Diagn Inf Virale

8/18/2019 Diagn Inf Virale

1/118

DIAGNOSTICUL DEDIAGNOSTICUL DE

LABORATOR ALLABORATOR ALINFECINFECŢIILOR VIRALEŢIILOR VIRALE


2/118

DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR

VIRALE

Argumente:• clinice (sdr. clinic, debut, evoluţie, patologia asociată)• epidemiologice (vârsta, sex etc.)• laborator


3/118

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

AL INFECŢIILOR VIRALE

Indicaţii:

• Alegerea terapiei etiotrope• Monitoriarea e!icienţei terapiei• Adoptarea măsurilor de pro!ilaxie "i

combatere #n !ocar a unor boli contagioase• $upraveg%erea epidemiologică a unor boliin!ecţioase


4/118



• &e'usti!icat (tardiv, !ără consecinţeterapeutice)

• Inaccesibil (in!rastructură complexă,personal #nalt cali!icat)

• ostisitor


5/118



*n preent:• +usti!icat "i necesar (metode de diagnostic

rapid, antivirale e!iciente)

• Accesibil (cel puţin pentru anumite metode)• ost e!icienţă


6/118

DIAGNOSTICUL DE LABORATORAL INFECŢIILOR VIRALE

Indicaţii:

• Iniţierea "i monitoriarea terapiei antivirale(v. gripale, -$/, -$0, M, -I, -1,-)

•$tabilirea conduitei terapeutice saupro!ilactice (%erpes genital prepartum,in!ecţie cu v. rubeolic, -I la gravidă)


7/118


AL INFECŢIILOR VIRALE• Adoptarea măsurilor de pro!ilaxie "i

combatere #n !ocar a unor boli contagioase

(-A)• $upraveg%erea epidemiologică "i adoptareamăsurilor de sănătate publică (tria'uldonatorilor de sânge "i organe,

supraveg%erea epidemiilor gripale, $A2$)• 3videnţierea unor in!ecţii noi, virusuri noi sau

a unor noi asocieri virus4boală


8/118



5ipuri de laboratoare:• 6aboratoare clinice• Institute de $ănătate 7ublică

• entre de re!erinţă


9/118

DIAGNOSTICUL DE LABORATORAL INFECŢIILOR VIRALE

METODE NESPECIFICE METODE SPECIFICE

Metode directe

• ex microscopic (ME, IF)• evidenţierea antigenelor virale

• evidenţierea secvenţelor ac.

nucleic• izolarea - identificarea

• ex. citologic (M)

Metode indirecte

• evidenţiereaanticorpilor specifici


10/118

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL

INFECŢIILOR VIRALE - ETAPE

• ooperarea clinician 8 medic de laborator9• Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico4

epidemiologic)• Alegerea produsului patologic

5ipul (sdr. clinic, stadiul bolii)Momentul prelevării

Metoda de recoltare "i transport


11/118

PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE

ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC• Sdr respiratriiSdr respiratrii: exsudat naal, exsudat !aringian,

lic%id de spălătură naală, spută

• Sdr di!esti"eSdr di!esti"e: materii !ecale, tampon rectal• Ras# "e$i%&'ar Ras# "e$i%&'ar : lic%id veicular, produs de racla'• I()e%*ii &ri(areI()e%*ii &ri(are: urină• I()e%*ii %&'areI()e%*ii %&'are: raclat con'unctival sau corneean,

exsudat !aringian• Sdr +e(i(!ia(, e(%e)a'iti%Sdr +e(i(!ia(, e(%e)a'iti%: 62, biopsie

cerebrală, materii !ecale, salivă, ţesuturi

• $ânge


12/118

MOMENTUL PRELEVRII ÎN

DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

OPTIM . pri+e'e / . 0 $i'e de 'ade1&t&' 1'ii (diagnostic direct)2


13/118

PRELEVAREA ÎN DIAGNOSTICUL

VIROLOGIC

• 5ipul produsului patologic• 3xpediere imediată• Mediu de transport

• 2e!rigerare (; < =), nu congelare(4/> 40? =)


14/118

• Lichid amniotic! se aspira lic"idul cu seringa sise in#ecteaza apoi intr-un tu$ steril.

