DIAGNOSTICA OSSIDATIVA

Aldo TomasiDipartimento servizi diagnostici e di

laboratorio, Università di Modena e Reggio Emilia

Lo stress Lo stress ossidativoossidativo: : coscos’è’èEsiste una definizione (condivisa)?

• A disturbance in the prooxidant-antioxidant balance in favour of the prooxidant, leading to potential damage (H. Sies, 1985-1991)

• Una modifica dell’equilibrio pro- anti ossidante a favore del primo, con conseguenti potenziali danni.

• The harmful condition that occurs when there is an excess of free radicals, a decrease in antioxidant levels, or both.

• Una condizione dannosa che avviene ogni volta che si forma un eccesso di radicali liberi, ovvero un calo delle difese antiossidanti, o di ambedue.

FaFa male lo stress male lo stress ossidatvoossidatvo ??

PatologiaPatologia umanaumana e stress e stress ossidativoossidativo ((dadaradicaliradicali liberiliberi))AmpioAmpio consensoconsenso sullsull’’importanzaimportanza didi radicaliradicali liberiliberi nellanellapatologiapatologia umanaumana

Malattie:– Aterosclerosi– Cancro– Infarto cardiaco– Ipertensione– Ictus– Shock– M. di Parkinson– Diabete– S. di Down– Trapianto d’organo

Meccanismifisiopatologici:

–Infiammazione–Cancerogenesi–Autoimmunità–Ischemia-riperfusione–Tossicità da farmaci

Da dove nasce lo stress ossidativo?

Il problema nasce dal fatto cherespirariamo …...ossigeno

LL’’ossigenoossigeno, , molecolamolecola stranastrana• L’ossigeno costituisce il 21% dell’atmosfera, e

l’89% del peso dell’acqua marina (come componente della molecola dell’acqua)

• Per oltre un miliardo di anni l’ossigeno è stato “liberato” nell’atmosfera dalla fotosintesi, da batteri e alghe.

• Praticamente tutto l’ossigeno presente sulla terra è il risultato di questi processi

• L’ossigeno è quindi un prodotto di “scarto”, (un “inquinante?).

• Non dovrebbe essere quindi sorprendente il fatto che l’ossigeno sia dotato di “tossicità”

• L’ossigeno atmosferico è quasi completamentecostituito da molecole costituite da due atomi diossigeno legate da un forte legame covalente.

• Una forma di ossigeno costituita da tre atomi(ozono) è presente nell’alta atmosfera (è al suoloin città inquinate)

• L’atomo di ossigeno può dare origine moltofacilmente a legami covalenti. E’ elettronegativo, e quindi legami formati sono polari (idrofilia)

• La molecola di ossigeno è un di-radicale. In quanto ha due elettroni spaiati in orbitali esterni.

La La molecolamolecola delldell’’ossigenoossigeno èè un un didi--radicaleradicale liberolibero

+

-

+

-

Elettrone mancanteElettrone mancante

ReazioniReazioni radicalicheradicaliche

Reazioni modulate da

metalli

ossigenoAnti-ossidanti

DNA

single- double

-strand breaks

Ossidazione delle basi

zuccheri

ossidazione

glicossidazione

Maillard

lipidi

perossidazione

lipofuscine

proteine

Degradazione

Legami crociati

AttaccoAttacco ossidativoossidativo e e difesedifeseantiossidantiantiossidanti

SODVit. EGSH O2

-.

O2H 2

OH .

R .

ascorbico

deidroascorbico

tocoferolo

tocoferilchinoneNADH

NAD

GSH-reductase

cinetiche di interazione

mobilizzazione

compartimentalizzazioneconcentrazione

GSH

GSSG

equilibrio energetico

Come Come ““funzionafunziona”” un antiossidanteun antiossidante

Sistemi enzimatici

Non

enzim

atic

i, id

rofli

Non

enzim

atic

i, lip

ofili

Stato nutriozionale/immunità

Un antiossidante è tale solo in determinate condizioni; cambiando le condizioni può agire come pro-ossidante.

Spesso è un radicale libero

Come Come ““funzionafunziona”” un antiossidanteun antiossidante

R.

