Anzeichen für Klone ohne Insert-DNA,

da das Enzym ß-Galactosidase, das das Substrat X-Gal zu einem Indigofarbstoff umsetzt,

gebildet worden war.

2.3.9 DNA-Sequenzierung

Sequenzierungen von cDNA-Inserts einzelner Plasmide wurden entweder selbst mit dem

Automated Laser Fluorescent DNA Sequencer (ALF) der Fa. Amersham Pharmacia (Freiburg,

Deutschland) in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. B. Reinhold-Hurek (Universität Bremen,

Deutschland)) durchgeführt oder bei der Fa. GAG BIOSCIENCE (Bremen, Deutschland) in

Auftrag gegeben. Für die Sequenzierungen am AFL express DNA Sequencer wurde das Thermo

Sequenase Fluorescent Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gemäß den Angaben

des Herstellers verwendet. Die Sequenzierreaktion beruhte auf dem Reapeated Primer

Extension-Verfahren, einer Weiterentwicklung der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode

(SANGER et al. 1977). CY5-fluoreszenzmarkierte Primer (3 pmol/Sequenzierreaktion) wurden

verwendet. Pro Sequenzierreaktion wurden 0.7-1.0 µg Plasmid-DNA in 21 µl A. bidest

eingesetzt.


2.3.10 Northernblot-Analyse

Zur Analyse der Expression verschiedener Lhc-Gene aus M. polymorpha in Abhängigkeit von

den herrschenden physiologischen Bedingungen (Dauer der Lichtphase, Intensität des Lichts),

wurde Gesamt-RNA isoliert, mittels denaturierender Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und

auf eine Nylonmembran transferiert. Anschließend erfolgte die Hybridisierung mit radioaktiv

markierten cDNA-Sonden (Nukleinsäurefragmente codierend für Lhc-Gene aus M. polymorpha).

2.3.10.1 Transfer von RNA auf Nylonmembranen

In denaturierenden Agarosegelen aufgetrennte Gesamt-RNA (2.3.5.2.2) wurde im Kapillarblot-

Verfahren auf Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland)

übertragen. Der Transfer erfolgt hierbei mit Hilfe der Kapillarwirkung eines Flüssigkeitsstroms,

der durch das Gel führt. Abbildung 6 zeigt den zuletzt angewandten Aufbau für den

Kapillartransfer. Auf einer Glasplatte der Größe 15 x 30 cm wurden mittig 2 Lagen, auf

Gelgröße zurechtgeschnittene Whatmann 3 MM Filterpapiere (Biometra, Göttingen,

Deutschland) plaziert. Die Filterpapiere waren zuvor kurz (2-3 min) mit 6 x SSC-Puffer getränkt

worden, ebenso wie das Agarosegel, das auf die 2 Lagen Filterpapier mit der Unterseite nach

oben gelegt wurde. Dabei wurde darauf geachtet, daß sich keinerlei Lufblasen zwischen dem

Filterpapier und der Glasplatte bzw. zwischen Filterpapier und Gel befanden. An die Kanten um

das Gel herum gelegte entsprechend große Stücke von Röntgenfilm oder Parafilm sollten einen

seitlichen Puffertransfer am Gel vorbei, verhindern. Anschließend wurde die mit 0.1 % (v/v)

DEPC behandeltem A. bidest. benetzte und dann in 6 x SSC getränkte Nylonmembran

luftblasenfrei auf das Gel gelegt, gefolgt von 10 Lagen trockenem Whatmann 3 MM-Papier. Ein

ca. 10 cm hoher Stapel Zellstofftücher wurde auf den Aufbau gelegt, das Ganze mit einer

Glasplatte abgedeckt und einem Gewicht von 1-2 kg beschwert. Der Transfer erfolgte für

mindestens 16 h über Nacht. Die Immobilisierung der auf die Membranen transferierten RNA

erfolgte durch anschließendes Backen der Nylonmembranen bei 80 °C für 2 h oder 120 °C für

30 min. Der anfänglich benutzte Aufbau für den Transfer von RNA auf Nylonmembranen

unterschied sich von dem zuvor beschriebenen daduch, daß die untere Glasplatte über die

Längskanten einer mit 20 x SSC gefüllten Glasschale gelegt wurde und die unteren 2 Lagen

Whatmann 3 MM-Filterpapiere in dieses Pufferreservoir hineinragten. Des weiteren erfolgte der

Transfer nicht mit 6 x SSC-Puffer, sondern mit 20 x SSC-Puffer.


Abb. 6: Aufbau für den Kapillartransfer, wie er zuletzt angewandt wurde.

2.3.10.2 Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden

DNA-Sonden wurden mit [α32P]-dCTP (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) nach der

random priming-Markierungsmethode (FEINBERG & VOGELSTEIN, 1983) mit Hilfe des

Oligolabelling Kits der Fa. Amersham Pharmacia (Freiburg, Deutschland) markiert (gemäß den

Angaben des Herstellers). In der Regel wurden 25–50 ng an DNA pro Markierungsreaktion

eingesetzt. Die Entfernung nicht inkorporierter Nukleotide erfolgte mit Hilfe des Nucleotide

Removal Kits der Fa. Qiagen (Hilden, Deutschland).

2.3.10.3 Hybridisierung

Vor der eigentlichen Hybridisierung erfolgte eine Vorbehandlung der Nylonmembranen.

Unspezifische Bindungsstellen für die DNA-Sonden sollten so möglichst weitreichend zu

blockiert werden. Die Nylonmembranen wurden in Hybridisierungsflaschen überführt und für

eine Stunde mit 10 ml PWB-Puffer (0.1 x SSC, 1% (w/v) SDS) bei 65 °C im

Hybridisierungsofen inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Prähybidisierungspuffer (6 x SSC,

0.5 % (w/v) SDS, 5 x Denhardts Reagenz) mit 100 µl Heringssperma-DNA (100µg/µl) versetzt

und nach dem Abgießen des PWB-Puffers auf die Nylonmembranen gegeben. Vor Zugabe zum

Prähybridisierungspuffer war die Heringssperma-DNA für 5 min bei 95 °C denaturiert und

anschließend für 5 min auf Eis gestellt worden. Nach mindestens zweistündiger Inkubation bei

65 °C im Hybridisierungsofen (Prähybridisierung) wurde die für 5 min bei 95 °C

hitzedenaturierte 32P-markierte DNA-Sonde zugesetzt (25-50 ng). Die Hybridisierung erfolgte

Glasplatte

Zellstoff

3MM Filterpapier (trocken)

Röntgenfilm Gel

Glasplatte

3 MM Filterpapier (feucht)

Nylonmembran

3 MM Filterpapier (feucht)


über Nacht für mindestens 16 h bei 65 °C im Hybridisierungsofen. Nicht hybridisierte DNA-

Sonde wurde durch die anschließenden Waschschritte entfernt. Nach Abgießen der

Hybridisierungslösung wurden die Nylonmembranen je für 15 min bei 65 °C mit 10 ml

Waschpuffer 1 (2 x SSC, 0.1% (w/v) SDS) gefolgt von 10 ml Waschpuffer 2 (1 x SSC,

0.1 % (w/v) SDS) gewaschen.

2.3.10.4 Detektion von Hybridisierungen mittels Autoradiographie

Der Nachweis von Hybridisierungen erfolgte mittels Autoradiographie, über die Schwärzung

hochempfindlicher Röntgenfilme (Kodak X-Omar R). Die in Frischhaltefolie eingeschlagenen

Membranfilter wurden nach einer Hybridisierung mit der RNA-Seite nach oben in

Autoradiograhie-Kassetten mit Verstärkerfolien gelegt. Nach dem Auflegen von Röntenfilm

erfolgte eine unterschiedlich lange Exposition bei – 80 °C, die von 3 h bis zu 7 d dauern konnte.

Die Entwicklung der Röntgenfilme erfolgte manuell, indem die Filme zunächst für 6-8 min unter

Rotlicht in Entwicklerlösung gelegt wurden, dann kurz mit Leitungswasser gewaschen, und

anschließend für 10 min in Fixierlösung gelegt und dann gut gewässert.

2.3.10.5 Entfernen radioaktiver Signale vor einer erneuten Hybridisierung

Auf Nylonmembranen fixierte Nukleinsäuren können mehrfach Hybridisierungsreaktionen

unterzogen werden. Vor einer erneuten Hybridisierung müssen die zuvor an die Nukleinsäuren

gebundenen radioaktiv markierte Sonden jedoch entfernt werden. Die Nylonmembranen wurden

zu diesem Zweck mit 100-200 ml kochender 0.1 % (w/v) SDS-Lösung übergossen und in der

Lösung geschwenkt, bis sie Raumtemperatur erreicht hatte. Anschließend wurden die

Membranen zweimal kurz mit 2 x SSC gespült, mit Prähybridisierungspuffer benetzt und in

Frischhaltefolie eingeschlagen. Bis zur erneuten Hybridisierung erfolgte die Lagerung der

Membranen bei – 20°C.

2.3.11 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels ESTs

Über die Erzeugung und computergestützte Analyse einer Vielzahl ansequenzierter cDNA-

Klone (expressed sequence tags, ESTs) lassen sich relativ schnell Informationen über die

codierenden Sequenzabschnitte von uncharakterisierten Genomen erhalten.

Zur partiellen Analyse des nahezu uncharakterisierten nukleären Genoms und speziell zur

Identifizierung und Klonierung des möglichst kompletten Satzes an cab-Genen wurden ESTs

von M. polymorpha generiert, sequenziert und einer Datenbankanalyse unterzogen. Die


Abbildung 7 gibt eine Übersicht über die einzelnen bei der Erzeugung der EST-Klone erfolgten

Arbeitsschritte.

1. Phase:

Isolierung von mRNA Herstellung einer cDNA Bibliothek

Thalli

2. Phase:

Parallele Anzucht einer hohen maschinelle Präparation Ansequenzierung der cDNAs Anzahl von cDNA-Klonen von Plasmiden der Plasmide

3. Phase:

Verarbeitung der Sequenzdaten: Bestimmung der Basenabfolge Bioinformatik Editierung und Assemblierung Annotierung

Abb. 7: Arbeitsschritte bei der partiellen Analyse des nukleären Genoms von M. polymorpha durch Herstellung und Sequenzierung von EST-Klonen.

2.3.11.1 cDNA Bibliotheken

Zwei cDNA-Bibliotheken von M. polymorpha wurden hergestellt. Die hierfür benötigete

mRNA wurde aus vier Wochen alten Thalli gewonnen. Die Thalli waren bei einer

Quantenflußdichte von 30 µmol m-2 s -1 angezogen worden (Ausgangsmaterial für die erste

cDNA-Bibliothek) bzw. zusätzlich für drei Tage einer um das 10 fache erhöhten

Quantenflußdichte ausgesetzt worden (Ausgangsmaterial für die 2. cDNA-Bibliothek). mRNA

wurde aus den Thalli 1 h vor dem Beginn der Lichtphase bzw. 2 h und 4 h nach dem Beginn der

Lichtphase isoliert und anschließend gepoolt.


2.3.11.1.1 Herstellung

Die cDNA Bibliotheken von M. polymorpha wurden mit dem SMART cDNA Library

Construction Kit der Fa. Clontech (Palo Alto, USA) hergestellt. Ausgehend von sehr geringen

Mengen an RNA (50 ng Gesamt-RNA bzw. 25 ng polyA+ RNA) lassen sich mit der SMART

(Switch Mechanism At the 5’ end of RNA Transcripts) Methode schnell und effizient große

Mengen an „full-length“ cDNA anreichern. Die Synthese des ersten cDNA Stranges erfolgt mit

Hilfe eines modifizierten oligo(dT) Primers (CDS III Primers) und einer MMLV RNase H-

Reversen Transkriptase, die aufgrund ihrer Terminalen Transferase Aktivität noch einige wenige

Desoxycytidin Reste an das 3’ Ende des synthetisierten cDNA Stranges anfügt. Das SMARTIII

Oligonukleotid bildet im folgenden über die oligo(dG) Sequenz an seinem 3’ Ende mit den an

den cDNA Strang angehängten Desoxycytidin Resten Basenpaarbindungen aus und dient der

Reversen Transkriptase als erweiterte Matrize. Die auf diese Weise erzeugten einzelsträngigen

cDNA Stränge sollten über das komplette komplementäre 5’ Ende der jeweiligen mRNA

verfügen, sowie über die komplementäre Sequenz zum eingesetzten SMARTIII Oligonukleotid.

Bei der sich anschließenden Amplifizierung der synthetisierten cDNA dient die zum SMARTIII

Oligonukleotid komplementäre Sequenz als Primerbindungsstelle. Über den bei der

Erststrangsynthese verwendeten Primer CDSIII und das SMARTIII Oligonukleotid werden

außerdem asymmetrische Sfi I Restriktions-schnittstellen an das 5’ (Sfi IA) und 3’ Ende (Sfi IB)

der synthetisierten cDNA Stränge eingeführt. Nach dem Schneiden der cDNA mit dem

Restriktionsenzym Sfi I und einer Größenfraktionierung mittels CHROMA SPIN–400 Säulen

erfolgt die Ligation in den ebenfalls mit Sfi I geschnittenen Phagemid-Vektor λTriplEx2. Nähere

Angaben zu genetischen Eigenschaften des Phagemid-Vektor λTriplEx2 finden sich unter 2.3.1.

Wenn nicht anders vermerkt, wurde nach dem Protokoll des Herstellers verfahren.

Erststrangsynthese

Die Reverse Transkription der poly A+-RNA in cDNA erfolgte mit Hilfe der MMLV RNase H-

Reversen Tanskriptase Superscript II der Fa. Life Technologies (Karlsruhe, Deutschland). Pro

Reaktionsansatz wurden 200 Units der Reversen Transkriptase und 1 µg polyA+-RNA

eingesetzt. Das Reaktionsvolumen betrug 100µl.

Synthese doppelsträngiger cDNA

Für die Synthese dopelsträngiger cDNA mittels primer extension wurde die Zykluszahl des im

Protokoll angegebenen Thermoprogramms von drei um weitere zwei Zyklen erhöht. Grund

hierfür war die geringe Anzahl an sichtbaren Nukleinsäurebanden im Agarosegel nach

gelelektrophretischer Auftrennung eines 10-tels des Ansatzes. Es ergab sich somit folgendes


Thermoprogramm, das in einem GeneAmp2400-Thermocykler der Fa. Perkin Elmer

(Überlingen, Deutschland) durchlaufen wurde:

1. Schritt: 72 °C für 10 min 2. Schritt: 95 °C für 20 s 3. Schritt: 3 Zyklen 95°C für 5 s und 68 °C für 8 min

Spaltung der cDNA mit SfiI

Nach der Inaktivierung der DNA-Polymerase durch eine Proteinase K Behandlung der Ansätze

gemäß den Angaben des Herstellers, erfolgte die gezielte Spaltung der cDNA mit dem

Restriktionsenzym Sfi I. Die Spaltung der cDNA mit dem Restriktionsenzym Sfi I diente der

Vorbereitung für die direktionale Ligation der cDNA in die asymmetrischen SfiI (A&B)

Schnittstellen des Phagemidvektors λTriplEx2.

Größenfraktionierung

cDNA, die kleiner als 100 bp war, wurde aus den Ansätzen entfernt. Dies geschah mittels einer

Fraktionierung der cDNAs nach ihrer Größe durch CHROMA-SPIN-400-Säulen. Das Profil der

einzelnen Fraktionen wurde elektrophoretisch in einem 1.1 % (w/v) Agarosegel überprüft. Die

ersten drei Fraktionen, die cDNA enthielten, wurden gepoolt und in den Vektor λTriplEx2

ligiert.

Ligation

Zur Ligation der cDNA in den Vektor xTriplEx2 wurden pro cDNA-Bibliothek drei

Ligationsansätze vorbereitet. Die Zusammensetzung der Reaktionsansätze ist in Tabelle 12

wiedergegeben.

Tab. 12: Zusammensetzung der Ligationsansätze.

Komponente 1. Ligationsansatz (µl) 2. Ligationsansatz (µl) 3. Ligationsansatz (µl)

cDNA (50 ng/µl) 0.5 1.0 1.5

Vektor DNA (500 ng/µl) 1.0 1.0 1.0

10 x Ligationspuffer 0.5 0.5 0.5

10 mM ATP 0.5 0.5 0.5

T4 DNA Ligase 0.5 0.5 0.5

A. bidest. (steril) 2.0 1.5 1.0

Gesamtvolumen (µl) 5.0 5.0 5.0

Die Ligation selbst erfolgte über Nacht bei 16 °C.


In vitro-Verpackung in λ-Phagen

Die in vitro-Verpackung der rekombinierten DNA in λ-Phagenköpfe erfolgte mittels des

Gigapack III Gold Packaging Extracts der Fa. Stratagene (Heidelberg, Deutschland) gemäß den

Angaben des Herstellers.

2.3.11.1.2 Titerbestimmung

Das wichtigste Charakteristikum einer cDNA-Bibliothek ist die sogenannte Representativität, die

Angabe darüber, ob alle mRNA-Moleküle in Form ihrer cDNAs in der Bibliothek vertreten sind.

Eine mittels des SMART cDNA Library Construction Kit der Fa. Clontech (Palo Alto, USA)

erzeugte, unamplifizierte cDNA-Bibliothek sollte mehr als 1 x 106 unabhängige Klone enthalten,

um representativ zu sein (Handbuch, SMART cDNA Library Construction Kit der Fa. Clontech,

Palo Alto, USA). Der Titer der unamplifizierten cDNA-Bibliotheken wurde bestimmt, inde m die

Zahl der plaque forming units (pfu) pro ml Phagensuspension ermittelt wurde (SAMBROOK et al.,

1989). Hierzu wurden die Phagensuspensionen 1:10 und 1:15 mit SM-Puffer (1 M NaCl,

0.1 M MgSO4, 0.35 M Tris-HCl, pH7,5) verdünnt und jeweils 1 µl zu 200 µl einer

Übernachtkultur von E.coli XL1-Blue-Zellen gegeben. Nach Inkubation für 15 min bei 37 °C

wurden die Suspensionen mit je 2 ml geschmolzenem Top-Agar (48 °C) versetzt und

luftblasenfrei auf 37 °C vorgewärmte LB-Agarplatten gegossen. Auf die Agarplatten waren

zuvor je 50 µl 100 mM IPTG und 100 mM X-Gal verteilt worden. In dem Vektor λTriplEx2

liegt die Multiple cloning site (MCS) in dem für das α-Polypeptid der β-Galactosidase (lacZ’)

codierenden Sequenzbereich. Dies ermöglicht es, die Insert-tragenden Phagen mittels lacZ α-

Komplemetation zu identifizieren (siehe Blau-Weiß-Selektion, 2.3.8.6). Nach Erstarren des Top-

Agars, wurden die Platten für 7-8 h zur Ausbildung der Plaques bei 37 °C inkubiert. Die

Ermittlung der pfu/ml erfolgte durch Auszählen der Plaques pro Agarplatte und wurde unter

Berücksichtigung der entsprechenden Verdünnungsfaktoren mit ca. 1.1 x 107 (1. cDNA

Bibliothek) bzw. 1 x 107 (2. cDNA Bibliothek) bestimmt. 85 % der erhaltenen Plaques waren

rekombinante Klone.

Nach Amplifikation der cDNA-Bibliotheken erfolgte erneut eine Titerbestimmung, wobei nach

der zuvor beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen wurde. Unterschiede bestanden in den

angesetzten Verdünnungen der Phagensuspensionen. Verdünnungen von 1:100, 1:1000, 1:10000

und 1:100000 wurden angesetzt und die pfu/ml für die 1. cDNA-Bibliothek mit 3.5 x 109 bzw.

für die 2. cDNA Bibliothek mit 2.6 x 109 bestimmt.


2.3.11.1.3 Amplifizierung

Die Amplifikation der primären cDNA-Bibliotheken erfolgte durch die Vermehrung der Phagen

in dem Wirtsstamm E. coli XL-1 Blue. Hierzu wurden die Phagen auf den Wirtsstamm plattiert

und nach Inkubation der Platten für 6-7 h bei 37 °C die Phagenplaques resuspendiert, indem die

Platten vorsichtig mit SM-Puffer gespült wurden. Die Vervielfältigung der primären cDNA-

Bibliotheken war einerseits notwendig, um die Stabilität der Bibliotheken zu erhöhen,

andererseits, um nicht durch die Menge des Materials limittiert zu sein. Während unamplifizierte

cDNA-Bibliotheken nur für kurze Zeit einen stabilen Titer und da mit ihre Repräsentativität

behalten, können amplifizierte Bibliotheken bis zu 7 Monate bei 4°C ober mindestens ein Jahr in

DMSO (Endkonzentration 7 % (v/v)) bei –80 °C aufbewahrt werden, ohne ihre Repäsentativität

zu verlieren (SAMBROOK et al. 1989).

Die Anzahl der zum Ausplattieren des Wirtsstammes benötigen LB-Agarplatten wurde in

Abhängigkeit von der zu amplifizierenden Anzahl an unabhängigen Klonen pro cDNA-

Bibliothek kalkuliert. Die Verdünnung der Phagensuspensionen erfolgte so, daß pro LB-

Agarplatte (Durchmesser150 mm) ca 1 x 105 Plaques zu erwarten waren. Jeweils 100 µl der

verdünnten Phagensuspensionen wurden mit 500 µl E. coli-XL-1-Blue Zellen für 15 min bei

37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Suspensionen mit 4.5 ml geschmolzenem Top-Agar

(48 °C) versetzt und luftblasenfrei auf die vorgewärmten LB-Agarplatten gegossen. Nach dem

Erkalten der Top-Agarschicht erfolgte die Inkubation der Platten für 6-7 h bei 37°C zur

Ausbildung der Phagenplaques. Nach Zugabe von 12 ml SM-Puffer und durch vorsichtiges

Schütteln der Platten bei 4 °C für 18 h und 1 h bei RT wurden die lysierten Phagen gewonnen.

Die anschließende Extraktion der vereinigten Lysate mit 0.25 Volumen an Chloroform diente

der Lyse noch vorhandener E. coli-Zellen bzw. der Entfernung vorhandener Zellrückstände. Die

amplifizierten cDNA-Bibliotheken wurden mit DMSO bis zu einer Endkonzentration von

7 % (v/v) versetzt und bei –80°C gelagert.

2.3.11.2 In vivo-Excision von pTriplEx2 aus λTriplEx2

Der Phagemidvektor λTriplEx2 ist derart konstruiert, daß durch eine Cre-Rekombinase

vermittelte Rekombination an den loxP Stellen des Phagemidvektors die effiziente in vivo-

Excision des Plasmides pTriplEx2 möglich ist. Die in vivo-Excision der Plasmide geschieht

automatisch bei der Transduktion der Phagen in einem E. coli Wirtsstamm, in dem die Cre-

Rekombinase exprimiert wird.


20 ml einer bei 30 °C über Nacht angezogenen Kultur von von E. coli BNN132 mit einer OD600

von 0.5 wurden durch Zentrifugation (4000 x g, 4 °C) sedimentiert und in 12 ml 10 mM MgCl2

resuspendiert. Anschließend wurden je 108 Phagen mit 1ml dieser Bakteriensuspension für

30 min bei 30°C inkubiert, mit 2 ml LB-Medium versetzt und für eine weitere Stunde einer

Inkubation bei 30°C, jedoch unter Schütteln (230 rpm), unterzogen. Das Ausplattieren der

Bakterien erfolgte auf Carbenicillin, IPTG-und X-Gal-haltigen LB-Platten, die für 16-18 h über

Nacht bei 37 °C inkubiert wurden.

2.3.11.3 Anzucht der EST-Klone

Nach erfolgter in vivo-Excision der rekombinanten Plasmide pTriplEx2 in dem E. coli Stamm

BNN132 wurden für jede cDNA-Bibliothek 960 einzelne, rekombinante Plasmide tragende

Bakterienkolonien mittels steriler Zahnstocher gepickt. Mit jeder einzelnen Kolonie wurden je

1.5 ml Carbenicillin haltiges LB-Medium inokuliert, und die Bakterien in 96-well Kulturplatten

bei 37 °C unter Schütteln angezogen. Die Kulturplatten waren zuvor mit einer den Gasaustausch

ermöglichenden Membran verschlossen worden, um die sterilen Bedingungen zu wahren. Die

Kulturdauer betrug zwischen 30 und 48 h, je nachdem wie gut die einzelnen Kulturen wuchsen.

Von jeder der 1920 angezogenen Bakterienkulturen wurden 200 µl abgenommen und

Glycerinstammkulturen in 96 well Mikrotiterplatten durch Versetzen der Suspensionen mit

Glycerin (Endkonzentration 15 % (w/v)) angelegt. Die Zellen der je verbleibenden 1.48 ml

Bakteriensuspension wurden durch Zentrifugation der Kulturplatten für 10 min mit 1000 x g

sedimentiert, das überständige Medium abgegossen und die Platten bis zur maschinellen

Plasmidpräparation bei –20°C eingefroren.

2.3.11.4 Sequenzierung aus EST-Klonen isolierter Plasmid-DNA

Die Sequenzierung der aus 1920 EST-Klonen isolierten Plasmide erfolgte an der Universität

Umeå (Schweden) in der Abteilung für Pflanzenphysiologie mit dem CEQ 2000 XL DNA

Analysis System (Beckman Coulter, Fullerton, USA). Dieses System vermag parallel 96 in einer

Mikrotiterplatte vorgelegte Sequenzierreaktionen durchzuführen, wobei pro Reaktion für die vier

Basen je ein unterschiedlicher Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt wird. Die Auftrennung mittels

Kapillar-Elektrophorese und die zeitaufgelöste Messung der Intensitäten der vier

basenspezifischen Fluoreszenzsignale verlaufen voll automatisiert. Die Sequenzdaten können als

verschiedene Formate ausgegeben werden (*.abd,*.scf,*.fas,*.txt) und mittels anderer

Programme als Chromatogramme dargestellt werden.


Pro Sequenzierreaktion wurden 0.5-1.5 µg Plasmid-DNA eingesetzt. Die Qualität und Quantität

der maschinell präparierten Plasmide wurde aufgrund der großen Anzahl der Proben nur

stichprobenartig mitte ls Agarosegelelektrophorese analysiert. Für die zyklische Sequenzierung

(cycle sequencing) beruhend auf der Kettenabbruch-Methode nach SANGER (1977) wurde das

CEQ 2000 Dye terminator Cycle Sequencing Kit der Fa. Beckman Coulter (Fullerton, USA)

verwendet.

