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Revista Médice de Costa Rica y Centroamélica XLI (527) 69·75; 1994
LABORATORIO
DIAGNOSTICODE LABORATORIODE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS
Rodrigo Siqueira-Batista *Luis Eduardo Meneses Quintas *'"Rubén Alberto Storino ***
SUMMARYIn the present paper it was intended
to establish the most important aspects onthe Chagas' Disease diagnosis, characterizing its laboratory stage. Were observed themajor assays, their indications, contra-indications and sensibility in the diferent phasesoC the disease (acute, indeterminated andchronic phases). We hope to be contributingthis way to widen the knowledge on this sosevere and prevalent disease.Key Words: Chagas's Disease. LaboratoryDiagnosis.
"'Entrenamiento del Departamento de Cirugía Cardíaca del HospitalUniversitario Pedro Ernesto (HUPE) y del Departamento deParasitología de la Facultad de Ciencias Médicas * VERJ.** Estudiante de Maestría en Farmacología por el Departamento deFarmacología Básica y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas,Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ).••• Doctor en Medjcina y profesor de la Universidad Nacional de LaPlata.1- Trabajo realizado en la Facultad de Ciencias Médicas -UERJ, y en elInstituto Cardjova.~ctllar de La Plata - INCALP (Agentjna).
INTRODUCCIONPodemos tener clara noción de la impor
tancia del diagnóstico de laboratorio de laenfermédad de Chagas, si tenemos en cuentaque solamente 5,0% de los individuos infectados presentan los síntomas y señales característicos de la patología 4,31. Veremos ahora losaspectos generales de los principales métodosde diagnóstico de laboratorio (Cuadro 1)
1- MÉTODOS DE DIAGNOSTICOPARASITOLOGICO
la) METODOS DIRECTOS:Utilizados preferentemente en la investi
gación de la enfermedad de Chagas (EC)aguda, por cuenta de la alta parasitemia característica de esta fase.
- Examen a fresco 4,27:
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CUADRO 1METODOS DE LABORATORIO UTILIZADOS EN LA
INVESTIGACION DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS.
Es un método sencillo y sensible, ensituaciones donde la parasitemia es elevada(fase aguda). Para realización del examen, secoge una gota de sangre del paciente (por ejemplo a través de punción digital), poniéndola enla lámina y cubriéndola con una laminilla. Selleva al microscopio en busca de formas tripomastigotas.
Diagnóstico Parasitológico
DIRECTO
Diagnóstico Inmunológico
punto inicial. Secar la lámina, fijarla y colorearla por el método de GIEMSA.
• Método de Deane y Kishner13:
Básase en el hecho de la lisis de eritrocitos puede ocurrir más rápidamente que la de lostripomastigotas sanguíneas. A Iml de sangreañádase 9 mi de agua destilada, póngaseinmedia-tamente después Iml de solución deNaCl a 17%, para mantener la osmolaridad delmedio y consecuentemente mantener los tripanosomas intactos. Se centrifuga a 2000 rpmpor 15 minutos, llévese el sedimento obtenidoal examen microscópico.
• Método de Silícones 28:
Se coloca la sangre sobre aceite de silicone de densidad 1075, el cual actúa como filtro. Después de centrifugada, los glóbulos rojos("más pesados") se depositan en el fondo de losparásitos, los leucocitos y las plaquetas quedanen el sobrante y es observado al microscopio.
• Floculación rápida
• Tripla centrifugación deMartín~Leubouef-Rouband
• Método de Strout• Punción biopsia de nódulos
linfáticos
• Examen en fresco _ Fijación del Complemento
• Gota gruesa • Hemoglutinación• Método de Deane e Kirchner • Inmunofluorescencia• Método de Silicones e Reacciones
InrnunoenzUnáticas• Aglutinación de látex
INDIRECTO• Inoculación en animales
sensibles• Xenodiagnóstico• Hemocultivos
• Gota gruesa 27,22:
Método preconizado por Salvador Mazza,consiste en colocar 2 o 3 gotas de sangre sobreuna lámina, reuniéndolas para confeccionar unaúnica mancha circular de Icm de diámetro.Después de la sangre secar, métese la lámina enagua destilada, para que ocurra hemolisis (y asíse torne más transparenteJ, se obtiene la coloración por el GIEMSA. Se examina al microscopio, averiguando la presencia de parásitos.