RH

tocoferolo

radicale tocoferile

Radicale ascorbile

ascorbato

Radicale ascorbile

Deidro -ascorbato

Un Un buonbuon marker marker ((didi stress stress ossidativoossidativo))

dovrebbedovrebbe essereessere::

• Preciso, accurato, riproducibile• Un prodotto rappresentativo• Utilizzabile sia per studi cinetici che

“steady state”• Utilizzabile su materiale congelato• La dieta non dovrebbe costituire un fattore

confondente

Marker funzionaliMarker funzionali

• Spessore arterie (Doppler)• Funzione endoteliale (Pulsewave analysis)

• Perfusione (infrarosso in vivo)

IdentificazioneIdentificazione didi marker marker didi stress stress ossidativoossidativo

• Misure indirette– Maillard– Lipofuscine– Pentosidina– Malonaldeide (TBAR)– Proteine carbonilate– Dieni coniugati– Ossidazione di

substrati

• Utilizzazione dellariserva funzionale– Consumo di

antiossidanti– Alterazione

dell’equilibrio redox– Misura della “lag

phase”– Misure di “resistenza

all’ossidazione

IdentificazioneIdentificazione didi marker marker didi stress stress ossidativoossidativo (misure dirette)

Spettroscopia di Risonanza dell'Elettrone (ESR) misura:

• radicali liberi• metalli di transizione• sensibilità:10-9 mole free spin

• le preparazione del campione non pone problemi

• Svantaggi: – Acqua assorbe le microonde– Misure possibili solo su piccoli campioni

MalondaldeiydeMalondaldeiyde (MDA o TBAR)(MDA o TBAR)• Un mebabolita importante, ma “tardivo”• Misura facile, poco costosa, riproducibile• Utilizzable su materiali congelati• Non è altamente specifico. (soluzione, utilizzare

metodiceh più costose e complesse; ad es. HPLC)• E’ in parte influenzato dalla dieta• Raccomandazioni: non usare in studie

epidemiologici; sì in studi caso-controllo, usareHPLC.

E’ un buon marker di stress ossidativo?

MisureMisure didi stress stress ossidativoossidativo: GSH: GSH

NAC PREVENTION OF BSO/D-RIB COMBINED TREATEMENT IN PBMC

0 24 48 720

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Hours

GSH

(nm

ol10

^6 c

ells

)

Ctrl

D-RIB+BSO

D-Rib + NAC 10 mM

D-Rib+BSO+NAC 10 mM

Origine dietetica

• Circa il 90% dei DC nel plasma

• Si differenzianoutilizzandotecniche complesse

Dieni coniugati dastress ossidativo

Meno del <10% deiDC totali nel

plasma• Si differenziano

utilizzandotecniche complesse

FosfolipidiFosfolipidi con con DieniDieni coniugaticoniugati

FosfolipidiFosfolipidi con con DieniDieni coniugaticoniugati

• Un metabolita importante, ma “tardivo”• Misura facile, poco costosa, riproducibile• Utilizzabile su materiali congelati• E’ influenzato dalla dieta

E’ un buon marker di stress ossidativo?

DiagnosticaDiagnostica ossidativaossidativa ??

Sfortunatamente, si è venuta a creare unanotevole confusione riguardo al ruolo dellaperossidazoine in patologia umana, soprattuttoper una inappropriata applicazione a campioniumani di due tecniche: i dieni coniugati e la reazione all’acido tiobarbiturico

Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance.Barry Halliwell and Susanna Chirico.Am J Clin Nutr 1993;57(suppl):715S-725S.

IsoprostaniIsoprostani in Plasma e Urinein Plasma e Urine• Gli isoprostani formati in vivo derivano,

quasi esclusivamente, da processi non-enzimatici di perossidazione lipidica

• Isoprostani F2 circolano nel plasma e sono secreti nelle urine.

• Il test non è influenzato dalla dieta(attenzione , arginina ↓ isoprostani)

IsoprostaniIsoprostani in Plasma e Urinein Plasma e Urine• Sono prodotti secondari del processo di ossidazione

• I metodi di misura disponibile sono molto complessi e costosi (GC-MS unico metodo ritenuto affidabile)

• Immunoassay disponibili non sono ancora accurati e precisi

E’ un buon marker di stress ossidativo?

OssisteroliOssisteroli7α hydroxycholesterol27 α-hydroxycholesterol

• ↑↑ nelle lesioni aterosclerotiche

• ↓ con trattamento antiossidantei

• molto stabili

•Non influenzati dalla dieta (ma pochi studi)

OssisteroliOssisteroli

• Misura complessa e costosa (GC-MS)• Utilizzabile su materiale congelato• Non è chiaro se sia un metabolia

rilevante

E’ un buon marker di stress ossidativo?