• %cop! cultivare virusuri• Sange periferic! se decontamineaza tegumentul.%e folosesc tu$uri cu "eparina sodic&

• %cop! cultivare virusuri

• Biopsie cerebrala! pro$ele se transporta in mediude transport M'

• %cop! cultivare, * pentru +%

• Bronhoscopie! se recomanda aspirarea secretiilor prin camera interioara a $ron"oscopului intr-unrecipient steril cu ml solutie salina. %e transportaimediat la la$orator.

• %cop! cultivare virusuri


15/118

• Cervix! se foloseste speculum fara lu$rifiant.• %e indeparteaza excesul de mucus si puroi cu a#utorul

tampoanelor de descarcare.

• %e introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru / 01 secunde.• %e evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. %e

comprima usor cervixul intre lamele speculului si seexprima puroiul eventual existent.

• %e introduce tamponul intr-un tu$ de colectie.• 2aca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt

tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M'.• %cop! cultivare virusuri si *


16/118

• Cornee! racla#ul corneean este realizat de catre medic.Este indicat a se introduce raclatul in mediu de transportM'

• ultivare +%• LCR: se decontamineaza pielea. %e realizeaza punctie

lom$ara, ventriculara sau su$occipitala. %e strimite 3*intr-un tu$ steril cu capac insuru$at. 4u se foloseste mediuM'. %e transporta in la$orator imediat dupa prelevare.

• ultivare virus si * pentru erpes %implex +irus• Ureche interna! se curata canalul extern cu antiseptic cu

actiune medie. %e preleva puroiul aseptic.• ultivare virus

• Ochi (extern): se indeparteaza mac"ia#ul. %eantiseptizeaza tegumentul din #urul oc"ilor cu antisepticsla$. %e trece de 5 ori un tampon umed la nivelulcon#unctivei. Evitati atingerea pleoapelor. %e folosestemediu de transport M'.

• ultivare virus


17/118

• Lezini herpetice: se sterge viguros $aza unei veziculedesc"ise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de

transport M'.• ultivare +%, * • Biopsie plmonara! se decontamineaza tegumentul. %e

efectueaza doar de catre specialist. %e trimite produsul lala$orator in mediu de transport M'.

• ultivare virus• Spalatra nasala ! aspirat nasal! capul pacientului este

indicat a fi inclinat su$ un ung"i de 617. %e aspira in seringa ml solutie salina. %e introduce lic"idul in narine. %e

colecteaza lic"idul si se reintroduce de cateva ori. 3a finalse colecteaza lic"idul de spalatura intr-un tu$ sterilinsuru$at. %e trimite imediat la la$orator. 2etectarea rapidade virus gripal este posi$ila in sezon epidemic.

• ultivare virus gripal, virus respirator sincitial.


18/118

• "asofaringe! se introduce un tampon su$tire, innasofaringe, in cavitatea nasala. %e tine tamponul aproape

de septul nasal. %e roteste tamponul si se retrage. %etransporta imediat la la$orator. %e foloseste mediu detransport M'.

• ultivare virus8 detectare +*%• Lichid pericardic# pleral# peritoneal! se decontami-

neaza tegumentul.• %e recomanda aspirarea sterila a cativa ml intr-o seringa.%e introduce lic"idul intr-un recipient steril, cu capac.

• ultivare virus• Rash! se curata suprafata cu alcool 619. %e instileaza o

cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tu$steril. %e foloseste mediu de transport M'.

• entru ras" vezicular se cur&ţ& viguros cu un tampon $azaveziculelor proaspete.

• ultivare virus si IF directa pentru + +aricella :oster


19/118

• $ampon rectal! in timpul proctoscopiei sausigmoidoscopiei se ating cu tamponul leziunile de la acestnivel. %e introduce tamponul in mediu de transport M'.

