รหสโครงการ SUT1-104-53-12-02

รายงานการวจย

การพฒนาเทคโนโลยใหมในการเพมจานวนเซลลตนกาเนด เมสเซนไคนมอลและการแชแขงเซลล

(Development a New Technology for Mesenchymal Stem Cell Expansion and Cryopreservation)

ไดรบทนอดหนนการวจยจาก

มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

 

 

 

 

 

 

 

 

รหสโครงการ SUT1-104-53-12-02

รายงานการวจย

การพฒนาเทคโนโลยใหมในการเพมจานวนเซลลตนกาเนด เมสเซนไคนมอลและการแชแขงเซลล

(Development a New Technology for Mesenchymal Stem Cell Expansion and Cryopreservation)

คณะผวจย

หวหนาโครงการ

ผชวยศาสตราจารย เทคนคการแพทยหญง ดร. วไลรตน ลอนนตศกดศร สาขาวชาจลชววทยา สานกวชาวทยาศาสตร

มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร

ผรวมวจย

อาจารย นายแพทย ดร. ชวบลย เดชสขม นางสาวพชร ปราศจาก

ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ปงบประมาณ พ.ศ. 2553

ผลงานวจยเปนความรบผดชอบของหวหนาโครงการวจยแตเพยงผเดยว

มถนายน 2556

 

 

 

 

 

 

 

 

ก

กตตกรรมประกาศ

โครงการวจยน� ไดรบทนอดหนนการวจยจากมหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร ประจาป

งบประมาณ พ.ศ. ���� ซ� งคณะผวจยขอขอบคณหนวยงานท�งสองแหงเปนอยางสงไว ณ โอกาสน�

งานวจยน� ประสบความสาเรจไดจากความรวมมอเปนอยางดของผรวมวจย � ทานคอ อาจารย

นายแพทย ดร. ชวบลย เดชสขม และ นางสาว พชร ปราศจาก ซ� งหวหนาโครงการขอขอบคณทานท�ง

สองไว ณ โอกาสน� เชนเดยวกน นอกจากน� ยงใครขอขอบคณ มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนารโดย

สวนรวม และ สานกวชาวทยาศาสตร รวมท�งศนยเคร�องมอวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลย

เทคโนโลยสรนาร ท�อานวยความสะดวกตางๆท�ง น� า ไฟ สถานท�ทาการวจย อปกรณและเคร�องมอ

ตางๆท�ใชในงานวจยในคร� งน� ท�สาคญท�สดอกประการหน�งท�ทาใหโครงการน�สาเรจไดดวยดคอการ

ไดรบความรวมมอเปนอยางดจากคณะแพทยและพยาบาลจากโรงพยาบาล ป.แพทย โรงพยาบาล

เซนตแมร�และโรงพยาบาลคายสรนาร จงหวดนครราชสมา ท�อานวยความสะดวกในการเกบตวอยาง

เพ�อนามาใชวจยในคร� งน� ซ� งตองขอขอบคณเปนอยางสงไว ณ โอกาสน� ท า ย ส ด น� ผ ว จ ย

ขอขอบคณคณะกรรมการประเมนงานวจยและบคคลอ�นๆซ�งไมอาจกลาวไดหมดในโอกาสน� สาหรบ

การสนบสนนและความชวยเหลอตางๆซ�งมสวนเก�ยวของท�ทาใหงานวจยน�สาเรจลลวงไปไดดวยด

ผศ. ทนพญ. ดร. วไลรตน ล�อนนตศกด� ศร

หวหนาโครงการวจย

 

 

 

 

 

 

 

 

