(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号

(43)申请公布日

(21)申请号 201611255371.X

(22)申请日 2016.12.30

(71)申请人 上海科技大学

地址 200030 上海市徐汇区岳阳路319号

(72)发明人 陶厚朝　瑞满德·史蒂文斯　赵飞　

赵素文　徐菲　

(74)专利代理机构 上海申汇专利代理有限公司

31001

代理人 翁若莹　王婧

(51)Int.Cl.

C07D 401/14(2006.01)

C07D 409/14(2006.01)

C07F 5/04(2006.01)

A61K 31/502(2006.01)

A61K 31/69(2006.01)

A61P 35/00(2006.01)

(54)发明名称

平滑受体配体及其应用

(57)摘要

本发明提供了一种平滑受体配体及其应用。

所述的平滑受体配体，其特征在于，其结构式为：

其中，Ar为取代

或未取代的苯环及芳香杂环，m＝0或1。本发明开

发了针对平滑受体(Smoothened receptor，SMO)

的一类新型小分子配体。本发明通过结合平滑受

体的晶体结构数据，在小分子的相应位置引入硝

基及类似官能团，进一步增强配体和受体之间的

相互作用。此类小分子配体可以作为工具分子应

用于平滑受体的功能和结构研究，也可以作为与

平滑受体相关疾病的医药开发候选。

权利要求书4页 说明书22页 附图1页

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2017.06.13

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1.一种平滑受体配体，其特征在于，其结构式为：

其中，Ar为取代或未取代的苯环及芳香杂环，m＝0或1。

2.如权利要求1所述的平滑受体配体，其特征在于，所述的苯环及芳香杂环上的取代基

团为取代或未取代的硝基、卤素、拟卤素、羧基、磺酸基、甲基、羟基、巯基、氨基、烷基和烃基

中的至少一种。

3.如权利要求1所述的平滑受体配体，其特征在于，所述的Ar为苯环，苯环的2位未取

代、或被三氟甲基取代、或被硝基取代。

4.如权利要求1所述的平滑受体配体，其特征在于，其结构式为：

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5.权利要求1-4中任一项所述的平滑受体配体的衍生物，其特征在于，为上述的平滑受

体配体的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、互变异构体、旋转异构体、阻转异构体、

消旋体、代谢产物、盐类、水合物或高聚物。

6.权利要求1-4中任一项所述的平滑受体配体或权利要求5所述的平滑受体配体的衍

生物在作为平滑受体的配体或作为SMO受体拮抗剂中的应用。

7.一种药物，其特征在于，其含有权利要求1-4中任一项所述的平滑受体配体或权利要

求5所述的平滑受体配体的衍生物。

权　利　要　求　书 4/4 页

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平滑受体配体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及平滑受体配体及其应用。

背景技术

[0002] 平滑受体属于G-蛋白偶联受体(G  protein-coupled  receptors，GPCRs)中的F家

族，其功能紊乱将导致出生缺陷。20世纪50年代在美国西部发现许多出生小羊只有一只眼

睛，通过对此种独眼症的研究发现了平滑受体的第一个天然植物小分子配体环巴胺

(Cyclopamine)。平滑受体的功能调控与一系列癌症的发生发展相关，因此平滑受体是医药

开发中的重要靶标。在过去的几十年中，许多的先导化合物配体被发现，其中两个小分子药

物在2015年被推向市场。然而，平滑受体突变体导致的抗药性很快显现出来，亟需针对现有

药物进行进一步的改造。与此同时，最近几年平滑受体的结构研究取得了丰富的成果，其跨

膜区和胞外区都分别得到了高分辨解析。然而，平滑受体多区域整合的结构还未获成功，其

也是高特异性可规避抗药性的小分子药物设计的基础。

[0003] 美国专利US2010/324048  A1中没有将包括硝基在内的多种官能团引入化合物，同

时没有指出取代基团的引入对目标蛋白的热稳定性提高的作用。

发明内容

[0004] 本发明的目的是开发针对平滑受体(Smoothened  receptor，SMO)的一类新型小分

子配体，提高其热稳定性。

[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案：

[0006] 一种平滑受体配体，其特征在于，其结构式为：

[0007]

[0008] 其中，Ar为取代或未取代的苯环及芳香杂环，m＝0或1。

[0009] 优选地，所述的苯环及芳香杂环上的取代基团为取代或未取代的硝基、卤素、拟卤

素、羧基、磺酸基、甲基、羟基、巯基、氨基、烷基和烃基中的至少一种。

[0010] 更优选地，所述的Ar为苯环，苯环的2位未取代、或被三氟甲基取代、或被硝基取

代。

[0011] 优选地，所述的平滑受体配体，其特征在于，其结构式为：

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[0012]

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[0014]

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[0015]