2.3.11.5 Verarbeitung von Sequenzdaten: Bioinformatik

Die bioinformatische Analyse der mittels des CEQ 2000 XL DNA Analysis Systems (Beckman

Coulter, Fullerton, USA) generierten Sequenzrohdaten umfaßte die halbautomatisierte

Bestimmung der Basenabfolge (basecalling), die Editierung und die Assemblierung der

Sequenzen sowie die Annotierung und die Homologiesuche in Datenbanken.

Bestimmung der Basenabfolge (basecalling)

Sequenzrohdaten wurden im „*.scf“ Format ausgegeben und die Basenabfolge mit Hilfe des

base caller Programms Phred bestimmt. Hierbei wird über Algorithmen die Wahrscheinlichkeit

berechnet, wann die Base A,T,C oder G an Position XYZ im DNA-Sequenzchromatogramm

vorhanden ist. Die Intensitäten der Fluoreszenzsignale sind entschiedend für die Auswertung der

Chromatogramme. Ab einem bestimmten Signal/Rausch-Verhältnis läßt sich die Sequenz nicht

mehr eindeutig ermitteln. Daher können Fehlinterpretationen, fälschliche Insertionen und

Deletionen einzelner Basen vorkommen. Das Programm Phred wurde für die Bestimmung der

Basenabfolge gewählt, da es sich im Vergleich zu anderen base caller Programmen (z.B. ABI

Software) durch eine sehr hohe Bestimmungsgenauigkeit auszeichnet. Das Programm bewertet

zur Fehlerabschätzung die Qualität einzelner Teilsequenzen, indem es durch Auswertung der

Fluoreszenspeaks eine lokale Fehlerwahrscheinlichkeit p bestimmt. Diese dient dazu einen

Qualitätsfaktor q zu definieren, für den gilt:

q = - 10 log (p)

Der Qualitätsfaktor kann Werte von 4 bis 60 annehmen, wobei höhere Werte mit einer höheren

Bestimmungsgenauigkeit einhergehen. Ein Wert von 40 bedeutet z.B., daß unter jeweils 10.000

Basen im Mittel mit einem Fehler zu rechnen ist.


Editierung und Assemblierung von Sequenzen

Im Anschluß an die Bestimmung der Basenabfolge wurden die Sequenzen sowohl um die

Sequenzen des Klonierungsvektors pTriplEx2 korrigiert (GCCATTATGGCCGGG) als auch um

die PolyA-Sequenzen. Dies erfolgte automatisch mit Hilfe des Programmes „vectorstrip“ von

EMBOSS (Version 2.3.45). Bei der darauffolgenden Assemblierung von Contigs wurden

Sequenzen, die aufgrund von überlappenden Sequenzbereichen zusammengehören, zu Klustern

(Contigs) zusammengefaßt. Von allen Teilsequenzen in einem Contig wurde zudem eine

Consensus-Sequenz generiert. Die Vorgehensweise entspricht der Bildung eines Multiplen

Sequenz Aligments. Der Assemblierungsprozeß selbst gliedert sich somit in drei Schritte: der

Bestimmung überlappender Regionen, der Bildung von Contigs und der Generierung der

Consensus-Sequenz. Das Assembly erfolge vollautomatisch mit Hilfe des „phragment assembly

program“, kurz Phrap genannt (Version 0.990319).

Annotierung und Homologiesuche in Datenbaken

Bei der Annotierung einer Sequenz wird versucht, die DNA-Sequenz zu identifizieren. Dies

geschah durch Homologiesuche mittels der Vergleichsalgorithmen der Programmgruppe Basic

Local Aligment Search Tool (BLAST, ALTSCHUL et al. 1997). Als Vergleichsdatenbank wurde

die Protein -Sequenzdatenbank Swiss-Prot gwählt (Stand Juni 2001). Die Homologiesuche

erfolgte auf Proteinebene, nachdem eine DNA-Sequenz je nach reading frame in die möglichen

Proteinsequenzen translatiert worden war (Programm: blastx). Dies ermöglicht es, wesentlich

weiter entfernte Homologien zu detektieren als auf DNA-Ebene.

Ergebnisse 54

Ergebnisse

12 Mitglieder der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha konnten über zwei

verschiedene methodische Ansätze identifiziert werden (3.1.1). Neun der ermittelten cDNA-

Sequenzen lassen sich Proteinen des Antennensystems des PSII zuordnen, eine Sequenz dem des

PSI. Weiterhin konnte für das ebenfalls zur cab-Genfamilie Höherer Pflanzen zählende PsbS-

Protein eine Teilsequenz ermittelt werden, sowie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana

ähnliche Sequenz.

Die von den ermittelten Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden mit den

Sequenzen der homologen Proteine eines Vertreters der Samenpflanzen (A. thaliana) und der

Grünalgen (C. reinhardtii) verglichen. Da für Bryophyten bislang kaum Informationen über

CAB-Proteine vorliegen, sollten so charakteristische Unterschiede bzw. Gemeinsamkeiten

herausgearbeitet werden (3.1.2).

Weitere Untersuchungen bezogen sich auf die Analyse der Expression einzelner cab-Gene von

M. polymorpha (3.1.3). Zum einen wurden Veränderungen in der Expression des Sep1-ähnlichen

Gens als Folge von Lichtstreß aufgezeigt. Zum anderen konnte gezeigt werden, daß die

Expression verschiedener cab-Gene von M. polymorpha einer diurnalen Rhythmik unterliegt. Im

Vergleich zu dem für viele Pflanzenspecies beschriebenen Expressionsmuster bestehen je doch

charakteristischen Unterschiede.

3.1 Strategien zur Identifizierung einzelner Mitglieder der cab-Genfamilie

Zahlreiche molekularbiologische Methoden stehen für die gezielte Klonierung von Genen zur

Verfügung. Bei der Wahl einer geeigneten Methode zur Klonierung der kerncodierten Lhc-Gene

von M. polymorpha war folgendes zu berücksichtigen:

- es sollte ein möglichst vollständiges Bild von der Zusammensetzung der cab-Genfamilie

gewonnen werden.

- das nukleäre Genom von M. polymorpha war nahezu uncharakterisie rt. So lag auch keine

Nukleotidsequenz für ein cab-Gen vor. Zudem mangelte es an einer Codon usage für die

Aminosäuren kerncodierter Proteine.

- Die verschiedenen CAB-Proteine sind sehr homolog zueinander. Die N-Termini sind

noch die am wenigsten konservierten Bereiche (PICHERSKY & JANSSON 1996).

Ergebnisse 55

- KILIAN und Mitarbeiter (1998) konnten vier Aminosäureteilsequenzen für CAB-Proteine

ermitteln. Allerdings ließen sich nur zwei dieser Sequenzen eindeutig als Lhcb4- bzw. Lhcb6-

Teilsequenz identifizieren und den N-Termini der jeweiligen Proteine zuordnen.

Unter Berücksichtigung dieser Tatsachen wurden zwei verschiedene Strategien zur

Identifizierung der einzelnen Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha verfolgt.

Zunächst wurde versucht, über RT-PCR die cDNAs der Lhc-Gene Lhcb4 und Lhcb6 zu

amplifizieren. Hierfür wurden die von KILIAN und Mitarbeitern (1998) ermittelten

Aminosäureteilsequenzen für Lhcb4 und Lhcb6 für die Ableitung von Primern herangezogen.

Aufgrund der großen Sequenzähnlichkeit der CAB-Proteine in den Helixbereichen hätten die

mittels RT-PCR amplifizierten Lhc-cDNAs dann als Sonden beim Screenen einer cDNA-Bank

von M. polymorpha eingesetzt werden können, um weitere Mitglieder der Genfamilie zu

identifizieren.

Da sich im Verlauf der Arbeit jedoc h die Möglichkeit der Herstellung und Sequenzierung von

expressed sequence tags (ESTs) von M. polymorpha bot, wurde die zunächst eingeschlagene

Strategie durch die oben umrissene Methodik nur bis zum Schritt der RT-PCR verfolgt.

Die Herangehensweise über die Sequenzierung von 1920 EST-Klonen versprach in der für die

Arbeit zur Verfügung stehenden Zeit weitaus mehr Mitglieder der cab-Genfamilie identifizieren

zu können. Auch die Chance Gene für bisher nicht bekannte CAB-Proteine zu finden, erhöhte

sich durch diesen methodischen Ansatz.

Obwohl sowohl das plastidäre und auch das mitochondriale Genom von M. polymorpha schon

komplett durchsequenziert waren (OHYAMA et al. 1986, ODA et al. 1992), lagen wenig

Sequenzen kerncodierter Gene vor. Durch die partielle Ana lyse des nukleären Genoms von

M. polymorpha mittels der Analyse von ESTs konnte eine Vielzahl an Sequenzinformation

gewonnen werden, die die Grundlage für weiterführende Forschungsvorhaben bildet.

3.1.1 RT-PCR

Da zu Beginn der Arbeiten noch keinerlei Infor mation über die bevorzugte Nutzung von Codons

für die Aminosäuren kerncodierter Proteine von M. polymorpha vorlag, wurde bei der

Konstruktion der Primer auf die von M. paleacea bekannte Codon Usage zurückgegriffen.

Ausgehend von Gesamt-RNA erfolgte die Reverse Transkription der mRNA in die

entsprechende cDNA mit Hilfe eines sich an den 3’-Poly(A)-Enden der mRNAs anlagernden

oligo(dT)17-Primers. Für die sich anschließende PCR wurde ein Primersystem aus dem

„genspezifischem“ Primer (Lhcb4 bzw. Lhcb6) und dem oligo(dT)17-Primer eingesetzt.

Ergebnisse 56

Gesamt-RNA von M. polymorpha wurde 4 h nach dem Beginn der Lichtphase isoliert.

Ausschlaggebend für den raschen Erfolg einer RT-PCR ist auch immer der Gesamtanteil der

mRNA des gewünschten Produktes an eingesetzter Gesamt-RNA. Über die Expression der

verschiedenen Lhc-Gene von M. polymorpha war zu Beginn der Arbeiten nichts bekannt. Wenn

ihre Expression ebenfalls der für viele pflanzliche Species beschriebenen typischen diurnalen

Rhythmik (PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT et al. 1996) unterliegt, sollte 4 h nach dem

Beginn der Lichtphase ein hoher Spiegel an mRNAs für Lhc-Proteine vorliegen. Der mRNA-

Gehalt für Lhc-Proteine steigt bei Angiospermen z.B. gerade mit Beginn der Lichtphase an und

erreicht um die Mittagszeit ein Ma ximum (PIECHULLA et al. 1993). Bleibt die Expression der

Lhc-Gene von M. polymorpha wie für das Lebermoos Conocephalum conicum beschrieben

(OBERSCHMIDT et al. 1996) dagegen konstant, ist der Zeitpunkt der Probennahme für die

Isolierung von Gesamt-RNA nicht bedeutsam.

Der methodische Ansatz, mittels RT-PCR die cDNAs der Lhc-Gene Lhcb4 und Lhcb6 von

M. polymorpha zu amplifizieren war nur für das Lhcb6-Gen erfolgreich.

Bei der RT-PCR zur Amplifizierung der Lhcb4 cDNA wurden mehrere im gleichen

Größenbereich liegende PCR-Produkte amplifiziert. Die Bedingungen für die RT-PCR konnten

nicht dahingehend optimiert werden, daß ein einzelnes PCR-Produkt amplifizierbar war. Da sich

die Möglichkeit der Erzeugung und Sequenzierung von ESTs von M. polymorpha bot, wurde der

methodische Ansatz ein Lhcb4-Gen mittels RT-PCR zu amplifizieren nicht weiter verfolgt.

Amplifikation der cDNA eines Lhcb6-Gens

Unter Verwendung des für die Amplifikation der Lhcb6 cDNA konstruierten Primersystems

konnte mittels RT-PCR ein einzelnes PCR-Produkt stark angereichert werden. Da die Größe des

PCR-Produktes mit ca. 820 bp der zu erwartenden Größe entsprach, wurde das PCR-Produkt

aufgereinigt, in den Vektor pBluescript SK(+) kloniert und sequenziert.

Der Homologievergleich mittels des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al. 1997) ergab,

daß die erhaltene Nukleotidsequenz für ein Protein codiert, das 76% Übereinstimmung zu dem

reifen Lhcb6-Protein von Spinacia oleracea aufweist. Sequenzierungsfehler wurden durch

vierfaches Sequenzieren der DNA-Stränge ausgeschlossen.

Die vollständige Nukleotidsequenz und die von der Nukleotidsequenz abgeleitete

Aminosäuresequenz sind in Abbildung 8 dargestellt.

Das als Lhcb6 identifizierte 819 bp lange cDNA-Fragment von M. polymorpha codiert für ein

Protein von 221 Aminosäuren. Somit ist es um sieben Aminosäuren länger als die von

PICHERSKY & JANSSON (1996) ermittelte Konsensussequenz für Lhcb6.

Ergebnisse 57

Da der N-terminale Primer zur Amplifizierung von der von KILIAN und Mitarbeitern (1998)

ermittelten Aminosäureteilsequenz abgeleitet worden war, ist unklar, ob der N-terminale Bereich

möglicherweise noch länger ist.

Interessanterweise unterscheidet sich der N-terminale Bereich der in dieser Arbeit für

M. polymorpha identifizierten Lhcb6-Sequenz von dem von KILIAN und Mitarbeitern (1998)

bestimmten N-Terminus des Lhcb6-Proteins von M. polymorpha. Abbildung 9 zeigt ein

Alignment der beiden N-Termini.

1 accaagaaggtggccgctaagcccgccttcaagggaggaaagggaggaaagctttcgtgggtcccc T K K V A A K P A F K G G K G G K L S W V P 22

67 gccatcaagagcggaggtagcttcgtcgaccccgagtggctcgatggctcgctcccaggagactac

A I K S G G S F V D P E W L D G S L P G D Y 44

133 ggcttcgaccccttgggactcggaagggaccctgctgctctgaagtggtacagggaagccgagatc G F D P L G L G R D P A A L K W Y R E A E I 66

199 atccacggccgatgggcgatggcagctgttcttggaatcttcgtcggtcaggcctggagcggtatc I H G R W A M A A V L G I F V G Q A W S G I 88

265 ccctggttcgaggccggtgccgatccctcggccgtggcaccattctccttcggaaccctgttggga P W F E A G A D P S A V A P F S F G T L L G 110

331 acccagctgttgttgatgggatgggtcgagggcaagagatgggcagactacgtgaaccccaactct T Q L L L M G W V E G K R W A D Y V N P N S 132

397 cagttggtcgactgggccactccatggtcgaggaccgcagagaacttcggtaactccaccggtctc Q L V D W A T P W S R T A E N F G N S T G L 154

463 cagggataccccggaggcaagttcttcgaccctctgagccttgctggagatgtgaagaacggaaag Q G Y P G G K F F D P L S L A G D V K N G K 176

529 tacaccaccgactacgacaagctcagcaggttgcagctcgccgagatcaagcactccagactcgcg Y T T D Y D K L S R L Q L A E I K H S R L A 198

595 atgttggccatgcttatcttctacttcgaggctggacagggactgacccccctcggtgccctcgga M L A M L I F Y F E A G Q G L T P L G A L G 220

661 ctgtaaatgtaatttagctgaccctgtgtatgatgtgtagtaattagccgaaatccaggactcgac L 231

727 cccactgagaatcttccgacagtcaaatcgactctgttttttgtaccgaacttgtgattatattct

793 tgcccttcacgaaaaaaaaaaaaaaaa Abb. 8: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb6 aus M. polymorpha. Besonders gekennzeichnet (grau unterlegt) sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D (KÜHLBRANDT et al. 1994). Die linke Nummerierung bezieht sich auf die Anzahl der Basen, die rechte auf die der Aminosäuren.

Ergebnisse 58

Unterschiede bestehen in einer Insertion von drei Aminosäuren, die die von KILIAN und

Mitarbeiten (1998) ermittelte Sequenz nicht aufweist, sowie in fünf weiteren Aminosäuren. Es

scheint sich somit um zwei verschiedene Lhcb6-Proteine von M. polymorpha zu handeln. Sie

werden im folgenden als Lhcb6.1 (KILIAN et al. 1998) und Lhcb6.2 (hier ermittelte Sequenz)

bezeichnet.

Lhcb6.1 TKKVAAKPS---GKGGKLSWIPAVKGGGSLVD Lhcb6.2 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVD

Abb. 9: Alignment der von KILIAN und Mitarbeitern (1998) ermittelten Aminosäureteilsequenz für den N-Terminus des Lhcb6-Proteins von M. polymorpha (Lhcb6.1) mit dem N-terminalen Bereich, des in dieser Arbeit identifizierten Lhcb6-Proteines von M. polymorpha (Lhcb6.2). Unterschiede zwischen den Sequenzen sind orange unterlegt.

3.1.2 Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels „expressed sequence tags“

Über die Erzeugung und computergetützte Analyse einer Vielzahl ansequenzierter cDNA-Klone

(expressed sequence tags, ESTs) lassen sich relativ schnell Informationen über die codierenden

Sequenzabschnitte von uncharakterisierten Genomen erhalten (BOUCHEZ & HÖFTE 1998).

Sequenzdatenbanken mit ihrem enormen Informationsgehalt dienen dabei als wertvolle Quelle

zur Identifizierung homologer Nukleotidsequenzen.

Zwei verschiedene cDNA-Banken von M. polymorpha wurden hergestellt und 1920 cDNA-

Klone ansequenziert und analysiert. Die Anzahl der zu sequenzierenden EST-Klone von

M. polymorpha war auf 1920 begrenzt worden, da unter einer vergleichbaren Anzahl von EST-

Sequenzen der Pappel nahezu alle Nukleotidsequenzen für die verschiedenen Mitglieder der cab-

Genfamilie zu finden waren (JANSSON, persönliche Mitteilung).

Beeinflußt von Umweltfaktoren wird gewebespezifisch jeweils nur ein bestimmter Teil des

gesamten Genoms eines Organismus exprimiert. Für die Gene der ELIPs und Seps konnte

gezeigt werden, daß ihr mRNA-Gehalt unter Lichtstress stark ansteigt (JANSON 1999, HEDDAD &

ADAMSKA 2000). Die Chance auch Homologe zu diesen Genen zu identifizieren, wurde dadurch

erhöht, daß die mRNA für eine der cDNA-Bibliotheken aus Thalli isoliert wurde, die drei Tage

vor der Isolierung der mRNA einer 10fach erhöhten Quantenflußdichte (300 µmol m-2 s-1)

ausgesetzt worden waren. Von jeder der beiden cDNA-Bibliotheken wurden 960 zufällig

ausgewählte cDNA-Klone vom 5’-Ende her ansequenziert.

Ergebnisse 59

3.1.2.1 Bioinformatische Analyse der EST-Sequenzen

Von den insgesamt 1920 ansequenzierten EST-Klonen konnten nach Analyse der erhaltenen

Sequenzrohdaten 1838 Nukleotidsequenzen einer weiteren bioinformatischen Auswertung

unterzogen werden. Die durchschnittliche Länge der EST-Sequenzen betrug 550 bp.

1399 EST-Sequenzen von M. polymorpha ließen sich zu 202 unabhängigen Clustern

zusammenfassen. Die verbleibenden 439 Sequenzen repräsentieren sogenannte Singlet-

Sequenzen (Sequenzen, die nur einmal innerhalb des ausgewerteten Datensatzes an Sequenzen

auftreten). Die Anzahl an unabhängigen EST-Sequenzen betrug somit 641. Diese 641 Sequenzen

wurden mit Hilfe des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al.1997) einem Vergleich mit

den in der Swiss-Prot.-Datenbank registrierten Sequenzen unterzogen.

176 der 641 unabhängigen EST-Klonen wiesen eine signifikante Ähnlichkeit zu einem in der

Datenbank registrierten Protein auf. Jedoch mehr als die Hälfte (72%) der Sequenzen ließen sich

nicht identifizieren (Abb. 10). In Anlehnung an die Arbeiten von NISHIYMA und Mitarbeitern

(2000) war ein Ähnlichkeitswert (score bits) von mindestens 100 als Grenzwert gesetzt worden,

um einen Treffer als signifikant zu definieren. Allerdings wurde kein weiterer Vergleich nur auf

Nukleotidebene durchgeführt. Somit läßt sich nicht mit Sicherheit sagen, ob die 465 ESTs ohne

Ähnlichkeit zu einem in der Swiss-Prot.-Datenbank registrierten Protein wirklich neue

Transkripte darstellen.

72%

23%

5%

nicht identifiziert

Ähnlichkeit zu einer Proteinsequenzeiner pflanzlichen Species

Ähnlichkeit zu einer Proteinsequenzeiner nicht pflanzlichen Species

Abb. 10: Anteil an EST-Klonen mit oder ohne signifikanter Ähnlichkeit zu einem bekannten Protein. Die Datenbankenrecherche erfolgte mittels des BLAST-Algorithmus (blastx, ALTSCHUL et al. 1997). Vergleichsdatendank war die Swiss-Prot.-Datenbank. Als signifikante Treffer wurden jene angesehen, die einen Ähnlichkeitswert (score bits) von mindestens 100 aufwiesen.

Ergebnisse 60

Im Rahmen dieser Arbeit wurde auf die weitere bioinformatische Auswertung wie die

Klassifizierung der ESTs nach Funktionen der von ihnen codierten Proteine oder ein Vergleich

zwischen den von den verschiedenen cDNA-Banken generierten ESTs verzichtet. Ein derartiger

Vergleich könnte z.B. Aufschluß darüber geben, welche Proteine insbesonders unter Lichtstress

exprimiert werden. Mit dem in dieser Arbeit erarbeiteten Datenmaterial wurde jedoch die solide

Grundlage für derart weiterführende Analysen gelegt. Die Ergebnisse des Vergleiches mit der

Swiss-Prot.-Datenbank für sämtliche in dieser Arbeit sequenzierte ESTs sind dem Anhang zu

entnehmen.

3.1.2.2 ESTs mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen

Insgesamt 41 der 1838 auswertbaren EST-Sequenzen zeigen Ähnlichkeit mit einer in der Swiss-

Prot.-Datenbank registrierten Sequenz für ein Chlorophyll a/b-bindendes Protein. Diese 41

Sequenzen schließen auch jene mit ein, deren Ähnlichkeitswert zu einem CAB-Protein unter 100

lag (Tab. 13). Als wesentliches Kriterium für die Identifizierung als Mitglied der Lhc-Genfamilie

wurde das Vorhandensein des hoch konservierten LHC-Motivs (1.3.1.1) herangezogen.

Tab. 13 : ESTs von M. polymorpha mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen. Bezüglich der mutmaßlichen Identifizierung wurde jeweils das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, angegeben. Es sei hier auf die verschiedenen für CAB-Proteine verwendeten Nomenklaturen verwiesen (1.3.1). Einträge von ESTs mit einem Ähnlichkeitswert unter 100 wurden grau unterlegt.

EST a) L b) Ä c) mutmaßliche Identifizierung Organismus d) Datenbanknr. C07P.E02 520 164 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4

(LHCI Type III CAB-4) Arabidopsis thaliana sp|P27521|

C02P.D04 484 57 Chlorophyll a/b bindendes Protein 1 (LHCII Type I)

Chlamydomonas moewusii sp|P22686|

35 (2 Klone)

601 162 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4 (LHCII Type I CAB-4)

Lycopersicon esculentum sp|P14278|

72 (2 Klone)

498 232 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB-4)


88 (2 Klone)

609 261 Chlorophyll a/b bindendes Protein 4 (LHCII Type I CAB-4)


178 (8 Klone)

628 310 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB-4)


185 (9 Klone)

686 64 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB)

Petunia x hybrida sp|P13869|

188 (12 Klone)

661 294 Chlorophyll a/b bindendes Protein (LHCII Type I CAB)

Silene pratensis sp|P12332|

127 (3 Klone)

572 244 Chlorophyll a/b bindendes Protein 13 (LHCII Type III)


C05P.A12 437 41 Photosystem II 22 kD Protein (PsbS)

Spinacia oleracea sp|Q02060|

D10P.G07 541 85 Photosystem II 22 kD Protein (PsbS)


a) Contigs werden nur mit einer Nummer bezeichnet, während Singlets mit einer Kombination von Zahlen und Buchstaben bezeichnet werden.

b) sequenzierte Länge der ESTs (bp). c) Ähnlichkeitswert (score bits). d) Organismus, aus dem das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, isoliert wurde

Ergebnisse 61

Wie Tabelle 13 zu entnehmen ist, lassen sich 38 der Sequenzen zu 7 unabhängigen Contigs

gruppieren. Die von den Konsensussequenzen der Contigs 35, 72 , 88 und 178 abgeleiteten

Aminosäureteilsequenzen sind jeweils dem Lhcb1-Protein der Erbse mit der Datenbanknummer

P14278 am ähnlichsten. Das Alignment der Aminosäuresequenzen zeigt, daß die cDNA Klone

eines jeden Contigs aber für unterschiedliche Proteine kodieren (Abb. 11). Die genannten

Contigs repräsentieren somit nicht nur sich überlappende Teilsequenzen ein und desselben

Genes. Auf Nukleotidebene sind die Unterschiede zwischen den genannten Contigs noch

ausgeprägter als auf Aminosäureebene (Tab. 14 und 15).

Tab. 14: Unterschiede zwischen den Contigs 35, 72, 88 und 178 auf Nukleotidebene. Es wurden nur die die ersten 435 bp des translatierten Bereiches verglichen (kürzeste Sequenz: Contig 72, 435 bp). Angegeben wurde die Anzahl unterschiedlicher Basen, sowie der Prozentsatz an Identität zwischen den Sequenzen (ID).