ข

บทคดยอ

เซลลตนกาเนดเมสเซนไคนมอลไดรบการยอมรบวาสามารถนามาประยกตใชรกษาโรคตางๆ

ไดเปนอยางด อยางไรกตามการรกษาโรคตางๆน�มกพบกบปญหาเร�องการมปรมาณเซลลตนกาเนด

ไมเพยงพอตอการนามาใชในการรกษาโรค และคณภาพท�ของเซลลซ� งหากนามาเล�ยงใน

หองปฏบตการเปนเวลานานเปนเดอนเพ�อเพ�มจานวนเซลลใหไดปรมาณเพยงพอน�น จะทาใหเซลล

ตนกาเนดเสยคณสมบตความเปนเซลลตนกาเนดได ซ� งเม�อนามาใชในการรกษาโรคจะสงผลใหการ

รกษาโรคในผปวยไมประสบผลสาเรจเทาท�ควร ดงน�นโครงการวจยน� จงมวตถประสงคท�จะคดคนหา

เทคโนโลยใหมในการเล�ยงเซลลตนกาเนดเมสเซนไคนมอลจากสายสะดอ ใหสามารถแบงตวเพ�ม

จานวนไดอยางรวดเรวในระยะเวลาอนส�น และยงคงคณสมบตความเปนเซลลตนกาเนดเพ�อ

แกปญหาดงกลาวขางตน ในการน�ไดมการพฒนาน�ายาเล�ยงเซลลชนดใหมท�ยงไมมผใดศกษา คอ

embryonic stem cells conditioned medium (ESCM) ผสมรวมกบ epidermal growth factor (EGF)

เปนสวนประกอบหลกอกชนดหน�ง และนามาเล�ยงเซลลภายใตสภาวะท�มออกซเจนต�า (ปรมาณ

ออกซเจน รอยละ �) จากผลการทดลองพบวาวธการน�สามารถเรงการเจรญเตบโตของ งเซลลตน

กาเนดเมสเซนไคนมอลจากสายสะดอไดเปนอยางด โดยสามารถกระตนใหเซลลเพ�มจานวนไดสงถง

���.�� 14.62 เทาเม�อเทยบกบจานวนเร�มตน ภายในระยะเวลาเพยง 12 วน ในขณะเดยวกนเซลล

เหลาน�ยงสามารถรกษาคณสมบตของความเปนเซลลตนกาเนดเมสเซนไคนมอล จากสายสะดอได

อยางดท�งในดานของรปรางเซลล การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลล (CD29+ CD44

+ CD90+ CD34

-

CD45-) ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลท�จาเพาะ (เซลลกระดกแขง เซลลกระดกออน

และเซลลไขมน) และการแสดงออกของยนท�บงช�ความเปนเซลลตนกาเนด การทดลองน�สรปไดวา

การเล�ยงเซลลแบบใหมน�สามารถเพ�มจานวนเซลลตนกาเนดเมสเซนไคนมอล จากสายสะดอไดอยาง

 

 

 

 

 

 

 

 

ค

มประสทธภาพท�สง ในระยะเวลาอนส�น ซ� งเหมาะแกการนาไปประยกตในทางคลนกเพ�อการรกษา

โรคและเกบแชแขงเปนธนาคารเซลลตนกาเนดเพ�อชในระยะยาวตอไปได

 

 

 

 

 

 

 

 

ง

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) has been accepted as a promising tool for therapeutic

purpose. However, insufficient quantity of the cells and changing in stem cell characteristics of the

stem cells according to the long term cell culture in vitro (more than 30 days) are major obstacles

for therapeutic applications of this cell type. These problems lead to ineffective therapeutic

outcomes. Therefore, this work focus on development a new effective method for Wharton’s jelly

mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) expansion in vitro in a short period of time which is also able

to maintain its stem cell characteristics. To this end, we developed a new culture medium

composes of embryonic stem cell condition media containing epidermal growth factor as another

major component of the media. We used this medium to culture WJ-MSCs under hypoxic

condition ( 5% O2). The results demonstrated that this new medium could accelerate WJ-MSCs

expansion by ���.�� 14.62 folds increase in day 12 compared to day 0 of the in vitro cultures.

The expanded cells also could preserve common characteristics of MSCs including cells

morphology, cell surface marker expressions (CD29+, CD44

+, CD90+, CD34

-, CD45-), differentiation

potential (osteoblasts, chondroblasts, adipocytes), and stemness marker expressions. Altogether,

this new method can serve as a new high effective method for WJ-MSCs expansion in vitro in a

short period of time which suitable for clinical applications and stem cell bank for long term use of

the cells.