• ultivare virus• Lichid %nt! se decontamineaza tegumentul si cateterul.

%e aspira steril de la nivelul ;untului si se conditioneazaintr-un recipient steril.

• ultivare virus• &aterii fecale! se colecteaza in recipiente curate, uscate,cu capac. 2aca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu urina sau dezinfectante.


20/118

• 'aringe! tampon de la nivelul exudaului faringiansau al mem$ranelor formate. %e sterg viguroscriptele amigdaliene. 4u se atinge mucoasa $ucalasau lim$a>

• ultivare virus• est! se recolteaza de catre medic• ultivare virus• spirat traheal! secretiile se transporta in

container steril.• ultivare virus


21/118

• Secretie retrala: se recolteaza la o ora dupa

ultima mictiune. %e introduc tampoane su$tiri de 5 / ' cm in uretra si se rotesc timp de 0 / secunde.%e depune tamponul intr-un tu$ colector. entru+% se foloseste mediu de transport M'.

• * pentru +%58 ultivare +%• Urina de la nivell cateterli! se dezinfecteazatu$ul cu alcool. %e aspira urina cu o seringa sterila.%e transporta in container steril. %e refrige-reazaimediat.

• ultivare virus• Urina sprapbiana ! citoscopie! se realizeaza

recoltarea de catre medic intr-un recipient steril8 serefrigereaza imediat.

• ultivare virus


22/118

• *agin! se foloseste speculum cu lu$rifiant. %eintroduce un tampon steril in vagin. Mediu M'

pentru +%.• ultivare +%, * • *lva! nu se foloseste alcool pentru mem$ranele

mucoase.


23/118

2iagnosticul direct

• +xaminarea direct, a prodselor patologice / -etectarea de antigene!

/ Evidentiere de virus ? ME si IEM / imunofluorescenţ& (IF),

/ teste imunenozimatice (E3I%= / enzime linkedimmunosorbent assay)8

/ latex aglutinarea (3=)8 / -etectarea genomli

/ * si *


24/118

2iagnosticul direct

• In examinarea direct&, produsele patologicesunt examinate pentru evidenţierea!

• virusului8• antigenelor virale8

• a genomului8

• modific&rilor "istopatologice induse dec&tre infecţia viral&.


25/118

2iagnosticul direct• Avantaje!• examinarea direct& este rapid&,• rezultatele fiind o$ţinute @n aceea;i zi, mai ales @n

scopul instituirii c"imioterapiei.• Dezavantaje: • costul ridicat al te"nicilor,• personalul de la$orator @nalt calificat, fac din aceste

metode apana#ul la$oratoarelor de cercetare sau specialec"ipate.

•


26/118

2iagnosticul direct

• %c&derea preţului de cost per determinarereprezint& soluţia de viitor pentru extinderea

lor pe scar& mai larg&.• rin dezvoltarea te"nologiilor tip DNA chip

se vor putea detecta virusuri direct @n

produsul patologic (), cu posi$ilitateacuantific&rii lor, @n vederea monitoriz&riiterapiei antivirale.


27/118

Metode / &icroscopia electronic, (ME) pentru evidenţierea

morfologiei ;i dimensiunilor virusurilor ;iidentificarea acestora utilizAnd imnoelectron.

microscopia (IME). / &icroscopia optic,! modific&ri "istopatolgice ;i

evidenţierea de incluzii.

/ -etectarea genomli viral! "i$ridizarea ;i reacţiade amplificare genic& (* / polymerase chainreaction).


28/118

/zolarea virsrilor

• Culturi de celule! evidenţierea efectului citopatic (E) produs de c&tre virusuri citopatogene8 identificareavirusului izolat prin IF, reacţia de neutralizare (*4), testul

de "emadsor$ţie, *I=, etc.• Izolarea pe ouă embrionate 0n dezvoltare! evidenţierea de pocBsuri la nivelul mem$ranei c"orioalantoidiene (M=),urmat& de identificarea prin *I.