Contig 35 72 88 72 41 von 435

(90.6 % ID)

88 67 von 435 (84.6 % ID)

67 von 435 (84.6 % ID)

178 71 von 435 (83.7 % ID)

69 von 435 (84.1 % ID)

81 von 435 (81.4 % ID)

Tab. 15 Unterschiede zwischen den Contigs 35, 72, 88 und 178 auf Aminosäureebene. Es wurden die ersten 145 Aminosäuren ausgehend vom Transitpeptid verglichen (kürzeste Sequenz: Contig 72, 145 AS). Angegeben wurde die Anzahl unterschiedlicherAS, sowie der Prozentsatz an Identität zwischen den Sequenzen (ID).

Contig 35 72 88 72 8 von 145

(94.5 % ID)

88 16 von 145 (89 % (ID)

16 von 145 (89 % ID)

178 24 von 145 (84 % ID)

21 von 145 (85.5 % ID)

23 von 145 84.1 % (ID)

Die vollständige cDNA-Sequenz der in Tabelle 13 aufgeführten EST-Klone wurde schließlich

durch mehrfaches Sequenzieren ermittelt. Von den Contigs war dafür jeweils der EST-Klon mit

dem längsten 5’-Ende ausgewählt worden. Die ermittelten Sequenzen wurden zur eindeutigen

Identifizierung einem erneuten Vergleich mit der Swiss-Prot.-Datenbank unterzogen.

Ergebnisse 62

Contig 35 MAAVTACASTSLAGQALGASSNALAAKVNVGEARVVMRKT-VKSTPTSIWYGEDRPKYLG Contig 72 ...A.....STF............................-................... Contig 88 ..TAT.....F...........E..K..............---GSAP............. Contig 178 -M.A..VSASTFV.....L.G...TQ...............SKAAAPA............ Transitpeptide Contig 35 PFSGATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAKNRELEVIHSRWAMLGALGCVFPELLS Contig 72 .....................................S....A................. Contig 88 ..........................................A................A Contig 178 ..........................................A................A Helix B

Contig 35 KNGVTFGEAVWFKAGSQIFAEGGLDYLGNSSLIHAQSILAIWGCQVVLMGAIEGYRVGGG Contig 72 ....S......S..............---------------------------------- Contig 88 ....K......S..................G.V.........AV.......V....QN.L Contig 178 ....K...........................V.........A..............A.. Helix C

Contig 35 PLGEGLVKIYPGGAFDPL Contig 72 ------------------ Contig 88 .G---------------- Contig 178 ...DVVDP....------

Abb. 11: Alignment der von den Nukleotidsequenzen (Konsensussequenzen) abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Contigs 35, 72, 88 und 178. Grau unterlegt sind die Bereiche der transmembranen Helices (KÜHLBRANDT et al., 1994). Bezogen auf die Sequenz des Contig 35 sind identische Aminosäuren durch Punkte dargestellt (...), die Bereiche der Transitpeptide sind unterstrichen.

3.2 Zusammensetzung der cab-Genfamilie von M. polymorpha

Insgesamt 12 Mitglieder der Lhc-Genfamilie von M. polymorpha konnten in der vorliegenden

Arbeit über die zwei beschriebenen methodischen Ansätze kloniert und identifiziert werden. Wie

der Tabelle 12 zu entnehmen ist, ließen sich 9 zu Lhcb-Genen homologe Sequenzen ermitteln.

Sechs dieser Sequenzen codieren für Proteine, die in Höheren Pflanzen den trimeren LHCII

bilden, drei für die in Höheren Pflanzen als Monomere vorliegenden CAB-Proteine Lhcb4,

Lhcb5 und Lhcb6. Eine für ein Lhca-Protein codierende Sequenz, eine Lhca4-Sequenz, war die

einzige Sequenz, die für ein Protein der peripheren Antenne des PSI ermittelt werden konnte.

Weiterhin wurden zwei Teilsequenzen für ein psbS-Gen und ein dem Sep1 ähnliches Gen

kloniert.

Die Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha scheint somit

generell der für Höhere Pflanzen bekannten vergleichbar. Die Übereinstimmung der reifen

Proteine für die die vollständige Sequenz ermittelt werden konnte mit den homologen Proteinen

Höherer Pflanzen beläuft sich zwischen 76 und 85 % (Tab. 16).

Ergebnisse 63

Tab. 16: Über EST-Sequenzierung und RT-PCR identifizierte Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha.

a) identische Aminosäuren bezogen auf das reife Protein b) Organismus, aus dem das CAB-Protein, zu dem die höchste Ähnlichkeit besteht, isoliert wurde.

Für sechs Lhc-Proteine von M. polymorpha wurden die Sequenzen für die reifen Proteine

vollständig bestimmt (Tab. 16). Abbildung 12 zeigt ein Alignment dieser Sequenzen. Besonders

gekennzeichnet sind in Analogie zu den homologen Proteinen Höherer Pflanzen die Bereiche der

mutmaßlichen transmembranen Helices und der Chlorophylliganden (abgeleitet vom Lhcb1 der

Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994)) sowie mögliche Bindungsstellen für Xanthophylle. Alle

Sequenzen enthalten die für die CAB-Genfamilie hoch konservierten Aminosäuren (GREEN &

KÜHLBRANDT 1995).

Die Ähnlichkeit der einzelnen Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha zueinander

gibt Abbildung 13 wieder. So sind sich die Lhcb2-, Lhcb3- und die verschiedenen als LHCII-

1.1-1.4 bezeichneten nicht eindeutig zuordbaren LHCII-Proteine untereinander ähnlicher als die

anderen CAB-Proteine.

Gen Protein Transitpeptid (AS)

reifes Protein (AS)

EST-Klon % IDa)

Organismusb)

Lhca4 Lhca4 31 (Teilsequenz)

200 C07/P.E02 80 Pinus sylvestris (S31863)

LHCII-1.1 Lhcb1 /2 ? 37 160 (Teilsequenz)

C01P.F03 Contig 35

90 Lycopersicon esculentum (S10857)


C06P.H11 Contig 72

88 Lycopersicon esculentum (P14278)


C09P.E07 Contig 88



C04P.G06 Contig 178

86 Nicotiana sylvestris (ABO12638)

Lhcb2 Lhcb2

39 226 C.o4P.B09 Contig 188

83 Pinus palustris (U51632)

Lhcb3 Lhcb3 40 223 C06P.H08 Contig 127


Lhcb4 Lhcb4 45 262 C.06P.F02 83 Vigna radiata (AF139466)

Lhcb5 Lhcb5 39 248 C.02P.D04 77 Zea mays (T02251)

Lhcb6 Lhcb6 nicht ermittelt 221 RT-PCR (3.1.1.1.1)

76 Spinacia oleracea (P36494)

PsbS PsbS nicht ermittelt 79 Teilsequenz

D10P.G07 92 Spinacia oleracea (P36491)

Sep 1? Sep1 ? nicht ermittelt 150 Teilsequenz

C05P.A12 33 Arabidopsis thaliana (AF134139)

Ergebnisse 64

Abb. 12: Alignment der für M. polymorpha bestimmten Aminosäuresequenzen für Lhca4, Lhcb2, Lhcb3,

Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 (jeweils vollständige Sequenz für das reife Protein). Im oberen Bereich sind für

CAB-Proteine konservierte Sequenzmotive dargestellt, die sich über die verschiedenen Farben den

Sequenzen zuordnen lassen. Grün hervorgehoben sind die mutmaßlichen Chlorophylliganden

(dunkelgrün: Chl a, hellgrün: Chl b).

consensus 2

1 3

Helix B Helix C Helix A Helix D

consensus 4 5

konservierte Sequenzmotive:

1: WYGPDRVL oder WFPG 3: VWFKAG 5: FDPLGL

2: GWDTA 4: YPGG 6: FVQA

Helix A consensus: ELWNGRFAMLGLVALAFTE

Helix B consensus: ELIHGRWAMLGALGXIXPE

Lhca4 KKGEWLPGL------PSPAYLNGSLAGDNGFDPLGLAED-------------------------------------------- Lhcb2 ITMRRTKTSTPESIWYGPDRPKFLGPF----SEATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSAD-------------------------------------------- Lhcb3 CRAKVSMDADYWYGPDRPKYLGPF----SAQTPSYLKGEFPGDYGWDTAGLSAD-------------------------------------------- Lhcb4 SAIKKAASAAKGAVKKAAPRPGSADRPLWFP-GAQAPAWLDGTLVGDYGFDPLGLDKPAEYLQYELDSLNQNLAKNEFGDVIGVRVDKKADLNPTPFQPYSE Lhcb5 KAAGKVAKTAPPSNAELAKWYGPDRRIYLPEGLLDKSDIPAYLTGEVPGDYGFDPFGLSKK-------------------------------------------- Lhcb6 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVDPEWLDGSLPGDYGFDPLGLGRD-------------------------------------------- a4 a5 a1 b6 b5 b5 Lhca4 PAALNWYVQAELQNGRWAMLGVAGMLVPEVLTKIGLI---NAPLWYDTGK---------------VEYFAPASTLFVIEFILFHYVEIRRWQDIKYPGSVSQD Lhcb2 PETFSKNRELEVIHSRWAMLGTLGMIFPELLAKNG --ITFGEPIWFKAGSQIFADGGLNYLGNENLIHAQSILAILGCQVVLMGLIEGYRVGGGPLGA----- Lhcb3 PESFAKNRALELIHGRWAMLGALGCILPEALVKYS-RVTLKEAVWFKAGSQIFTDGGLDYLGNPNLVHAQSILAIWAVQVVLMGAVEGYRQNGLPGIG----- Lhcb4 VFGLQRFRECELIHGRWCMLATLGALSVEAFTGVT ---------WQDAGKVELVEGSS-YLGQPLPF---SITTLIWIEVLVIGYIEFQRNAELD-------- Lhcb5 PADFDKYQAYELIHARWAMLGAAGFVLPEAFNKYG -ARCGPEAVWFKTGALLLEGNTLNYFGA--SIPVNLSLAAVIAEVILVGGAEYYRLSPLG-------- Lhcb6 PAALKWYREAEIIHGRWAMAAVLGIFVGQAWSGIP ---------WFEAGA------------DPSAVAPFSFGTLLGTQLLLMGWVEGKRWADYVNPNSQLVD Helix B Helix C a1 a2 a4 a3 b3 Lhca4 PF------FKSYKLPPGDVGYPGGI-FNPL -------------KFPANQEYKEKEIANGRLAMLAFLGMLVQSK-LTGAGPFENLLTHLADPWHTTIIQTLAN Lhcb2 ---------------DLDPIYPGGA-FDPLGLA---------NDPDTFAELKVKEIKNARLAMFSMFGFFVQAI-VTGKGPLDNLLSHIADPATNNAWAYATASPPGQ Lhcb3 ---------------EGGELYPGGKYFDPLGLA---------EDPETFAELKVKEIKNGRFAMFSMFGFFVQAI-VTGKGPLENLLDHLDNPVANNAWVYATNFRPGA Lhcb4 ---------------PEKRLYPGGKYFDPLGLA---------SDPEKKATLQLAEIKHARLAMVAFLGFAVQAAA-TGKGPLDNWATHLSDPLHTTIIDTFSK Lhcb5 --------------SGLDRLHPGGA-FDPLGLA---------KDPDQFALLKVKEIKNGRLAMVSMLGFFIQAY-VTGEGPVENLAAHLSDPFGNNLLTVIGGASERVPT Lhcb6 WATPWSRTAENFGNSTGLQGYPGGKFFDPL SLAGDVKNGKYTTDYDKLSRLQLAEIKHSRLAMLAMLIFYFEAG--QGLTPLGALGL Helix A Helix D

Ergebnisse 65

Abb. 13:Vergleichende Darstellung der relativen Übereinstimmung der für M. polymorpha ermittelten CAB-Proteine (erstellt mittels CLUSTALW).

3.2.1 Proteine des LHCI

Lhca4

Für das Antennensystem des PSI konnte lediglich ein EST-Klon mit einer für ein Lhca4-Protein

codierenden cDNA-Sequenz von 878 bp isoliert werden. Die von der Nukleotidsequenz

abgeleitete Aminosäuresequenz (Abb. 14) weist 80 % Übereinstimmung mit der Lhca4-Sequenz

des reifen Proteines von Pinus sylvestris auf.

Das als Lhca4 identifizierte cDNA-Fragment codiert für 200 Aminosäuren des reifen Proteins

sowie für 31 Aminosäuren des Transitpeptids, das nur unvollständig vorliegt.

0.1

Lhcb3

Lhcb5

Lhca4

Lhcb4

Lhcb6

Lhcb2 LHCII-1.4

LHCII-1.1

LHCII-1.2

LHCII-1.3

Ergebnisse 66

1 gtctcctctccgggaactagcagcactcgcttctccaggaatgtgcaggtcgctgccgctcccatc

A S S P G T S S T R F S R N V Q V A A A P I 22

67 tcttcccaatctttgaaggtcgagggcaagaagggagaatggctgcccggtctcccctcccccgct

S S Q S L K V E G K K G E W L P G L P S P A 44

133 taccttaacggaagcttggccggagacaacggattcgaccccctcggtcttgctgaggaccctgct

Y L N G S L A G D N G F D P L G L A E D P A 66

199 gccttgaactggtacgtccaggccgagctccagaacggacgatgggctatgctcggagttgcaggt

A L N W Y V Q A E L Q N G R W A M L G V A G 88

265 atgttggtgcccgaggttctgaccaagatcggtctgatcaacgcgcccctgtggtacgacaccggt

M L V P E V L T K I G L I N A P L W Y D T G 110

331 aaggtcgagtacttcgctcccgcctcgactcttttcgtgatcgagttcatcctcttccactacgtc

K V E Y F A P A S T L F V I E F I L F H Y V 132

397 gagatcagaaggtggcaagacatcaagtaccctggtagcgtgagccaggaccccttcttcaagagc

E I R R W Q D I K Y P G S V S Q D P F F K S 154

463 tacaagcttccccctggtgatgtcggttaccccggaggtatcttcaaccctctaaagttccccgcc

Y K L P P G D V G Y P G G I F N P L K F P A 176

529 aaccaggagtacaaggagaaggaaatcgccaacggacgattggccatgctcgctttcttgggtatg

N Q E Y K E K E I A N G R L A M L A F L G M 198

595 cttgtgcaatcgaaattgaccggagctggaccttttgagaatttgttgacccaccttgccgacccg

L V Q S K L T G A G P F E N L L T H L A D P 220

661 tggcacacaaccattatccagacactcgcgaactagattatctgcgtcttgtaaagatgggacctg

W H T T I I Q T L A N * 231

727 tccttgatgcggatttatgctagaatttgtcgacgcatccttggagcgttttgatgtattgtacca

793 tgtaactactttctcagaccaccgtgtatttcagcaaaacgacataatttttcttgggccgctgca

859 aaatctctaaaaaaaaaaaa

Abb. 14: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhca4 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen. Die Numerierung links bezieht sich auf die Basen, die rechts auf die Aminosäuren.

Abbildung 15 zeigt ein Alignment der Lhca4 Aminosäuresequenz des reifen Proteins von

M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Die bestehenden

Unterschiede liegen im wesentlichen in Bereichen, die nach der Konsensussequenz von

PICHERSKY & JANSSON (1996) zwischen Lhca4-Sequenzen verschiedener Species wenig

konserviert sind.

Ergebnisse 67

a4 a5 a1 M. polymorpha Lhca4 kKGeWLPGLpSPaYLdGSLpGDNGFDPLGLaEDPAaLNWyvQAELQNGRWAMLGVAGMLv A.. thaliana Lhca4 .........A..D..T..................EN.K.F.....V.............L Helix B b6 b5 b5 M. polymorpha Lhca4 PEVlTkIGliNAPlWYDTGKveYFAPASTLFVIEFILFHYVEiRRWQDIKyPGSVSQDPf A. thaliana Lhca4 -..F.......V.E...A..EQ...SS.......................N....N...I Helix C a1 a2 a4 a3 M. polymorpha Lhca4 FKsYKLPpgdvgYPGGIFNPLKFpAnqEYKEKEIANGRLAMLAFLGMlVQSKLTGAGPFe A. thaliana Lhca4 ..Q.S....E...........N.APT..A.................FV..HNV..K.... Helix A b3 M. polymorpha Lhca4 NLLTHLADPWHTTIiQTlan A. thaliana Lhca4 ...Q..S....N..V..FN- Helix D

Abb. 15: Alignment der Lhca4 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha und A. thaliana (reife Proteine). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D, grün die als mutmaßliche Chlorophylliganden identifizierten Aminosäuren des Lhcb1 der Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994) (hellgrün:Chl b , dunkelgrün: Chl a).Kleine Buchstaben in der Sequenz von M. polymorpha kennzeichnen Aminosäuren, die laut der Konsensussequenz für Lhca4 von PICHERSKY & JANSSON (1996) weniger hoch konserviert sind.

3.2.2 Proteine des LHCII

3.2.2.1 Lhcb1-3

In Höheren Pflanzen setzt sich der trimere Hauptlichtsammelkomplex LHCII aus den Proteinen

Lhcb1-Lhcb3 zusammen. Vier der für M. polymorpha ermittelten Lhc-Sequenzen (Abb. 16/17)

lassen sich weder dem Lhcb1 noch dem Lhcb2 eindeutig zuordnen, obwohl sie diesen Proteinen

am ähnlichsten sind. Die Unterschiede zwischen den vier genannten LHCII-Sequenzen von

M. polymorpha belaufen sich auf Aminosäureebene zwischen 6% und 16%. Im folgenden

werden diese Proteine als LHCII-1.1.-1.4 bezeichnet. Zwei weitere Lhc-Sequenzen von

M. polymorpha konnten hingegen eindeutig als Lhcb2- (EST-Klon C04P.B09 aus Contig 188)

bzw. Lhcb3-Gensequenz (EST-Klon C06P.H08 aus Contig 127) identifiziert werden.

Damit verfügt der Bryophyt M. polymorpha über zwei LHCII-Proteine, die bei Grünalgen noch

nicht zu finden sind, aber in Höheren Pflanzen.

Ergebnisse 68

LHCII-1.1 (Contig 35)

1 aacagtggtatcaacgcagagtgccattttggcgggaactgaatca 47 tttgttcagcatttctcttccatttcccagagcttcgcattcgaccccctgtgcaagtcggaagcc 113 atggccgccgtcaccgcttgcgcttccacctccctcgctggacaggccctcggagcctccagcaat

M A A V T A C A S T S L A G Q A L G A S S N 22

179 gccctcgccgccaaggtgaacgtcggcgaagcccgcgtcgtcatgcgtaagaccgtgaagagcacc A L A A K V N V G E A R V V M R K T V K S T 44

245 cccaccagcatctggtacggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggcGccacccca P T S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66

311 agctacttgaccggtgagttccccggggactacggttgggacactgctggactcTctgctgaccca S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88

377 gagaccttcgctaagaaccgtgaattggaggtgatccactcccgatgggctAtgttgggagctttg E T F A K N R E L E V I H S R W A M L G A L 110

443 ggatgcgtcttccccgagcttttgagcaagaacggagttaccttcggaGaggctgtgtggttcaag G C V F P E L L S K N G V T F G E A V W F K 132

509 gctggctcccagatcttcgctgagggaggtttggactacctcggcaactcgagcctcatccacgct A G S Q I F A E G G L D Y L G N S S L I H A 154

575 cagagcattctggccatctggggctgccaggtcgtcctcatgggggccatcgagggatacagagtg Q S I L A I W G C Q V V L M G A I E G Y R V 176

641 ggcggaggacctttgggtgagggacttgtcaacatctacCccggaggtgcattcgaccccctg G G G P L G E G L V K I Y P G G A F D P L 197


1 gagaagctctcactaaaccctcagttcaccgagaaagcttctctcccacctcaccaggacacg

65 atggccgccgctaccgcctgtgcctcctccaccttcgctggtcaggctctcggagcctccagcaat M A A A T A C A S S T F A G Q A L G A S S N 22

131 gccctcgctgccaaggtcaacgttggtgaggctcgcgtggtgatgcgcaagaccgtgaagagcact A L A A K V N V G E A R V V M R K T V K S T 44

197 cccaccagcatctggtacggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggcgccacccca P T S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66

263 agctacttgaccggtgaattccccggtgactacggctgggacaccgctggactctctgctgatcca S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88

329 gagaccttcgccaagaaccgtgaatcggaggtgatccacgcccgatgggccatgttgggagctttg E T F A K N R E S E V I H A R W A M L G A L 110

395 ggatgcgtcttccccgagcttttgagcaagaacggtgtctccttcggagaggcagtgtggtccaag G C V F P E L L S K N G V S F G E A V W S K 132

461 gccggatctcaaatcttcgctgagggagggttggactac A G S Q I F A E G G L D Y 145

Abb. 16 : Nukleotidsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für LHCII-1.1 und -1.2 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.

Ergebnisse 69


1 ga

3 acactacatcgttccaactgttgctgcacagaagtcagtttgcgaagtgttcttacgactatcagg

69 atggccacagcaacagcttgcgcatctaccttcttggctggacaggctctcggagcctccagcaat

M A T A T A C A S T F L A G Q A L G A S S N 22

135 gagctcgccaagaaagtcaacgtcggtgaagcccgcgttgttatgcgcaaaggatctgccccatcc E L A K K V N V G E A R V V M R K G S A P S 44

201 agcatctggtatggtgaggaccgacccaagtacttgggcccattctccggtgccaccccaagctac S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P S Y 66

267 ttgaccggtgaattccccggtgactacggttgggacaccgccggactctctgccgatcccgagacc L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P E T 88

333 ttcgccaagaaccgtgaattggaggtgatccacgctcgatgggccatgttgggagctttgggatgt F A K N R E L E V I H A R W A M L G A L G C 110

399 gtgacccccgagctgctggccaagaacggcgtcaagttcggcgaggcggtgtggttcaaggccgga V T P E L L A K N G V K F G E A V W F K A G 132

465 tcgcagatcttctccgagggaggcctggactacctcggcaattctggccttgtccacgcccagagc S Q I F S E G G L D Y L G N S G L V H A Q S 154

531 atcctggccatctgggcctgccaggtcgtgctcatgggagccgttgagggataccgccagaacggt I L A I W A V Q V V L M G A V E G Y R Q N G 176

597 ctccccgga

L P G


1 gaaccattcctctcatactcgaacacttcacctcctctcaccgccttctagtcagc

57 atggccgccaccgccgtctccgcatccaccttcgttggacaggctttgggcctgtccggcaatgcc M A A T A V S A S T F V G Q A L G L S G N A 22

123 ctcacccagaaggtgAatgttggtgaggctcgcgttgtcatgcgcaagacctcgaaggccgccgcc L T Q K V N V G E A R V V M R K T S K A A A 44

189 cccgcctccatctggtacggtgagGaccgacccaagtacttgggcccattctccggagctaccccc P A S I W Y G E D R P K Y L G P F S G A T P 66

255 tcgtacctgactggtgagttccccggtgactacGgatgggacactgcaggactctctgctgacccc S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A D P 88

321 gagaccttcgccaagaaccgtgaattggaggtgatccacgctcgatgggccatgttgggagctctg E T F A K N R E L E V I H A R W A M L G A L 110

387 ggatgcgtcttccccgagttgttggccaagaacggtgtgaagttcggagaggcagtgtggttcaag G C V F P E L L A K N G V K F G E A V W F K 132

453 gctggatcacagatcttcgctgagggaggtttggactacctcggtaactcgagcctcgtccacgcc A G S Q I F A E G G L D Y L G N S S L V H A 154

519 cagagcattctggccatctgggcttgtcaggttgtgctcatgggagccatcgagggatacagagta Q S I L A I W A C Q V V L M G A I E G Y R V 176

585 gcaggaggtcctttgggtgatgtcgtcgaccccatctaccccgga A G G P L G D V V D P I Y P G 191

Abb. 17 : Nukleotidsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für LHCII-1.3 und -1.4 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.

Ergebnisse 70

Lhcb2 (Contig 188)

1 gacacatctctcagcttgcgaagttctcagactctgagatttgtcatccacgaagaccgtcacc

65 atggcagcagccaccgcgtccgccatcagcagcaccaccttcgccggccagagcgtgctcaaggga M A A A T A S A I S S T T F A G Q S V L K G 22

130 cagagcgagctctccaagaaggtcggcaatgtcgacgccaggatcaccatgaggaggaccaagacc Q S E L S K K V G N V D A R I T M R R T K T 44

196 agcaccccagagagcatctggtacggtcccgacagacccaagttcttgggcccgttctctgaggcg S T P E S I W Y G P D R P K F L G P F S E A 66

262 accccatcgtacctgaccggagagttcccgggagactacgggtgggacaccgcggggctctcggct T P S Y L T G E F P G D Y G W D T A G L S A 88

328 gaccccgagaccttctccaagaaccgggagctcgaggtgatccactcgcgctgggcaatgctcgga D P E T F S K N R E L E V I H S R W A M L G 110

394 acattgggaatgatcttccccgagcttctggccaagaacggcatcaccttcggcgagcccatctgg T L G M I F P E L L A K N G I T F G E P I W 132

460 ttcaaggccgggtcgcagatcttcgccgatggcggtctgaactacctcggcaacgagaacctgatc F K A G S Q I F A D G G L N Y L G N E N L I 154

526 cacgcgcagagcattctggccatcctcggatgccaggttgttctcatgggcctgatcgagggttac H A Q S I L A I L G C Q V V L M G L I E G Y 176

592 cgagtgggaggcggccctctgggcgctgacctcgacccgatctaccccggaggcgctttcgacccc R V G G G P L G A D L D P I Y P G G A F D P 198

658 ttgggtcttgccaacgaccccgacaccttcgccgagctcaaggtgaaggagatcaagaacgcccgt L G L A N D P D T F A E L K V K E I K N A R 220

724 ctggccatgtttccxtccggattcttcgtccaggccatcgtcaccggcaagggacctctggacaac L A M F S F G F F V Q A I V T G K G P L D N 231

790 ttgctgagccacatcgccgaccccgccaccaacaatgcctgggcctacgccaccgcctcacccccc L L S H I A D P A T N N A W A Y A T A S P P 253

856 ggccagtaagcgctggacgctctgagggatttcgttcagtggatggatatgccgccggagtctcga G Q * 255

922 tctatcgatcgctggcgaggcaatggaacggaattggagcgagcgcggtcgtgtactatgcgaacc

988 ttgattgtacagttgcaattttgcctcccacttgatctcgtttagaatgtaattgtagagcacgat

1054 cactgggatttactgatggactcgtcgatgtatacccatatataaacgaaccatttccaaaaaaaa

1120 aaaaaaa

Abb. 18: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb2 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.

