7.1. Mtodos de cristalizacin para protenasSi a la izquierda de la pantalla no se muestra el men de estos apuntes, use este enlace.La cristalizacin es el proceso mediante el cual las molculas se ordenan de un modo natural formando un retculo repetitivo que denominamos cristal. No es objeto de estas pginas hacer una presentacin exhaustiva de las diferentes tcnicas de cristalizacin que se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes pginas eb! " slo nos detendremos brevemente en algunas de las tcnicas ms extendidas que se usan para obtener cristales de protenas. #in embargo! para principiantes se recomienda leer el panfleto preparado por la UNESCO para crecer cristales nicos. $l experimento de cristalizacin comienza con una solucin de protena relativamente concentrada %entre & " '( mg)ml* a la que! de alg+n modo! se le a,ade lentamente alg+n reactivo! con la intencin de reducir la solubilidad de la protena " generar una precipitacin controlada de la misma. #i posteriormente se fuerza un incremento paulatino de concentracin " se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos n+cleos cristalinos cu"o ulterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tama,o adecuado para los experimentos de difraccin %entre (.- " (.' mm*.Los esquemas superiores muestran! genricamente las diferentes zonas de un sistema protena.precipitante en funcin de las concentraciones de ambos componentes.Las zonas de color amarillo %izquierda* " blanco %derecha* representas las condiciones en las que la protena estara solubilizada. $n la zona de color azul la protena dejara de ser soluble " aparecera como un precipitado. /mbas zonas estn separadas por otra %de color rosa* en donde existe una ligera sobresaturacin! idnea para la nucleacin "0or lo tanto! para maximizar la posibilidad de xito de un intento de cristalizacin! es necesario dise,ar distintos experimentos! partiendo de diferentes posiciones iniciales! es decir! de diferentes concentraciones de protena "precipitante %flechas de diferentes colores en el esquema de la derecha*.Esquema de un pocillo de cristalizacin con elmtodo de la gota colgante$l mtodo ms com+n para estos experimentos es el basado en la tcnica de la#e colocan unos pocos microlitros %-.& 1l* de la solucin de protena en el centro de un cubre.objetos de vidrio " se le a,aden otros tantos microlitros de la solucin del precipitante contenido en un pocillo! al cual previamente se le ha equilibrado su p2 mediante un tampn. $l cubre.objetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta " con l se tapa el pocillo mencionado. $ste sistema cerrado evolucionar por equilibrio de vapor " como la mezcla de protena " precipitante en la gota est menos concentrada que la solucin de precipitante en el pocillo! el agua de sta se evaporar! unindose a la solucin del pocillo. 3omo resultado de este proceso! la concentracin de la protena " del precipitante aumentarn lentamente en la gota! " si las condiciones son las adecuadas! se formarn cristales.$n el mercado existen cajas que contienen un n+mero elevado de estos pocillos %&4 o ms*! de tal modo que se puedan etiquetar " almacenar con facilidad para su ulterior observacin a travs de una lupa.microscopio! tal como se muestra en la figura de abajo.Caja de 24 pocillos para la cristalizacin de protenas#i las condiciones son adecuadas! los cristales crecen en la gota con la apariencia que se muestra en la imagen superior! tomada a travs de una lupa.microscopio.3omo a"uda en la preparacin de las diferentes condiciones de inicio! se han desarrollado robots de cristalizacin que simplificanmucho el proceso manual para rellenar las cajas que contienen las diferentes condiciones de prueba!de cristalizacin en segundos.La animacin del recuadro de la derecha muestra el proceso de crecimiento de cristales de lisozima %una protena mu" estable* desde un medio acuoso. La duracin del proceso! que en su pantalla es de escasos segundos! corresponde aproximadamente a unos 5( minutos reales. $ste es un caso relativamente excepcional en lo que a la velocidad de crecimiento cristalino se refiere! pues es mu" rpido.La pelcula original se puede encontrar en la pgina web que ofrece George M. Sheldric.3on esta misma enzima %lisozima*! el vdeo producido por 6ernhard 7upp nos muestra la relacin que existe entre una rpida nucleacin " la velocidad de crecimiento. 3uanto ma"or es el n+mero de n+cleos formados! menor es la velocidad de crecimiento! " por lo tanto menor ser el tama,o de los cristales obtenidos. 3omprese el tama,o %mucho menor* de los cristales que crecen en las imgenes de la derecha con los mostrados arriba.$xisten otras muchas tcnicas de cristalizacin que se usan para las protenas! tales como el de la gota sentada %similar al de la gota colgante*! botones de dilisis! microbatch... 2a"! adems! otras tcnicas mu" interesantes basadas en la difusin en geles! incluso con acupuntura! que el lector puede consultar en las pginas del !EC" !aboratorio de Estudios Cristalogrficos.Igualmente, el lector interesado puede visitar las pginas que, sobre los fen#$enos de cristali%aci#n en gotas" ofrece &erese 'ergfors de la Uni(ersidad de Uppsala.No podemos perder de vista la revolucin que va a significar para el supuesto 8cuello de botella8 de la cristalizacin %especialmente para las protenas*! la introduccin de la tcnica de la nanocristalografa en la escala de los femtosegundos! con tiempos de exposicin de la difraccin del orden de los femtosegundos! irradiando nanocr"stales con ra"os 9obtenidos mediante tcnicas de un laser de electrones libres %()ase este art*culo publicado en Nature +,-../ 01-" 12311*.