• Izolarea pe animale de laborator determin& decesul sau

reproducerea $olii la animal, urmat& de o$ţinerea desecţiuni "istologice ;i examinarea lor prin M pentruevidenţierea unor leziuni caracteristice ;i identificarea deantigene prin *4, *I, etc.


29/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC

Mi%rs%pia e'e%tr(i%3Mi%rs%pia e'e%tr(i%3 4ME5 sensibilitate redusă (/?@4A virioniml) personal specialiat "i in!rastructură

complexă cost ridicat utiliare limitată


30/118


31/118


32/118

&icroscopia electronic, (ME)

• presupune un la$orator dotat cu ME cu putere dem&rire @ntre 51111-'1111C sau 1111-D1111C.

• e lAng& dezavanta#ele legate de ec"ipamentulscump, al necesit&ţii de personal @nalt calificat ;i alcosturilor ridicate pentru reactivi ;i @ntreţinerea ME,te"nica are ;i dezavanta#ul unei sensi$ilit&ţi reduse,

deoarece limita de detecţie presupune prezenţavirusului @n @n cantitate de aproximativ 1D

particule virale?ml.


33/118

&icroscopia electronic, (ME)• Avantaje:

• rapiditatea detect&rii virusurilor ;i utilitatea descrierii morfologieivirusurilor8

• uneori reprezint& singura metod& de diagnostic, a;a cum s-a@ntAmplat @n cazul descrierii coronavirusului recunoscut, ulterior,

ca agent etiologic al %=*% (sindromul acut respirator sever).• Dezavantaje!

• sensi$ilitatea redus&,

• cost ridicat,

• similitudini morfologice @ntre diferite virusuri,

• imposi$ilitatea identific&rii serotipului.


34/118

&icroscopia electronic, (ME)

• Produse patologice utile pentru detecţia devirus!

• materii fecale (MF) pentru rotavirusuri,adenovirusuri, virusul 4oralB ;i virusurile 4oralB-like, astrovirusuri, calicivirusuri8

• lichid veziclar pentru +% ;i ++:8

• prods din lezinile ctanate pentru papillomavirusuri, virusul orf , moluscumcontagiosum.


35/118

icornavirusuri


36/118

IME

• Creste sensibilitatea si specificitatea &+• *ariante ale /&+:• /+& clasic,: pro$a este tratat&, anterior examin&rii la

ME cu un ser specific cu =c monoclonali, anti-virus

presupus prezent @n .• articulele virale, prezente @n pro$e vor aglutina ;i @n

final, se vor agrega, datorit& specificit&ţii reacţiei =g-=c8

• /+& 0n faz, solid,! grila ME, (sau alt suport), va ficoafat&G cu =c monoclonali8 particulele virale,

prezente @n vor fi adsor$ite la suprafaţa grilei prinintermediul =c-lor.


37/118

&icroscopia optic,!

+videntiaza modific,ri histopatolgice %ieviden1ierea de inclzii

• Incluziile cu diferite localiz&ri!• intranucleare ;i?sau intracitoplasmatice,• eozinofile sau $azofile,

• cu variate forme / rotunde, alungite, piriforme, etc.• reprezint& doar un reper orientativ ;i nu unul

patognomonic.


38/118

Infectii cu +% (incluzii I4)

http://www.medvet.umontreal.ca/pathologie_microbiologie/beluga/images/Herpes_micro.jpeg


39/118

3eziuni determinate de +%. %ageata verde indica incluzii I4, cea al$astra ,celule Beratinizate, iar cea rosie, celule $inucleate, cu incluzii i4.


40/118

%ageata rosie - incluzii I4, al$astra, degenerarea celulelor cu $alonizare(aspect generat de +%, Beratinocite, multinucleate).