[0016] 本发明还提供了上述的平滑受体配体的衍生物，其特征在于，为上述的平滑受体

配体的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、互变异构体、旋转异构体、阻转异构体、消

旋体、代谢产物、盐类、水合物或高聚物。

[0017] 本发明还提供了上述的平滑受体配体的或其衍生物在作为平滑受体的配体或作

为SMO受体拮抗剂中的应用。

[0018] 一种药物，其特征在于，其含有上述的平滑受体配体的或其衍生物。

[0019] 本发明在之前平滑受体的结构信息基础上(PDB：4JKV，4OQR，4N4W，4QIM，4QIN)，本

发明认为有必要在小分子配体和K395(hSMO)的侧链上氨基之间建立新的明确的相互作用

关系，这样可以进一步稳定平滑受体，更好地进行多区域整合的结构研究，也有利于小分子

的结合，克服因突变导致的药物失效。本发明在已知配体LY2940680的基础上，引入了硝基

(图1A)，此化合物TC114极大地稳定了平滑受体，在相关的热稳定性实验中(图1B)，在原有

配体的基础上更进一步成为超稳定配体(super  stabilizing  ligand)。TC114应用于多区

域平滑受体的结晶学结构研究，获得了2.7埃的高分辨率(图1C)。同时，基于荧光素酶报告

基因的细胞实验也证实了TC114大大优于原先LY2940680的抑制剂活性(图1D)。

[0020] 受到以上结果的鼓舞，本发明拓展了小分子配体的设计思路，从已知化合物出发，

在适当位置引入硝基官能团(图2A)。以不同的已知化合物为母体，通过改变硝基和其他取

代基的位置和数目，设计合成了多个系列的化合物。另外，本发明也进一步地引入芳香氮杂

原子的氮-氧化物作为新的作用位点，设计合成一系列化合物(图2B)。已知母体化合物包

括，但不限于，LY2940680、SANT-1、Cyclopamine、GDC-0449以及SAG等。取代基包括，但不限

于，卤素原子、拟卤素官能团、羧基、磺酸基、甲基及其取代甲基、羟基、巯基、氨基及衍生官

能团等。所列小分子配体符合通式以及相关联的对映异构体、非对映异构体、几何异构体、

互变异构体、旋转异构体、阻转异构体、消旋体、代谢产物等，以及相应的盐类、水合物、高聚

物等不同剂型或其他任何形式的潜药。

[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0022] 本发明开发了针对平滑受体(Smoothened  receptor，SMO)的一类新型小分子配

体。本发明通过结合平滑受体的晶体结构数据，在小分子的相应位置引入硝基及类似官能

团，进一步增强配体和受体之间的相互作用。此类小分子配体可以作为工具分子应用于平

滑受体的功能和结构研究，也可以作为与平滑受体相关疾病的医药开发候选。

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附图说明

[0023] 图1为含硝基的平滑受体小分子配体的设计和验证。1A.基于LY2940680的小分子

配体TC114的设计。1B.TC114极大地增强了平滑受体的热稳定性。1C.TC114与多区域整合的

平滑受体的共结晶结构。1D.基于荧光素酶报告基因的抑制剂活性细胞实验。

[0024] 图2为含硝基的平滑受体小分子配体的拓展。2A.植入不同数目和不同位置取代的

硝基化合物的设计。2B.以氮杂原子的氮氧化物为新作用位点的化合物设计。其中，Ar代表

含有一个或多个硝基及其它取代基团的苯基，或含有一个或多个取代基的芳杂环的氮氧化

物。配体代表已知SMO配体，例如LY2940680，SANT-1，Cyclopamine，GDC-0449或SAG的母体骨

架。

具体实施方式

[0025] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明

而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人

员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定

的范围。

[0026] 实施例1：配体及其合成

[0027] 1、平滑受体配体，其结构式分别为(I)-(XXIX)。

[0028] 2、除配体TC113、TC641、TC642、TC643、TC658和TC659外，其它配体合成方法如下：

[0029] 在5mL  N-甲基吡咯烷酮(NMP)中加入0.21g4-(N-Boc-甲氨基)哌啶、0.2g1，4-二氯

呔嗪和0.28g碳酸钾，加热至80℃反应6h。反应结束后加入20mL饱和氯化铵溶液淬灭，分出

有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水洗

涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300

目硅胶，洗脱剂为正己烷∶乙酸乙酯＝3∶1)分离得到纯净的中间体A。

[0030] 将0.37g上述中间体A与0.22g5-(1-甲基吡唑)硼酸频哪醇酯、0.06g四(三苯基膦)

钯和0.22g碳酸钠加入6mL体积比为3∶2∶1的甲苯/乙醇/水的混合溶剂中，加热至90℃反应

2h。反应结束后加入饱和氯化铵溶液淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有

机相，依次用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸

钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)

分离得到纯净的中间体B。

[0031] 将0.25g上述中间体B与2mL4M氯化氢/二氧六环溶液加入2mL二氯甲烷中室温搅拌

反应3h。反应结束后浓缩除去溶剂和多余的氯化氢得到纯净的中间体1。

[0032]

[0033] 将1.2mmol取代的苯甲酸和1.4mmol2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲

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六氟磷酸酯(HATU)在室温下加入3mL二氯甲烷中搅拌反应0.5h，然后加入1.0mmol中间体1

以及1.8mmolN，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，于室温下继续搅拌反应1h。反应结束后加入饱和

食盐水淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和碳酸氢钠水

溶液和饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产

品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的配体化合

物。反应通式如下：

[0034]

[0035] 其中，结构式分别为(I)-(XXIX)的配体对应的取代的苯甲酸和中间体见下表，各

取代的苯甲酸均为市售产品：

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[0036]

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[0037]