Ergebnisse 71

Lhcb3

1 tagagatttccattgctgtcagtcgagtgttgtgcagtcggtcttccatcagcagcc

58 atggccgccacagcactcaccaagcaggtcgtgagccgatccacattcttgggtgctaccgctgca

124 cccaaggatgctctcagggagcaattgccagtatgcagggccaaggtctcaatggacgccgactac P K D A L R E Q L P V C R A K V S M D A D Y 44

190 tggtatggcccggacagacccaagtacttgggcccgttctcagctcagaccccctcttacctgaag W Y G P D R P K Y L G P F S A Q T P S Y L K 66

256 ggagagttccccggtgactacggatgggataccgctgggttgtctgccgaccccgaatcgttcgcc G E F P G D Y G W D T A G L S A D P E S F A 88

322 aagaaccgcgctttggagctgatccacggaaggtgggcaatgctcggagctttgggatgcatcttg K N R A L E L I H G R W A M L G A L G C I L 110

388 cccgaggctttggtgaagtacagccgagtgacgctgaaggaggcagtgtggttcaaggccgggtcc P E A L V K Y S R V T L K E A V W F K A G S 132

454 cagatcttcaccgacggtggtctcgactacctcggcaaccccaaccttgtgcacgcgcagagcatt Q I F T D G G L D Y L G N P N L V H A Q S I 154

520 ttggccatctgggccgtgcaggtcgtgctcatgggagccgttgagggataccgccagaacggtctc L A I W A V Q V V L M G A V E G Y R Q N G L 176

586 cccggaatcggagagggaggcgagctttaccccggaggcaagtacttcgacccactgggtcttgct P G I G E G G E L Y P G G K Y F D P L G L A 198

652 gaggaccccgagaccttcgccgagctgaaggtgaaggagatcaagaacggccggtttgccatgttt E D P E T F A E L K V K E I K N G R F A M F 220

718 tccatgttcggattctttgtccaggccatcgtcaccggcaagggcccccttgagaaccttttggac S M F G F F V Q A I V T G K G P L E N L L D 231

784 caccttgacaacccggttgccaacaacgcctgggcttaacgcaaccaactttcgtcccggagctta H L D N P V A N N A W V Y A T N F R P G A 252

850 aattgtgaaggaaaagaataat

Abb. 19 : Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb3 aus M. polymorpha. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert. Die Bereiche der transmembranen Helices A-D (nach KÜHLBRANDT et al. 1994) sind grau unterlegt, Aminosäuren des Transitpeptides wurden unterstrichen.

Für Lhcb2 und Lhcb3 konnte der vollständig codierende cDNA-Bereich ermittelt werden

(Abb. 18/19). Die 1127 bp lange cDNA-Sequenz des EST-Klones C04P.B09 codiert für 226

Aminosäuren eines reifen Lhcb2-Proteins sowie für 39 Aminosäuren des Transitpeptids, das als

Lhcb3 identifizierte 871bp lange cDNA-Fragment für 223 Aminosäuren des reifen Proteins und

40 Aminosäuren des Transitpeptids. Damit sind die reifen Proteine von M. polymorpha etwa so

lang wie bekannte Lhcb2- bzw. Lhcb3-Proteine Höherer Pflanzen (vergleiche Tab. 4, 1.3.1.3).

Der Vergleich der Aminosäuresequenzen von Lhcb2 und Lhcb3 aus M. polymorpha mit den

entsprechenden Proteinsequenzen aus A. thaliana zeigt den hohen Grad an Homologie zwischen

den Sequenzen. Die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen beläuzft sich auf 83 % (Lhcb2)

bzw. 86 % (Lhcb3). Alle Pigmentbindungsstellen sind in den Sequenzen von M. polymorpha

konserviert. Auch das für die Trimerisierung als essentiell betrachtete Sequenzmotif WYGPDR

(HOBE et al. 1995) ist vorhanden (Abb.20).

Ergebnisse 72

Abb. 20: : Alignment der Lhcb2 und Lhcb3 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha und A. thaliana (reife Proteine). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D, grün die als mutmaßliche Chlorophylliganden identifizierten Aminosäuren des Lhcb1 der Erbse (KÜHLBRANDT et al., 1994) (hellgrün: Chl b , dunkelgrün: Chl a). Im oberen Bereich der Abbildung sind für diese CAB-Proteine konservierte Sequenzmotive (die Nummerierung der farblichen Bereiche ergibt die Zuordnung zu einem konservierten Motiv).

1

2 3 5 4


Helix B consensus Lhcb2: PETFArNRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNG Helix B consensus Lhcb3: PEAFAkNRALEVIHGRWAMLGALGCifPEVLqKWV Helix C consensus Lhcb2: SILAIWAcQVVLMGfvEGYRV Helix C consensus Lhcb3: SILAVLGFQvvLMGLVEGFRI Helix A consensus Lhcb2: PeafAELKVKEiKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix A consensus Lhcb3: PvTFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix D consensus Lhcb2: PIENLsDhia Helix D consensus Lhcb3: PLENLlDHLD 1: Trimerisierungsmotiv: WYGPDR 2: Luteinbindungsstelle (L2): GDYGWD 3: Luteinbindungsstelle (L2): WFKAG 4: Luteinbindungsstelle (L1): FDPLGL 5: Trimerisierung: W

M. polymorpha Lhcb2 RRTKTSTPESIWYGPDRPKFLGPFSEATPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFSKNREL A. thaliana Lhcb2.1 ...VK...Q..........Y......N........Y..................A..... M. polymorpha Lhcb3 -------DADYWYGPDRPKYLGPFSAQTPSYLKGEFPGDYGWDTAGLSADPESFAKNRAL A. thaliana Lhcb3 -------GN.L......V.......V......T...................A....... Helix B a4 a5 a1 M. polymorpha Lhcb2 EVIHSRWAMLGTLGMIFPELLAKNG-ITFGEPIWFKAGSQIFADGGLNYLGNENLIHAQS A. thaliana Lhcb2.1 ...........A..CT...I.S...-VK...AV.........SE...D....P....... M. polymorpha Lhcb3 ELIHGRWAMLGALGCILPEALVKYSRVTLKEAVWFKAGSQIFTDGGLDYLGNPNLVHAQS A. thaliana Lhcb3 .V..........F...T..V.Q.WV..DF..P..........SE................ b6 b5 b5 a1 M. polymorpha Lhcb2 ILAILGCQVVLMGLIEGYRVGGGP-LGADLDPIYPGG-AFDPLGLANDPDTFAELKVKEI A. thaliana Lhcb2.1 ....WAV......F..........-.-EG...L....-.....N..E..EA.S......L M. polymorpha Lhcb3 ILAIWAVQVVLMGAVEGYRQNGLPGIGEGGE-LYPGGKYFDPLGLAEDPETFAELKVKEI A. thaliana Lhcb3 ...VLGF..I...L...F.I...D.V...ND-.....Q........D..V.......... Helix C Helix A a2 a4 a3 b3 M. polymorpha Lhcb2 KNARLAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLDNLLSHIADPATNNAWAYATASPPGQ A. thaliana Lhcb2.1 ..G.....................IE..FD.L...VA....S...NFV..K M. polymorpha Lhcb3 KNGRFAMFSMFGFFVQAIVTGKGPLENLLDHLDNPVANNAWVYATNFRPGA A. thaliana Lhcb3 ....L.....................................F..K.A... Helix D

Ergebnisse 73

Lhcb1 und Lhcb2 unterscheiden sich bei Höheren Pflanzen in weniger als 15% der Aminosäuren

der reifen Proteine, wobei maximal 14 Aminosäurepositionen zwischen den beiden Proteintypen

unterschiedlich sein können (PICHERSKY & JANSSON 1996). Abbildung 21 zeigt ein Alignment

der als LHCII-1.1-1.4 bezeichneten Proteine von M. polymorpha mit den von PICHERSKY &

JANSSON (1996) ermittelten Konsensussequenzen für Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau). Sowohl

zu Lhcb1 als Lhcb2 identische Aminosäuren sind durch Punkte wiedergegeben (...). Es wird

deutlich, daß ein sehr hoher Grad an Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Sequenzen

besteht. Für Lhcb1 charakteristische Aminosäuren in den Sequenzen von M. polymorpha sind

orange hervorgehoben, für Lhcb2 charakteristische Aminosäuren blau.

Die vier LHCII-Sequenzen LHCII-1.1-1.4 von M. polymorpha weisen sowohl für Lhcb1 als

auch Lhcb2 charakteristische Aminosäuren auf (Abb.21), was sie weder als das eine noch das

andere Protein identifizieren läßt. Sie scheinen vielmehr eine „Mischung“ zwischen diesen

Proteinen darzustellen. Dieser Befund ist aus Sicht der phylogenetischen Entwicklung der

verschiedenen cab-Gene von besonderem Interesse.

TERAMOTO und Mitarbeiter (2001) identifizierten für die Grünalge C. reinhardtii vier

verschiedene LHCII-Proteine, die sie als LhcII-1.1-LhcII-1.6 bezeichnen.

Obwohl diese Proteine ebenfalls den Proteinen des trimeren LHCIIs Höherer Pflanzen (Lhcb1-

Lhcb3) am ähnlichsten sind, lassen sie sich nicht eindeutig als Lhcb1, Lhcb2 oder Lhcb3

identifizieren. Die LHCII-Sequenzen LHCII-1.1-1.4 von M. polymorpha wurden mit den

genannten LHCII-Sequenzen von C. reinhardtii verglichen. Die Sequenzen von C. reinhardtii

unterscheiden sich zu den LHCII-1.1-1.4 Sequenzen von M. polymorpha in dem gleichen

Ausmaß, wie zu den Lhcb1 bzw Lhcb2 Sequenzen von A. thaliana. Dies zeigt die vergleichende

Darstellung der relativen Übereinstimmung der für M. polymorpha ermittelten LHCII-Sequenzen

mit den LHCII-Sequenzen von A. thaliana bzw. C. reinhardtii (Abb. 22). Zum anderen wird die

deutliche Ähnlichkeit der als Lhcb3 bzw Lhcb2 identifizierten Sequenzen von M. polymorpha

mit den Sequenzen der Lhcb2- bzw. Lhcb3-Proteine aus A. thaliana ersichtlich.

KILIAN und Mitarbeiter (1998) unterschieden mehrere Proteine des trimeren LHCIIs von

M. polymorpha durch Isoelektrische Fokussierung (IEF), wobei das Protein mit dem niedrigsten

Molekulargewicht (22 kDa) im Unterschied zu den Proteinen des trimeren LHCIIs bei

Samenpflanzen den basischeren pI aufweist. Der Anteil der sauren und basischen Aminosäuren

wurde aus den hier ermittelten Sequenzen bestimmt (Tab. 17).

Ergebnisse 74

Tab. 17: Anteil der basischen (K, N, Q, R) und sauren ( E, D) Aminosäuren in den ermittelten Sequenzen LHCII-1.1-1.4, Lhcb2 und Lhcb3 von M. polymorpha sowie der entsprechenden Sequenzabschnitte der Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996).

Protein saure Aminosäuren basische Aminosäuren

Lhcb2 23 30

Lhcb3 24 31

Lhcb2 (Konsensussequenz) 26 32

Lhcb3 (Konsensussequenz) 24 32

Das Verhältnis basischer zu sauren Aminosäuren ist für das Lhcb3 dem der Konsensussequenz

vergleichbar., das des Lhcb2 ist hingegen höher als das der Konsensussequenz. Dies läßt auf

einen basischeren pI des Lhcb2 Proteines aus M. polymorpha schließen. Aus Abbildung 21 wird

für die LHCII-1.1-1.4 Sequenzen von M. polymorpha ersichtlich, daß die Unterschiede zu den

Konsensussequenzen von Lhcb1 und Lhcb2 sich nic ht in einem veränderten Anteil an basischen

zu sauren Aminosäuren widerspiegelt.

LHCII-1.1 RKT-V.STP---T.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.2 RKT-V.STP---T.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.3 ---RKGSAP---S.I...E..P.......GAT...........................K LHCII-1.4 RKTSKAAAP---A.I...E..P.......GAT...........................K Lhcb1 RKtatkakpvssgSPWyGpDRVkYLGPFSGEsPSYLTGEFpgDYGWDTAgLSADPETFAk Lhcb2 -RRTvk---SaPqSIWYGeDRPKyLGPFSEqTPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAr LHCII-1.1 ....... S..............L.SK...T..............A.........SS.I. LHCII-1.2 ...S....A..............L.SK...S......S.......A......-------- LHCII-1.3 ........A...........T..L.AK........................... SG... LHCII-1.4 ........A..............L.AK................. A.........SS... Lhcb1 NReLEVIHcRWaMLGALGCVFPELLaRNGvKFGEAvWfKaGsQIFseGGLdYLGnPslvH Lhcb2 NRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNGVkFGEAVWFKAGsQIFseGGLDYLGNPNLvH Helix B LHCII-1.1 ....... G...V...AI....VG......GLVKI....A....---------------- LHCII-1.2 ------------------------------------------------------------ LHCII-1.3 ........ VQ.V...A.....QN.L.G-------------------------------- LHCII-1.4 ............V...AI....VA.....DVVDPIYPG---------------------- Lhcb1 AQSiLAIWAcQViLMGAvEGYRiAGgPLGevtDPlYPGGsFDPLgLAddpeafaELkVKE Lhcb2 AQSILAIWAcQVVLMGFvEGYRVGGGPLGEGLDkiYPGGAFDPLGLAdDPeafAELKVKE Helix C Helix A LHCII-1.1 ---------------------------------------------------- LHCII-1.2 ---------------------------------------------------- LHCII-1.3 ---------------------------------------------------- LHCII-1.4 ---------------------------------------------------- Lhcb1 iKnGRLAMfSMFGFFvQAiVTGKGPlenLADHlaDPVNNNAwAfATNFVPgK Lhcb2 iKNGRLAMFSMFGFFVQAIVtGKGPIENLsDhiaDPVANNAWAyATNFVPGK Helix D

Abb. 21: Alignment der LHCII-1.1-1.4 Aminosäuresequenzen von M. polymorpha mit den Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau) Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices A-D. Zu beiden Konsensussequenzen identische Aminosäuren sind durch Punkte (...) gekennzeichnet, für Lhcb1 bzw. Lhcb2 typische Aminosäuren mit der entsprechenden Farbe der Konsensussequenz.

Ergebnisse 75

Abb. 22: Vergleichende Darstellung der relativen Übereinstimmung verschiedener LHCII-Sequenzen von M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii aufgrund der Sequenzähnlihckeiten (Alignment und Gruppierung mittels CLUSTALW (EMBL, European Bioinformatic Institue).

0.1

C. reinhardtii LHCII-4



C. reinhardtii LHCII1.3

C. reinhardtii LHCII1.1

C.reinhardtii LHCII 1.2

A. thaliana Lhcb3

M. polymorpha Lhcb3

M. polymorpha LHCII-1.3




M. polymorpha Lhcb2

A. thaliana Lhcb2.1

A. thaliana Lhcb2.4

A. thaliana Lhcb1.4

A. thaliana Lhcb1.1

A. thaliana Lhcb1.5

Ergebnisse 76

3.2.2.2 Lhcb4-Lhcb6

Von 1838 analysierten EST-Sequenzen von M. polymorpha wiesen zwei jeweils eine besonders

hohe Homologie zu den CAB-Proteinen Lhcb4 bzw. Lhcb5 auf. Eine für ein Lhcb6-Protein

codierende Sequenz fand sich nicht unter den EST-Sequenzen. Eine solche konnte jedoch mittels

RT-PCR amplifiziert werden (3.1.1.1.1).

1 gtc 4 atttcatcgggttgaaatcggggcgtttcttcgtggagctgcagtagtgcggtagacagtaagtgg

70 tcgaacattcagtccgcagcctctcaaacacagaccgcagcagtgcagccatcagcagcaggagca

136 atggcgaccgccatcgcagcgacgtcgttggccgcatcttccttctgtggatcatgccgcgaggtt

M A T A I A A T S L A A S S F C G S C R E V 22

202 gggtccgtcgagagcgtcgcgtatagcagggtattcggagcacccagcaatgccgccaggattgtt G S V E S V A Y S R V F G A P S N A A R I V 44

268 tgccgatcggccataaagaaggccgcatctgctgccaagggagctgtgaagaaggccgcacccaga C R S A I K K A A S A A K G A V K K A A P R 66

334 cccggaagtgcggaccgcccattgtggtttcccggtgcacaggctcccgcgtggttggacggtacg P G S A D R P L W F P G A Q A P A W L D G T 88

400 cttgttggagattacggatttgatcctcttggtttggacaagcccgcagagtacttgcaatatgaa L V G D Y G F D P L G L D K P A E Y L Q Y E 110

466 ttggactcacttaaccagaacttggccaagaatgagtttggtgatgttattggagtccgcgtggac L D S L N Q N L A K N E F G D V I G V R V D 132

532 aagaaggcagacttgaaccccacaccattccagccgtacagtgaggtatttgggcttcaaaggttc K K A D L N P T P F Q P Y S E V F G L Q R F 154

598 agagaatgtgagctcatccacggaagatggtgtatgctcgccactcttggtgcgctctcagtcgaa R E C E L I H G R W C M L A T L G A L S V E 176

664 gcattcactggcgttacctggcaagatgccggaaaggttgagctcgtcgaagggtcatcttacctg A F T G V T W Q D A G K V E L V E G S S Y L 198

730 ggacntccactgccnttctcaattaccaccctgatctggatcgaggtcctggtcattggatacatc G Q P L P F S I T T L I W I E V L V I G Y I 220

796 gagttccagcgtaacgctgagctggaccctgagaagcgtctgtacccaggagggaagtacttcgac E F Q R N A E L D P E K R L Y P G G K Y F D 231

862 ccgttgggactcgcctcagaccccgagaagaaggctaccctgcagctggctctggctgaaatcaag P L G L A S D P E K K A T L Q L A L A E I K 253

928 cacgcccgtcttgctatggttgcgttcttgggattcgctgttcaagccgctgctactggaaagggc H A R L A M V A F L G F A V Q A A A T G K G 275

994 cccctcgacaactgggcgactcacttgagcgaccctctccacacgaccatcatcgacaccttctct P L D N W A T H L S D P L H T T I I D T F S 297

1060 aagtgatgtgacata gatgaagctgcgatatgtaatttctagttggtttccccgagagctgtaac K 298

1126 aaatgtaacatgttggatcgttatttcaagtcaatgtagatattcaacattttatccgcgcactgg

1192 aatggtagctcttgctatcatttctagctttgtggcttggccttgacttgtatcccgccttagcac

1258 gtattattcaacctcgttgcagtccttcgtgtgcagtgtgtcgcaccctggaaataatttgtcgat

1324 ttctccagttaatgataaatctatcttccttttcgtgagggtattttccaaaaaaaaaaaaaaaaa 1390 aaaaaaaaaa

Abb. 23: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb4 aus M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices A-D sind grau unterlegt, das Transitpeptid ist unterstrichen. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.

Ergebnisse 77

Die 1398 bp lange Lhcb4 cDNA-Sequenz (EST-Klon C06P.F02) besitzt ein offenes Leseraster

von 927 bp und codiert für 226 Aminosäuren des reifen Proteins sowie für 39 Aminosäuren des

Transitpeptids (Abb. 23). Damit konnte die Sequenz des reifen Proteines vollständig bestimmt

werden.

Auch das als Lhcb5 identifizierte 926 bp lange cDNA-Insert des EST-Klones C02P.D04 codiert

für die vollständige Sequenz des reifen Proteins (Abb. 24). Die Länge der reifen Proteine von

M. polynmorpha entspricht somit der für diese Proteine aus Höheren Pflanzen bekannten

(vergleiche Tabelle 4, 1.3.1.3). Die Aminosäuresequenzen der Lhcb6-Proteine von

M. polymorpha sind jedoch am N-Terminus um mindestens sieben Aminosäuren länger (siehe

3.1.1.1.1).

1 aggtcgagggcgagagcttcgcgaagctttctgtagagtgaggagaa

48 atggcggcaatggctggaaccgcagccgtgctcggaaggtccgagatcctgggacagggcctcgtc M A A M A G T A A V L G R S E I L G Q G L V 22

114 gcctcgtcctccacctccgtcaggacctcgtccccgttccaggtcgtggccctcttcaacaagaag A S S S T S V R T S S P F Q V V A L F N K K 44

180 ggtgctgctcccaagaaggccgctggcaaggtcgccaagaccgcaccaccctccaacgccgagttg G A A P K K A A G K V A K T A P P S N A E L 66

246 gccaagtggtatggccctgacaggagaatctacttgcccgagggtcttttggacaagtctgatatc A K W Y G P D R R I Y L P E G L L D K S D I 88

312 cccgcgtacttgacgggtgaggttcccggagattacggattcgaccccttcggtctctccaagaag P A Y L T G E V P G D Y G F D P F G L S K K 110

378 cccgccgacttcgacaagtaccaggcctacgagctcatccacgcccgttgggccatgctcggagca P A D F D K Y Q A Y E L I H A R W A M L G A 132

444 gctggattcgtcctccccgaggccttcaacaagtacggtgcccgttgcgggcccgaggctgtgtgg A G F V L P E A F N K Y G A R C G P N L E A 154

510 ttcaagaccggagctcttctgctcgaaggaaacaccctcaattacttcggtgccagcattccagtg V W F K T G A L L L E G N T L N Y F G A S I 176

576 aaccttaacagcctggccgctgtcatcgccgaaggtatcctcgtcggaggtgccgagtactaccgg P V N S L A A V I A E V I L V G G A E Y Y R 198

642 cttagccccctgggatctggacttgaccgtctgcaccccgggggagctttcgaccccctgggactt L S P L G S G L D R L H P G G A F D P L G L 220

708 gctaaggaccctgatcagttcgctctgctgaaggtcaaggagatcaagaacggaaggctggctatg A K D P D Q F A L L K V K E I K N G R L A M 242

774 gtctctatgctgggattcttcatccaggcttacgtcaccggagagggacccgtcgagaacctggct V S M L G F F I Q A Y V T G E G P V E N L A 264

840 gctcaccttagcgaccctttcggaaacaacttgctgactgtcatcggaggcgcttctgagcgtgtc A H L S D P F G N N L L T V I G G A S E R V 286

906 cccacctaagctagtctggta P T 288

Abb. 24: Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für Lhcb5 von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices (A-D) sind grau unterlegt. Der Bereich des Transitpeptids wurde unterstrichen. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.

Ergebnisse 78

Lhcb4

Die größten Unterschiede zwischen den Primärsequenzen der Lhcb4-Proteine von

M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii bestehen in den N-terminalen Bereichen

(Abb. 25). Wie das Lhcb4 Höherer Pflanzen besitzt auch das für M. polymorpha ermittelte

Lhcb4-Protein im Vergleich zu anderen Lhc-Proteinen ein 40 Aminosäure langes Insert vor der

ersten transmembranen Helix.

Zwei der von KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994) als Chlorophylliganden für das Lhcb1 der

Erbse identifizierten Aminosäuren sind in Lhcb4-Proteinen Höherer Pflanzen nicht konserviert

(SANDONA et al. 1998). So ist der Ligand für das Chl b6, das Glutamin in Helix C, durch

Glutamat ersetzt und der Ligand für das Chl a2, ein Asparagin in Helix A durch, Histidin. Wie

aus Abbildung. 25 zu ersehen ist, findet sich auch bei dem Lhcb4 von M. polymorpha in Helix C

anstelle des Glutamin ein Glutamat und in Helix A anstelle des Asparagin ein Histidin.

Weiterhin sind die für Lhcb4-Proteine Höherer Pflanzen charakteristischen sauren Aminosäuren

im Loop zwischen der Helix B und C auch bei M. polymorpha hoch konserviert.

Abgesehen von seiner Funktion bei der Absorption und Weiterleitung von Anregungsenergie

wird dem Lhcb4 insbesonders eine Rolle beim nicht photochemischen Quenching (NPQ)

zugeschrieben (CROFTS & YERKES 1994, PERSARESI et al. 1997, BASSI et al. 1999, NIYOGI 1999).

Das Glutamat in Helix C sowie drei für Lhcb4-Proteine charakteristische saure Aminosäuren im

Loop zwischen der Helix B und C sollen hierfür von funktioneller Bedeutung sein

(JEGERSCHÖLD et al. 2000). Diese Aminosäuren sollen die Bindung von Ca2+-Ionen coordinieren.

Bei niedrigem pH soll das NPQ dadurch getriggert werden, daß sich die Coordination der Ca2+-

Ionen verändert (4.1.3).

Da die drei sauren Aminosäuren im Loop zwischen Helix B und C (Abb. 23) ebenfalls bei

M. polymorpha hoch konserviert sind, läßt sich vermuten, daß auch das Lhcb4 von

M. polymorpha eine Funktion beim NPQ übernehmen kann.

Bei Mais kommt es in vivo unter Licht- und Kältestress zu einer reversiblen Phosphorylierung

des Lhcb4 (BERGANTINO et al. 1995). Phosphoryliert wird hierbei das Threonin-83 (TESTI et al.

1996), das in einer für Lhcb4 charakteristischen Stroma-exponierten Schleife vor der ersten

transmembranen Helix liegt (PICHERSKY & JANSSON 1996). Die von der Nukleotidsequenz

abgeleitete Aminosäuresequenz des Lhcb4 von M. polymorpha weist anstelle des Threonin-83

ein Valin auf (Abb 25). Der Befund von KILIAN und Mitarbeitern (1998), die dies anhand der

von ihnen ermittelten Aminosäureteilsequenz für Lhcb4 zeigen konnten, wurde somit bestätigt.

Ergebnisse 79

Abb. 25: Alignment der Aminosäuresequenzen für die Lhcb4-Proteine aus M. polymorpha, A. thaliana und C. reinhardtii. Grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices, grün: Chlorophyllliganden des Lhcb1 der Erbse (hellgrün: Chl b, dunkelgrün Chl a), orange: konservierte saure Aminosäuren im Loop zwischen den Helices C und A, ?: Phosphorylierungsstelle in Mais.