41/118

**2 3 inclzii /"


42/118

*4 rabic 3 inclzii /C (bazofile)

Coloratie 5+


43/118

/nclzii Babes."egri

granle albastr.inchis la nivell

inclziilor (coloratie Sellers)


44/118

*RS 3 sincitii si inclzii eozinofile i4c4

/nfectie 5/* 3 celle nervoase


45/118

/nfectie 5/* celle nervoase

/nclzii Co6dr7 # /" si /C 3 eozinofile

(coloratie 5+)


46/118

#oi


47/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC

Dete%*ia 6i ide(ti)i%area a(ti!e(e'r "ira'eDete%*ia 6i ide(ti)i%area a(ti!e(e'r "ira'e

imuno!luorescenţă imuno%istoc%imie metode imunoenimatice

latexaglutinare reacţii de neutraliare, !ixare a complementului,

in%ibare a %emaglutinării


48/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC

VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

• =nticorpi marcaţi cu fluorocrom• 2etecţia ;i identificarea antigenelor de la

nivelul celulelor infectate (produs patologic,

culturi de celule)


49/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA


50/118


VIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE

• 2etecţia ;i identificarea antigenelor virale de la

nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturide celule)

• =nticorpi marcaţi cu peroxidaz&

•Examinare la microscopul optic• 2ezavanta# / peroxidaza endogen&, prezent& @nnumeroase ţesuturi, poate genera reactii fals pozitive

O C G OS C


51/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - IMUNO7ISTOC7IMIE



52/118




53/118



54/118

*a$ie - imuno"istoc"imie

http://www.fujita-hu.ac.jp/~tsutsumi/photo/photo141-3.htm


55/118

Incluzii I4 odrH = / se vad uneori8 Imuno"istoc"imie, utilizand=c monoclonali anti- +%! semnal () I4 si I (stanga coloratie

apanicolau si dreapta! I, dupa recolorare)

http://www.fujita-hu.ac.jp/~tsutsumi/photo/photo141-3.htm


56/118

METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC

VIROLOGIC• 3videnţierea anticorpilor speci!ici metode imunoenimatice (36I$A) latexaglutinare (6A)

reacţia de !ixare a complementului (2B) evidentiaa Ac speci!ici de grup (exceptii $2,paragripal tip C)

reacţia de in%ibare a %emaglutinării (2I-)

• $ensibilitate, speci!icitate, complexitate "i costuri 8 !uncţie de metoda utiliată• riterii de semni!icaţie a preenţei Ac


57/118

riterii de semni!icaţie a

preenţei Ac• 8 probe de ser (ideal)

- dinamica semnificativ&

- seroconversia• 9 prob, nic,

- titrul semnificativ

- clasa de =c (IgM versus IgJ)


58/118

METODE IMUNOENZIMATICE ÎN

DIAGNOSTICUL VIROLOGIC• Aplicaţii extrem de variate• Diverse variante (directe, indirecte, competitive,

sandwich)• Detecţia "i identi!icarea antigenelor (virioni,antigene virale solubile, celule in!ectate) si aanticorpilor

• $ensibilitate !oarte bună• $peci!icitate 8 !uncţie de a!initatea anticorpilor • Accesibilitate• ost redus


59/118


60/118


61/118


62/118

E3I%=- principiu

• Evidenţierea complexului =g-=c cu a#utorulunui element cunoscut (=c sau =g) marcat

cu o enzim&• *eacţia de culoare, prin ad&ugarea unui

su$strat specific (pentru enzima utilizat&)


63/118

laca E3I%= (5?)


64/118


65/118

E3I%= - metoda

• =g partial purificat, inactivat este adsor$it pesuport

• %e adauga ser (poate contine =c / secupleaza de =g)


66/118

E3I%= - metoda

• =c anti Ig umana, cuplati cu enzima(con#ugat)

• romogenul (su$stratul) va sc"im$a

culoarea reactiei daca se formeazacomplexul =g-=c-on#ugat


67/118

E3I%= / ser reactiv


68/118

E3I%= / ser nereactiv


69/118

E3I%=

ositive Control "egative Control atient atient B atient C ssa7 Control

94;49?@ O4>?? >4A98 94=== >498@


70/118

E3I%=

indirect


71/118

E3I%=

indirect


72/118

E3I%=

http://www.apotech.ch/?id=12


73/118

E3I%= / direct (detectare de =g)