[0038] 3、结构式为(VI)的配体TC113由TC114反应得到，具体步骤如下：

[0039] 将0.1g  TC114溶解于10mL甲醇中，加入5％钯碳催化剂(阿拉丁，P116794)，在通入

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氢气的条件下室温搅拌3h。反应结束后过滤除去钯碳催化剂，浓缩得到纯净的TC113。

[0040] 结构式为(XIII)(XIV)(XV)的配体TC641、TC642和TC643由下述化合物TC111反应

得到。TC111采用步骤2相同方法，通过表格中的 (安耐吉，货号A020197)作

为取代的苯甲酸合成得到。

[0041]

[0042] TC111的表征数据请提供。TC111：无色固体。分离产率49％ .1H  NMR(500MHz，

CDCl3)，δ(ppm)1 .87-2.39(m，4H，CH2)，2.92(s，3H，CH3)，2.99(br，1H，CH2)，3.39(br，1H，

CH2)，4.04(s，3H，CH3)，4.22(br，2H，CH2)，4.92(br，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.61(br，1H，

CH)，7.67(d，J＝1.5Hz，2H，CH)，7.84-7.91(m，2H，CH)，7.97-7.99(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，

2H，CH)，10.08(s，1H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ22.1，28.2，28.9，29.2，31.4，37.8，

50.2，108.7，120.9，124.2，125.8，127.0，127.5，129.5，131.6，136.3，137.7，142.0，158.7，

169.9，191.0；高分辨质谱C26H26N6O2[M+H]+计算值：455.2190；实测值：455.2186。

[0043] 具体步骤如下：

[0044] TC641：将0.1g  TC111溶解于2mL冰醋酸、2mL硝基甲烷(安耐吉，货号N1096611000)

和0.5g乙酸铵的混合溶液中，加热至90℃搅拌3小时。反应结束后加入饱和碳酸氢钠水溶液

淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和碳酸氢钠水溶液饱

和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层

析(200-300目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的TC641。

[0045] TC642：将0 .05g  TC641溶解于3mL甲醇中，加入0 .038g硼氢化钠(国药，货号

80115860)，室温搅拌1小时。反应结束后加入饱和氯化铵水溶液淬灭，分出有机相，水相用

二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水洗涤，然后用无水

硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂

为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的TC642。

[0046] TC643：将0.1g  TC111溶解于2mL甲醇、2mL硝基甲烷和0.5g乙酸钠的混合溶液中，

室温搅拌12小时。反应结束后加入饱和食盐水淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三

次，并入有机相，用饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗

产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的

TC643。

[0047] 结构式为(XX)(XXI)的配体TC658、TC659由下述化合物LY2940680反应得到。

[0048]

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[0049] 具体步骤如下：

[0050] TC658：在2mL二甲基亚砜(DMSO)中加入0.1g苯酚、0.08g叔丁醇钾，加热至66℃，加

入0.1g  LY2940680，反应12h。反应结束后加入20mL饱和氯化铵溶液淬灭，分出有机相，水相

用二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和氯化铵水溶液和饱和食盐水洗涤，然后用无

水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用柱层析(200-300目硅胶，洗脱

剂为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的TC658。

[0051] TC659：在5mL  N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中依次加入0.07mL苯甲醇、0.05g氢化钠

(60％)，室温搅拌30分钟后加入0.1g  LY2940680，反应2h。反应结束后加入20mL饱和氯化铵

溶液淬灭，分出有机相，水相用二氯甲烷萃取三次，并入有机相，依次用饱和氯化铵水溶液

和饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，浓缩得到粗产品。粗产品用

柱层析(200-300目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)分离得到纯净的TC659。

[0052] 4、将各配体进行结构表征，具体如下：

[0053]

[0054] TC101：无色固体。分离产率62％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.87-2.21(m，4H，

CH2)，2.93(s，3H，CH3)，2.98(br，1H，CH2)，3.38(br，1H，CH2)，4.05(s，4H，CH3  and  CH2)，4.19

(br，1H，CH2)，4.90(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.43(br，5H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，

CH)，7.81-7.90(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ17.6，29.5，

29.6，30.6，38.2，49.3，50.7，109.1，121 .4，124 .6，126.2，127 .9，128.5，129.5，131 .5，

131.9，136.7，136.8，138.1，159.4；高分辨质谱C25H26N6O[M+H]+计算值：427.2247；实测值：

427.2245。

[0055]

[0056] TC102：无色固体。分离产率60％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm)1.95-2.22(m，4H，

CH2)，3.01-3.36(m，5H，CH3  and  CH2)，3.85(s，3H，CH3)，4.05-4.19(m，5H，CH3  and  CH2)，

4.84(br，1H，CH)，6.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.94(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.42(d，J＝8.5Hz，

2H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.82-7.90(m，2H，CH)，8.06(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，8.11

(d，J＝8.0Hz，1H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ22.6，25.4，27.1，31.8，38.2，38.5，50.6，

55.2，109.0，113.6，121.3，124.6，126.1，127.8，128.8，131.4，131.9，136.7，138.1，159.4，

160.5；高分辨质谱C26H28N6O2[M+H]+计算值：457.2347；实测值：457.2340.