• Distensión Sanguínea 27:
S(i: coloca una pequeña porción de sangresobre una lámina (completamente desengrasada), próxima a una de sus extremidades. Seapoya otra lámina sobre la primera, en un ángulo de 45° y a seguir, se distende la gota a lolargo de la lámina, de modo de moverla del
• Método de la triple centrifugación deMartin.Leubouef.Rouboud 7:
Se deposita 10 mI de sangre venoso en untubo de ensayo conteniendo 1ml de solución a20% de citrato sódico. Se procede entonces trescentrifugaciones -la primera a 1800 rpm/7min.;la segunda a 2000 rpmllO min.; utilizando elsobrante de la anterior; y por fin a 2000 rpm/20mino con el residuo de la segunda centrifugación. De este último centrifugado se retira elsobrante y analiza el sedimento al microscopio.
• Método de Strout 32,7,
Se coge 5ml de sangre, se dejan enreposo a temperatura ambiente, para que lacoagulaci6n y retracción espontánea delcoágulo ocurra. Se centrifuga el suero obtenidoa l60g/5 min., para la separación de los eritrocitos aún en suspensión, y enseguida se hacenueva centrifugación a 350gll0 min., paraobtenci6n del sedimento que será observado enel microscopio. Este método tiene alta sensibilidad, pudiendo alcanzar 95% de éxito en la fase
Siqueira, Meneses, Storino: Enfermedad de Chagas 11
aguda 33,15.
. Punción Biopsia de Nódulos Linfáticos 30:Por su gran afinidad a las células del Sis
tema Retículo-Histiocitário ll ,12, el T.cruzj desdetemprano puede ser encontrado en n6dulos linfáticos, parasitando macrófagos, dispersos enexudato inflamatorio (especialmente en casosde adenitis satélite y chagoma de inoculaci6n).Así, se hacen del material biopsiado, se puedeinvestigar una posible infección por T. cruzi.
lB) MÉTODOS INDIRECTOSUtilizados tanto en la fase aguda como en
la fase cr6nica, pero por tratarse de ensayos quepretenden encontrar parásitos, su sensibilidaden la fase cr6nica no es muy alta.
. Inoculación en animales sensibles 33,
Es un método preferentemente utilizadoen el aislamiento de parásitos, teniendo algunasrestricciones para su diagn6stico de rutina - (l)El desariOllo de los parásitos en el animaldependerá de las características del T. cruzi ; (2)Mantenci6n de animales para su investigaci6nes dispendiosa y también muy laboriosa; (3).Tiempo prolongado para obtenci6n de resultados (entre 7 y 20 días 6). No obstante, la inoculación aún se utiliza para el diagnóstico enalgunos Centros de Pesquisas.
-Xenodiagnóstico:Lo fundamental de este método es la
simulaci6n en el laboratorio de condicionesnaturales para ciclo evolutivo del T. cruzj en losTriatomineos, hasta entonces exento de infección 21. Se utilizan 4 cajas con 10 ninfas de tercer grado (alimentadas durante toda la vida enaves, para garantizar la "virgindad" de infecci6n de las nifas), con una fase abierta, cubiertasolamente por una cepa delgada de tul. Se aplica esta fase en el antebrazo del paciente por 30min., y después de este período, se guardan lascajas en condiciones adecuadas (local oscuro a27°C), para desarrollo del insecto. La lectura serealiza por la observación del contenido intesti-
nal del insecto, 30 y 60 días trás de la aplicaciÓn33•16. Durante la realizaci6n de examen,pueden ocurrir reacciones alérgicas, siendonecesario en tales casos, la prescri pci6n depomadas con corticoides33 • La sensibilidadacepta para el xenodiagn6stico es alrededor de100% para la fase aguda33 y 5,3 11 hasta 50%26de positividad para la fase cr6nica, parapacientes conocidos como chagásicos. El xenodiagn6stico está siendo motivo de numerososestudios 11,12, con el prop6sito de mejorar latécnica e incrementar la sensibilidad en la fasecr6nica (por ejemplo, se utiliza solamente enTriatomineos hembras25).
• Hemocultivos:Esta es una técnica diagn6stica que requieremenos infraestructura que el xenodiagn6stico lJ• La técnica empleda para la realizaciónde hemocultivos es demostrada en el cuadro n.
CUADRO 1ITECNICA PARA LA REALlZACION
DE HEMOCULTIVO
1- Se procede la colecta de 30 mi de sangre delpacieute a ser investigado, se utiliza como allticoagulante laHeparina o la EDTA;
2- Centrifugar la sangre a 300g/1O min., a temperatura ambiente;
3· Dejar en reposo por una hora (también a temperatura ambiente);
4- Separar el sobrelíquido (plasma) del sedimento(fundamentalmente eritrocitos). centrifuga el primer a 900g/30 min., a temperatura de 4°C, adicionando 5ml de LIT alsedimento obtenido durante esta centrifugación;
5- Centrifúguese y lávese el sedimento de eritrocitos con lOml de medio UT, y dividirlo a 6 tubos conteniendo3ml de medio UT cada;
6- Incubar los tubos a 27°C, procédase a la suavehomogeneización bisemanal;
7- Hacer lecturas trás 30, 60, 90, Y 120 días, recójase l gota del medio de cultivo. póngase sobre lámina devidrio limpia y posteriomlente cúbrase con lamínula. Lléveseal microscopio y examine toda la lámina en busca de parásitos.