74/118

E3I%=


75/118

E3I%= / competitiv

• competiţia se realizeaz& direct @n prezenţade =c diri#aţi @mpotriva =g insolu$ilizat,

prin adsor$ţia pe faza solid&.• este posi$il s& ad&ug&m reactivii @n etape! @n

prima etap&, =g-ul de dozat se adaug& peste

=c insolu$ilizaţi pe faza


76/118

E3I%= / competitiv

E3I%=


77/118

E3I%=

• 4u se lucreaza pro$e "emolizate, contaminate>• astrarea serului cel mult zile la frigider (ideal,

maxim 0 zile).

• 4u se ing"eata pro$a repetat>

• Rezltate fals pozitive! impun repetarea pro$ei pe5 godeuri (mai ales in cazul pro$elor indeterminate8

=% N ).


78/118

Srse de eroare 0n dozarea

antigenelor! rezltatele fals pozitive pot fi determinate de!

O fixarea nespecfic& a imunoglo$ulinelor de c&trereceptori Fc mem$ranari sau de c&tre factorulreumatoid (F*) prezenţi @n ser sau alte lic"ide

$iologice8

O reacţii "eterospecifice determinate de utilizareaanticorpilor anti-antigene "eterologe, anti-gazd&sau anti-mem$rane ale gazdei sau de prezenţa deantigene @n pro$& ($acterii, levuri, ciuperci,

proteine)8


79/118


antigenelor!O proasta conservare a serurilor ce duce la

alterarea imunoglo$ulinelor @n pro$&8

O folosirea unui con#ugat la titru sau cu oaviditate insuficient&.


80/118


antigenelor!• Rezltate fals negative• =viditate scazuta a =c adsor$iti pe suport

• on#ugat nelegat (incu$are insuficienta,spalare in exces, etc)


81/118

E3I%=

• Condita! repetarea pe aceeasi pro$a sau?si pe o noua pro$a de ser (recoltat imediat sau?si

la 5-0 luni interval).• %e prefera repetarea pe truse de la producatori

diferiti.

• =tentie! pacienti cu $oli autoimune, su$tratament cu cortosterioizi, "emodializati, etc.


82/118

E3I%=

• Rezltate fals negative:• ser recoltat anterior perioadei de

seroconversie• =c complexati?legaţi cu =g• sensi$ilitate redusa a trusei

• =c antiI+5 nu sunt recunoscuti de truse pentru I+• imunsupresie

E"'&*ia r3sp&(s&'&i i+&( 8( i()e%*ia %&


83/118

E"'&*ia r3sp&(s&'&i i+&( 8( i()e%*ia %&7IV

E3I%= / sc"ematic (indirect)


84/118

E3I%= sc"ematic (indirect)


85/118

E3I%= / =g p 5' (I+)

Sa(d9i%# ELISA 4A%-A!-A%5


86/118

IgJ-apture EI=


87/118

IgJ-apture EI=

Serm (9!9>>)

Biotin-Labeled g

Strepavidin-eroxidase

$&B

Sbstrate

oat-anti-5man-/gCaptre ntibod7


88/118

E3I%=

• Rezltate fals pozitive

• Confirmarea printr.n test principial

diferit (B# /')4


89/118

I+ PL


90/118

PL - principiu

• =g virale fixate pe un suport (mem$ran&),reacţioneaz& specific cu =c din ser

• Marca# imunoenzimatic• 3egarea reactivilor ca in E3I%= de tip

indirect


91/118

PL

• vantaDe:

• evidentiaza categorii de =c

• este mai specifica• permite aprecieri prognostice (ex.

aparitia?versus disparitia =nti- p5').