1 2 3


Helix B consensus Lhcb4: PETFArNRELEvIHcRWAMLGALGCvFPEiLsKNG Helix C consensus Lhcb4: SILAIWAcQVVLMGfvEGYRV Helix A consensus Lhcb4: PeafAELKVKEiKNGRLAMFSMFGFFVQAI Helix D consensus Lhcb4: PIENLsDhia 1: Luteinbindungsstelle (L2): GDYGWD 2: Luteinbindungsstelle (L2): WQDAG 3: Luteinbindungsstelle (L1): FDPLGL

M. polymorpha Lhcb4 -RSAIKKAASAAKGAVKKAAPRPGSADRPLWFPGAQAPAWLDGTLVGDYGFDPLGLDKPA A. thaliana Lhcb4.1 --VFGFGKKK..P---..S.KKTVTT.........IS.D....S.........F..G... A. thaliana Lhcb4.3 RFGFSFGKKKP.PPP-..SRQVQDDG.........NP.E....SMI..R....F..G... C. reinhardtii Lhcb4 --------------TRSGGVGYRKYQGDA..LPNTTR.E....S.P..R.......S..S * a4 a5 a1 M. polymorpha Lhcb4 EYLQYELDSLNQNLAKNEFGDVIGVRVDKKADLNP-TPFQPYSEVFGLQRFRECELIHGR A. thaliana Lhcb4.1 ....FDI...D......LA.....TRT-EA..AKS-...........I............ A. thaliana Lhcb4.3 .....DF.G.D......VA..I..IIQ-ESSEIKP-......T....I............ C. reinhardtii Lhcb4 .FVVIGV.END..A...NK.S.EAIVQATPDEVSSENRLA........A........... ? Helix B Ca2+ b6 b5 M. polymorpha Lhcb4 WCMLATLGALSVEAFTGVTWQDAGKVELVEGSSYLGQPLPFSITTLIWIEVLVIGYIEFQ A. thaliana Lhcb4.1 .A............L..............D.............S................ A. thaliana Lhcb4.3 .A..G....IA...L..IA.......................L..........V...... C. reinhardtii Lhcb4 .A...C....VA..T...S.VE......-D.A..A.LS......Q......I.V.GA..Y Helix C b5 a1 a2 a4 a3 M. polymorpha Lhcb4 RNAELDPEKRLYPGGKYFDPLGLAS-DPEKKATLQLAEIKHARLAMVAFLGFAVQAAATG A. thaliana Lhcb4.1 ................F.......A-......Q........................... A. thaliana Lhcb4.3 ..S.......I....-....... A-....LD..K......S........I..L...F.. C. reinhardtii Lhcb4 ..S.TN....C....-V....K...E.E.RAFR.KT...........S.F.YG...LS.. Helix A b3 M. polymorpha Lhcb4 KGPLDNWATHLSDPLHTTIIDTFSK A. thaliana Lhcb4.1 ....N...................SS A. thaliana Lhcb4.3 ...VSFL..FNN C. reinhardtii Lhcb4 E.A.GSL.KFADGLNNGKGL Helix D

Ergebnisse 80

Lhcb5

Ein Vergleich der Primärsequenzen der Lhcb5-Proteine von M. polymorpha, A. thaliana und

C. reinhardtii (Abb. 26) zeigt, daß das Lhcb5 von M. polymorpha wesentlich mehr identische

Aminosäuren zur Lhcb5-Sequenz von A. thaliana aufweist als zu C. reinhardtii. So zeigen die

interhelikalen Bereiche zwischen den Helices B und C bzw. C und A nicht die für C. reinhardtii

beschriebene hohe Variabilität (KÜHLBRANDT et al. 1994, TERAMOTO et al. 2001). Zudem läßt

sich auch keine Insertion zusätzlicher Aminosäuren im Anschluß an die Helic C wie bei

C. reinhardtii ausmachen.

Hochkonserviert sind die für das Lhcb1 der Erbse von KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994)

bestimmten Chlorophylliganden, ebenso wie die für die Trimerisierung des LHCII wichtige

Sequenzabfolge WYGPDR (Abb. 26). Wie von HOBE und Mitarbeitern (1995) gezeigt, soll das

Vorhandensein dieses Motivs ja essentiell für die Bildung von trimerem LHCII in vitro sein.

Allerdings ist immer noch unklar, warum gerade in Lhc b5-Proteinen diese Sequenzabfolge hoch

konserviert ist. Es ist nicht bekannt, daß sie Trimere zu bilden vermögen.

In Höheren Pflanzen wird dem Lhcb5 ebenso wie dem Lhcb4 eine besondere Bedeutung bei der

Dissipitation überschüssiger Energie beigemessen. Die Protonierungstellen, die hierbei eine

wichtige Rolle spielen, können durch DCCD blockiert werden (4.1.3). Die für Höhere Pflanzen

bekannten DCCD-Bindungsstellen sind auch in dem Lhcb5-Protein von M. polymorpha

konserviert (Abb.26).

M. polymorpha Lhcb5 LFNKKGAAPKKAAGKVAKTAPPSNAELAKWYGPDRRIYLPEGLLDKSDIPAYLTGEVPGD A. thaliana Lhcb5 ---..KP..A.S-----.AVSETSD............F..D....R.E..E..N...A.. C. reinhardtii Lhcb5 ---.A.GK.TRG----WLGGQGGA.D.D.......KLF..S..YDR.E..E..N..LA.. M. polymorpha Lhcb5 YGFDPFGLSKKPADFDKYQAYELIHARWAMLGAAGFVLPEAFNKYGARCGPEAVWFKTGA A. thaliana Lhcb5 ............EN.A....F...............II...L.....N............ C. reinhardtii Lhcb5 .....L..G.D.ETVA..REN..........A...IL...GLQAN..NIK-GGT..E... Helix B � M. polymorpha Lhcb5 LLLEGNTLNYFGA--SIPVN--LSLAAVIAEVILVGGAEYYRLS---------------- A. thaliana Lhcb5 ...D........K--N..I.--.V....V...V.L.......IT---------------- C. reinhardtii Lhcb5 EM.N.G.....AVPWGIVS.PLPLF.VIAV..G.MGAV.F..RNGTGPAGYSPGIGKFDS � Helix C M. polymorpha Lhcb5 PLGSGLDRLHPGGAFDPLGLAKDPDQFALLKVKEIKNGRLAMVSMLGFFIQAYVTGEGPV A. thaliana Lhcb5 NGLDFE.K.....P..........E.G...............FA................ C. reinhardtii Lhcb5 SVFD...PLY...P.......D..EVLQE...............V...AV.S...... Y Helix A � M. polymorpha Lhcb5 ENLAAHLSDPFGNNLLTVIGGASERVPT- A. thaliana Lhcb5 ....K..............A.TA..A..L C. reinhardtii Lhcb5 A.WTK.VA....Y.....LG-.E..T..L Helix D

Abb. 26: Alignment der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz für Lhcb5 aus M. polymorpha mit den Sequenzen der homologen Proteine aus A. thaliana und C. reinhardtii. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: Chlorophylliganden (hellgrün: Chl b, dunkelgrün: Chl a) (nach KÜHLBRANDT et al. 1994), türkis: Trimerisierungsmotif, � bzw. orange: DCCD Bindungsstellen.

Ergebnisse 81

Lhcb6

Während in Grünalgen bisher keine Lhcb6-Sequenz kloniert werden konnte, konnte für

M. polymorpha eine für ein Lhcb6-Protein codierende cDNA-Sequenz mittels RT-PCR

amplifiziert werden (3.1.1.1.1).

Der Sequenzvergleich zu Lhcb6 von A. thaliana zeigt, daß alle für die Pigmentbindung

wichtigen Aminosäuren in der Lhcb6-Sequenz von M. polymorpha hoch konserviert sind und

auch sonst die Übereinstimmungen sehr hoch sind.

M. polymorpha Lhcb6 TKKVAAKPAFKGGKGGKLSWVPAIKSGGSFVDPEWLDGSLPGDYGFDPLGLGRDPAALKW A. thaliana Lhcb6 ----------AAAAQP-K..I..V.G..N.L............F............F... M. polymorpha Lhcb6 YREAEIIHGRWAMAAVLGIFVGQAWSGIPWFEAGADPSAVAPFSFGTLLGTQLLLMGWVE A. thaliana Lhcb6 .....L.....................VA......Q.D.I......S............. Helix B Helix C M. polymorpha Lhcb6 GKRWADYVNPNSQLVDWATPWSRTAENFGNSTGLQGYPGGKFFDPLSLAGDVKNGKYTTD A. thaliana Lhcb6 S...V.FF..D..S.E......K.....A.Y..D......R.....G...KNRD.V.EP. M. polymorpha Lhcb6 YDKLSRLQLAEIKHSRLAMLAMLIFYFEAGQGLTPLGALGL A. thaliana Lhcb6 FE..E..K...........V............K........ Helix A Helix D

Abb. 27: Alignment der von der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz für Lhcb6.2 aus M. polymorpha mit den Sequenzen dem homologen Protein aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: Chlorophylliganden (hellgrün: Chl b, dunkelgrün: Chl a) (nach KÜHLBRANDT et al. 1994).

Da KILIAN und Mitarbeiter (1998) auch für die CAB-Proteine Lhcb4-Lchb6 ungewöhnlich

basische pI -Werte ermittelten, wurde der Anteil der sauren und basischen Aminosäuren aus den

Lhcb4-Lhcb6-Aminosäuresequenzen bestimmt (Tab. 18) und mit denen der Konsensus-

sequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996) verglichen:

Tab. 18: Anteil der basischen (K, N, Q, R) und sauren (E, D) Aminosäuren in den ermittelten Sequenzen für Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 von M. polymorpha sowie der der Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON (1996).

Protein Anteil saurer Aminosäuren Anteil basischer Aminosäuren Lhcb4 31 43 Lhcb5 24 36 Lhcb6 18 32 Lhcb4 (Konsensussequenz) 30 39 Lhcb5 (Konsensussequenz) 30 36 Lhcb6 (Konsensussequenz) 23 28

Das Verhältnis basischer zu sauren Aminosäuren ist in der Tat für die Proteine von

M. polymorpha höher als für die entsprechenden Konsensussequenzen.

Ergebnisse 82

3.2.3 Verwandte der cab-Genfamilie

3.2.3.1 PsbS

Das 22 kDa große membranintrinsische PsbS-Protein des PSII Höherer Pflanzen ist ein

Chlorophyll bindendes Protein mit Besonderheiten (1.3.1.2).

Ein dem PsbS Höherer Pflanzen homologer EST-Klon konnte von M. polymorpha isoliert

werden (Abb. 27). Allerdings codiert das 237 bp lange cDNA-Insert nur für eine Teilsequenz des

vollständigen Proteins. Die von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz von

79 Aminosäuren zeigt 92 % Übereinstimmung zum entsprechenden Bereich des PsbS-Proteins

von A. thaliana (Abb. 28).

NISHIYAMA und Mitarbeiter (2000) generierten aus Sporophyten von M. polymorpha 960 EST-

Klone. Unter den analysierten Sequenzen fand sich ebenfalls ein EST-Klon mit Homologie zum

PsbS.

Die vollständige cDNA-Sequenz dieses freundlicherweise von Dr. K. Yamato (Universität

Kyoto, Japan) zur Verfügung gestellten EST-Klones wurde in der vorliegenden Arbeit ermittelt.

Leider codiert das cDNA-Insert ebenfalls nur für eine Teilsequenz des PsbS-Proteins. Allerdings

für den C-terminalen Bereich, während die in dieser Arbeit isolierte EST-Sequenz für den N-

terminalen Bereich eines PsbS-Proteins codiert (Abb. 29). Auch der C-terminale Bereich zeigt

mit 73% Sequenzidentität eine hohe Ähnlichkeit zu dem PsbS-Protein von A. thaliana.

PsbS (D10P.G07)

1 gaggatggtatcttcggaacctcaggaggaatcggtttcaccaaggctaacgagcttttcgttgga E D G I F G T S G G I G F T K A N E L F V G 22

67 cgtgtagctatgcttggtttctctgcctccatccttggagaggctcttaccggaaagggtaccctt R V A M L G F S A S I L G E A L T G K G T L 44

133 gcccagttcgacgttgagaccggtattcccttgaacgagaccgagccactgttgctgtccttcatt A Q F D V E T G I P L N E T E P L L L S F I 66

199 ctgttcactttgttgggagcaattggagctctcagcgac L F T L L G A I G A L S D 79

PsbS (zur Verfügung gestellter Klon)

1 caattgaacatcgagactggtctgccgatcactgagctcgagcccctgatcctgttcaacgttatc Q L N I E T G L P I T E L E P L I L F N V I 22

67 ttctttttccttgctgctatcaaccctggtaccgggaagttcatcaacgacgatgacatcgaagag F F F L A A I N P G T G K F I N D D D I E E 44

133 taaagtggaaatggattttgcgtaacctcactttttccctctaggacttgacttggttttagaaat

199 ttgttgataatttcattgcggagctgcaaatacgaattattt

Abb. 28: Nukleotidteilsequenzen und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen für das PsbS von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices (A-D) sind grau unterlegt. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.

Ergebnisse 83

A. thaliana PsbS APKKVEKPKSKVEDGIFGTSGGIGFTKANELFVGRVAMIGFAASLLGEALTGKGILAQLN M. polymorpha PsbS ------------EDGIFGTSGGIGFTKANELFVGRVAMLGFSASILGEALTGKGTLAQFD

A. thaliana PsbS LETGIPIYEAEPLLLFFILFTLLGAIGALGDRGKFVDDPPTGLEKAVIPPGKNVRSALGL M. polymorpha PsbS VE**********************************************************

A. thaliana PsbS KEQGPLFGFTKANELFVGRLAQLGIAFSLIGEIITGKGALAQLNIETGIPIQDIEPLVLL M. polymorpha PsbS *****************************************QLNIETGLPITELEPLILF A. thaliana PsbS NVAFFFFAAINPGNGKFITDDGEES M. polymorpha PsbS NVIFFFLAAINPGTGKFINDDDIEE

Abb. 29: Alignment der von den Nukleotidteilsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen für ein PsbS aus M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices A-D, grün: zwischen den Sequenzen unterschiedliche Aminosäuren, *****: Bereiche, von denen keine Sequenzdaten für M. polymorpha vorliegen.

3.2.3.2 Sep1 ähnliches Protein

Für die molekularbiologisch wohl am besten untersuchteste Pflanze A. thaliana konnten unter

über 30.000 EST-Sequenzen in den Datenbanken zahlreiche neue Mitglieder der Lhc-Genfamilie

identifiziert werden (JANSSON 1999). Aus Sicht der molekularen Entwicklung der Genfamilie

könnten insbesonders Sep-Proteine das fehlende Glied zwischen den ein und drei Helix

Antennenproteinen in Pro- und Eukaryoten repräsentieren (JANSSON 1999, HEDDAD & ADAMSKA

2000).

Die vollständige Sequenzierung der cDNA des EST-Klones C05P.A12 von M. polymorpha ergab

ein 598 langes bp Fragment, welches für 150 Aminosäuren eines Proteinfragmentes codiert mit

Ähnlichkeit zu dem von HEDDAD & ADAMSKA (2000) näher charakterisierten Sep1-Protein von

A. thaliana (Abb. 28) Der Prozenzsatz identischer Aminosäuren beträgt nur zwar nur 33 %, aber wie

das Alignment der Sequenzen von M. polymorpha und A. thaliana zeigt (Abb. 29), sind 18 von 22

Aminosäuren der ersten transmembranen Helix zwischen den beiden Proteinsequenzen identisch. Die

Übereinstimmung zwischen den zweiten transmembranen Helices beträgt 57 %. Die mutmaßlichen

transmembranen Regionen der Proteinteilsequenz aus M. polymorpha wurden mittels des TMHMM-

Programmes (Version 2.0) ermittelt.

Ergebnisse 84

1 gcgtgcgagaaggaaagcatcgaccatggcaactctttgtgtctcgtcgattgtgcacggtgccat A C E K E S I D H G N S L C L V D C A R C H 22

67 gccagctgggcatgtatgctcagcagtttcttctggacaacaaaagctccatgcctagagcgagac A S W A C M L S S F F W T T K A P C L E R D 44

133 tgtcctccacatcgtcattttggtagctccaacttggtagcattgaggtccgaatcgaaaggagtc C P P H R H F G S S N L V A L R S E S K G V 66

199 aaacgagttgccaccgtagaaacaaggtgtgagagcaagacagaggagaccagaggacccagcgcc K R V A T V E T R C E S K T E E T R G P S A 88

265 gatatttggatcggatgattagcgatggtcgggtttgccgctgccatcacatcggagattgtcacc D I W I G S L A M V G F A A A I T S E I V T 110

331 gggaaaggagtactagcgaccgcaggtttgagcactccccaacccactctggctctggcgttagca G K G V L A T A G L S T P Q P T L A L A L A 132

397 gcactggtaggaggattgacagcgtttggagtgttccgatctgctggaagtgattaattggacttg A L V G G L T A F G V F R S A G S D 150

463 atgttccagaaacaacacattgatgtagaaagctgttcaatacttgccactagtgtagccttttgt

529 agagactgttgcctctttgagtctcttgtctaggaattgatgcgggtaaattagatgacaacaaga

595 agttttagaacgggcaactagaccaacgcgccgttctctgcaagtactactgcacatcctcacgag

661 tccgtgactgtcatttgaattataaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Abb. 30: Nukleotidteilsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz für das Sep1-ähnliche Protein von M. polymorpha. Die Bereiche der mutmaßlichen transmembranen Helices sind grau unterlegt. Die Nukleotide sind links, die Aminosäuren rechts numeriert.

M. polymorpha Sep1? ACEKESIDHGNSLCLVDCARCHASWACMLSSFFWTTKAPCLERDCPPHRHFGSSNLVALR A.thaliana Sep1 -MALSQVSASLAFSLPNSGALKLATITNPTSTCR-VHVPQLAGIRSTFASGSPLLPLKLS M. polymorpha Sep1? SESKGVKRVATVETRCESKTEETRGPSADIWIGSLAMVGFAAAITSEIVTGKGVLATAGL A.thaliana Sep1 MTRRGGNRAASVSIRSEQSTEGSSG--LDIWLGRGAMVGFAVAITVEISTGKGLLENFGV M. polymorpha Sep1? STPQPTLALALAALVGGLTAFGVFRSAGSD A.thaliana Sep1 ASPLPTVALAVTALVGVLAAVFIFQSSSKN

Abb. 31: Alignment der von der Nukleotidteilsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen für ein Sep1-ähnliches Protein aus M. polymorpha mit der Sequenz des homologen Proteins aus A. thaliana. Besonders gekennzeichnete Bereiche: grau unterlegt: mutmaßliche transmembrane Helices.

3.2.4 Analyse der Expression einzelner cab-Gene

Die Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha wurde unter zwei Gesichtspunkten

näher untersucht. Zum einen sollte die Frage geklärt werden, ob die Expression verschiedener

Lhc-Gene von M. polymorpha ebenfalls wie für viele Pflanzenspecies gezeigt, einer diurnalen

Rhythmik unterliegt. Zum anderen sollte die Auswirkung von Lichtstress auf die Expression des

Ergebnisse 85

Sep1-ähnlichen Gens untersucht werden. In A. thaliana sind Sep-Proteine Stress-induzierte

Proteine.

3.2.4.1 diurnale Expression einzelner cab-Gene

Viele Untersuchungen haben gezeigt, daß pflanzliche Gene oft circadian bzw. diurnal exprimiert

werden, so auch die Lhc-Gene in vielen Pflanzenspecies (PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT

et al. 1996). Das typische Akkumulationsmuster für mRNAs der Lhc-Gene beginnt mit einem

langsamen Anstieg der mRNA-Gehalte vor und nach Sonnenaufgang. Diese erreichen dann ihre

höchste Konzentration um die Mittagszeit und erfahren eine stetige Abnahme im Laufe des

Nachmittages und der Nacht (PIECHULLA et al.1993). Während viele angiosperme Pflanzen eine

derartiges Lhc-Genexpressionsmuster zeigen, läßt sich bei den gymnospermen Conipherophytina

keine solche diurnale Oscillation der mRNA von Lhc-Proteinen finden.

OBERSCHMIDT und Mitarbeiter (1996) ermittelten für zwei Vertreter der Bryophyten,

Conocephalum conicum und Physcomitrella patens, das Expressionsmuster des Gens im

Tagesgang. Interessanterweise unterliegt die Expression des Hauptlichsammelproteins des

LHCIIs von Physcomitrella patens (LHCP), einem Laubmoos, der oben beschriebenen diurnalen

Rhythmik, während für das Lebermoos C. conicum die Expression dieses Genes im Tagesverlauf

nahezu konstant bleibt.

Die Expression von fünf in dieser Arbeit identifizierten Lhc-Genen (Lhca4, Lhcb2, Lhcb4. PsbS,

Sep1-ähnlich) von M. polymorpha wurde auf das Auftreten einer diurnalen Rhythmik hin

untersucht. Abbildung 30 zeigt die Ergebnisse der entsprechenden Northern Blot-Analysen.

Photoautotroph gewachsene Thalli von M. polymorpha wurden für die Isolierung von Gesamt-

RNA aus 6 Kulturbehältern entnommen und das Material gepoolt. Die Probennahme begann im

Dunkeln, 1 h vor dem Beginn der Lichtphase und erfolgte dann alle 3 h. Die letzte Entnahme

erfolgte 1 h nach der Lichtphase. Die Dauer der Lichtphase betrug 16 h, die der Dunkelphase

8 h. Die Quantenflußdichte entsprach den Anzuchtsbedingungen.

Mit Ausnahme des Sep1 ähnlichen Gens, kommt es zu einem stetigen Anstieg der mRNA

Gehalte nach Beginn der Lichtphase. Die maximale Konzentration wird jedoch nicht um die

Mittagszeit erreicht, sondern durchweg erst nach elfstündiger Lichtphase. Zur Dunkelphase hin

erfolgt dann eine stetige Abnahme der mRNA-Gehalte.

Das Sep1-ähnliche Gen von M. polymorpha wird insgesamt nur sehr schwach exprimiert

(Abb. 30). Es kommt zu einem langsamen aber stetigen Anstieg des mRNA-Gehalts in

Abhängigkeit von Dauer der Lichtphase.

Ergebnisse 86

Abb. 32: Northernblotanalyse: Ergebnisse der Expressionsanalyse zur diurnalen Expression einzelner Lhc-Gene (Lhca4, Lhcb2, Lhcb4, PsbS, Sep1?) von M. polymorpha. Die Lichtphase betrug 16 h, die Dunkelphase 8 h. 1 h vor Beginn der Lichtphase (6.00 Uhr), wurde die erste Probe genommen, dann alle 3 h, bis 1h nach Ende der Lichtphase. Der untere Balken gibt die Dauer Dunkel und Lichtzeiten wieder, oberer Auftrag: Uhrzeit der Probennahme.

3.2.4.2 Auswirkung von Lichtstress auf die Genexpression des Sep1-ähnlichen Gens

Für Sep-Proteine von A. thaliana ist beschrieben, daß ihr mRNA-Gehalt in Folge von Lichtstress

drastisch ansteigt. Bisher liegen nur Sequenzen für Sep-Proteine aus A. thaliana vor. Die

Expression des Sep1-ähnlichen Gens von M. polymorpha, wurde auf Veränderungen in Folge

von Lichtstress untersucht. Damit sollte geklärt werden, ob sich die Expression des für

M. polymorpha nachgewiesenen Gens ähnlich der für die Sep-Gene aus A. thaliana

beschriebenen Expression verhält, oder ob gravierende Unterschiede bestehen.

Thalli von M. polymorpha wurden zur Lichtstress-Behandlung einer Quantenflußdichte von

300 µmol m-2 s-1 ausgesetzt. Diese war damit 10 fach erhöht gegenüber der Quantenflußdichte

bei der die Thalli angezogen wurden. WÖLFEL (1998) hatte gezeigt, daß es unter diesen

Lichtbedingungen zu einer Abnahme der Effizienz des photosynthetischen Elektronentransportes

kommt, die bei einer anschließenden Erhohlungsphase im Schwachlicht nur langsam und nur

teilweise reversibel war.

Gesamt-RNA wurde aus den Thalli nach 0, 2, 4, 8, 24 und 48 h Lichtstress isoliert. Dazu wurden

Thalli aus sechs Kulturgefäßen, die sich möglichst wenig beschatteten, vorsichtig entnommen

ohne sie zu verwunden und das Material gepoolt.

Lhca4

Lhcb2

Lhcb4

Psb S

Sep1?

6.00 9.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00

Ergebnisse 87

Abbildung 31 zeigt das Ergebnisse der Northernblot-Analyse. Während das Sep1-ähnliche Gen

vor Gabe des Lichtstresses schwach exprimiert wird, kommt es schon nach 2 h erhöhter

Quantenflußdichte zu einem drastischen Zunahme an mRNA. Der Gehalt an mRNA bleibt dann

für die weitere Dauer nahezu konstant. Das Ergebnis wurde durch drei unabhängige Experimente

reproduziert.

Lichtstress: 0 h 2 h 4h 8 h 16 h 24 h 48 h

Abb. 33: Northernblotanalyse: Spiegel des Transkriptes des Sep1-ähnlichen Gens von M. polymorpha in Abhängigkeit zur Dauer des Lichtstresses (0 , 2, 4, 6, 8, 16, 24, 48 h, 300 µmol m-2 s-1). Der gleichmäßige Auftrag der Gesamt-RNA wurde durch EtBr -Färbung überprüft.

Sep1?

88

4 Diskussion

Das Ziel der vorliegenden Arbeit, für den Bryopyten M. polymorpha ein umfassendes Bild von

der Zusamensetzung der cab-Genfamilie zu erlangen, konnte durch die Klonierung und

Sequenzierung der cDNAs von 12 verschiedenen Mitgliedern erreicht werden. Die

Zusammensetzung der Genfamilie und der Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine mit

denen der homologen Proteine der Samenpflanzen und Grünalgen werden in bezug auf die

molekulare Evolution dieser Genfamilie diskutiert (4.1, 4.2). Die Primärsequenzen geben einen

Hinweis darauf, daß die differenzierten Funktionen der meisten CAB-Proteine wohl schon vor

der Trennung der Bryophyten von den Farnpflanzen, aus denen sich die Samenpflanzen

entwickelten, festgelegt waren (4.2).

