Diagnostic Methods in Virology

RNDr. Luděk Eyer, Ph.D.Veterinary Research Institute, Brno

Department of VirologyEmerging Viral Diseases

Why? • Identify virus/clusters

• Virus subtyping• Chain transmission

• Identification of drug-resistant mutants• Strain evolution

• Detect emerging pathogens

more effective therapy

Klasické metody pro diagnostiku virů

Culture methods in virologyCytopathic effect examination

Mock-infected cells: (no CPE) Tick borne encephalitis virus infected cells: (strong CPE)

Cell lines for TBE: porcine kidney cells (PS), human neuroblastoma cells (UKF-NB-4 )

TBEV-induced cytopathic effect quantification

(Eyer et al. 2015)

Histopathological changes

(Růžek et al., 2010)

1 4 5 8

Non-infected

TBEV infected, non-treated

TBEV infected, treated with 7-deaza-2´-CMA (50 mg/kg)

Days post infection Monitoring the course of infection using in vivo imaging system

Plaque titration assay

Immunofluorescence staining

TBEV protein E

rabbit anti-TBEV protein E antibody (primary ab)

goat anti-rabbit antibody (secondary ab)

Fluorophore

cell structures

Fluorescence/confocal microscopy

Immunofluorescence staining of TBEV-infected PS cells

Immunofluorescence staining: antiviral activity testingTick-borne ecephalitis virus

no antivirals

7-deaza-2´-C-methyladenosine(Eyer et al., 2015)

Immunofluorescence staining: antiviral activity testingZika virus

Elektronová mikroskopie

Transmisní elektronový mikroskopNepohyblivý svazek elektronů, detekují se elektrony prošlé vzorkem, vhodnépro velmi malé objekty (viry, bakterie) případně se mikroskopují řezy (např. z buněk), velkými objekty elektrony neprojdou.-větší vzorky (buňky) se před prohlížením musí fixovat, odvodnit, zalít do pryskyřice a nařezat na ultramikrotonu-malé vzorky (hlavně viry) se přichytí na síťku a negativně barví (viz. protokol a ukázkové fotografie virů)

Rastrovací elektronový mikroskop Pohyblivý svazek elektronů, detekují se odražené sekundární elektrony (tedy používá se pro zobrazení povrchu vzorku)-vzorky se musí před mikroskopováním fixovat, odvodnit a vysušit

Morfologické studie virových částic

herpes simplex poxvirus paramyxovirus

adenovirus coronavirus rotavirus

Fotografie virových částic (transmisní EM, negativní barvení)

Molekulárně-biologickémetody pro diagnostiku virů

Molekulárně-biologické metody pro diagnostiku virů

znalost sekvence molekulární otisk (pattern, fingerprint)

Molekulární techniky bez amplifikace DNA/RNA

Molekulárně-biologické techniky nevyžadujícípředchozí amplifikaci pomocí PCR

•pulsní gelová elektroforéza•hybridizační techniky

•restrikční analýza

Hybridizace in situsondy značené fluorescenční protilátkou, nebo sondy tvořeny fluorescenčně

značenými nukleotidy – fluorescenční hybridizace in situ (FISH).

Multiplex detection in Huh-7 cells using the RNA FISH assay. Multiplex fluorescence RNA in situ detection of HCV viral genomic RNA (green) and 18S RNA (red) in Huh-7 cells lacking (-HCV) or containing (+HCV) an HCV replicon (Ikeda et al., 2002, J. Virol., 76: 2997-3006). In both panels, nuclei are stained with DAPI (blue).

HIV-1 is expressed in HeLa and collected at different time points. Viral RNA expression is tracked in green while the cellular protein, hnRNP A1, is stained in red. Size bars are 10 µm.

Detection of H1N1 Influenza A RNA migration in MEF cells using RNA fluorescence in situ hybridization. Murine embryonic fibroblasts (MEFs) were incubated on ice with influenza A virus (H1N1, PR8 strain). The cells were fixed and processed with the probe set against the nucleoprotein (NP) viral genomic segment (green). DNA is stained blue with DAPI.

DNA-microarrays

• Labeled PCR product is hybridized to the probes, and hybridization signals are mapped to sevral positions within the array.

• Sequencing by hybridization

• Confocal microscopy is used to can the chip.

• First application: rapid sequencing to detect HIV mutations associated with drug resistance.