92/118

PL

• -ezavantaDe:

• timp mai mare de executie

• presupune dotari suplimentare• personal super-calificat

• uneori presupune interpretari su$iectiveG

• cost ridicat



93/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC . LATE: AGLUTINARE

• =nticorpi fixaţi pe particule de latex /identific& antigene (reciproca estevala$il&, pentru evidenţierea de =c)

• Metod& simpl&, rapida ;i accesi$il&

• %ensi$ilitate ;i specificitate relativreduse

• Ex! antigenul rotaviral in materii fecale


94/118

L

METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR


95/118

METODE DE BIOLOGIE MOLECULAR ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Detecţia "i identi!icarea unor secvenţe speci!icede acii nucleici

• Diverse variante-ibridiarea aciilor nucleici neampli!icaţi Ampli!icarea semnalului (bD&A) Ampli!icarea secvenţei (72, 25472, &A$1A)

• $ensibilitate "i speci!icitate !oarte bune• Accesibilitate restrânsă• ost ridicat, dar cu raport costbene!icii !avorabil


96/118


97/118

CR

* id ţi f t l i


98/118

* / evidenţierea fragmentului

amplificat

D li i ă i il l i i i li


99/118

Detectarea calitativă a acizilor nucleici virali

• and metodele convenţionale sunt greu de utilizat!• virusurile care se cltiv, dificil (+L, +,

papillomavirusul uman, I+ ;i parvovirusul LQ)8

• datorit& riscli cresct de infec1iozitate (I+)8• cAnd serologia n este evident, (ex. @n cazul pacienţilor

imunocompromi;i- virusul citomegalic)8• diagnosticul infec1iilor virale congenitale şi perinatale

(I+, +)8• virusul este prezent @n concentra1ii foarte Doase!

screening /ul sAngelui ;i al produselor sanguine (+L,+, I+)8


100/118

roduse patologice

• testarea fluidelor organismelor care @n modnormal sunt sterile

- 3* (+%, ++:, +M)8- lic"idul amniotic (++:, +M, parvovirusul

LQ, virusul ru$eolei)8

- fluidele oculare (++:, +M).


101/118

*

- =u fost folosite variate metode pentruaceste scopuri, inclusiv * ;i "i$ridizarea,

cu scopul de a putea evidenţia concentraţiisc&zute de genom viral @n pro$e.

Secvenţierea acidului nucleic viral


102/118


• dat& ce genomul viral a fost detectat, secvenţiereagenomului poate evalua relaţiile dintre dou& sau mai multeizolate virale, @n cazurile @n care este posi$il& coinfecţia(+L / +) sau poate g"ida terapia antiviral&.

• Rn testarea rezistenţei la antitretrovirale a I+ se determin&secvenţierea *< ;i a proteazelor ;i se compar& expresiasc"im$&rilor aminoacizilor cu tulpina iniţial& de virus.

•


103/118


• plica1ii: • alegerea terapiei de prim& intenţie, adaptarea terapiei,• profilaxia post / expunere ;i prevenţia transmiterii

verticale.• Ex. terapia I+ ;i +.• r&spunsul la IF4 @n infecţiile cu + depinde de

genotipul viral! genotipurile 5 ;i 0 r&spund mai $ine decAtgenotipul 8

• cAteva variante de +L cu sensi$ilitate redus& la3amivudin& sunt asociate cu prezenţa unui singur nucleotidla nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.


104/118

Cuantificarea acidului nucleic viral

• uantificarea @nc&rc&turii virale este

important& @n virusologia clinic& datorit&utilit&ţii sale ca!

- indicator al prognosticului8

- al r&spunsului la terapia antiviral&8- al riscului transmiterii infecţiei.

Evaluarea prognosticului:


105/118


• = fost $ine sta$ilit pentru I+.• %/a demonstrat c& nivelul plasmatic al =*4/

ului viral corelat cu stagiul $olii ;i cu un nivel

sc&zut al I+ @n plasm& se asociaz& cu olung& perioad& asimptomatic&.

• Inc&rc&tura viral& crescut& dup& seroconversie

poate preceda progresia spre %I2=.



106/118


• M&surarea @nc&rc&turii virale pentru +M este util&@n cazurile post / transplant, aceast& metod&dovedindu/se mult mai eficient& decAt determi-

narea calitativ&.• Inc&rc&tura viral& pentru +M este un factor

predictiv independent @n supravieţuire, @n cazul%I2= avansat.