[0057]

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[0058] TC103：无色固体。分离产率55％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.83-2.20(m，4H，

CH2)，2.93(s，3H，CH3)，3.08(br，1H，CH2)，3.40(br，1H，CH2)，4.06(s，4H，CH3  and  CH2)，4.19

(br，1H，CH2)，4.86(br，1H，CH)，6.59(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.37-7.43(m  4H，CH)，7.66(d，J

＝2.0Hz，1H，CH)，7.82-7.90(m，2H，CH)，8.06-8.10(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ

28.6，29.6，32.5，38.3，50.57，50.63，109.1，121 .3，124.6，126.2，127.9，128.4，128.8，

131.5，132.0，135.1，135.6，136.7，138.1，147.5，159.4；高分辨质谱C25H25ClN6O[M+H]+计算

值：461.1851；实测值：461.1848。

[0059]

[0060] TC104：无色固体。分离产率47％.1HNMR(500MHz，CDCl3)主要旋转异构体，δ(ppm)

1 .84-2.33(m，4H，CH2)，2.93(s，3H，CH3)，3.39-3.44(m，2H，CH2)，4.07(s，3H，CH3)，4.22-

4.25(m，2H，CH2)，4.88-4.93(m，1H，CH)，6.60(br，1H，CH)，7.61-7.66(m，3H，CH)，7.84-7.92

(m，2H，CH)，8.07-8.15(m，2H，CH)，8.30-8.32(m，2H，CH)；次要旋转异构体，δ(ppm)1 .84-

2.33(m，4H，CH2)，3.13(s，3H，CH3)，2.90-3.04(m，2H，CH2)，3.66-3.73(m，2H，CH2)，4.03(s，

3H，CH3)，5.34-5.36(m，1H，CH)，6.60(br，1H，CH)，7.61-7.66(m，3H，CH)，7.84-7.92(m，2H，

CH)，8.07-8.15(m，2H，CH)，8.30-8.32(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)主要旋转异构体，

δ27.0，28.4，29.7，32.2，38.1，50.5，51.6，109.0，121.2，123.7，126.1，127.78，127.80，

131.4，131.9，136.6，138.0，142.8，147.3，148.0，159.3，165.6，169.1；次要旋转异构体，δ

(ppm)22.5，25.4，27.8，31.7，38.1，50.2，56.9，107.6，124.0，124.5，127.1，128.3，128.4，

131 .6，132 .0，136 .5，138 .0，142 .8，147 .6，148 .0，159 .1，165 .6，169 .4；高分辨质谱

C25H25N7O3[M+H]+计算值：472.2092；实测值：472.2087。

[0061]

[0062] TC114：无色固体。分离产率49％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)主要旋转异构体，δ(ppm)

1 .84-2.36(m，4H，CH2)，2.77(s，3H，CH3)，3.60-3.67(m，2H，CH2)，4.01(s，3H，CH3)，4.39-

4.46(m，2H，CH2)，4.88-4.93(m，1H，CH)，6.65(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.62(d，J＝8.5Hz，1H，

CH)，7.70(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.98-8.06(m，2H，CH)，8.09-8.15(m，1H，CH)，8.25-8.27(m，

1H，CH)，8.49-8.52(m，1H，CH)，8.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)；次要旋转异构体，δ(ppm)1.84-

2.36(m，4H，CH2)，3.14(s，3H，CH3)，3.12-3.21(m，2H，CH2)，3.45-3.49(m，1H，CH)，3.98(s，

3H，CH3)，4.18-4.20(m，2H，CH2)，6.63(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.61(d，J＝8.5Hz，1H，CH)，7.69

(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.98-8.06(m，2H，CH)，8.09-8.15(m，1H，CH)，8.25-8.27(m，1H，CH)，

8.49-8.52(m，1H，CH)，8.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)主要旋转异构体，

δ27.8，28.2，32.0，38.1，50.7，51.3，51.5，109.9，122.2，122.42(q，J＝272.9Hz)，122.45

(q，J＝4.7Hz)，126.2，127.3，128.2(q，J＝33.5Hz)，128.83，128,85，133.0，134.1，134.6，

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138.3，141 .1(q，J＝2.8Hz)，146.3，147.7，157.4，166.8；次要旋转异构体，δ(ppm)27 .7，

28.9，29.3，38.0，50.1，51 .0，56.3，109.8，115 .6(q，J＝286.1Hz)，122.0，122.8(q，J＝

4.7Hz)，125.5，127.1，128.39，128.42(q，J＝33.5Hz)，128.6，128.8，132.9，134.6，135.0，

138.2，140.8(q，J＝2.3Hz)，146.8，147.8，158.0，166.5；高分辨质谱C26H24F3N7O3[M+H]+计算

值：540.1965；实测值：540.1964。

[0063]

[0064] TC113：无色固体。分离产率52％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)主要旋转异构体，δ(ppm)

1 .76-2.24(m，4H，CH2)，2.78(s，3H，CH3)，3.34-3.40(m，2H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，4.18-

4.23(m，4H，CH2)，4.90-4.94(m，1H，CH)，6.60(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，

CH)，6.94(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.09(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，

7.81-7 .90(m，2H，CH)，8.03-8.13(m，2H，CH)；次要旋转异构体，δ(ppm)1 .76-2.24(m，4H，

CH2)，3.09(s，3H，CH3)，2.94-3 .09(m，2H，CH2)，3.57-3 .62(m，1H，CH)，4.02(s，3H，CH3)，

4.11-4.18(m，4H，CH2)，6.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，6.83(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，6.96(d，J＝