Techniky založené na amplifikaci signálu•bDNA assays•hybrid capture assays

Techniky založené na amplifikaci cílovésekvence•PCR techniky•amplifikační metody založené na transkripci•amplifikace vytěsňováním řetězce

Techniky založené na amplifikaci sondy•cleavase-invander technology•ligázová řetězová reakce•technologie cyklující sondy

Molekulární techniky založené na amplifikaci

Metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR)

Tick-borne encephalitis diagnosis

ELISA, FIA, neutraliz. tests

Fatal cases: el. microscopy / RT-PCR from brain and other organs

Zpětná PCR (RT-PCR)• metoda určená k amplifikaci molekul RNA• RNA – cDNA – DNA• retrovirové zpětné traskriptázy: M-MuLV, AMV

(termolabilita, enzym ztrácí funkčnost nad 42°C)

• termostabilní Tth DNA-polymeráza, za přítomnosti Mn2+ se vyznačuje RNA-dependentní DNA-polymerázovou aktivitou

• pro zahájení RT-PCR se využívá jako jeden z primerů oligo(dT)-primer rozeznávající poly(A)-konce mRNA nebo náhodné hexanukleotidy v případě, že mRNA není polyadenylovaná

• možnost využití taktéž sekvenčně specifických primerů

Revese transcriptase-PCR methods for tick-borne encephalitis diagnostics

• 252-bp long portion of highly conserved NS5 region of TBEV genome

• AMV reverse transcriptase

PCR-method for early differential diagnosis of tick-borne encephalitis

(Saksida et al., 2005)

Mnohonásobná („MULTIPLEX“) PCR• do reakční směsi je přidáno několik párů primerů

rozpoznývajících několik rozdílných cílových sekvencí, což umožňuje detekci několika genů současně v jednéreakční směsi

• výhoda: nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích a proto se používá pro vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA, testování vzájemněnesouvisejících oblastí na DNA a zejména pro amplifikaci vnitřních kontrol současně se vzorky.

Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates

Unique conmbination of oligonucleotide primers hybridizing with subtype-specific signature positions of the sequence encoding viral E protein. (Růžek et al., 2007)

Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates

Subtyping of TBEV strains using the multiplex RT-PCR. Members of separate subtypes were analyzed individually (a) and in all possible combinations (b).

(Růžek et al., 2007)

Diagnosis of TBEV in ticks

virus RNA isolationQIAamp RNA kit

(Qiagen)

tick samples

tick homogenisation

PCR amplification of sequence encoding E protein

identification of TBEV positive samples

(Růžek et al., 2007)

Real time PCR/Kvantitatvní real time PCR

• amplifikace a detekce probíhají simultánně• kvantifikace amplikonu v reálném čase se provádí

prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve specálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky

• pro kvantitativní detekci produktu v průběhu PCR existují tři obecné metody založené na použití:

1. interkalačního barviva vázajícího se na DNA2. fluorescenčně značených sond vázající se na střední část

amplifikovaného produktu3. fluorescenčně značených primerů

Quantitative real-time RT-PCR for the laboratory detection of tick-borne encephalitis virus RNA

• targeting the 3´-noncoding region of the TBEV genome • highly sensitive and specific method to quantify of even low viral loeads in serum/CSF/tick

homogenate samples.

(Schwaiger and Cassinotti, 2003)

(DeBiasi and Tyler, 2004)

Miniature RT–PCR system for diagnosis of RNA-

based viruses

Molecular diagnosis of TBE: future perspectives

(Liao, 2005)

Asymetrická PCR• technika pro přípravu PCR produktů pro sekvencování (Sangerova metoda vyžadující

ssDNA)• při asymetrické PCR jsou preferenčně tvořeny ssDNA• výchozí koncentrace primerů: jeden z primerů je ve 100x vyšší koncentraci než druhý

primer. Dvouřetězcové formy se tvoří až do okamžiku, kdy se jeden z primerů vyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců

• asymetrická PCR může být prováděna rovněž pouze s jedním primerem, zejména pro účely automatického sekvencování

Imunologické metody pro diagnostiku virů

Imunologické metody• Založeny na interakci protilátka-antigen

• Polyklonální protilátky-imunizace zvířat• Monoklonální protilátky-hybridomová technologie

• Rekombinantní protilátky-mol.biol.techniky• Nanoprotilátky-velbloudovití, paryby

Antigen Antigen

Protilátka

• Klasické imunologické metody (aglutinační techniky, imunodifuzní

techniky, imunoelektroforetické metody) • Imunoanalytické metody (immunoassays)• Rychlé imunologické metody (lateral flow

immunoassays, dipstick techniky)• Biosenzorové technologie

Imunologické metody

Klasické imunologické techniky

• Precipitační metody• Aglutinační metody• Komplement-fixační reakce• Imunodifuzní metody• Imunoelektroforetické metody• Neutralizační testy