 

 

 

 

 

 

 

 

จ

สารบญ

หนา

กตตกรรมประกาศ ………………………………………………………………………. ก

บทคดยอภาษาไทย …………………………………………………………….………… ข

บทคดยอภาษาองกฤษ .……………………………………………………….…………. ง

สารบญ .…………………………………………………………………………………. จ

สารบญตาราง ……………………………………………………………………………. ฉ

สารบญภาพท� ………………………………………………………………………………. ช

คาอธบายสญลกษณ.……………………………………………………….……………... ซ

บทท� 1 บทนา

ความสาคญและท�มาของปญหาการวจย ………..……………………………. 1

วตถประสงคของการวจย .………………………..………………………….. 5

ขอบเขตของการวจย …………………..…………..…………………………. 5

ขอตกลงเบ�องตน ………...…………………………..……………………….. 6

ประโยชนท�ไดรบจากการวจย ………..………………..……………….……. 6

บทท� 2 วธดาเนนการวจย

วธการทดลองเกบขอมล .……………………………………………………….. 7

วธวเคราะหขอมล …………………………………………..……………………. 12

บทท� 3 ผลการวจยและผลการวเคราะหขอมล

ผลการวจยและผลการวเคราะหขอมล.…………………………………………. 14

บทท� 4 ขอวจารณ ……………………………………………………………………………. 22

บทท� � บทสรป

สรปผลการวจย ……………………………………………………………………. 26

ขอเสนอแนะ .…………………………………………………………………….. 27

บรรณานกรม …………………………………………………………………………….. 28

ภาคผนวก ………………………….……………………………………………………….. 35

ประวตผวจย …………………………………………………………………………………. 36

 

 

 

 

 

 

 

 

ฉ

สารบญตาราง

หนา

ตาราง 1 รายการแสดงช�อและ sequences ของ primers ………………………………… 10

 

 

 

 

 

 

 

 

ช

สารบญภาพ

หนา

ภาพท� 1 รปรางลกษณะของ WJ-MSCs ………………………………………….. 14

ภาพท� 2 อตราการเจรญเตบโต และอตราการเพ�มจานวนของ WJ-MSCs ………….. 15

ภาพท� 3 ระยะเวลาโดยเฉล�ยท�เซลลใชในการแบงตว (PDT) ……………………….. 16

ภาพท� 4 การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลลของ WJ-MSCs ในชวงปลาย (P7) .. 17

ภาพท� 5 การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลลของ WJ-MSCs ………………….. 19

ภาพท� 6 ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลล

adipocytes, chondroblast และ osteoblast ……………………………….. 20

ภาพท� 7 การแสดงออกของยนท�เก�ยวของกบความเปน stem cells ของ WJ-MSCs .. 21

 

 

 

 

 

 

 

 

ซ

คาอธบายสญลกษณ

AFP = alpha-fetoprotein

ALB = albumin

bFGF = basic fibroblast growth factor

BM = bone marrow

BSA = bovine serum albumin

º C = degree Celsius

cDNA = complementary DNA

CK-18 = cytokeratin 18

CO2 = carbon dioxide

D = day

DAPI = 4,6-diamidino-2-phenylindole

DMEM = Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid

EGF = epidermal growth factor

ES = embryonic stem cells

ESCM = embryonic stem cells conditioned medium

FBS = fetal bovine serum

 

 

 

 

 

 

 

 

ฌ

คาอธบายสญลกษณ (ตอ)

g = gram

h = hour

HDGF = hepatoma-derived growth factor

HepG2 = hepatocellular carcinoma cell line

HGF = hepatocyte growth factor

ITS = insulin, transferrin and selenium

LDL = low-density lipoprotein

mRNA = messenger RNA

MSCs = mesenchymal stem cells

NH4Cl = ammonium chloride

O2 = oxygen

OSM = oncostatin M

PBS = phosphate buffer saline

PDT = population doubling time

RNA = ribonucleic acid

RT-PCR = reverse transcription polymerase chain reaction

WJ-MSCs = Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells

 

 

 

 

 

 

 

 

บทท� 1

บทนา

1. ความสาคญและท�มาของปญหาการวจย

Mesenchymal stem cells (MSCs) คอเซลลตนกาเนดท�มศกยภาพเปล�ยนแปลงไปเปนเซลล

จาเพาะชนดตางๆในรางกายไดเชน adipocytes, chondroblast และ osteoblast ซ� งมการคนพบเซลลน�

คร� งแรกจากไขกระดกโดยทมวจยของ Fridenstein และคณะในป 1970 (Caplan, 2007) จากน�นเปน

ตนมาไดมทมวจยมากมายศกษา MSCs ในแงมมตางๆ ทาใหเกดความหลากหลายของ MSCs ท�งใน

แงคณลกษณะและคณสมบต ดงน�นเพ�อเปนการสรางความเขาใจท�ตรงกน เม�อเรวๆน� International

society for cellular therapy (ISCT) ไดกาหนด criteria ข�นต�าในการจาแนก MSCs ดงน� 1: MSCs ตอง

มคณสมบตเกาะตดกบภาชนะท�ใชเล� ยงเซลลได เชน culture flask 2: MSCs ตองมรปรางเรยวยาว

คลาย fibroblast 3: MSCs ตองมการแสดงออกของกลมโปรตนบนผวเซลลคอ CD29, CD44, CD90

และ CD105 เปนอยางนอย 4: MSCs ตองมศกยภาพในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลตางๆในสายของ

mesodermไดเชน adipocytes, chondrocytes และ osteoblast (Dominici et al., ����)

นอกจากไขกระดกแลวงานวจยตอมาพบวา MSCs สามารถแยกไดจากแหลงอ�นๆอกมากมาย

เชน ช� นไขมน, น� าคร� า, รก และ สายสะดอรก เปนตน (in 't Anker et al., ����; In 't Anker et al.,

����; Troyer & Weiss, ����; Tsai, Lee, Chang, & Hwang, ����; Zuk et al., ����) ซ� งสวนมากแลว

งานวจยสวนใหญมกศกษา MSCs ท�แยกไดจากไขกระดก แมจะมคณลกษณะและคณสมบตของ

MSCs แตอยางไรกตามจานวนเซลลท�แยกไดจากไขกระดกมปรมาณคอนขางต�า อกท�งคณสมบตของ

เซลลท�แยกมาไดยงข�นกบอายของไขกระดกดวย ซ� ง MSCs ท�แยกไดจากไขกระดกของผสงอายจะม

ความสามารถเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะชนดตางๆไดต�ากวา MSCs ท�แยกไดจากไขกระดกของ

เดก เปนตน (Caplan, ����) ดงน�นจงมความจาเปนท�จะตองหาแหลงอ�นๆของ MSCs มาทดแทนและ

 

 

 

 

 

 

 

 

�

ตอบสนองตองานวจยตางๆโดยเฉพาะงานวจยทางคลนก ซ� งในปจจบนมการใช MSCs ในงานวจย

ทางคลนกเพ�อรกษาโรคตางๆมากมายเชน โรคกลามเน�อหวใจขาดเลอด (Stamm et al., ����) โรค

กระดก (Horwitz et al., ����) เปนตน และผลในเบ�องตนพบวา MSCs สามารถชวยฟ� นฟภาวะของ

ความผดปรกตเหลาน�ไดเปนอยางด

สายสะดอรกจากเดกแรกเกดโดยเฉพาะสวน Wharton’s jelly จดวาเปนอกแหลงหน�งท�พบวา

อดมไปดวย MSCs และมขอดเหนอกวาแหลงอ�นๆเน�องจากสายสะดอรกมความออนเยาวและ

primitive มากกวา อกท� งย งงายตอการเกบตวอยาง ซ� งตางกบการเกบตวอยางจากไขกระดกท�

กอใหเกดความเจบปวดมาก นอกจากน�การศกษาท�ผานมาพบวา MSCs ท�แยกไดจาก Wharton’s jelly

ของสายสะดอรก (Wharton’s jelly derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs) มคณลกษณะและ

คณสมบตเหมอนกบ MSCs ท�แยกไดจากแหลงอ�นๆ (Baksh, Yao, & Tuan, ����; Majore, Moretti,

Hass, & Kasper, ����; Wang et al., ����) รวมท�งมความสามารถเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะ

ชนดตางๆไดนอกเหนอจากสาย mesoderm เชน สาย ectoderm ไดแก nerve cells (Mitchell et al.,