1.5Hz，1H，CH)，7.09(d，J＝8.0Hz，1H，CH)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.81-7 .90(m，2H，

CH)，8.03-8.13(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)主要旋转异构体，δ17.5，27.5，31.7，

38 .11，38 .16，51 .0，56 .7，109 .0，112 .0(q，J＝4 .5Hz)，117 .6，121 .3，123 .6(q，J＝

272.2Hz)，124.6，124.8(q，J＝2.5Hz)，126.0，127.4(q，J＝31.4Hz)，127.8，128.2，131.4，

131 .9，136 .7，138.0，147 .2，147 .3，159.5，169.6；次要旋转异构体，δ(ppm)14 .1，29.1，

29.5，30 .6，49.3，50 .1，50 .9，109 .8，112 .2(q，J＝4.5Hz)，117 .4，121 .3，123 .6(q，J＝

272 .2Hz)，124 .0(q，J＝2.1Hz)，124 .4，126 .1，127 .4(q，J＝31 .4Hz)，127 .78，127 .80，

131.6，132.0，136.6，138.1，147.4，147.6，159.4，169.6；高分辨质谱C26H26qF3N7O[M+H]+计算

值：510.2224；实测值：510.2221。

[0065]

[0066] TC262：无色固体。分离产率88％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.75-2.25(m，4H，

CH2)，3.03(s，3H，CH3)，3.33(t，J＝13.0Hz，2H，CH2，)，3.86(s，2H，CH3)，4.05(s，3H，CH3)，

4.17(d，J＝8.0Hz，1H，CH2)，4.80-4.85(m，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.51-7.55(m，1H，CH)，

7.63-7 .70(m，2H，CH)，7.82-7 .92(m，2H，CH)，8.05-8 .17(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，

CDCl3)，δ27.8，28.8，29.9，30.2，38.2，40.6，50.7，51.4，55.6，109.1，121.3，121.9，124.1，

124 .6，126 .2，127 .9，129 .4，131 .5，132 .0，135 .5，136 .6，137 .0，138 .1，147 .3，148 .2，

159.3，169.5；高分辨质谱C26H27N7O3[M+H]+计算值：486.2248；实测值：486.2248。

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[0067]

[0068] TC277：无色固体。分离产率79％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.96-2.25(m，4H，

CH2)，3.18(s，3H，CH3)，3.38(br，2H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，4.24(d，J＝13.0Hz，2H，CH2)，

4.70-4.80(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.86-7.94(m，3H，CH)，

8.09-8.14(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ38.3，50.6，109.2，121.4，126.4，127.6，

128.0，131 .8，132.4，136.3，138.2，158.9，162.1；高分辨质谱C23H23N7O3S[M+H]+计算值：

478.1656；实测值：478.1681。

[0069]

[0070] TC288：无色固体。分离产率53％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.84-2.29(m，4H，

CH2)，2.91(s，3H，CH3)，3.01(br，1H，CH2)，3.42(t，J＝12.5Hz，2H，CH2)，4.08(s，3H，CH3)，

4.23(d，J＝12.5Hz，1H，CH2)，4.87-4.97(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.49-7.52(m，2H，CH)，

7.69(s，1H，CH)，7.84-7 .92(m，2H，CH)，8.05-8.16(m，4H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ

25.5，27 .1，28.6，29.2，30 .2，31 .5，36 .6，38.1，50 .6，51 .6，52.3，67 .9，109 .1，124 .7，

125.4，126.2，126.7，128.0，130.1，138.1，159.4，162.9；高分辨质谱C26H26N6O3[M+H]+计算

值：471.2139；实测值：471.2147。

[0071]

[0072] TC637：无色固体。分离产率82％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.94-2.25(m，4H，

CH2)，3.02(s，6H，CH3)，3.04(s，3H，CH3)，3.27(br，1H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，4.16(d，J＝

13.0Hz，2H，CH2)，4.89(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，6.73(d，J＝8.5Hz，2H，CH)，7.39(d，J＝

8.5Hz，2H，CH)，7.65(d，J＝2.0Hz，1H，CH)，7.82-7 .90(m，2H，CH)，8.05-8.13(m，2H，CH)，

8.31(s，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ38.2，40.3，50.7，109.0，111.4，121.3，124.6，

126.1，127.8，131.5，132.0，136.6，138.0，147.2，159.3；高分辨质谱C27H31N7O[M+H]+计算

值：442.2350；实测值：442.2329。

[0073]

[0074] TC638：无色固体。分离产率52％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.91-2.33(m，4H，

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CH2)，2.96(s，3H，CH3)，3.13(br，1H，CH2)，3.46(br，2H，CH2)，4.05(s，3H，CH3)，4.28(d，J＝

13.0Hz，1H，CH2)，4.89(br，1H，CH)，6.59(s，1H，CH)，7.65(br，2H，CH)，7.79(d，J＝3.0Hz，

1H，CH)，7.85-7 .93(m，2H，CH)，8.06-8.14(m，2H，CH)，8.31(s，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，

CDCl3)，δ17.6，28.5，29.1，29.9，32.5，38.2，38.5，50.7，53.4，109.2，121.4，124.4，124.8，

126.4，131.7，132.3，136.4，138.1，147.9；高分辨质谱C25H25N7O3[M+H]+计算值：472.2092；

实测值：472.2069。

[0075]