Antioxidant ConsumptionAntioxidant Consumption

Antioxidant consumption in vitro

0

20

40

60

80

100

time

[ant

ioxi

dant

]

Antioxidant consumption in vivo

0

20

40

60

80

100

time

[ant

ioxi

dant

]

CapacitCapacitàà antiossidante del plasma o antiossidante del plasma o del del sanguesangue ((MisureMisure didi utilizzazioneutilizzazione delladella riservariserva funzionalefunzionale))

• total antioxidant status (TAS) • ferric reducing ability of plasma

(FRAP)• oxygen radical absorbance capacity

(ORAC)• total (peroxyl) radical scavenging

antioxidant capacity (TRAP)

FRAPFRAP(ferric reducing ability of plasma)(ferric reducing ability of plasma)

• La riduzione da ione ferrico a ferroso a basso pH dà origine ad una complesso colorato(ferrous-tripyridyltriazine complex)

• Acido urico, bilirubina ecc. influenzano la misura in modo importante

E’ un buon marker di stress ossidativo?

TAS (total antioxidant status)TAS (total antioxidant status)

• Determinerenne la presenza di radicaliperossidici nel plasma. Darebbe informazionisulla capacità protettiva di ascorbato, urato, albumina e, in minor misura, del glutatione e della taurina

• E’ automatizzato ed è stato utilizzato un numerosi studi umani

TAS (Total Antioxidant Status)TAS (Total Antioxidant Status)

• Il test si basa sulla assorbanza di una sostanza che si colora allo stato di radicale catione (ABTS)

• La reazione non ha, in effetti, un “end-point”• Il prodotto colorato può essere ridotto (scavenger)

da vari composti, inoltre il tasso di riduzione èsconosciuto

• Potrebbe essere usato in studi caso/controllo, con molta prudenza

E’ un buon marker di stress ossidativo?

Determinazione di Determinazione di IdroperossidiIdroperossidiD-ROM® test

• Gli idroperossidi sono degradati da ioni ferrosi (aggiunti al plasma) in ambiente acido, dando origine a radicali alcossili

• Un processo di “electron transfer” porta alla formazione diun radicale catione radicale (N,N-diethyl-p-phenylendiamine).

• Si misura facilmente con spettrofotometri (anche portatili) a 505 nm

• Formazione del colore potrebbe dipendere non solo dallapresenza di idroperossidi, il radicale può essere ridotto

E’ un buon marker di stress ossidativo?

Marker Marker didi stress stress ossidativoossidativo sulsul DNADNA• 7,8-Dihydro-8-oxo-guanine (8-OHGua or 8-

OHdG) sono usati in molti studi e sono ritenutimaker molto sensibli di danno ossidativo al DNA

• Si determinano nel plasma e nelle urine• È ben conosciuta l’ossidazione della guanina

provocata dalle procedure di isolamento del DNA• Costoso e complesso

E’ un buon marker di stress ossidativo?

RicercaRicerca didi nuovinuovi marker marker didi stressostressoossidativoossidativo

• La situazione non è soddisfacente• Per avere un quadro appena soddisfacente sullo

stato ossidativo è necessaria la determinazionedi svariati marker, spesso costosi, complessi e difficilmente automatizzabili.

• Mancano studi (soprattutto epidemiologici) cheindichino con chiarezza la relazione tra patologiastudiata e modifica dello stato ossidativo.

• Nuove metodiche si stanno affacciando, in particolare molte speranze si stannoappuntando sullo studio del proteoma.

Proteomica e Proteomica e statostato ossidativoossidativo• La proteomica studia le proteine (plasma, urine, tessuti)• Le proteine vanno incontro a numerose modifiche post-

traduzionali (con lo stesso numero e tipologia di geni si èdato origine a Berlusconi e a Bertinotti)

• Numerosi modifiche osservate sulle proteine sonoindotte da reazioni radicaliche/ossidative

• Le metologie che si stanno sviluppando (protein-chip; MS/MS; MALDI-TOF ecc.) sono automatizzabili e veloci

• Metodica costosa, ma è possibile automatizzare ed esaminare un gran numero di campioni, abbassando ilcosto.