Wie Expressionsanalysen zeigen, läßt sich die für viele pflanzliche Species beschriebene

diurnale Expression der cab-Gene auch an M. polymorpha beobachten. Es bestehen jedoch

charakteristische Unterschiede zum sonst typischen Expressionsmuster. Über mögliche Gründe

hierfür, läßt sich nur spekulieren (4.3.1). Die festgestellten Veränderungen in der Expression des

Sep1-ähnlichen Gens als Folge von Lichtstress zeigt, daß der mRNA-Gehalt in Folge von

Lichtstress ebenfalls wie für die Sep-Proteine aus A. thaliana beschrieben drastisch ansteigt.

Dies legt eine mögliche Funktion des Proteins bei Lichtstress nahe (4.3.2).

4.1 Zusammensetzung der cab-Genfamilie des Bryophyten M. polymorpha

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Zusammensetzung der cab-Genfamilie eines Bryophyten

erstmalig detailliert untersucht. Sequenzdaten für cab-Gene, die für Samenpflanzen ja keine

Seltenheit mehr darstellen, lagen für Bryophyten bisher nur sehr begrenzt vor. Bis weit in die

neunziger Jahre waren zwei von LONG und Mitarbeitern (1989) sequenzierte Gene für zwei

LHCII-Proteine des Laubmooses Physcomitrella patens, die einzig sequenzierten Gene von

CAB-Proteinen eines Bryophyten, deren Sequenzen zur Verfügung standen. Mit dem Beginn

mehrerer Genomprojekte, finden sich seit neuestem auch vermehrt Sequenzen für verschiedene

CAB-Proteine von Bryophyten in den Datenbanken, insbesonders für das Laubmoos

Physcomitrella patens. Allerding handelt es sich hierbei um unausgewertete und nicht

abgesicherte Nukleotidteilsequenzen von EST-Klonen. Eine umfassende Analyse der cab-

Genfamilie eines Bryophyten stand somit immer noch aus.

Besonders interessant macht eine derartige Untersuchung, daß signifikante Unterschiede in den

Sequenzen der CAB-Proteine auf wichtige funktionelle Unterschiede hinweisen könnten. Somit

böte sich ein weiterer Ansatz die spezifischen Funktionen eines jeden CAB-Proteines besser

Diskussion 89

verstehen zu lernen. Des weiteren bedarf es der Sequenzdaten für CAB-Proteine von

Bryophyten, um das Bild von der Evolution der Lhc-Genfamilie zu komplementieren,

insbesonders da Bryophyten erste Landpflanzen repräsentieren (MISHLER et al. 1994, KENRICK et

al. 1997).

Das thallö se Lebermoos M. polymorpha, ist unter letzterem Gesichtspunkt ein besonders

interessantes Untersuchungsobjekt, denn aus morphologischen Untersuchungen resultiert die

Annahme, daß Lebermoose die primitivsten Landpflanzen seien (GRAHAM 1993, EDWARDS et al.

1995, KENRICK et al. 1997). Diese Annahme wird inzwischen durch Untersuchungen von QIU

und Mitarbeitern (1998) über die Verteilung dreier mitochondrialer Introns unterstützt. Sie

untersuchten 352 verschiedene Landpflanzen auf das Vorkommen der mitochondrialen Introns

cox2.i3 , cox2.i4 und nad1.i4 . Diese finden sich bei allen Hauptlinien der Gefäßpflanzen, den

Moosen (mit einigen wenigen Ausnahmen) und den Hornmoosen, aber nicht in Lebermoosen,

Grünalgen und allen anderen Eukaryoten.

Die grobe Architektur der Antennenkomplexe scheint seit mehr als 350 Millionen Jahren zu

existieren, da die zehn verschiedenen CAB-Proteine in allen Höheren Pflanzen präsent sind

(JANSSON 1994). Dies legt gleichzeitig nahe, daß den verschiedenen Proteinen jeweils eine

differenzierte Funktion zukommen muß, ansonsten wären einige der sie codierenden Gene wohl

im Verlauf der Evolution verloren gegangen.

Die Zusammensetzung der in dieser Arbeit ermittelten cab-Genfamilie des Bryophyten

M. polymorpha (Tab. 16, 3.1.2) ist der Höherer Pfla nzen in weiten Teilen sehr ähnlich. Dies und

die Tatsache, daß die Sequenzen der verschiedenen cab-Gene von M. polymorpha sehr hoch

konserviert sind, spricht dafür, daß sich die CAB-Proteine der PSII-Antenne und ihre

Eigenschaften seit ca. 480 Millionen Jahren nicht gravierend verändert haben. Da nur eine

cDNA-Sequenz für ein Antennenprotein des PSI ermittelt werden konnte (3.1.2.1.1), eine Lhca4-

Sequenz, läßt sich bezüglich der PSI-Antenne auf Basis der in dieser Arbeit ermittelten Daten

wenig aussagen. Bereits die biochemische Charakterisierung einzelner CAB-Proteine des PSII

von HARRER und Mitarbeitern (1998) sowie die von ihnen durchgeführten cross-link-Studien zur

Organisation der einzelnen Lhc-Proteine innerhalb der PSII-Antenne zeigen, daß die

Organisation des Antennensystems des PSII bei M. polymorpha grundsätzlich mit der bei

Samenpflanzen übereinstimmt. Somit scheinen Aufbau und Organisation der PSII-Antenne

schon seit den ersten Landpflanzen, seit ca. 480 Millionen Jahren, konserviert zu sein.

Wie am Beispiel von C. reinhardtii gezeigt werden konnte, findet sich die komplexe

Organisation der PSII-Antenne mit monomeren und trimeren CAB-Proteinen bereits bei den

Grünalgen (TREMOLIERES et al. 1994). Es stellt sich somit die Frage, wie ähnlich sind sic h die

Diskussion 90

Antennen der Lebermoose und der Grünalgen. Sind Aufbau und Oganisation schon seit den

Grünalgen so stark konserviert, wie zwischen Lebermoosen und Höheren Pflanzen?

Durch die Analyse von 15.000 EST Sequenzen wurde erst kürzlich ein umfassendes Bild von der

Zusammensetzung der Lhcb-Genfamilie der Grünalge C. reinhardtii gewonnen (TEARAMOTO et

al. 2001). Charakteristische Unterschiede zu Höheren Pflanzen bestehen darin, daß die als

LhcII-1.1-1.4 bezeichneten Proteine von C. reinhardtii zwar den Trimere bildenden

LHCII-Proteinen (Lhcb1-Lhcb3) Höherer Pflanzen homolog sind, sich jedoch nicht eindeutig

einem dieser Proteine zuordnen lassen. Ferner konnte keine homolge Lhcb6-Gensequenz und

ebenso keine homolge psbS-Sequenz ermittelt werden, obwohl die Anzahl der ausgewerteten

EST-Sequenzen mit 15.000 doch recht hoch ist. Dies führte zu dem vorsichtigen Schluß, daß

Grünalgen diese Proteine möglicherweise nicht besitzen (TERAMOTO et al. 2001).

Für M. polymorpha hingegen konnte in der vorliegenden Arbeit sowohl eine Lhcb6-Sequenz

(Abb. 8, 3.1.1.1.1) als auch eine psbS Sequenz (Abb. 28, 3.1.2.3) ermittelt werden. Aufgrund der

Unterschiede in den N-terminalen Bereichen der in dieser Arbeit ermittelten Lhcb6-Sequenz

(Lhcb6.2) und der Aminosäureteilssequenz von KILIAN und Mitarbeitern (1998) (Lhcb6.1) ist

sogar davon auszugehen, daß M. polymorpha über zwei verschiedene Lhcb6-Proteine verfügt

(Abb.9).

Ferner ließen sich die Sequenzen für ein Lhcb2 bzw. Lhcb3 Protein identifizieren (3.1.2.2.1).

Die Zusamensetzung der Lhcb-Familie von M. polymorpha entspricht somit doch schon

wesentlich mehr der Höherer Pflanzen als die der Grünalge C. reinhardtii.

Jedoch wurden ebenso wie bei der Grünalge C. reinhardtii LHCII-Sequenzen für M. polymorpha

ermittelt, die hohe Homolgie zu den Trimere bildenden LHCII-Proteinen Lhcb1 und Lhcb2

Höherer Pflanzen aufweisen und sich nicht eindeutig einem dieser beiden Proteine zuordnen

lassen (3.1.2.2.1). Zwar konnten von diesen als LHCII-1.1-1.4 bezeichneten Proteinen von

M. polymorpha nur Teilsequenzen ermittelt werden, die fehlenden C-terminalen Sequenz-

bereiche sind aber nicht die Ursache, daß nicht unterschieden werden kann, ob sie Lhcb1 oder

Lhcb2 ähnlicher sind (Abb. 21). Aber genauso wenig lassen sich die genannten Sequenzen von

M. polymorpha den LhcII-1.1-1.4 Proteinen von C. reinhardtii zuordnen (Abb. 22).

TERAMOTO und Mitarbeiter (2001) zogen aufgrund der von ihnen für C. reinhardtii ermittelten

Daten den Schluß, daß sich erst nach der phylogenetischen Trennung der Grünalgen und der

Höheren Pflanzen die Proteine Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 entwickelten.

Ferner soll dieser Prozess in jeder Algenspecies unabhängig voneinander erfolgt sein, als

Anpassung an unterschiedliche Umweltbedingungen, da sich die LHCII-1.1-1.4-Proteine von

C. reinhardtii auch nicht denen anderer Grünalgen wie zB von Dunalielle salina (LONG et al.

1989, Dunaliella tertiolecta (LAROUCHE et al. 1990) oder C. moewusii (LAROUCHE et al. 1991)

Diskussion 91

zuordnen lassen. Die inneren PSII-Antennenproteine aber müssen sich aufgrund der bestehenden

Sequenzähnlichkeiten der CAB-Proteine Lhcb4 und Lhcb5 zu den Lhca-Proteinen früher d.h.

vor der phylogenetischen Trennung der Höheren Pflanzen und Grünalgen entwickelt haben

(DURNFORD et al. 1999, TERAMOTO et al. 2001)

Die in dieser Arbeit gewonnenen Sequenzdaten für die CAB-Proteine von M. polymoprha fügen

sich in diese Vorstellungen zur phylogenetischen Entwicklung der einzelnen CAB-Proteine ein.

Allerdings konnten für M. polymorpha schon eindeutig Sequenzen für ein Lhcb2 und Lhcb3-

Protein ermittelt werden, was dafür spricht, daß bereits ab den Bryophyten vor 480 Millionen

Jahren diese Proteine entwickelt waren und in den Höheren Pflanzen erhalten blieben. Eine

Frage, die sich nun aufdrängt ist, wie sieht es bei anderen Bryophyten aus? Sequenzen liegen

bisher nur noch für P. patens vor: zwei vollständig sequenzierte Gensequenzen für zwei LHCP-

Proteine (LHCP(1), LHCP (2) (LONG et al. 1989)). Aber handelt es sich um Lhcb2-, Lhcb3- oder

gar um Lhcb1-Proteine? Die Frage läßt sich durch ein Alignment der entsprechenden Sequenzen

klären (Abb. 34).

Lhcb1 ---------------------------------------RKTATKAKPVS-SGSP--WYG Lhcb2 -------------------------------------------RRTVK---SAPQSIWYG LHCP(2) ----------------------------------------KKGAKAVSK.-SSSANQF.. LHCP(1) ---------------------------------------------------AGSDTI... Lhcb1 PDRVKYLGPFSGESPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFAKNRELEVIHCRWAMLGALG Lhcb2 EDRPKYLGPFSEQTPSYLTGEFPGDYGWDTAGLSADPETFARNRELEVIHCRWAMLGALG LHCP(2) P.ATSGWD-LQHQH.RLP... P.................KRY....L..A.CGL..... LHCP(1) A..PKFL....GET....N...A...........S......R........A......... Lhcb1 CVFPELLA-RNGVKFG-EAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPSLVHAQSILAIWACQVILMG Lhcb2 CVFPEILS-KNGVKFG-EAVWFKAGSQIFSEGGLDYLGNPNLVHAQSILAIWACQVVLMG LHCP(2) M.T..L.ADEDGI...DA.I.....AA..QD...N.....S.I...N.V.TL.V..V... LHCP(1) .LT..L.A-KS.....-........A..............S...............V... Lhcb1 AVEGYRIAGGPLGEVTDPLYPGGSFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFV Lhcb2 FVEGYRVGGGPLGEGLDKIYPGGAFDPLGLADDPEAFAELKVKEIKNGRLAMFSMFGFFV LHCP(2) L.....VN...A..GL.PL...EA..........DTF................ACL.... LHCP(1) A......A......VT.P.....S..........DT........................ Lhcb1 QAIVTGKGPLENLADHLADPVNNNAWAFATNFVPGK- Lhcb2 QAIVTGKGPIENLSDHIADPVANNAWAYATNFVPGK- LHCP(2) .........I...T..L.N.AE...F.Y..K.T.Q-- LHCP(1) .........L...N..L....A.....Y.PTSP.. TR

Abb. 34: Alignment der LHCP-Sequenzen von P. patens mit den Lhcb1 (orange) und Lhcb2 (blau) Konsensussequenzen von PICHERSKY & JANSSON. (1996). Grau hervorgehoben sind die Bereiche der transmembranen Helices. Zu beiden Konsensussequenzen identische Aminosäuren sind durch Punkte (...) gekennzeichnet, für Lhcb1 bzw. Lhcb2 typische Aminosäuren mit der entsprechenden Farbe der Konsensussequenz.

Diskussion 92

Die LHCP (1) Sequenz läßt sich eindeutig als ein Lhcb2-Protein identifizieren, die andere

hingegen weder als Lhcb1 noch als Lhcb2. Auch P. patens verfügt somit eindeutig über ein

Lhcb2-Protein. Weitere Untersuchungen an anderen Organismen müssen klären, ab wann sich

im Verlauf der Evolution der Lhcb1 der Höheren Pflanzen herausgebildet hat.

Auch was das Vorhandensein der Verwandten der CAB-Proteine betrifft, scheint M. polymorpha

Höheren Pflanzen vergleichbar. So konnte eine dem PsbS-Protein homolge Sequenz ermittelt

werden, ebenso wie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana ähnliche Sequenz. Immunnachweise

lassen auch das Vorhandensein anderer zur ELIP-Familie gehörenden Proteine in dem

Lebermoos M. polymorpha vermuten (KILIAN 1998).

Bezüglich der am Aufbau des LHCI beteiligten Proteine von M. polymorpha kann aufgrund nur

einer ermittelten Lhca-Sequenz nur gesagt werden: M. polymorpha besitzt ein Lhca4-Protein,

das dem Höherer Pflanzen sehr ähnlich ist.

Jedoch zeigen frühere biochemische Untersuchungen, daß sich die periphere Antenne des PSI

von M. polymorpha ebenfalls wie bei Höheren Pflanzen aus vier verschiedenen Lhca-Proteinen

zusammensetzt. HERRMANN und Mitarbeiter (1997) isolierten aus phototrophen Zellkulturen von

M. polymorpha PSI-Komplexe. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung unter

volldenaturierenden Bedingungen im Polyacrylamidgel ordneten sie vier Proteine mit apparenten

Molekulargewichten von 20-24 kDa aufgrund ihres Molekulargewichtes den LHCI-

Untereinheiten Lhca1-Lhca4 zu.

Warum sich unter den 1920 analysiertern EST-Sequenzen nur eine Lhca-Sequenz fand, ist

schwer zu sagen. Die Häufigkeit mit der eine bestimmte cDNA in einer cDNA-Bibliothek

vertreten ist, gibt zwar auch einen Hinweis auf die Expression des entsprechenden Genes. Doch

darf dies nicht überbewertet werden. Vermutlich würden sich bei Untesuchung einer höheren

Anzahl an EST-Sequenzen von M. polymorpha auch weitere Lhca-Sequenzen finden.

4.2 Analyse der CAB-Proteinsequenzen

Lassen die in dieser Arbeit ermittelten Sequenzdaten für die CAB-Proteine von M. polymorpha

Rückschlüsse auf von den Proteinen aus Samenpflanzen abweichende Eigenschaften zu?

Im folgenden werden die Ergebnisse der Sequenzvergleiche zwischen den CAB-Proteinen von

M. polymorpha und den homologen Proteinen der Höheren Pflanzen diskutiert.

Die Übereinstimmungen der für M. polymorpha identifizierten CAB-Proteine mit denen Höherer

Pflanzen belaufen sich für die reifen Proteine auf Aminosäureebene zwischen 76 und 85 %

Diskussion 93

(Tab 16, 3.1.2). Damit liegen die Sequenzabweichungen in der für verschiedene

Pflanzengruppen bisher bekannten Größenordnung. In der Regel sind die Übereinstimmungen

zwischen den Primärsequenzen homologer CAB-Proteine verschiedener pflanzlicher Species

sehr hoch: innerhalb der Angiospermen beläuft sich die Übereinstimmung auf mehr als 90%.

Werden Sequenzen Angiospermer mit denen Gymnospermer verglichen, liegt der Prozentsatz

identischer Aminosäuren bei 80 bis 90 % (JANSSON & GUSTAFSSON 1991, PICHERSKY &

JANSSON 1996). Angemerkt sei, daß sich diese Zahlenwerte auf die reifen Proteine beziehen.

Bezüglich der Transitpeptide bestehen wesentlich größere Unterschiede (ROBINSON & KNOTT

1996).

4.2.1 Lhca4

Zwei Subkomplexe des LHCI werden aufgrund ihrer Fluoreszensemissionsmaxima bei 77K

unterschieden, der LHCI-630 und der LHCI-730. Sind beide Subkomplexe mit dem PSI-

Reaktionszentrum assoziiert, liegt das 77K-Fluoreszensmaximum des Gesamtkomplexes

zwischen 738-742 nm (KNOETZEL et al. 1992). Das Flureszenzmaximum der PSI-Komplexe von

M. polymorpha bei 77K liegt, wie von HERRMANN und Mitarbeitern (1997) gezeigt, hingegen bei

720 nm. Dieses Maximum entspricht damit eher dem einer PSI-Reaktionszentrumseinheit ohne

Lhca-Proteine (KNOETZEL et al. 1992, TJUS et al. 1995), scheint aber, wie von ARO und

Mitarbeitern (1981) gezeigt, typisch für Moose und einige Algen zu sein. Eine mögliche Ursache

für dieses blauverschobene Fluoreszenzmaximum bei 77K läßt sich von der in dieser Arbeit

ermittelte Lhca4-Sequenz von M. polymorpha nicht ableiten. Mit 80 % identischen Aminosäuren

zur Lhca4-Sequenz des reifen Proteins von A. thaliana (Abb. 15) ist das Lhca4 von

M. polymorpha dem Höherer Pflanzen doch sehr ähnlich. Die Sequenzunterschiede liegen

zudem in Bereichen, die im Vergleich zur Lhca4-Konsensussequenz von PICHERSKY & JANSSON

(1996) zwischen den Sequenzen verschie dener Species eher nicht so hoch konserviert sind.

Alle mutmaßlichen der aus der Kristallstruktur für das Lhcb1 der Erbse bestimmten

Chlorophylliganden (KÜHLBRANDT et al. 1994) sind in der Lhca4-Proteinsequenz von

M. polmorpha hoch konserviert. Allerdings liegen bisher keine quantitativen Daten zur

Pigmentbindung vor. Für LHCI ermittelte Pigmentverhältnisse (CROCE & BASSI 1998) sprechen

dafür, daß jedes der Lhca-Proteine ca. 10.4 Chl a, 2.6 Chl b, 1.3 Lutein, 1.3 β-Carotein und

0.8 Violaxanthin bindet (SCHELLER et al. 2001). Abgesehen davon, daß weitere Lhca-Sequenzen

für M. polymorpha weiteren Aufschluß für das blauverschobene Fluoreszenzmaximum bei 77K

geben könnten, könnten aber auch Rekonstitutionsexperimente mit Lhca1-Proteinen aus anderen

Organismen z.B. ein Ansatz sein, diese Frage zu klären.

Diskussion 94

4.2.2 LHCII1.1-1.4, Lhcb2, Lhcb3

Bereits ARO (1982) konnte die Existenz eines LHCIIs für M. polymorpha nachweisen. KILIAN

und Mitarbeitern (1998) gelang es dann zu zeigen, daß ebenso wie bei Samenpflanzen zwischen

Trimere bildenden LHCII-Proteinen und monomeren minoren CAB-Proteinen unterschieden

werden kann.

Jedes der LHCII-1.1-1.4-Proteine von M. polymorpha stellt für sich eine Mischung aus Lhcb1-

und Lhcb2- Protein Höherer Pflanzen dar, was sie als Vorläufer dieser Proteine erscheinen läßt.

Vermutlich sind sie somit auch Bestandteil der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha,

zusammen mit dem Lhcb2 und Lhcb3. Zeichnen sich die trimeren LHCII-Komplexe von

M. polymorpha nun durch andere Eigenschaften aus?

Da charakteristische Sequenzbereiche, deren Vorhandensein bisher mit spezifischen

Eigenschaften der Proteine in Verbindung gebracht werden, hoch konserviert sind, eher nicht.

Das für die Trimerisierung als essentiell betrachtete Aminosäuresequenzmotiv WYGPDR (HOBE

et al. 1995) ist in allen diesen Sequenzen vorhanden. Zudem ist die 11. Aminosäure an den C-

Terminini des Lhcb2 und des Lhcb3 von M. polymorpha ein Tryptophan (Abb. 20). Dieses soll,

wie von KUTTKAT und Mitarbeitern (1996) gezeigt, ebenfalls essentiell für die Trimerisierung

des LHCII sein. Somit ist davon auszugehen, daß die LHCII-1.1-1.4-Proteine zusammen mit

dem Lhcb2 und dem Lhcb3 die trimeren LHCII-Kompexe von M. polymorpha bilden. In SDS-

Harnstoffgelen trennen sich trimere LHCII-Komplexe von M. polymorpha in Apoproteine von

25-29 kDa und einem Protein von 22 kDa auf (KILIAN 1998). Da nur Teilsequenzen von den

LHCII-1.1-1.4-Proteinen ermittelt werden konnten, läßt sich leider nicht ihr Molekulargewicht

ableiten.

Die spektralen Eigenschaften der LHCII-Trimere von M. polymorpha entsprechen denen von

isolierten LHCII-Komplexen aus Samenpflanzen (KILIAN 1998). Die Sequenzvergleiche zeigen,

daß alle mutmaßlichen Chlorophylliganden und Xanthophyllbindungsstellen hoch konserviert

sind (3.1.2.2.1), dies läßt auf eine vergleichbare Chromophorbindung schließen und steht in

Einklang mit den spektralen Eigenschaften der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha.

Im Unterschied zu Samenpflanzen weist das kleinste von KILIAN (1998) nach Elektrophorese in

SDS-Harnstoffgelen detektierte Protein der trimeren LHCII-Komplexe von M. polymorpha einen

basischeren pI auf als die entsprechenden Proteine Höherer Pflanzen. Da es das kleinste Protein

von 22 kDa betrifft, wurde vermutet, daß es sich um das Lhcb3-Genprodukt handelt.

Basische pI-Werte deuten auf einen höheren Gehalt an basischen Aminosäuren in der

Primärsequenz hin. Das in dieser Arbeit bestimmte Verhältnis an basischen zu sauren

Diskussion 95

Aminosäuren für das Lhcb3-Protein von M. polymorpha (Tab 17, 3.1.2.2.1), weicht jedoch nur

geringfügig von dem der Konsensussequenz des Lhcb3-Proteines ab. Das Lhcb3 von

M. polymorpha sollte somit einen dem Lhcb3 Höherer Pflanzen vergleichbaren pI-Wert

aufweisen. Für das Lhcb2 Protein von M. polymorpha hingegen ist das Verhältnis basischer zu

sauren Aminosäuren jedoch höher gegenüber der Konsensussequenz (PICHERSKY & JANSSON

1996) und läßt auf basischeren pI-Wert des Proteines schließen.

Die Phosphorylierung von Lhcb-Proteinen und ihre Bedeutung für die Verteilung von

Anregungsenergie zwischen den Photosystemen (state transistions) ist ein inzwischen

weitreichend bekanntes Phänomen (WANG & MEYERS 1974). Die N-terminale Phosphorylierung

der Untereinheiten Lhcb1 und Lhcb2 und die damit möglicherweise einhergehende

Konformationsänderung (ALLEN et al. 1997) bewirkt die Dissoziation der LHCII-Trimere vom

PSII. Für die Assoziation dieser Trimere mit PSI scheint dann, wie von LUNDE und Mitarbeitern

(2000) gezeigt der PSI-H Untereinheit der PSI eine besondere Funktion zuzukommen. Die

Phosphorylierungsstelle in Lhcb1-Proteinen liegt in unmittelbarer Nähe des N-Terminus

(MULLET , 1985). Jedoch läßt sich der genaue Aminosäurerest, der phosphoryliert wird, nicht so

eindeutig definieren, wie dies für andere PSII-Phosphoproteine möglich ist (RINTAMÄKI & ARO

2001). So ist das Thr-5 (Nummerierung beginnend mit dem Arginin des processierten Proteines)

in synthetischen Peptiden, die zum N-Terminus des Lhcb1-Proteines der Erbse analog sind, die

am meisten phosphorylierte Aminosäure (MICHEL & BENNETT, 1989). Ist dieser Threoninrest in

den synthetischen Peptiden nicht vorhanden, werden andere Threoninreste oder Serinreste in

unmittelbarer Nähe phosphoryliert (MICHEL & BENNETT 1989). Das Thr-5 ist nicht in allen

Aminosäuresequenzen von Lhcb1 oder Lhcb2-Proteinen konserviert (JANSSON 1999), was darauf

schließen läßt, daß andere Threonin- oder Serinreste dieser Proteine phosphoryliert werden

(DILLY-HARTWIG et al. 1998).