A lo largo de los años, muchos GruposCientíficos se han esmerado en busca demejores técnicas de hemocultivo. Tanto paraaumentar la sensibilidad, como para el xenodiagnóstico, es baja en la fase crónica (positividad máxima aceptada alrededor de 50%"-24).
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La mayoría de los trabajosl2-23 utilizando elmedio LIT, han variado la positividad de25,7%33 hasta 71,4%23, dependiendo delnúmero de repeticiones del examen (cuantomayor el número de repeticiones, mayores sonlas tasas de positividad ll). Vale la pena resaltarun relato descrito en la literatura1, en la cual lapositividad del método fue de 100%, en taleventualidad se utilizaron dos series deexámenes. Actualmente, se está estudiando lainterferencia de diversos factores, que puedenresponder por la baia de positividad del métodoen la fase crónica, como por ejemplo diferencias en cuanto al anticoagulante empleado l8.Con la progresión de éstos y otros trabajos,esperamos en breve, una mayor eficacia de latécnica de hemocultivo y tener resultados másanimadores.
2) Métodos de diagnóstico InmunológicoEl Inmunodiagnóstico de la EC, hasta el
presente momento, se pronostica la detecciónde anticuerpos generados en el desenvolvimiento de la evolución de la infección. Teniendo encuenta los mecanismos inmunológicos de estaenfermedad19, las técnicas inmunológicas sonde destacada relevancia para el diagnóstico dela etapa crónica, llevando gran ventaja sobrelos métodos parasitológicos ya descritos. Esinteresante resaltar que el inmunodiagnósticosolamente preconizará la enfermedad propiamente33 que deberá ser identificada también.por hallazgos clínicos. Trataremos ahora lasprincipales reacciones suerológicas utilizadasen el diagnóstico de la EC. Reacción deFijación del Complemento (RFC): Las reacciones diagnósticas que utilizan la Fijación delComplemento, tiene como principio el agotamiento del Complemento existente en unadeterminada porción de suero, por inmunocompiejos formados por reacción inmunológicaprevia27. En la sangre de chagásicos e¡¡istenanticuerpos ami T. cruzj, capaces de ligarse aun antígeno adicionado al medio (derivado delparásito). Este complejo antígeno-anticuerpo esligado por el Complemento (en la región-Fc de
la Inmunoglobulina). agotando este complejodel medio de la reacción. Tras este adicionadoun "Sistema hemolítico"21, constituído porglóbulos rojos de carnero ligados a las hemolisinas (anticuerpo anti-eritrocito de carnero),se puede tener los siguientes resultados - (1)Hemolisis, significando reacción negativa, puesen este caso el complemento no fue agotadorpor el complejo Ag-Ac. teniendo libertad paraactullr sobre el complejo eritrocito de carnerohemolisina; y (2) la ausencia de hemolisis. significa positividad del test, pues el complementono actuó sobre el complejo eritrocito decarnero-hemolisina. originado de haber sidoagotado en la reacción Ag-Ac de la EC. La sensibilidad varía de 84.5%20 hasta 100,0%21. encuanto a la relación de especificidad. puedenocurrir reacciones positivas para enfermos conCalazar o Leishmaniosis TegumentariaAmericana 21.
- Hemaglutinación:Las reacciones están basadas en los tra
bajos de Boyden4• que muestran la posibilidadde cambiar las membranas de eritrocitos utilizando ácido tánico, de manera que permitanque éstas sean capaces de incorporar Ags de losparásitos, pudiendo entonces utilizarse loseritrocitos sensibilizados en la detección de Acsdel suero-problema. Se coloca una muestra deeritrocitos sensibilizados en una placa tipoKline33• y enseguida añádase en suero a seraveriguado, así queda homogenizada la mixturaresultante. Se aguardan 10 mino y enseguida seprocede a la lectura. Por corto tiempo de reacción, la facilidad de la técnica y los bajos costos33, la hemoglutinación es ideal para la regulación en bancos de sangre y averiguacionesepidemiológicas 27. Su único inconveniente esla necesidad de la preparación de los eritrocitossensibilizados. casi que diariamente8. La sensibilidad varía de 50%33 (fase aguda) hasta 100%(fase cronica)20.