2003) สาย endoderm ไดแก hepatocytes (Zhang, Lie, & Wei, 2009), insulin-producing cells (Chao,

Chao, Fu, & Liu, 2008) แล ะ cardiomyocytes (Pereira, Khushnooma, Madkaikar, & Ghosh, 2008)

เปนตน

ในปจจบนการนาเซลลตนกาเนด mesenchymal stem cells มาใชในการรกษาโรคตางๆ มก

ประสบกบปญหาเร�องการท�มเซลลตนกาเนดอยางจากด คอมจานวนนอยไมพอตอการรกษาโรค ซ� ง

ทาใหการรกษาโรคในผปวยไมประสบผลสาเรจเทาท�ควร ตองเกบตวอยางบอยหรอหลายคร� งเพ�อให

เพยงพอตอความตองการในการนาไปรกษาโรค ซ� งไมสะดวกตอผปวย หรอตองเกบจากอาสาสมคร

จานวนมากเพ�อใหเพยงพอตอการวจย แมจะมนกวจยหลายกลมพยายามท�จะเพ�มจานวนเซลลตน

กาเนดน� ใหมากข�น แตยงประสบปญหาเร�องการเล�ยง mesenchymal stem cell ท�ตองใชเวลานานหลาย

 

 

 

 

 

 

 

 

�

สปดาหหรอเปนเดอนเพ�อใหไดเซลลในจานวนท�เพยงพอตอการใชงาน นอกจากน�การเล�ยงเซลลใน

หองทดลอง (in vitro) ในระยะเวลานานทาใหเซลลตนกาเนดเสยคณสมบตความเปนเซลลตนกาเนด

ได หยดการแบงตวและตายได รวมท�งเกดการเปล�ยนแปลงเปน polyploidy และ aneuploidy ซ� งหาก

นาไปรกษาโรคแกผปวยหรอนาไปศกษาวจยตอจะสงผลลพธท�ไมพงประสงคได และทาใหเสย

งบประมาณโดยเปลาประโยชน ปญหาเหลาน�ทาใหการรกษาโรคไมสามารถทาไดในระยะ เวลาอน

ส�นหรออาจไมทนการณได ในแงของการวจยจะทาใหการวจยตางๆเกดความลาชาและส�น เปลอง

งบประมาณ เปนตน

ดงน�นการคดคนหาวธการใหมท�สามารถเพ�มจานวนเซลลไดมากข�นเปนจานวนหลายเทาใน

ระยะเวลาท�ส�นลงจะสามารถแกปญหาดงกลาวขางตนได ดวยเหตน�โครงการวจยน� จงมวตถประ สงค

ท�จะคดคนหาเทคโนโลยใหมในการเล�ยงเซลลตนกาเนดชนด mesenchymal stem cell ใหสามารถ

แบงตวเพ�มจานวนไดอยางรวดเรวในระยะเวลาอนส�น และยงคงคณสมบตความเปนเซลลตนกาเนด

รวมท�งคงความสามารถท�จะเปล�ยนแปลงเปนเซลลชนดตางๆได เม�อไดรบการกระตนท�เหมาะสม

โดยจะทดสอบการเปล�ยนแปลงของเซลลเปน osteocyte, chondrocyte และ adipocyte นอกจากน�

หลงจากกระบวนการเพ�มจานวนเซลลแลว เซลลท�ไดตองสามารถเกบแชแขงและนากลบมาใชใหม

ได เพ�อใหสามารถเกบเซลลตนกาเนดไวใชในระยะยาวได โครงการน� จะใชmesenchymal stem cell ท�

แยกจากสายสะดอ เน�องจากเกบงายและเปนสวนท�มกจะท�งไปหลงคลอด

การใช MSCs เพ�อเปาหมายในการรกษาน�นจาเปนตองใชเซลลจานวนมาก ดงน�นการขยาย

จานวนเซลลในหองปฏบตการใหเพยงพอตอความตองการจงมความจาเปน โดยปกตแลว MSCs

ส ามารถเจรญ เตบ โตไดในอาห ารเล� ยงเซ ลลท�วไป คอ Dulbecco’s modified Eagle’s medium