[0076] TC639：无色固体。分离产率79％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.82-2.23(m，4H，

CH2)，2.81(s，3H，CH3)，3.17(br，1H，CH2)，3.41(t，J＝11.0Hz，2H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，

4.27(d，J＝12Hz，1H，CH2)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.42-7.46(m，1H，CH)，

7.58-7.66(m，2H，CH)，7.76(dt，J＝7.5，1.5Hz，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.05-8.09

(m，1H，CH)，8.14-8.16(m，1H，CH)，8.22-8.25(m，1H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ27.6，

31 .2，38.2，38.3，38.5，51 .2，57 .1，109 .2，121 .4，124 .5，124 .7，124 .8，125 .0，126 .2，

126.3，127.4，127.8，127.9，129.6，131.6，132.2，133.5，134.7，138.1，144.8；高分辨质谱

C25H25N7O3[M+H]+计算值：472.2092；实测值：472.2106。

[0077]

[0078] TC641：无色固体。分离产率93％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.87-2.31(m，4H，

CH2)，2.94(s，3H，CH3)，3.04(br，1H，CH2)，3.45(br，1H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，4.27(d，J＝

12.5Hz，1H，CH2)，4.89(br，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.52(d，J＝8.0Hz，2H，CH)，7.63-7.66

(m，4H，CH)，7.84-7.93(m，2H，CH)，8.01-8.76(m，3H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ28.5，

38.2，50.7，109.2，121.4，126.2，127.9，131.1，132.0，132.3，133.9，136.4，137.9，138.1，

140.0，159.0；高分辨质谱C27H27N7O3[M+H]+计算值：498.2248；实测值：498.2251。

[0079]

[0080] TC642：无色固体。分离产率80％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.85-2.23(m，4H，

CH2)，2.92(s，3H，CH3)，3.08(br，1H，CH2)，3.37，(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，3.43(br，2H，CH2)，

4.06(s，3H，CH3)，4.25(d，J＝12.5Hz，1H，CH2)，4.65(t，J＝7.0Hz，2H，CH2)，4.88(br，1H，

CH)，6.59(s，1H，CH)，7.30(m，2H，CH)，7.40(d，J＝7.5Hz，2H，CH)，7.66(d，J＝2.0Hz，1H，

CH)，7.84-7.91(m，2H，CH)，8.07-8.13(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ28.6，33.0，

37.8，38.3，50.8，75.8，109.2，121 .4，126.2，126.3，126.8，128.6，131 .6，132.0，132.3，

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133 .9，135 .9，136 .4，137 .2，138.1，138.4，144 .8；高分辨质谱C27H29N7O3[M+H] +计算值：

500.2405；实测值：500.2447。

[0081]

[0082] TC643：无色固体。分离产率84％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.85-2.25(m，4H，

CH2)，2.90(s，3H，CH3)，3.00(br，1H，CH)，3.08(br，1H，CH2)，3.40(t，J＝13.0Hz，1H，CH2)，

4.01(s，3H，CH3)，4.22(d，J＝12.5Hz，1H，CH2)，4.50-4.63(m，2H，CH2)，4.79-4.88(m，1H，

CH)，5.46-5.49(m，1H，OH)，6.58(s，1H，CH)，7.37-7.47(m，4H，CH)，7.62(s，1H，CH)，7.84-

7.92(m，2H，CH)，8.03-8.15(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ28.5，29.8，32.4，38.1，

50.6，51 .6，53.4，70.2，81 .5，109.1，121 .4，126.0，126.2，127 .2，127 .9，131 .6，132.2，

136 .4，138 .1，140 .9，159 .2；高分辨质谱C27H29N7O4[M+H] +计算值：516 .2354；实测值：

516.2381。

[0083]

[0084] TC645：无色固体。分离产率66％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.83-2.29(m，4H，

CH2)，2.81(s，3H，CH3)，3.11(br，1H，CH2)，3.44(t，J＝12.5Hz，2H，CH2)，3.95(s，3H，CH3)，

4.07(s，3H，CH3)，4.26(d，J＝12.5Hz，1H，CH2)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.50

(d，J＝8.0Hz，2H，CH)，7.66(s，1H，CH)，7.84-7.92(m，2H，CH)，8.08-8.16(m，4H，CH)；13C  NMR

(125MHz，CDCl3)，δ28.5，29.8，32.3，38.2，38.5，50.4，50.7，51 .5，52.3，109.1，121 .3，

126 .0，126 .2，126 .8，127 .9，129 .6，129 .7，130 .0，131 .6，132 .2，136 .4，138 .1，141 .0，

159.1，166.2；高分辨质谱C27H28N6O3[M+H]+计算值：485.2296；实测值：485.2274。

[0085]

[0086] TC649：无色固体。分离产率69％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1 .36(s，12H，

CH3)，1.85-2.24(m，4H，CH2)，2.89(s，3H，CH3)，3.08(br，1H，CH2)，3.53(br，2H，CH2)，3.95(s，

3H，CH3)，4.06(s，3H，CH3)，4.35(br，1H，CH2)，4.83-4.94(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.40

(d，J＝7.0Hz，2H，CH)，7.65(s，1H，CH)，7.80-7.93(m，4H，CH)，8.09-8.17(m，2H，CH)；13C  NMR

(125MHz，CDCl3)，δ24.8，28.5，29.8，32.3，38.2，38.5，50.4，50.7，51.5，52.3，75.0，84.0，

109 .4，121 .3，126 .0，126 .2，126 .8，127 .9，129 .6，129 .7，130 .0，131 .6，132 .2，134 .9，

136.4，138.2，141.0，159.1，166.2.