- Reacción de InmunoOuorescencia:Es una de las técnicas más sensibles en
... _ .. _. -- ------------ -------_._ •.....•..•.....•._....•....••.... _.•..•...........
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la suerología de la EC, se puede utilizar tantoen la fase aguda (detección de 10M), como enla crónica (detección de 100). Podemos subdividir la Inmunofluorescencia en directa e indirecta, siendo esta última la más utilizada en ladetección de la EC. La técnica se resume en lamarcación de un anticuerpo anti-inmunoglobulina, con la substancia fluorescente, siendo esteAc anti-Ac capaz de ligarlo a un complejo AgITcruzj) -Ac del paciente chagásico, la florescencia aparece, cuando es llevado al microscopio adecuado (equipado con luz ultravioleta).El resumen de la técnica es demostrada en elCuadro III.
CUADRO III
1) Se coloca una muestra de eritrocitos sensibilizados en una placa tipo K1ine;
2) A continuación añádese el suero a ser investigado, luego se homogeniza la mistura resultante;
3) Se espera 10 min., y enseguida se procede 1alec-tura.
Estudios han indicado que la sensibilidad varíade 93%20 hasta valores próximos a 100%27. Laespecificidad es del orden de 99,7% pudiendo,en raros casos, ocurrir reacciones de falso positivo para Leishmaniosis33.
-Reacciones Inmunoenzimáticas (ELISA);Así como la Inmunofluorescencia, estos
tests se basan en el uso de Ac anti-Ac. En cambio, al contrario de las sustancias fluorescentes,los Acs utilizados serán marcados con enzimas35. En el ensayo conocido por ELISA (Enzymelinked Inmunosorbent Assay), la reacción sehace en tubos o placa~ de material plástico conexcavaciones, en las cuales la superficie internaes cubierta por Ags (tripanosomas); luego, adiciónese el suero a ser investigado, incúbese elsistema por 2 horas a temperatura ambiente27.Enseguida se lava y adiciónase el Ac anti-Acenzimáticamente marcado (fosfatasa alcalina operoxidasa)33, incubando nuevamente por 3horas a temperatura ambiente. Se lava de
nuevo, se incluye el respectivo substrato para laactuación enzimática, y una vez más se incubaa temperatura ambiente de 30 mino hasta lhora, tiempo al fmal del cual se adiciona NaOH3N27, para la interrupción de la reacción enzimática. Leer en espectrofotómero a 440nm o400nm (para substratos de fosfatasa alcalina).Por su fácil ejecución, y por su bajo costo 27, esindicado para la investigación de la EC en granescala. Estudios apuntan una sensibilidad de98,0%20, para ELISA.
-Aglutinación de látex (directa);Desarrollada en 197134, teniendo origen
similar a la HA (hemaglutinación), pero utilizando partículas de látex adsorbidas con Ag, ala inversa de eritrocitos sensibilizados. La técnica es la misma de la HA, siendo la lecturarealizada más rápida (5-7 min.)27. Tanto para lafase aguda3, como para la fase crónica2O, la positividad se sitúa en la escala de 94,0%.
- Test de Floculación Rápida29 ;
En este ensayo, se utilizan Tripanosomas fijados por formol, posteriormente rotospor el ultrasón y liofilizados. Para realizar elexamen, añádese sobre una lámina de vidrio 1gota de reactivo ya descrito arriba y una gotadel suero-problema, agítese por 8 minoProcédase al fmal de este intervalo de tiempo ala lectura. La sensibilidd de este método es similar a los ensayos descritos anteriormente.
PERSPECTIVAS 33,5
No se cuenta hasta el momento conmétodos que permitan pronosticar la evoluciónde los enfermos, aunque numerosos estudioshan sido dirigidos a buscar parámetros que permitan identificar este grupo de pacientes. Hayalgunas alternativas para correlacionar el perfilde anticuerpos con la sintomatología clínica.Estos trabajos parecen promisorios pero esnecesario realizar un estudio en un gran númerode pacientes, a fin de confirmar los resultados.
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RESUMENEste tipo pretendió establecer los más
importantes aspectos del diagnóstico de laenfermedad de chagas, en su estudio de laboratorio. Fueron observados los mejores ensayos,sus indicaciones, contraindicaciones y sensibilidad en las diferentes etapas (aguda, indeterminada, crónica). Se espera haber contribuído enalgo para el conocimiento de esta enfermedadtan importante.UNITERMOS: Enfermedad de Chagas,Diagnóstico de laboratorio.
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