Die molekulare Grundlage für die LHCII-Phosphorylierung ist auch in den LHCII-Sequenzen

von M. polymorpha vorhanden. Die N-terminalen Regionen der LHCII-Proteine LHCII-1.1,

LHCII-1.2, LHCII-1.4 und Lhcb2 weisen jeweils einen Threoninrest auf. Frühere

Untersuchungen lassen vermuten, daß bei M. polymorpha grundsätzlich auch state transitions

stattfinden. SCHMID und Mitarbeiter (1995) konnten bei photoautotrophen

Suspensionskulturzellen von M. polymorpha eine Verlagerung des LHCII in die

Stromamembranen als Folge von Lichtstress feststellen. HERRMANN und Mitarbeiter (1997)

wiesen zudem LHCII als Bestandteil einer PSI-Bande im Saccharosedichtegradienten nach.

Diskussion 96

4.2.3 Lhcb4-6

Insbesondere aufgrund der hohen Gehalte an Xanthophyllzykluspigmenten (BASSI et al. 1993)

wird den CAB-Proteinen Lhcb4-6 von Samenpflanzen eine wichtige Funktion bei der

Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie zugesprochen (BASSI et al. 1993, HORTON et al.

1996, NIYOGI 1999) (siehe Tab 3, 1.3.1.2). Ausgelöst durch einen niedrigen pH-Wert im Lumen

der Thylakoide, der sich infolge überschüssiger Anregungsenergie bildet, werden die Minoren

CAB-Proteine Lhcb4 und Lhcb5 protoniert (CROFTS & YERKES 1994, HORTON & RUBAN 1994,

WALTERS et al 1994, RUBAN & HORTON 1996, NIYOGI 1999). Gleichzeitig bedingt der niedrige

pH-Wert die Deepoxidation von Violaxanthin zu Zeaxanthin durch die Violaxanthin-

Deepoxidase. Die Bindung von Zeaxanthin und Protonen durch die Minoren CAB-Proteine mag

dann die für die Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie in Wärme nötigen

Konformationsänderungen auslösen (BILGER & BJÖRKMANN 1989, NIYOGI 1999).

JEGERSCHÖLD und Mitarbeiter (2000) propagieren, daß das Glutamat in Helix C sowie die drei

für Lhcb4 charakteristischen sauren Aminosäuren im Loop zwischen den Helices B und C die

Bindung von Ca2+-Ionen coordinieren. Bei niedrigem pH soll das NPQ dadurch getriggert

werden, daß sich die Koordination der Ca2+-Ionen verändert.

Auch für die CAB-Proteine Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 von M. polymorpha wurde gezeigt, daß sie

einen hohen Anteil des Xanthophylls Violoxanthin binden und daß die spektralen Eigenschaften

der Proteine denen der Samenpflanzen vergleichbar sind (KILIAN 1998). Die in dieser Arbeit

ermittelten Sequenzdaten für die Minoren CAB-Proteine von M. polymorpha zeigen, daß die

molekularen Grundlagen für vergleichbare Funktionen der Proteine beim NPQ vorliegen.

So sind zum einen die für Lhcb4-Proteine Höherer Pflanzen charakteristischen sauren

Aminosäuren im Loop zwischen den Helices B und C auch bei M. polymorpha hoch konserviert

(Abb. 25), ebenso wie die für Lhcb4 und Lhcb5 Proteine bekannten DCCD-Bindungsstellen.

DCCD bindet bevorzugt an saure Aminosäuren in hydrophoben Umgebungen, die an

Protonentranslokationen beteiligt sind und fungiert somit als ein Inhibitor des NPQ. Zwei

DCCD-Bindungdstellen wurden für Lhcb5-Proteine identifiziert (WALTERS & HORTON 1995).

Zum einen ist dies ein Glutaminsäurerest im Lumen-exponierten Loop zwischen Helix B und C,

zum anderen ein Glutaminsäurerest am C-Terminus des Proteines (Abb. 25). Lhcb5 weist andere

DCCD-Bindungsstellen auf als Lhcb4. PESARESI und Mitarbeiter identifizierten den Glutamat-

liganden für das Chl b6 als DCCD-Bindingsstelle in Lhcb4.

KILIAN (1998) ermittelte für die CAB-Proteine Lhcb4-6 von M. polymorpha um zwei bis drei

Einheiten basischere pI-Werte als für die homologen Proteine der Samenpflanzen beschrieben.

Die Ermittlung des Verhältnisses basischer zu sauren Aminosäuren aus den in dieser Arbeit

Diskussion 97

ermittelten Primärsequenzen ergab, daß die Verhältnisse in der Tat für alle drei Minoren CAB-

Proteine höher sind (Tab. 18, 3.1.2.2.2) und sich so die basischeren pI-Werte der Proteine im

Vergleich zu den homologen Proteinen der Samenpflanzen erklären lassen. Ob und welche

Auswirkungen dies jedoch auf die Funktion der Proteine hat, bleibt weiterhin in den Raum

gestellt. Auch für den Farn Ceratopteris richardii berichteten OBERSCHMIDT und Mitarbeiter

(1995) basischere pI-Werte der Lhcb4- und Lhcb5-Proteine.

Neben den Lhcb1 und Lhcb2-Proteinen ist das Lhcb4-Protein ein weiteres Lhcb-Protein für das

eine reversible Phosphorylierung beschrieben wurde. BERGANTINO und Mitarbeiter (1995)

berichteten von einer reversiblen Phosphorylierung des Lhcb4 bei Mais unter Licht- und

Kältestress in vivo. Phosphoryliert wird hierbei das Threonin-83 (TESTI et al. 1996), das in einer

für das Lhcb4 charakteristischen Stroma-exponierten Schleife vor der ersten transmembranen

Helix liegt. Über die Bedeutung dieser Phosphorylierung unter Licht- und Kältestress wird

jedoch immer noch spekuliert. CROCE und Mitarbeiter (1996) vermuten, daß die

Phosphorylierung eine Konformationsänderung des Proteines induziert, die sich wiederum auf

die Chlorophyll-Chlorophyll-Wechselwirkungen auswirkt. Dadurch soll ein dissipativer Zustand

erreicht werden, der das PSII-Reaktionszentrum bei Lichtstress entlasten kann (CROCE et al.

1996). Gestützt wird diese Annahme dadurch, daß Mais-Linien mit einer geringeren Fähigkeit

zur Phosphorylierung des Lhcb4 auch empfindlicher auf Licht und Kältestress reagieren

(MAURO et al. 1997). Wie schon von KILIAN und Mitarbeiter (1998) ermittelt und nun durch die

von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Lhcb4-Proteines von

M. polymorpha bestätigt, sitzt anstelle des Threonin-83 ein strukturell ähnliches aber nicht

phosphorylierbares Valin. Auch in unmittelbarer Nähe finden sich keine phosphorylierbaren

Aminosäurereste (Abb. 25). Phosphoryliertes Lhcb4 weist in SDS-Harnstoffgelen gegenüber der

Normalform ein verändertes Migrationsverhalten auf. Eine solche Form des Lhcb4 trat auch bei

Lichtstressbehandlung von phototrophen Suspensionskulturzellen von M. polymorpha nicht auf.

Ein Vergleich mit weiteren Sequenzdaten von Lhcb4-Proteinen von Bryophyten könnte klären,

ob die Phosphorylierungsstelle in Lhcb4 der Bryophyten generell nicht vorhanden ist und sich

erst im Verlauf der Evolution ein neuer protektiver Mechanismus entwickelt hat.

4.2.4 Verwandte der cab-Genfamilie

Als erstmals die Sequenz eines psbS-Gens ermittelt wurde (KIM et al. 1992, WEDEL et al. 1992),

herrschte großes Erstaunen über den hohen Grad an struktureller Ähnlichkeit des Proteines zu

den CAB-Proteinen. Die Sequenzähnlichkeit des PsbS-Proteins der Tomate zu dem Lhcb3-

Genprodukt beläuft sich zum Beispiel auf 44.4 % (FUNK 2001). Erst später wurde gezeigt, daß

Diskussion 98

das PsbS auch Chlorophyll a und b zu binden vermag, wenn auch in weitaus geringerem Maße

als andere CAB-Proteine (FUNK et al. 1995 a,b).

PsbS-Gensequenzen liegen inzwischen für verschiedene C3 und C4-Pflanzen vor (KIM et al.

1992, WEDEL et al. 1992, WALLBRAUN et al. 1994, IWASAKI et al. 1997, WYRICH et al. 1998,

JANSSON et al. 1999). Mittels polyklonaler Antikörper konnte das Protein auch in dem Farn

Nephrolepsis exaltata und in der Grünalge C. reinhardtii identifiziert werden. Die psbS-Gene

verschiedener Organismen sind sehr hoch konserviert. So beläuft sich die Übereinstimmung der

Sequenzen des psbS-Genes der Tomate und des Spinates auf 86% (WALLBRAUN et al. 1994). Die

Ähnlichkeit des psbS aus Reis zu dem aus Tomate liegt bei 84.4 %, zu dem des Spinates bei

80.6 % (IWASAKI et al. 1997).

Zwei der in dieser Arbeit analysierten EST-Klone von M. polymorpha codieren für jeweils einen

anderen Teilbereich eines PsbS-Proteines (3.1.2.3). Der Anteil identischer Aminosäuren der

beiden Teilsequenzen zu der entsprechenden Sequenz von A. thaliana liegt mit 92% für den N-

terminalen und mit 73 % für den C-terminalen Bereich ebenfalls sehr hoch.

Aufgrund der hohen Übereinstimmungen zwischen den PsbS-Proteinen verschiedener

Organismen, wird vermutet, daß dem PsbS eine essentielle Funktion zukommen muß. Mehrere

mögliche Funktionen werden diskutiert. Diese können dann auch für das PsbS aus

M. polymorpha in Frage kommen. Die relativ schwache Bindung der Pigmente und die geringe

Anzahl an Chlorophyllen sowie deren geringe excitonische Kopplung ließ vermuten, daß es als

„Liganden Chaperone“ fungiert und kurzfristig Sammelstelle für neu synthestisierte

Chlorophylle ist (FUNK 2001).

LI und Mitarbeiter (2000) konnten zeigen, daß eine an dem psbS-Gen defiziente Mutante von

A. thaliana kein NPQ ausführen konnte. Somit scheint eine wichtige Funktion des PsbS-

Proteines bei der Dissipitation überschüssiger Lichtenergie zu liegen. Da M. polymorpha

ebenfalls über ein PsbS-Protein verfügt und dieses, wie die ermittelten Teilsequenzen, vermuten

lassen, dem Höherer Pflanzen sehr ähnlich ist, liegt es nahe, daß dem Protein in M. polymorpha

eine ähnliche Funktion zukommt. Der vermutete protektive Mechanismus muß also schon sehr

alt und essentiell sein.

Nach derzeitiger Vorstellung gehen die Lichtsammelproteine aller photosynthetischen

Eukaryoten auf einen gemeinsamen Ursprung zurück. Aufgrund des hohen Grades an

Sequenzhomologie zwischen dem cyanobaktriellen HLIP, der ersten transmembranen Helix der

Sep-Proteine und der Helices I und III der CAB-Proteine von A. thaliana postulierten HEDDAD &

ADAMSKA (2000), daß die Sep-Proteine das fehlende Bindeglied in der derzeit favorisierten

Vorstellung zur Evolution der Antennenproteine von Pro-und Eukaryoten repräsentieren (siehe

1.1.3.3). Veröffentlichte Sequenzen liegen bisher nur für Sep-Proteine aus A. thaliana vor. Es

Diskussion 99

konnte jedoch auch ein dem Sep1 homologer cDNA-Klon von der Pappel sequenziert werden

(JANSSON 1999). Der in dieser Arbeit isolierte cDNA-Klon mit Ähnlichkeit zum Sep1-Protein

aus A. thaliana besitzt im Bereich der ersten transmembranen Helix 82 % Übereinstimmung zu

diesem. Die Übereinstimmung für die zweite transmembrane Helix beläuft sich nur noch auf

57% (Abb. 29). Alle weiteren Bereiche zwischen den Proteine unterscheiden sich sehr stark

voneinander. Dies läßt vermuten, daß es sich möglicherweise um einen anderen Typ eines Sep-

Proteines in M. polymorpha handelt. Auch der Vergleich der für A. thaliana ermittelten

Sequenzen der drei Sep-Proteintypen zeigt, daß die Sequenzähnlichkeit zwischen den drei Sep-

Proteinen weniger als 25 % beträgt. Höchste Ähnlichkeit besteht auch dort zwischen der ersten

transmembranen Helix, während die Helix II und der N-Terminus sehr polymorph sind und

zwischen den verschiedenen Sep-Proteinen stark variierten (ADAMSKA 2001).

Durch die für M. polymorpha ermittelte Sequenz konnte eindeutig gezeigt werden, daß die zur

ELIP-Familie gehörenden zwei Helix-Proteine nicht nur auf Höhere Pflanzen beschränkt sind.

Dies unterstützt nachhaltig die derzeitigen Vorstellungen zur Evolution der Lhc-Proteine.

4.3 Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha

Lhc-Gene waren unter den ersten pflanzlichen Genen, die isoliert und sequenziert wurden. Somit

ist es auch nicht verwunderlich, daß zahlreiche Untersuchungen bezüglich ihrer Expression

erfolgten. Allerdings beschränkten sich diese meist auf das Lhcb1-Gen. Expressionsmuster

wurden für verschiedenste physiologische Bedingungen, während verschiedener

Entwicklungsstadien und in den unterschiedlichsten pflanzlichen Organen ermittelt (PICHERSKY

& JANSSON 1996).

4.3.1 Diurnale Expression

Ein Charakteristikum der Lhc-Genexpression, das immer noch unbeantwortete Fragen aufwirft,

ist die diurnale Expression der Lhc-Gene in vielen pflanzlichen Species (MEYER et al. 1989,

NEVO et al. 1993, PIECHULLA et al. 1993, OBERSCHMIDT et al. 1995). Lhc-Gene der Vertreter der

verschiedensten Abteilungen des pflanzlichen Reiches werden diurnal exprimiert, was zu der

Vermutung führte, daß der Kontrollmechanismus, eine „circadiane Uhr“, ein sehr alter Prozess

ist (OBERSCHMIDT et al. 1995). Species der gymnospermen Coniferophytina bilden jedoch eine

Ausnahme, ebenso wie das Lebermoos C. conicum. Sie zeigen keine diurnale Akkumulation der

Lhc-mRNA. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsanalysen sprechen dafür, daß dies

kein generelles Merkmal für Lebermoose ist, denn wie gezeigt werden konnte, werden

verschiedene Lhc-Gene von M. polymorpha diurnal exprimiert (Abb. 32). Allerdings bestehen

Diskussion 100

charakteristische Unterschiede im Akkumulationsmuster, das im Vergleich zu dem bisher

bekannten zeitverschoben ist. Über die Gründe warum der regulatorische Mechanismus zur

Kontrolle der täglichen Expression der Lhc-Gene fehlt (Coniferophytina) oder wie im Fall von

M. polymorpha die diurnale Expression im Vergleich zu Angiospermen zeitverschobenen ist,

läßt sich, bislang leider nur spekulieren. Da Kinetiken zum CAB-Protein turnover bisher so gut

wie gar nicht vorliegen, läßt sich nicht mit Bestimmtheit sagen, ob das mittägliche bzw. spät

nachmittägliche Maximum (M. polymorpha) der Akkumulation von Lhc-mRNA sich auch auf

Proteinebene widerspiegelt und einem erhöhten Bedarf an Lhc-Protein entspricht. Diesbezüglich

sind weitere Untersuchungen unabdingbar, um so auch das Phänomen der diurnalen Lhc-

Genexpression besser zu verstehen.

OBERSCHMIDT und Mitarbeiter (1995) spekulierten, daß die diurnale Expression der Lhc-Gene in

einem direkten Zusammenhang damit steht, ob eine Pflanze nur auf einen lichtabhängigen

Chlorophyllbiosyntheseweg angewiesen ist, oder ob sie auch im Dunkeln Chlorophyll

synthetisierern kann. Coniferophytina können ebenso wie einige Species der Bryophyten

Chlorophyll unabhängig vom Licht synthetisieren (STAHL 1909, KOJIMA et al. 1992, CANOVAS et

al. 1993, YAMAMOTO et al. 1991). Die Synthese von Chl a und Chl b ist bei vielen Species eine

determinierende Voraussetzung für die Expression der CAB-Proteine (ALOSI & NEALE 1991)

und da viele CAB-Proteine ohne Pigmente nicht stabil sind (PAULSEN 2001) und das

Gefährdungspotential des Photosyntheseapparates durch freie Pigmente im Licht erhöht ist,

macht die unter der Kontrolle einer circadianen Uhr stehendende Lhc-Genexpression hochgradig

Sinn. So setzt mit Sonnenaufgang, wenn die Chlorophyllsynthese wieder einsetzt, auch vermehrt

die Expression der Lhc-Gene ein. In Pflanzen mit lichtunabhängigem Chlorophyllbio-

syntheseweg liegt der Chlorophyllgehalt im Dunkeln bei etwa 20-50 % von im Licht

gewachsenen Pflanzen (OBERSCHMIDT et al. 1995).

Die für M. polymorpha festgestellte zeitverschobene diurnale Expression der Lhc-Gene im

Vergleich zu Angiospermen, paßt sich insofern in diese Vorstellungen ein, daß M. polymorpha

ebenso wie C. conicum auch im Dunkeln Chlorophyll zu synthetisieren vermag (STAHL 1909).

Somit liegt bei Sonnenaufgang schon ein gewisser Gehalt an Chlorophyll in der Pflanze vor und

es Bedarf nicht einer solch erhöhten Lhc-Genexpression in den Vormittagsstunden. Warum

allerdings gerade in den späten Nachmittagsstunden nach 11h Lichtphase die Genexpression

erhöht ist, bleibt offen. Hier ist es unabdingbar zu untersuchen, in wieweit der erhöhte Lhc-

mRNA-Gehalt auch zu einem erhöhten Lhc-Proteingehalt führt.

Diskussion 101

4.3.2 Veränderte Expression des Sep1-ähnlichen Gens bei Lichtstress

Frühere Arbeiten vor allem an phototrophen Suspensionskulturzellen von M. polymorpha zeigen,

daß das Lebermoos M. polymorpha zu einer Starklichtanpassung in Folge von Lichtstress fähig

ist (PETER 1994, ROOS 1994, HERRMANN 1995, WÖLFEL 1998). Da Sep-Proteine Lichtstress-

induzierte Proteine sind (HEDDAL & ADAMSKA 2000), wird viel über eine mögliche Funktion

spekuliert, insbesondere aufgrund ihrer Zugehörigkeit zur Lhc-Genfamilie. Bislang liegen

Sequenzen für Sep-Proteine nur für A. thaliana vor. Hier konnte erstmalig gezeigt werden, auch

Bryophyten haben Sep-ähnliche Proteine. Da Sep-Proteine das bislang fehlende „missing link“

bei der derzeit gängigen Vorstellung zur Evolution der Lhc-Genfamilie darstellen, ist es umso

bedeutender zu zeigen, daß sich diese Proteine auch bei Bryophyten finden.

Für die Sep-Proteine von A. thaliana ist beschrieben, daß ihr mRNA-Gehalt in Folge von

Lichtstress drastisch ansteigt. Dies konnte auch für den mRNA-Gehalt des Sep1-ähnlichen

Proteins von M. polymorpha gezeigt werden. Die Reaktion erfolgt sogar sehr zügig, schon nach

2 h. Ist dies ein Hinweis auf eine ganz besondere Funktion dieses Proteines bei Lichtstress?

Zunächst müßte die Frage geklärt werden, ob sich der erhöhte mRNA-Gehalt auch wirklich auf

Proteinebene widerspiegelt.

4.4 Ausblick

Durch das hier erarbeitete und vorgestellte Datenmaterial ergeben sich eine Reihe weiterer

Fragestellungen und Forschungsansätze. Insbesondere die Fülle der hier gewonnenen Sequenzen

für das nukleäre Genom von M. polymorpha wartet auf eine weitere Auswertung. Zum einen

würde die Klassifizierung der EST-Sequenzen nach Funktionen der von ihnen codierten Proteine

wichtige Informationen über diesen Organismus liefern. Ganz besonders mit dem Augenmerk

auf seine phylogenetische Stellung. Zum anderen steht der Vergleich zwischen den EST-

Sequenzen, der zwei verschiedenen cDNA-Bibliotheken von M. polymorpha aus. Darüber

könnten wichtige Informationen gewonnen werden, welchen Proteinen und Stoffwechselwegen

bei Lichtstress eine besondere Funktion zukommt.

Aufgrund der hier ermittelten CAB-Proteinsequenzen lassen sich Antikörper generieren, die

eingesetzt werden sollen, um in der Einzelpartikelanalyse mittels Elektronenmikroskopie eine

Lokalisierung der einzelen CAB-Proteine innerhalb der Antenne des PSII vorzunehmen. Ein

schwieriges Unterfangen, das aber, wenn es gelingen würde, wesentlich zum Verständnis der

pflanzlichen PSII-Antenne und ihrer einzelnen Pigmente beitragen könnte.

Diskussion 102

Die weitere Sequenzierung von EST-Klonen von M. polymorpha wäre sinnvoll, um mehr Lhca-

Sequenzen zu gewinnen. Denn über den LHCI von M. polymorpha ist weit weniger bekannt als

über den LHCII.

Ganz besonders interessant wäre es, das Sep1-ähnliche Protein von M. polymorpha näher zu

charakterisieren. Bisher ist es das einzige für eine Niedere Pflanze ermittelte. Zudem scheint es

möglicherweise ein eigener Typ eines Sep-Proteins zu sein. Über die Funktion dieser Proteine ist

bislang sehr wenig bekannt, auch ob sie überhaupt Chlorophylle zu binden vermögen, bedarf

noch erst einer eingehenden Untersuchung.

103

5 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig die cab-Genfamilie eines Bryophyten detailiert

untersucht. Untersuchungen der Chlorophyll a/b bindenden (CAB) Lichtsammelproteinen

erstreckten sich bislang vorwiegend auf Samenpflanzen und einige wenige Algengruppen.

Aufgrund der taxonomischen Zwischenstellung des hier untersuchten Lebermooses

M. polymorpha, komplementieren die gewonnenen Daten das bisherige Bild von der

molekularen Entwicklung dieser Genfamilie.

12 Mitglieder der cab-Genfamilie von M. polymorpha wurden über zwei verschiedene

methodische Ansätze identifiziert. Neun der ermittelten cDNA-Sequenzen lassen sich Proteinen

des Antennens ystems des PSII zuordnen, eine Sequenz dem des PSI. Weiterhin konnte für das

ebenfalls zur cab-Genfamilie Höherer Pflanzen zählende PsbS-Protein eine Teilsequenz ermittelt

werden, sowie eine dem Sep1-Protein von A. thaliana ähnliche Sequenz.

Anhand der gewonnenen Daten kann zwar wenig bezüglich der Antenne des PSI von

M. polymorpha ausgesagt werden, doch bezüglich des PSII weist die Zusammensetzung der cab-

Genfamilie darauf hin, daß sich der Aufbau des LHCII aus den verschiedenen Lhcb-Proteinen

seit mehr als 480 Millionen Jahren, seit den primitivsten Landpflanzen, nicht mehr gravierend

verändert hat. Dafür spricht abgesehen von der Zusammensetzung der Genfamilie auch der hohe

Grad an Sequenzhomologie zwischen den CAB-Proteinen von M. polymorpha und denen der

Samenpflanzen. Im Vergleich zur Grünalge C. reinhardtii sind bei M. polymorpha zwei Lhcb-

Proteine, das Lhcb2 und das Lhcb3 schon entwickelt. Ein eindeutig dem Lhcb1 Protein Höherer

Pflanzen zuzuordnendes Protein konnte hingegen nicht gefunden werden. Da stattdessen LHCII-

Proteine gefunden wurden (LHCII1.1-1.4), die eine Mischform aus Lhcb1- und Lhcb2-Protein

Höherer Pflanzen darzustellen scheinen, liegt die Vermutung nahe, daß sich das Lhcb1 erst

später aus einem solchen entwickelte. Die Primärsequenzen der für M. polymorpha ermittelten

CAB-Proteine geben ferner einen Hinweis darauf, daß die differenzierten Funktionen der

meisten CAB-Proteine wohl schon vor der Trennung der Bryophyten von den Farnpflanzen, aus

denen sich die Samenpflanzen entwickelten, festgelegt waren.

Sep-Proteine sind erst kürzlich entdeckt und der Proteinfamilie der Elips zugeordnet worden.

Sequenzen lagen bisher nur für drei Proteine aus A. thaliana vor. Erstmalig konnte hier eine für

ein Sep1-ähnliches Protein codierende cDNA Sequenz auch in einer Niederen Pflanze

nachgewiesen werden. Wie der Anstieg des mRNA-Gehaltes in Folge von Lichtstress zeigt,

scheint es sich bei dem Sep1-ähnlichen Protein von M. polymorpha ebenfalls um ein Lichtstress-

induziertes Protein zu handeln. Seine funktionelle Bedeutung ist allerdings noch völlig unklar.

Zusammenfassung 104

Anhand von Expressionsanalysen konnte geteigt werden, daß einzelne cab-Gene von

M polymorpha ebenfalls wie die der Angiospremen diurnal exprimiert werden. Gründe für das

zeitverschobene Akkumulationsmuster sind allerding sehr schwer auszumachen. Die Frage,ob

sich ein erhöhter mRNA-Spiegel auch auf Proteinebene widerspiegelt, muß erst noch durch

entsprechendeUntersuchungen ermittelt werden.

105

6 Literaturverzeichnis

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119

7 Anhang

Im folgenden werden die Ergebnisse der Annotierung der in dieser Arbeit ermittelten EST-

Sequenzen für M. polymorpha aufgelistet.