(DMEM) ท�ม 10% fetal bovine serum (FBS) เปนสวนประกอบ MSCs สามารถเจรญเตบโตใน

สภาวะท�วไปคอ 21% oxygen แตอยางไรกตามการศกษาเรวๆน� พบวาในสภาวะ low oxygen หรอ

 

 

 

 

 

 

 

 

�

hypoxia สามารถกระตนให MSCs เจรญเตบโตไดดกวาในสภาวะท�วไป (Dos Santos et al., ����)

นอกจากน� เม�อพจารณาถง FBS ซ� งเปนแหลงสารอาหารท�สาคญของเซลลแลวพบวา FBS สามารถ

เปนแหลงการแพรกระจายและปนเป� อนของ prion และ xenogeneic proteins ตางๆไดเปนอยางด ซ� ง

สามารถกอใหเกดผลเสยในการใชเซลลเพ�อการรกษาทางคลนก ดงน�นจงมความจาเปนท�จะตองหา

แหลงสารอาหารอ�นๆเพ�อมาทดแทน เปนท�นาสนใจวาอาหารสาหรบใชเล� ยง Embryonic stem cells

(ES) ซ� งมขอดคอมกใชสวนผสมของอาหารแบบชนด xeno-free สามารถกระตนให MSCs มอตรา

การเจรญเตบโตท�สงกวาการใชอาหารเล�ยงเซลลท�วไป 4-5 เทา (Battula et al., 2007) แตอยางไรกตาม

ยงไมพบการศกษาเก�ยวกบการใช Embryonic stem cells conditioned medium (ESCM) ในการเล� ยง

MSCs ซ� งเปนท�นาเสยดายมาก เน�องจากการเล� ยง ES เซลลโดยปรกตแลวจะตองมการเปล�ยนอาหาร

เล� ยงเซลลทกๆวน เพ�อปองกนการเกด spontaneous differentiation ดงน� นในทกๆวนจะมการท�ง

ESCM ไปแบบเสยเปลา ซ� งในการศกษาน� ไดเลงเหนประโยชนและคณ คาของ ESCM จงม

วตถประสงคท�จะศกษาศกยภาพของ ESCM ในการสนบสนนการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs โดย

ทดสอบคณลกษณะและคณสมบตตางๆของเซลลในแงมมตางๆเชน อตราการเจรญเตบโต, รปราง

ลกษณะของเซลล, การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลล, ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปน

เซลลจาเพาะชนดตางๆ osteocyte, chondrocyte และ adipocyte ตามมาตรฐานการทดสอบคณสมบต

ของ mesenchymal stem cells การแสดงออกของยนท�บงช� ถงความเปน stem cells และวฎจกรของ

เซลลหรอ cell cycle หากโครงการน�สาเรจจะทาใหไดเทคโนโลยใหมในการเพ�มเซลลตนกาเนดใน

ปรมาณท�มากข� นอยางมนยสาคญ ในระยะ เวลาส� น ลดงบประมาณในการเล� ยงและเตรยมเซลล

สามารถเกบเซลลจากผ ปวยหรออาสาสมครจานวนนอยลงและไมตองเกบบอยคร� ง สามารถ

ประยกตใชเทคโนโลยในทางการแพทยและยงสามารถเกบแชแขงเปนธนาคารเซลลตนกาเนดไวใช

ในอนาคตในยามท�ตองการ ย�งไปกวาน� นเม�อโครงการน� ประสบความสาเรจจะมการถายทอด

 

 

 

 

 

 

 

 

�

เทคโนโลยแกนกวจย ไทยท�สนใจเพ�อนาไปใชตอยอดงานวจยในดานตางๆตอไป ซ� งส� งเหลาน� จะ

เปนประโยชนตอสงคมและประเทศไทยโดยสวนรวม

2. วตถประสงคของการวจย

ศกษาความสามารถในการสนบสนนการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs โดยอาหารเล� ยงเซลล

Embryonic stem cells conditioned medium (ESCM) ท� เ ต ม growth factor ค อ epidermal growth

factor (EGF) และทดสอบคณสมบตของเซลลในแงมมตางๆเชน อตราการเจรญเตบโต, รปราง

ลกษณะของเซลล, การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลล, ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปน

เซลลจาเพาะในสาย mesoderm, การแสดงออกของยนท�บงช� ถงความเปน stem cells และวฎจกรของ

เซลลหรอ cell cycle นอกจากน� ยงทาการศกษาความสามารถของเซลลในการเปล�ยนแปลงไปเปน

เซลลจาเพาะในสาย endoderm คอเซลลตบ หลงจากท�ถกเล�ยงดวยอาหาร ESCM+ EGF มาแลว

3. ขอบเขตของการวจย

แยก mesenchymal stem cells จากสายสะดอ เพ�อทาการเพ�มจานวนเซลลดวยเทคโนโลย

การเล�ยงแบบใหมและทาการตรวจสอบคณสมบตของเซลลท�ไดวาเปนเซลลตนกาเนดชนดน� จรง

กอนทาการแชแขงเซลลเพ�อเปนธนาคารเซลลไวใชในการทดลองตลอดโครงการ โดยตรวจสอบ

คณสมบตท�งระดบเซลลและระดบอณชววทยา จากน�นทดสอบความสามารถของเซลลกาเนดท�

ไดในการเปล�ยน แปลงเปนเซลล osteocyte, adipocyte และ chondrocyte ข�นตอนถดไปทาการ

วเคราะหขอมล สรปผลการทดลอง เตรยมผลงานเพ�อตพมพผลงานในระดบนานาชาต

 

 

 

 

 

 

 

 

�

4. ขอตกลงเบ�องตน

ไมม

5. ประโยชนท�ไดรบจากการวจย

ประโยชนจากงานวจยน�คอไดวธการเล� ยงเซลลแบบใหมท�มประสทธภาพในการเพ�มจานวน

เซลลไดเปนจานวนมาก ในระยะเวลาอนส� นภายในหองปฎบตการ โดยใชน� ายาท�ไมมการปนเป� อน

จาก serum ของสตว ซ� งสอดคลองกบความตองการใชเซลลปรมาณมากเพ�อการรกษาโรคทางคลนก

ในระยะเวลาท�จากด และ น� ายาเล� ยงเซลลชนดใหมน� ยงเปนแหลงของสารอาหารท�ดสาหรบ WJ-

MSCs ซ� งนอกจากจะชวยเรงการเจรญเตบโตของเซลลแลว ยงสามารถคงสภาพความออนเยาวของ

stem cells ไวไดอยางดเย�ยม เซลลท�ไดสามารถแชแขงทาเปนธนาคารเซลลตนกาเนดเพ�อใชในการ

รกษาโรคในระยะยาว เหมาะสาหรบใชในทางคลนกตอไปในอนาคต

 

 

 

 

 

 

 

 

�

บทท� 2

วธดาเนนการวจย

1. การแยกและเล�ยง WJ-MSCs ในหองปฏบตการ

ทาการเกบสายสะดอรกจากเดกแรกเกด ซ� งทางโรงพยาบาลไมตองการแลวและจะนาไป

กาจดท�งตอไป หลงจากไดรบความยนยอมจากพอหรอแมของเดกโดยม inform of concent ซ� งเปนไป

ต าม ระ เบ ย บ แ ล ะ อ ยภ าย ใตค ว าม ด แ ล ข อ ง Human Research Ethics Committee of Suranaree

University of Technology จากน�นนาตวอยางมาแยก mesenchymal stem cells โดยทาการตดตวอยาง

ใหเปนช�นเลกและยอยตวอยางดวยเอนไซม 2 mg/ml collagenase type I (Gibco-Invitrogen) ท� 37ºC

เปนเวลา 16 ชม. เม�อครบเวลาแลวเตม FBS ในปรมาณท�เทากนกบปรมาณของตวอยางท�เหลอจาก

การยอย จากน�นนาไปป�นตกตะกอนเพ�อแยกเซลลท� 1200 rpm, 4ºC นาน 10 นาท จากน�นนาไปป�น

ลางดวย PBS ท�ผสมดวยยาปฏชวนะ แลวนาตะกอนของเซลลท�แยกไดมาเล� ยงใน T25 cm2 culture

flask (Greiner Bio-One) โ ด ย อ า ห า ร ESCM ท� เ ต ม 10 ng/mL epidermal growth factor (EGF,