Klasické imunologické techniky

+

HEMAGLUTINACE

Aglutinační testy

Komerčně dostupné latexové aglutinační testy pro detekci Shiga toxin produkující E. coli

• Dryspot E. coli Seroscreen (Meridian BioScience, Inc., Cincinnati, OH)detekce non-O157 E. coli

• VTEC-RPLA (Oxoid Ltd. Hampshire, UK)detekce non-O157 E. coli

• VTEC-RPLA SEIKEN (Denka Seiken Co., Ltd., Tokyo, Japonsko)detekce non-O157 E. coli

Virus neutralizační testSérologická metoda, při které se detekují protilátky z vyšetřovaného séra jedince proti virům. Je tedy určena k diagnostice některých virových nemocí člověka a zvířat. Test je založen na principu vazby specifických protilátek proti viru a následné inhibici cytopatického efektu.

Imunonalytické metody

Imunoanalytické metody

•Radioizotopové metody

•Imunoenzymové metody

•Fluorescenční metody

•Chemiluminiscenční metody

•Alternativní metody

Imunoanalytické metody

Homogenní x heterogenní

Kompetitivní x nekompetitivní

Antigen

Signálanalyt

tracer

Imunoenzymovémetody (EIA)

protilátka nebo antigen značený enzymem

kolorimetrické stanovení (absorbance)

Enzymy používané v EIA

ELISAEnzyme linked immunosorbent assay

Přímá nekompetitivní ELISA

Antigen

Protilátka

Enzym

Substrát

Produkt Signál

Nepřímá nekompetitivní ELISA

Antigen

Protilátka

Protilátka značenáenzymem

Enzym

Substrát

Produkt Signál

Sandwich ELISA

Záchytnáprotilátka

Enzym

Antigen

Substrát

Produkt Signál

Protilátka značená

enzymem

Epitop 1

Epitop 2

Stanovení

•mikrobiální antigen = přítomnost mikroorganismu v daném prostředí (např. v krvi pacienta, ve vzorku potraviny, ve vzorku životního prostředí)•specifickou protilátku proti mikroorganismu v klinických vzorcích

Standardní k řivka pro nekompetitivní ELISA

Signál je přímo úměrný koncentraci analytu

ELISA-based (serological) methods for tick-borne encephalitis diagnostics

TBEV protein E

IgM / IgG from serum or CSF

Secondary anti-IgM or anti-IgG antibody

Enzyme

Substrate

Product Signal

Commercial IgG/IgM-ELISA kits for the detection of anti-TBEV antibodies

(Niedrig, 2000)

Virological interpretations of serological test results in case of a clinically suspected TBE

Subviral particle-based ELISA• co-expression of recombinant prM/E protein

of TBEV in mammalian cells• realease of subviral particles (SPs) into the

culture medium• using the SPs as antigen for development of

TBE-specific ELISA • SP-IgG and SP-IgM ELISA systems• No cross-reactivity with antibodies against

other flaviviruses

Komerčně dostupné kity pro detekci filovirů

Technologie dipstick(Lateral flow immunoassay)

Technologie dipstick

kontrolní

testovacíkontrolní

RychlostNízké náklady

Vysoký počet vzorkůNekvalifikovaný personál

Polní a provozní podmínky

Nižší citlivost Preenrichment

Předběžné stanovení

Rychlé imunologické metody:

PanBio Dengue Duo IgM and IgG Rapid Strip Test (PanBio,

Brisbane, Australia)

Proteomické metody pro diagnostiku virů

Elektromigra ční metody

Elektromigrační metodySeparace nabitých látek ve stejnosměrném elektrickém poli

+

- +El. síla Fe Frikční síla Ff

= tření

mobilita: µ=v/E=Q/f [m-2V-1s-1]

ElektroforézaDělení nabitých částic na základě rozdílných mobilit

Volná Zónová

Stabilizující prost ředí

•rotace

•gradienty hustoty

•porézní médium

•kapilára

Separace probíhávoln ě v elektrolytu

Porézní média

chromatografický papír

agar, agaróza

acetát celulózy

škrob (hydrolyzovaný)

sypané (nalévané) vrstvy (Sephadex)

polyakrylamid

Polyakrylamid

kopolymer akrylamidu a N,N-bisakrylamidu

polymerace katalyzovaná TEMED

iniciátor persíran amonný

síťovaný gel

!!!! monomery jsou silné neurotoxiny !!!!

Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)

polyakrylamidový gel + aniontový detergent (SDS, dodecylsulfát sodný)

na 1 g bílkoviny se váže 1,4 g SDS – uniformnínáboj bílkoviny na jednotku Mr

Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)

Mr1

Mr2

Mr3

Mr1>Mr2>Mr3

Studium proteomu a identifikace strukturních proteinůpolyvalentního stafylokokového bakteriofága

Izoelektrická fokusaceElektroforéza v prostředígradientu pH. Látky se rozdělujípodle izoelektrických bodů (pI).