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[0087]

[0088] TC653：无色固体。分离产率82％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.82-2.23(m，4H，

CH2)，2.80(s，3H，CH3)，3.01(br，2H，CH2)，3.41(t，J＝11Hz，1H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，4.24

(br，1H，CH2)，4.80-4.90(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.02-7.07，(m，4H，CH)，7.16(t，J＝

7.5Hz，1H，CH)，7.36-7 .43(m，4H，CH)，7.59(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，7.83-7 .92(m，2H，CH)，

8.08-8 .14(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ24.8，31 .4，38.3，38.5，50 .9，109 .2，

118 .0，119 .5，121 .4，124 .0，126 .4，128 .0，129 .9，131 .6，132 .3，138 .1，156 .1，158 .6，

162.4；高分辨质谱C31H30N6O2[M+H]+计算值：519.2503；实测值：519.2505。

[0089]

[0090] TC654：无色固体。分离产率75％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)  1.99-2.27(m，

4H，CH2)，3.00(s，3H，CH3)，4.06(s，3H，CH3)，5.11(s，2H，CH2)，6.62(s，1H，CH)，7.01(d，J＝

8.5Hz，1H，CH)，7.33-7.48(m，8H，CH)，7.66(s，1H，CH)，7.91-7.97(m，2H，CH)，8.12-8.17(m，

2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ27.2，29.3，31.8，38.4，51.0，70.1，109.5，127.5，128.1，

128.6，136.4，138.1，147.1，159.8，168.9；高分辨质谱C32H32N6O2[M+H]+计算值：533.2660；

实测值：533.2641。

[0091]

[0092] TC658：无色固体。分离产率70％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.77-2.29(m，4H，

CH2)，2.80(s，3H，CH3)，3.04(br，2H，CH2)，3.45(t，J＝11.0Hz，1H，CH2)，4.07(s，3H，CH3)，

4.28-4.32(m，1H，CH2)，4.91-4.97(m，1H，CH)，6.60(s，1H，CH)，7.05-7.11(m，2H，CH)，7.16-

7.24(m，2H，CH)，7.29-7.34(m，2H，CH)，7.39-7.45(m，2H，CH)，7.65-7.66(m，1H，CH)，7.85-

7.92(m，2H，CH)，8.07-8.16(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ27.6，28.0，28.7，29.2，

29.6，31.7，38.3，51.1，109.2，116.2，119.7，121 .4，124.2，126.4，128.8，130.0，131 .6，

132.4，138.2，147.1，155.4，158.0，168.6；高分辨质谱C32H29F3N6O2[M+H]+计算值：587.2377；

实测值：587.2380。

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[0093]

[0094] TC659：无色固体。分离产率86％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)  1.78-2.26(m，

4H，CH2)，2.76(s，3H，CH3)，3.03(br，2H，CH2)，3.46(t，J＝12.5Hz，1H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，

4.24-4.34(m，1H，CH2)，4.91-4.96(m，1H，CH)，5.13(s，2H，CH2)，6.60(s，1H，CH)，7.17-7.20

(m，1H，CH)，7.27-7.30(m，2H，CH)，7.33-7.48(m，5H，CH)，7.65-7.66(m，1H，CH)，7.85-7.93

(m，2H，CH)，8.07-8.16(m，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ27.6，29.6，31.8，38.4，51.0，

70.4，109.2，113.2，118.2，127.5，127.6，128.3，128.7，131.7，135.7，138.1，147.1，158.7，

168.9；高分辨质谱C33H31F3N6O2[M+H]+计算值：601.2533；实测值：601.2531。

[0095]

[0096] TC660：无色固体。分离产率92％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)1.87-2.38(m，4H，

CH2)，2.81(s，3H，CH3)，3.13(br，1H，CH2)，3.45(t，J＝12.5Hz，2H，CH2)，4.06(s，3H，CH3)，

4.14-4.29(m，2H，CH2)，4.80-4.90(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.66(d，J＝1.5Hz，1H，CH)，

7.84-7.94(m，3H，CH)，8.02-8.16(m，4H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ28.4，30.4，32.4，

38.5，50.6，53.4，109.2，124.7，125.5，126.4，128.0，131.8，132.3，136.3，138.1，142.0，

142.7，158.9，166.7；高分辨质谱C25H24N8O5[M+H]+计算值：517.1942；实测值：517.1954。

[0097]

[0098] TC661：无色固体。分离产率68％.1H  NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm)  1.96-2.39(m，