Anhang 120

Contig /Klone

Länge

(Basen)

Score

(bits) Identifizierung Organismus

5 712 137

HYPOTHETICAL OXIDOREDUCTASE IN ADD-NTH

INTERGENIC REGION Escherichia coli

9 549 117

PERIOD CIRCADIAN PROTEIN 1 (CIRCADIAN

PACEMAKER PROTEIN RIGUI) (HPER) Homo sapiens (Human)

44 619 147

HYPOTHETICAL 9.8 KD PROTEIN ZK652.3 IN

CHROMOSOME III Caenorhabditis elegans

114 1080 124

PROBABLE PHOSPHATIDYLINOSITOL-4-PHOSPHATE 5-

KINASE MSS4

Saccharomyces cerevisiae

(Baker's yeast)

137 753 178

SUCCINATE DEHYDROGENASE [UBIQUINONE] IRON-

SULFUR PROTEIN

Drosophila melanogaster

(Fruit fly)

167 700 215 SERINE--GLYOXYLATE AMINOTRANSFERASE (SGAT)

Hyphomicrobium

methylovorum

193 637 129 40S RIBOSOMAL PROTEIN S27

Xenopus laevis (African

clawed frog)

UC04P.D04 390 170

2-OXOGLUTARATE DEHYDROGENASE E1

COMPONENT, MITOCHONDRIAL PRECURSOR Saccharomyces cerevisiae

UC02P.H08 330 119 40S RIBOSOMAL PROTEIN S3

Ambystoma mexicanum

(Axolotl)

UC04P.G01 423 140 40S RIBOSOMAL PROTEIN S9 Podospora anserina

UC06P.C01 541 126 50S RIBOSOMAL PROTEIN L18 Bacillus stearothermophilus

UC10P.H05 611 116

ADENYLATE KINASE (ATP-AMP

TRANSPHOSPHORYLASE) (SUPEROXIDE-INDUCIBLE

PROTEIN 16) (SOI16) Bacillus subtilis

UC09P.H04 583 168 NIFS PROTEIN HOMOLOG Haemophilus influenzae

UC01P.D11 508 217 PUTATIVE ATP-DEPENDENT RNA HELICASE STE13

Schizosaccharomyces

pombe (Fission yeast)

UC05P.H01 377 120

SERINE/THREONINE PROTEIN PHOSPHATASE 5 (PP5)

(PROTEIN PHOSPHATASE T) Rattus norvegicus (Rat)

UC03P.G11 415 129 SEVERIN

Dictyostelium discoideum

(Slime mold)

UC01P.B11 402 116

VACUOLAR ATP SYNTHASE SUBUNIT C (V-ATPASE C

SUBUNIT) (VACUOLAR PROTON PUMP C SUBUNIT)

Dictyostelium discoideum

(Slime mold)

UD08P.E10 667 194

3-HYDROXYISOBUTYRATE DEHYDROGENASE

PRECURSOR (HIBADH) Rattus norvegicus (Rat)

UD09P.B12 688 120

ATP-DEPENDENT CLP PROTEASE PROTEOLYTIC

SUBUNIT (ENDOPEPTIDASE CLP) Bacillus halodurans

UD06P.B05 579 101

BIFUNCTIONAL PURINE BIOSYNTHESIS PROTEIN

PURH Aquifex aeolicus

UD02P.G11 520 132

COATOMER BETA' SUBUNIT (BETA'-COAT PROTEIN)

(BETA'-COP) (P102) Homo sapiens (Human)

UD07P.F02 663 113

GLUTATHIONE S-TRANSFERASE THETA 1 (GST CLASS-

THETA) Mus musculus (Mouse)

UD09P.G04 580 100

GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE

(GAPDH) Candida albicans (Yeast)

UD04P.G08 687 215 HYPOTHETICAL 31.8 KD PROTEIN IN CHROMOSOME II Caenorhabditis elegans

UD01P.E07 495 110 NIFU-LIKE PROTEIN Rickettsia prowazekii

UD08P.H09 590 123

NUCLEAR TRANSPORT FACTOR 2 (NTF-2) (NUCLEAR

TRANSPORT FACTOR P10) Candida albicans (Yeast)

Anhang 121

UD09P.H10 541 137

PROBABLE LEUCYL-TRNA SYNTHETASE (LEUCINE--

TRNA LIGASE) (LEURS) Caenorhabditis elegans

UD10P.G06 610 161

PROTEASOME BETA CHAIN PRECURSOR (MACROPAIN

BETA CHAIN)

Xenopus laevis (African

clawed frog)

UD10P.C01 582 150

PROTEASOME SUBUNIT BETA TYPE 2 (PROTEASOME

COMPONENT C7-I) Mus musculus (Mouse)

UD06P.B08 622 125

SPLICEOSOME ASSOCIATED PROTEIN 62 (SAP 62)

(SPLICING FACTOR 3A Mus musculus (Mouse)

UD08P.B03 578 190 WD40-REPEAT CONTAINING PROTEIN CIAO 1 Homo sapiens (Human)

Contig / Klone

Länge

(Basen))

Score

(bits) Identifizierung Organismus

53 538 181

(S)-2-HYDROXY-ACID OXIDASE, PEROXISOMAL

(GLYCOLATE OXIDASE) (GOX)

Spinacia ol eracea

(Spinach)

60 571 172

2-CYS PEROXIREDOXIN BAS1 PRECURSOR (THIOL-

SPECIFIC ANTIOXIDANT)

Spinacia oleracea

(Spinach)

UD02P.C04 447 130

3-ISOPROPYLMALATE DEHYDROGENASE

PRECURSOR (BETA-IPM DEHYDROGENASE) Brassica napus (Rape)

UC09P.G08 585 267 40S RIBOSOMAL PROTEIN S11 Glycine max (Soybean)

UC02P.D02 417 200 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15A (PPCB8) Brassica napus (Rape)


Gossypium hirsutum

(Upland cotton)


Arabidopsis thaliana

(Mouse-ear cress)

29 415 166 40S RIBOSOMAL PROTEIN S19 Oryza sativa (Rice)

94 616 160 40S RIBOSOMAL PROTEIN S23 (S12)

Fragaria ananassa

(Strawberry)



(Mouse-ear cress)

116 575 258 40S RIBOSOMAL PROTEIN S3A (CYC07 PROTEIN)

Catharanthus roseus (Rosy

periwinkle)

UD07P.A05 457 201 40S RIBOSOMAL PROTEIN S5

Cicer arietinum (Chickpea)

(Garbanzo)

UD07P.D01 605 233 40S RIBOSOMAL PROTEIN S8 Oryza sativa (Rice)

UD04P.G11 658 188

50S RIBOSOMAL PROTEIN L15, CHLOROPLAST

PRECUR

Pisum sativum (Garden

pea)

UD09P.B10 575 213


PRECURSOR (CL24)

Nicotiana tabacum

(Common tobacco)

UD05P.B06 585 116


PRECURSOR (CL28)

Nicotiana tabacum

(Common tob acco)

62 938 381 60S ACIDIC RIBOSOMAL PROTEIN P0 Glycine max (Soybean)

183 676 326 60S RIBOSOMAL PROTEIN L10 (EQM)

Solanum melongena

(Eggplant) (Aubergine)

UC01P.H06 450 252 60S RIBOSOMAL PROTEIN L11 (L5) Medicago sativa (Alfalfa)

123 548 141 60S RIBOSOMAL PROTEIN L12 Prunus armeniaca (Apricot)

UC10P.B05 557 263 60S RIBOSOMAL PROTEIN L15-1

Picea mariana (Black

spruce)

UD09P.G06 597 320

60S RIBOSOMAL PROTEIN L2 (L8) (RIBOSOMAL

PROTEIN TL2)

Lycopersicon esculentum

(Tomato)

Anhang 122

UD10P.E12 472 198

60S RIBOSOMAL PROTEIN L2 (L8) (RIBOSOMAL

PROTEIN TL2)


(Tomato)

159 560 180 60S RIBOSOMAL PROTEIN L23A Fritillaria agrestis

UC09P.A03 632 148 60S RIBOSOMAL PROTEIN L26 Brassica rapa (Turnip)

11 587 141 60S RIBOSOMAL PROTEIN L27


pea)



pea)



(Mouse-ear cress)


Nicotiana tabacum

(Common tobacco)



(Mouse-ear cress)

160 646 183 60S RIBOSOMAL PROTEIN L37A

Pseudotsuga menziesii

(Douglas-fir)



(Mouse-ear cress)


Gossypium hirsutum

(Upland cotton)

107 553 253 60S RIBOSOMAL PROTEIN L5 Oryza sativa (Rice)

UD04P.F02 613 236 60S RIBOSOMAL PROTEIN L6 (YL16-LIKE)

Mesembryanthemum

crystallinum (Common ice

plant)

174 570 286 ACTIN 2/7


(Mouse-ear cress)

76 719 316

ALCOHOL DEHYDROGENASE CLASS III

(GLUTATHIONE-DEPENDENT FORMALDEHYDE

DEHYDROGENASE) Oryza sativa (Rice)

UD06P.B10 560 190 ARGININE DECARBOXYLASE (ARGDC) (ADC)

Brassica juncea (Leaf

mustard)

UC02P.E02 441 180

ASPARTATE AMINOTRANSFERASE, CHLOROPLAST

PRECURSOR


(Mouse-ear cress)

UC02P.E01 377 178 ATP SYNTHASE A CHAIN (PROTEIN 6) Marchantia polymorpha

UD06P.G02 542 156

ATP SYNTHASE GAMMA CHAIN 1, CHLOROPLAST

PRECURSOR


(Mouse-ear cress)

177 608 215 CALMODULIN

Helianthus annuus

(Common sunflower)

184 638 134

CARBONIC ANHYDRASE 2 (CARBONATE

DEHYDRATASE 2)


(Mouse-ear cress)

119 669 327 CATALASE

Phaseolus aureus (Mung

bean)

UD10P.F12 607 133 CATIONIC PEROXIDASE 2 PRECURSOR Arachis hypogaea (Peanut)

UD09P.F01 599 257 CELL DIVISION CYCLE PROTEIN 48 HOMOLOG


(Mouse-ear cress)

15 443 123

CHALCONE SYNTHASE (NARINGENIN-CHALCONE

SYNTHASE) Hydrangea macrophylla

111 612 178

CHALCONE SYNTHASE (NARINGENIN-CHALCONE

SYNTHASE) Hydrangea macrophylla

70 715 129 CHAPERONIN 20 KD, CHLOROPLAST PRECURSOR

(PROTEIN CPN10)


(Mouse-ear cress)

Anhang 123

(PROTEIN CPN10) (Mouse-ear cress)

UC06P.F02 510 122

CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN 1 PRECURSOR

(LHCII TYPE I CAB-1)

Sinapis alba (White

mustard)

127 572 244


(LHCII TYPE III


(Tomato)

UC05P.E02 520 164


(LHCI TYPE III CAB-4)


(Mouse-ear cress)

88 609 261


(LHCII TYPE I CAB-4


(Tomato)

35 601 162




(Tomato)

72 498 232




(Tomato)

178 628 310




(Tomato)

188 661 294

CHLOROPHYLL A-B BINDING PROTEIN PRECURSOR

(LHCII TYPE I CAB)

Silene pratensis (White

campion)

UD06P.E05 612 320 CHLOROPLAST 30S RIBOSOMAL PROTEIN S4 Marchantia polymorpha

UC10P.G08 594 197 CHLOROPLAST 50S RIBOSOMAL PROTEIN L16 Marchantia polymorpha

UC10P.H11 543 249 CHLOROPLAST 50S RIBOSOMAL PROTEIN L2 Marchantia polymorpha

97 620 174 CINNAMYL-ALCOHOL DEHYDROGENASE 2 (CAD 2)

Picea abies (Norway

spruce)

57 485 206 CLATHRIN HEAVY CHAIN

Spinacia oleracea

(Spinach)

108 503 238 COP1 REGULATORY PROTEIN (FUSCA PROTEIN FUS1)


(Mouse-ear cress)

173 1064 355 CYTOCHROME B6

Marchantia polymorpha

(Liverwort)

UC08P.F02 610 212

CYTOCHROME B6-F COMPLEX IRON-SULFUR SUBUNIT

2 PRECURSOR (RIESKE IRON-SULFUR PROTEIN)

Nicotiana tabacum

(Common tobacco)

UD03P.B08 474 124

DIHYDROFLAVONOL-4-REDUCTASE (DFR)

(DIHYDROKAEMPFEROL 4-REDUCTASE)

Antirrhinum majus (Garden

snapdragon)

93 584 168 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA CHAIN


(Liverwort)

UC01P.E05 410 148 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA CHAIN Marchantia polymorpha

UD09P.H11 450 205 DNA-DIRECTED RNA POLYMERASE BETA" CHAIN Marchantia polymorpha

196 1801 858 ELONGATION FACTOR 1-ALPHA (EF-1-ALPHA) Vicia faba (Broad bean)

UD07P.E10 259 118 ELONGATION FACTOR TU (EF-TU)

Cyanophora paradoxa

[Cyanelle]

74 611 129

ELONGATION FACTOR TU, CHLOROPLAST

PRECURSOR (EF-TU) Glycine max (Soybean)

UC09P.A08 576 170 ENDOCHITINASE CH25 PRECURSOR Brassica napus (Rape)

UC06P.D07 554 103 ETHYLENE- INDUCIBLE PROTEIN HEVER

Hevea brasiliensis (Para

rubber tree)

81 857 349

EUKARYOTIC INITIATION FACTOR 4A-11 (EIF-4A-11)

(EIF4A-11)

Nicotiana tabacum

(Common tobacco)

169 721 150 FERREDOXIN


(Liverwort)

175 574 180

FRUCTOSE-BISPHOSPHATE ALDOLASE,

CHLOROPLAST PRECURSOR (ALDP) Oryza sativa (Rice)

Anhang 124

UD06P.A02 583 114

GLUCAN ENDO-1,3-BETA-GLUCOSIDASE GIV ((1->3)-

BETA-GLUCAN Hordeum vulgare (Barley)

40 644 296 GLUTAMATE DEHYDROGENASE 2 (GDH 2)


(Mouse-ear cress)

19 429 128

GLUTAMINE SYNTHETASE NODULE ISOZYME

(GLUTAMATE--AMMONIA LIGASE)

Vigna aconitifolia

(Mothbean)

UD09P.G01 616 110

GLUTATHIONE S-TRANSFERASE (GST CLASS-PHI) (25

KD AUXIN-BINDING


(Mouse-ear cress)

144 638 222

GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE

A, CHLOROPLAST PRECURSOR

Nicotiana tabacum

(Common tobacco)

129 627 121

GLYCINE CLEAVAGE SYSTEM H PROTEIN,

MITOCHONDRIAL PRECURSOR

Mesembryanthemum

crystallinum (Common ice

plant)

28 618 136 GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN Daucus carota (Carrot)

UD03P.B09 438 105 HEAT SHOCK PROTEIN (HSP 18.1) 18.1 KD CLASS I


pea)

UC10P.B10 486 302 HEAT SHOCK PROTEIN 83

Pharbitis nil (Viol et)

(Japanese morning glory)

98 621 148 HEVEIN-LIKE PROTEIN PRECURSOR


(Mouse-ear cress)

UD05P.A08 353 133

HYDROXYACYLGLUTATHIONE HYDROLASE,

MITOCHONDRIAL PRECURSOR


(Mouse-ear cress)

UD08P.H02 564 140

HYPOTHETICA L 11.1 KD PROTEIN IN NAD3-NAD7

INTERGENIC REGION Marchantia polymorpha

145 834 213

HYPOTHETICAL 19.6 KD PROTEIN IN RPS1-NAD4L

INTERGENIC REGION (ORF172)


(Liverwort)

UD07P.F07 487 208 HYPOTHETICAL 259 KDA PROTEIN (ORF 2136) Marchantia polymorpha

37 820 296 INITIATION FACTOR 5A-2 (EIF-5A) (EIF-4D)

Nicotiana plumbaginifolia

(Leadwort-leaved tobacco)

146 587 229 L-ASCORBATE PEROXIDASE, CYTOSOLIC (AP)


pea)

132 667 226

MALATE DEHYDROGENASE, GLYOXYSOMAL

PRECURSOR

Citrullus lanatus

(Watermelon)

140 608 225

MALATE DEHYDROGENASE, MITOCHONDRIAL

PRECURSOR

Citrullus lanatus

(Watermelon)

69 716 106 MANNOSE-SPECIFIC LECTIN (AGGLUTININ)

Aloe arborescens (Kidachi

aloe)

UD04P.F07 527 169 MARPO MITOCHONDRIAL RIBOSOMAL PROTEIN S7 Marchantia polymorpha

79 908 153 MITOCHONDRIAL RIBOSOMAL PROTEIN S3


(Liverwort)

UC07P.D10 176 120

NADH-PLASTOQUINONE OXIDOREDUCTASE CHAIN 1,

CHLOROPLAST Marchantia polymorpha

52 477 275

NADH-PLASTOQUINONE OXIDOREDUCTASE SUBUNIT

K


(Liverwort)

143 725 253

NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE 20 KDA

SUBUNIT PRECURSOR (COMPLEXI-20KD)


(Mouse-ear cress)

UD01P.H10 429 115

NADP-DEPENDENT MALIC ENZYME, CHLOROPLAST

PRECURSOR (NADP-ME) Oryza sativa (Rice)

UC02P.D03 431 107

OUTER MITOCHONDRIAL MEMBRANE PROTEIN PORIN

36 KDA

Solanum tuberosum

(Potato)

Anhang 125

UD10P.H04 656 293 PHENYLALANINE AMMONIA -LYASE Pinus taeda (Loblolly pine)

136 1030 700

PHOTOSYSTEM I P700 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN

A2


(Liverwort)

UD09P.B06 495 243

PHOTOSYSTEM I P700 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN

A2 Marchantia polymorpha

166 1299 250

PHOTOSYSTEM I REACTION CENTRE SUBUNIT III

PRECURSOR (PSI-F)

Spinacia oleracea

(Spinach)

36 595 119

PHOTOSYSTEM I REACTION CENTRE SUBUNIT N

PRECURSOR (PSI-N) Hordeum vulgare (Barley)

18 445 206

PHOTOSYSTEM II P680 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN

(CP-47 PROTEIN)


(Liverwort)

UC10P.C07 455 221

PHOTOSYSTEM II P680 CHLOROPHYLL A APOPROTEIN

(CP-47 PROTEIN) Marchantia polymorpha

147 1177 470

PHOTOSYSTEM Q(B) PROTEIN (32 KD THYLAKOID

MEMBRANE PROTEIN)(PHOTOSYSTEM II PROTEIN D1)


(Liverwort)

22 400 114

PLASMA MEMBRANE INTRINSIC PROTEIN 1B

(TRANSMEMBRANE PROTEIN A)


(Mouse-ear cress)

UC07P.E03 600 191

PROBABLE 60 RIBOSOMAL PROTEIN L14

(HYDROXYPROLINE RICH GLYCOPROTEIN


pea)

170 635 385

PROBABLE CLPP-LIKE PROTEASE (ENDOPEPTIDASE

CLP) (ORF 203)


(Liverwort)

67 702 153

PROBABLE COATOMER EPSILON SUBUNIT (EPSILON-

COAT PROTEIN)


(Mouse-ear cress)

UC09P.D03 631 257 PROBABLE CYTOCHROME C BIOSYNTHESIS PROTEIN Marchantia polymorpha

UD08P.A11 548 128

PROBABLE METHIONINE AMINOPEPTIDASE 1 (METAP

1) (PEPTIDASE M 1)


(Mouse-ear cress)

UD02P.B02 455 205

PROTEASOME SUBUNIT ALPHA TYPE 2 (20S

PROTEASOME ALPHA SUBUNIT B) Oryza sativa (Rice)

126 634 207

PROTEIN TRANSLATION FACTOR SUI1 HOMOLOG

(GOS2 PROTEIN) Oryza sativa (Rice)

UD08P.F05 548 215

PROTOCHLOROPHYLLIDE REDUCTASE,

CHLOROPLAST PRECURSOR (PCR) Marchantia paleacea

133 623 152

PUTATIVE LACTOYLGLUTATHIONE LYASE

(METHYLGLYOXALASE)

Brassica oleracea

(Cauliflower)

UC07P.B05 556 134

PUTATIVE RECEPTOR PROTEIN KINASE ZMPK1

PRECURSOR Zea mays (Maize)

UD04P.D04 620 258 RAS-RELATED PROTEIN RAB11B

Nicotiana tabacum

(Common tobacco)

151 597 198

RIBULOSE BISPHOSPHATE CARBOXYLASE SMALL

CHAIN PRECURSOR (RUBISCO SMALL SUBUNIT) Marchantia paleacea

168 943 305



171 698 202



172 664 194



181 660 306



190 676 299



Anhang 126

197 698 173



198 697 178



87 564 145

RIBULOSE BISPHOSPHATE

CARBOXYLASE/OXYGENASE ACTIVASE,

CHLOROPLAST Malus domestica (Apple)

113 1343 326

S-ADENOSYLMETHIONINE DECARBOXYLASE

PROENZYME (ADOMETDC) (SAMDC)

Pharbitis nil (Violet)

(Japanese morning glory)

135 930 488

SERINE HYDROXYMETHYLTRANSFERASE,

MITOCHONDRIAL PRECURSOR (SERINE

Solanum tuberosum

(Potato)

UC09P.B09 633 234

SERINE HYDROXYMETHYLTRANSFERASE,

MITOCHONDRIAL PRECURSOR (SERINE METHYLASE)

Solanum tuberosum

(Potato)

UC07P.A08 634 138 SUCCINYL-COA LIGASE [GDP-FORMING] ALPHA -CHAIN


(Mouse-ear cress)

UD06P.B03 650 229

THIAZOLE BIOSYNTHETIC ENZYME, CHLOROPLAST

PRECURSOR

Citrus sinensis (Sweet

orange)

103 626 142 THIOREDOXIN H-TYPE (TRX-H)

Picea mariana (Black

spruce)

47 550 133

TONOPLAST INTRINSIC PROTEIN, GAMMA (GAMMA

TIP) (AQUAPORIN-TIP)


(Mouse-ear cress)

55 821 195

TRANS-CINNAMATE 4-MONOOXYGENASE (CINNAMIC

ACID 4-HYDROXYLASE) Zinnia elegans

75 554 197

TRANSLATIONALLY CONTROLLED TUMOR PROTEIN

HOMOLOG (TCTP)

Hevea brasiliensis (Para

rubber tree)

UC04P.C02 462 192 TUBULIN ALPHA -2/ALPHA-4 CHAIN


(Mouse-ear cress)

UD03P.E05 484 113

UBIQUINOL-CYTOCHROME C REDUCTASE COMPLEX

7.8 KDA PROTEIN

Solanum tuberosum

(Potato)

131 777 150 UBIQUITIN Glycine max (Soybean)

UC04P.E03 481 174

VACUOLAR ATP SYNTHASE 16 KD PROTEOLIPID

SUBUNIT Oryza sativa (Rice)

Contig / clone

length

(bases)

Score

(bits) putative identification organsim

53 538 181

(S)-2-HYDROXY-ACID OXIDASE, PEROXISOMAL

(GLYCOLATE OXIDASE) (GOX)

Spinacia oleracea

(Spinach)

60 571 172

2-CYS PEROXIREDOXIN BAS1 PRECURSOR (THIOL-

SPECIFIC ANTIOXIDANT)

Spinacia oleracea

(Spinach)

UD02P.C04 447 130

3-ISOPROPYLMALATE DEHYDROGENASE

PRECURSOR (BETA-IPM DEHYDROGENASE) Brassica napus (Rape)

UC09P.G08 585 267 40S RIBOSOMAL PROTEIN S11 Glycine max (Soybean)

UC02P.D02 417 200 40S RIBOSOMAL PROTEIN S15A (PPCB8) Brassica napus (Rape)


Gossypium hirsutum

(Upland cotton)



(Mouse-ear cress)

29 415 166 40S RIBOSOMAL PROTEIN S19 Oryza sativa (Rice)

94 616 160 40S RIBOSOMAL PROTEIN S23 (S12)

Fragaria ananassa

(Strawberry)

127

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, mich in den letzten drei Jahren unterstützt und damit wesentlich zu dieser Arbeit beigetragen haben.

Mein ganz großer Dank gilt Frau Prof. Dr. F. Koenig: ohne unsere Aufnahme in ihre Arbeitsgruppe wäre das Projekt zu dieser Arbeit niemals zustande gekommen und ich hätte mich für ein anderes Thema entscheiden müssen. Als sich dann die „Elternlosigkeit“ anbahnte, hat sie sofort und ohne großes Zögern die „Patenschaft“ übernommen. Dafür, für die stetige Unterstützung und die anregenden Diskussionen möchte ich mich bedanken.

Großer Dank gilt auch Dr. Stefan Jansson und seiner Arbeitsgruppe. Die insgesamt vier Monate, die ich am Institut für Pflanzenphysiologie der Universität Ume å (Schweden) verbringen durfte, haben wissenschaftlich wesentlich zu dem beigetragen, was aus dieser Arbeit geworden ist. Es war eine sehr schöne Zeit, die ich niemals vergessen werde. Kirsten, Jenny, Ulrika, Johanna und Karsten sei in diesem Zuge für die herzliche Aufnahme im Labor gedankt.

PD Dr. Christian Schäfer danke ich für die Vergabe des Themas zu dieser Arbeit und die anfängliche Hilfsbereitschaft.

Dr. Thomas Hiltonen (Universität Ume å, Schweden) danke ich für die Einweisung in die EST-Sequenzierung und die Bioinfomatik sowie für die Durchführung eines Teils davon.

Dr. Thomas Hurek (Arbeitsgruppe Fr. Prof. Dr. B. Reinhold-Hurek,Universität Bremen) danke ich für die Einweisung in die Sequenzierung am ALF.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) danke ich für die Finanzierung der Arbeit. Der FNK (Universität Bremen) sei für das dreimonatige Abschlußstipendium gedankt. Ganz herzlichen Dank an Annette Hintelmann, Guido Lützenkirchen, Dorothea Mangels, Petra Jöstingmeyer, Tall Pressler und unserem „Ehrenmitglied“ Frank Klimmek: ohne Euch wären mir die „Cyanos“ immer noch suspekt. Danke für die Zusammenarbeit und die uneigennützige Unterstützung, nicht nur in wissenschaftlichen Dingen.

Annette Hintelmann und Dorothea Mangels danke ich für das Korrekturlesen der Arbeit und für die seelische Unterstützung gerade in der letzten Phase.

Meinem Mann Horst Heitmann danke ich für Liebe und Unterstützung während der letzten drei Jahre.

Documents

Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine …elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/E-Diss309_Groke.pdf · Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine von Marchantia polymorpha