Proteiny se v elektrickémpoli pohybují podle náboje ažna místo, kde pH = pI.

Náboj má nulovou hodnotu a tamzůstávají stát.

IEF fokusace patří mezi metodys největší rozlišovací schopností.Gradient pH se tvoří pomocíamfolytů (komerčně dostupné)

Nosič - polyakrylamid

2-D SDS-PAGEstudium proteomu

vysoká rozlišovací schopnost

I. klasická isoelektrická fokusace

II. SDS-PAGE

detekce stříbrem

srovnání jednotlivých gelůdensitometry

+ -

+ -

pI

Mr

Proteinové profily polyvalentního stafylokokového bakteriofága získané pomocí 2-D SDS-PAGE

Western blotting

Blotting (přesávka)

Přenesení biomolekuly na membránu

Southern blotting – přenos DNA

Northern blotting – přenos RNA

Western blotting – přenos proteinu

gel

membránaprotein

Blotting (přesávka)

difuzní

kapilární

vakuový

elekroblotting

polosuchý (semidry blot)

kapkovací (dot blot)

ElektroblottingKapilární blotting

Kapkovací blottingPolosuchý blotting

Vakuový blotting

Membrány pro blotting

PVDF (polyvinyldendifluoridová) –hydrofobní interakce

nitrocelulosová – hydrofobní interakce

nylonová (+polymer) – elstat interakce

membrána s NH 2 skupinami –kovalentní reakce

Western blot EBOLA-specifických glykoproteinů (GP) izolovaných ze séra 8 osob s akutní infekcí EBOLA

Komerčně dostupnéwestern blot testy pro

detekci protilátek proti HIV

Proteinové mikro čipy (biočipy)

• Slibný experimentální přístup pro analýzu proteinů v budoucnosti

• Použití pro purifikaci proteinů, stanovení expresních profilů, meziproteinových interakcí

• Imobilizace protilátek, receptorů, ligandů, nukleových kyselin, uhlovodíků, látek s určitými biologickými vlastnostmi (kationty, anionty, látky s hydrofilním/fobním povrchem)

• Některé mají nízkou specifitu a vážou celé skupiny proteinů, jiné jsou vysoce specifické

• Kombinace s hmotnostní spektrometrií nebo biosenzory

• Stacionární vs. průtočné uspořádání

DNA chips

microfluidic

surface plasmon resonance

fluorescent probes

Schematické znázornění principu mikročipových/microarrayových technologií

Multi-analytové mikro čipy (arrays)detekce a identifikace mnoha antigenů

v jediném stanovení

Mikročip pro studium interakce virus-hostitel

Aplikace mikročipů pro studium vztahů virus-hostitel

Aplikace mikročipůpro detekci

biomarkerů infekce v séru pacienta

Mikročip pro detekci protilátek proti mnohočetným patogenům v lidském séru

Mikrofluidní (průtočné) mikročipy pro detekci

virů v klinických vzorcích

Hmotnostníspektrometrie

Hmotnostní spektrometrie• Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda sloužící k

převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů

• Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, kterérozlišuje ionty podle poměru jejich m/z

• Výhody: vysoká citlivost, kvalitativní analýza (určení M.W. a dalších strukturních informací), kvantitativní analýza (odezva závislá na koncentraci), minimální spotřeba vzorku

• Nevýhody: destruktivní metoda, vysoké provozní náklady

Základní části hmotnostního spektrometru1. iontový zdroj – slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (tzv.

ionizace), konstrukce se liší podle použité ionizační techniky2. hmotnostní analyzátor – slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle

jejich m/z3. detektor – slouží k detekci iontů po jejich rozdělení podle m/z a k určení relativní

intenzity (četnosti) jednotlivých iontůDalší důležité části přístroje:- vakuový systém- iontová optika sloužící k urychlení a fokusaci iontů- počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr, ukládání a zpracování dat, porovnání spekter

s knihovnou

Hmotnostní spektrum bakterie Mycobacterium tuberculosis

Peptidové mapování s využitím hmotnostní spektrometrie pro studium proteomu stafylokokového bakteriofága

vzorek 2D-PAGE štěpenítrypsinem

MALDI TOF MS/MS

MS spektrumsrovnání s databázíidentifikace proteinu

přirazení k sekvenci DNA, identifikace ORF

Obr. 3. Lokalizace genů kódujících identifikované proteiny fága 812