4H，CH2)，2.81(s，3H，CH3)，3.01(br，1H，CH2)，3.46(t，J＝12.5Hz，2H，CH2)，4.07(s，3H，CH3)，

4.14-4.31(m，2H，CH2)，4.83-4.92(m，1H，CH)，6.61(s，1H，CH)，7.45-7.49(m，1H，CH)，7.54-

7.58(m，1H，CH)，7.65-7.69(m，1H，CH)，7.86-7.94(m，2H，CH)，8.09-8.17(m，2H，CH)8.65(d，

J＝2.0Hz，2H，CH)；13C  NMR(125MHz，CDCl3)，δ28.4，32.4，38.5，50.6，52.4，109.2，119.5，

121 .4，124 .7，126 .4，127 .4，128 .4，131 .7，131 .9，132 .3，138 .1，142 .0，148 .4，158 .9，

165.6；高分辨质谱C25H24N8O5[M+H]+计算值：517.1942；实测值：517.1971。

[0099] 实施例2

[0100] 分别对实施例1中合成的各配体进行热稳定性实验和细胞活性实验：

[0101] 1、热稳定性实验：

[0102] SMO蛋白纯化：

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[0103] 在HEK293F细胞(Life，货号K1663)中对SMO蛋白进行表达。细胞在37℃培养至细胞

密度达到1.0-1.3x106cells/mL后收集，破碎得到细胞膜，并悬浮于含有10mM4-(2-羟乙基)

哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(西格玛奥德里奇，货号H3375)，10mM氯

化镁(西格玛奥德里奇，M4880)，20mM氯化钾(西格玛奥德里奇，P9541)pH  7.5的缓冲液中。

在上述缓冲液中加入浓度1M的氯化钠得到高盐缓冲液，加入浓度200mM的氯化钠得到低盐

缓冲液。细胞膜用高盐缓冲液洗涤(50mL*3次)并离心，再用低盐缓冲液洗涤(50mL*3次)并

离心。加入100mL含有去垢剂(n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，Anatrace，货号D310)的缓冲液，

于4℃下混匀3小时，离心得到上清液，加入700mg  TALON  IMAC树脂(Clontech，货号

635670)，于4℃下混匀12小时。含有树脂的溶液过滤除去水相，依次用洗涤液1(50mM  4-(2-

羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH  7.5；800mM氯化钠(西格玛奥

德里奇，S3014)；10％甘油(西格玛奥德里奇，G5516)，0.5％n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷20mM

咪唑(西格玛奥德里奇，货号I5513)，10mM氯化镁)、洗涤液2(25mM  4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙

磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH  7.5；500mM氯化钠；10％甘油，0.03％n-十二烷

基-β-D-麦芽糖苷，40mM  Imidazole)各洗涤3次。用提取液(25mM  4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙

磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)pH  7.5；300mM氯化钠；10％甘油，n-十二烷基-β-D-

麦芽糖苷，220mM咪唑)冲洗树脂得到SMO蛋白的缓冲溶液。

[0104] 将所得的SMO蛋白(0.2μM)、配体化合物(20μM)与下所示的荧光染料(Biotium，货

号91010) 混合于含有(浓度为0 .03％)去垢剂(n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷，

Anatrace，货号D310)的缓冲溶液(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-

乙磺酸)，西格玛奥德里奇，货号H3375，使用氢氧化钠调节pH至7.4)中。样品于4℃放置30分

钟后，使用Rotor-Gene采集样品的荧光信号(激发波长365nm，发射波长460nm)随温度的变

化并绘制曲线，得到该样品的Tm值用于评估配体对蛋白热稳定性的影响。

[0105]

[0106] 细胞活性实验：使用NIH  3T3细胞进行荧光素酶报告实验测定配体化合物作为SMO

受体拮抗剂的活性。信号使用100nM  SAG(Sellect，货号S7779)激活。具体步骤如下：转基因

有荧光素酶报告基因NIH3T3的细胞(Clontech，货号631197)在96孔板中培养至6*105个细

胞/孔，然后加入浓度为10000nM、2000nM、400nM、80nM、16nM、3.2nM、0.64nM、0.128nM、

0.0256nM、0.00512nM的梯度浓度的配体化合物在37℃共孵育1小时，加入终浓度为100nM的

激活剂SAG，继续在37℃共孵育24小时。加入 荧光素报告系统(Promega，货号，货

号E2920)并使用Envision酶标仪(PerkinElmer)对Gli荧光素酶报告水平进行测定。平行测

定三组数据，根据下述公式拟合曲线并得到化合物的IC50值。

[0107] Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

[0108] 其中，X代表化合物浓度，Y代表酶标仪测定的荧光读数，Top表示曲线的上平台值，

Bottom代表曲线的下平台值。HillSlope代表曲线最大斜率的绝对值。

[0109] 2、实验结果如下表：

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[0110]

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[0111]

[0112] 上表中的大部分化合物在热稳定性实验中的Tm值高于不加入配体化合物时的测

定值(56.0℃)，说明这些化合物能够通过与SMO蛋白结合增加其热稳定性。活性实验中大部

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分化合物的IC50值在10000nM以下，说明这些化合物是有效的SMO受体抑制剂。

[0113] 对于实施例1中合成的TC114，如图1B所示，在原有配体的基础上更进一步成为超

稳定配体(super  stabilizing  ligand)，如图1C所示，TC114应用于多区域平滑受体的结晶

学结构研究，获得了2.7埃的高分辨率。同时，如图1D所示，基于荧光素酶报告基因的细胞实

验也证实了TC114大大优于原先LY2940680的抑制剂活性。

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图1

图2

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