• re;terea +EL @n plasm& ;i @n limfocitele dinsAngele periferic poate precede apariţia unortul$ur&ri limfoproliferative post / transplant.


107/118

Evaluarea răspunsului terapeutic:

• este cel mai $ine cunoscut& @n cazul infecţiei cu I+, caz @ncare scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al I+

cAt mai mult posi$il• exist& controverse @n acest sens8- s-a sugerat c& pacienţii cu nivelul plasmatic al I+ @ntre

01.111 ;i 1.111 cSpii ? ml ar tre$ui s& primeasc& terapieantiretroviral& indiferent de stadiul clinic,

- @n timp ce pentru pacienţii care au concentraţii @ntre 111 /01111 cSpii ? ml tre$uie s& se ai$& @n vedere ;i stadiul clinic ;inum&rul 2' pentru iniţierea terapiei antiretrovirale.


108/118


•


109/118


• Rn cazul +L, @n care un nivel crescut de =24 @nainte deiniţierea tratamentului este asociat cu un r&spuns sla$ laIF4, cuantificarea =24? +L a fost utilizat& pentru a

preconiza r&spunsul terapeutic ;i pentru a monitorizar&spunsul la terapia antiviral&.

• 3a fel ;i @n cazul infecţiilor cu +, nivelul ridicat alviremiei, @naintea iniţierii terapiei antivirale este asociat cuun r&spuns terapeutic redus (s-a demonstrat c& acesta apare

indiferent de genotip).• Este @nc& neclar care este raportul dintre genotipul + ;inivelul viremiei.

Evaluarea riscului transmiterii virale:


110/118


• cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscultransmiterii virale nu este frecvent utilizat& @n prezent, dar

poate deveni mult mai important& @n viitor8• este general acceptat c& riscul transmiterii virale este corelat

cu nivelurile crescute de virus @n diverse fluide aleorganismului8• transmiterea + de la mam& la copil este mai frecvent&

atunci cAnd nivelul =*4 ? + al mamei @n sAnge este maimare decAt 1 cSpii ? ml (practic risc N 1 la 10 cSpii ? ml ).

•


111/118


• Rn ceea ce prive;te transmiterea mama-fat @n cazulI+, s-a demonstrat, de;i inconstant, c& nivelurileridicate ale =*4 ? I+ @n plasma mamei cresc risculinfecţiilor fetale.

• %c&derea riscului transmiterilor se poate face eficient prin :idovudin&.

• meta / analiz& recent& ce a inclus studii deco"ort& sugereaz& c& na;terea prin cezarian& reduce

riscul transmiterii I+ pe cale vertical&, indiferent deutilizarea :idovudinei.• 4ivelurile crescute de I+ apar mai frecvent @n timpul

relaţiilor "eterosexuale.


112/118

&etode cantitative

• *eal


113/118

METODE DIRECTE DE DIAGNOSTICVIROLOGIC - CULTIVARE

• Metodă standard 8 permite

stabilirea semni!icaţiei iolatului testarea sensibilităţii la antivirale iolarea unor virusuri noi

• laborioasă, necesită in!rastructură complexă"i personal cali!icat• accesibilitate redusă "i costuri mari



114/118


• 7relucrarea produsului patologic

• Medii de cultură %e'&'are%e'&'are culturi de celule (primare, diploide, linii celulare) ouă embrionate

animale de laborator



115/118


• 3videnţierea replicării virale e!ect citopatic incluii %emadsorbţie %emaglutinare

imuno!luorescenţă, metode imunoenimatice trans!ormare malignă inter!erenţă

E65IA23A I2E$E2I6F2 83B35 I5F7A5I i itii


116/118

3B35 I5F7A5I 4 sincitii

+irus urlian ! - sincitii (se confunda cu cele


117/118

ale +*% / diferentiere prin testul de

"emadso$tie)

CULTIVAREA VIRUSURILOR . INCLUZIIVIRALE


118/118

VIRALE

Documents

Diagn Inf Virale