Peprotech) ท� 37ºC ในสภาวะ 5% oxygen และ 5% carbon dioxide เพ� อศกษาคณ ลกษณ ะและ

คณสมบตของเซลลในแงมมตางๆตอไป

2. การวเคราะหอตราการเจรญเตบโตและ population doubling times

เล� ยงเซลลดวยอาหารท�ง 2 ชนดใน 6 well plate โดยเร�มตนความหนาแนนของเซลลท� 5,000

เซลล/cm2 เปนเวลา 12 วน จากน�นทาการนบเซลลทกๆ 3 วนดวยวธ vital Trypan blue staining เพ�อด

อตราการเจรญเตบโตของเซลลและการคานวณคา fold increase ทาโดยการนาคาจานวนเซลลท�งหมด

ท�นบไดของแตละวนมาหารดวยคาจานวนเซลลเร� มตนของวนแรกท�ทาการทดลอง สาหรบการ

คานวณคา population doubling times ทาโดยเล� ยงเซลลดวยอาหารท� ง 2 ชนดใน 6 well plate โดย

 

 

 

 

 

 

 

 

�

เร�มตนความหนาแนนของเซลลท� 5,000 เซลล/cm2 เปนเวลา 6 วน จากน�นทาการนบเซลลทกๆวนดวย

วธ vital Trypan blue staining เพ�อนาคาจานวนเซลลท� งหมดท�นบไดของแตละวนมาเขาสตร

คานวณหา population doubling times (PDT) = tplg2/(lgNH-lgNI) ซ� ง NI = จานวนเซลลเร�มตน, NH

= จานวนเซลลท�นบได และ t = ระยะเวลาท�ใชในการเล�ยงเซลล (ชม.) หรอคานวณคา PDT จากสตร

online จากเวปไซด www.doubling-time.com

3. การเตรยม ESCM

น� าเล� ยงเซลล ESCM ไดมาจากการเกบน� าเล� ยงเซลลหรออาหารท�ผานการเล� ยงเซลล H9

human embryonic stem cells line บน feeder ท�เปน human foreskin fibroblast เปนเวลานาน 24 ชม.

ซ� ง ม ส ว น ป ร ะ ก อ บ ต า ง ๆ ด ง น� Knockout-DMEM (Gibco-Invitrogen), 20% Knockout serum

replacement (Gibco-Invitrogen), 1% non-essential amino acids (Sigma), 1mM L-glutamine (Gibco-

Invitrogen), 0.1 mM -mercaptoethanol (Gibco-Invitrogen) แ ล ะ 5 ng/ml human basic fibroblast

growth factor (bFGF, Peprotech) จากน� นนา ESCM มากรองและเกบท� -20ºC จนกวาจะนามาใช

สาหรบ unconditioned medium มข�นตอนการเตรยมเหมอนกบ ESCM ทกอยาง แตกตางแคเพยง

อาหารชนดน�ไมผานการเล�ยงเซลลเหมอน ESCM

4. การวเคราะหโปรตนบนผวเซลลโดยวธ Flow cytometry

ใชเซลลจานวน 2 x 105 cells เพ�อเปนกลมตวอยางในการตรวจหาโปรตนบนผวเซลลท�บงช�

ถงคณลกษณะของ MSCs คอ CD29, CD44 และ CD90 ซ� งใชเปน positive markers นอกจากน� ยงทา

การตรวจหาโปรตนบนผวเซลลท�บงช� ถงคณลกษณะของ Heamatopoietic stem cells คอ CD34 และ

CD45 ซ� งใชเปน negative markers เพ�อใชในการยนยนคณลกษณะของเซลลท�แยกมาได โดยมวธ

 

 

 

 

 

 

 

 

�

ทดสอบคราวๆดงน� นาเซลลมาป�นลางดวย 2% FBS/PBS จากน�นนาเซลลมายอมดวย antibody ตอ

markers ต า ง ๆ ค อ CD29-phycoerythrin (PE), CD34-PE, CD44-PE, unconjugated antibody ต อ

CD90 แ ล ะ CD45-fluorescein isothiocyanate (FITC) (all from BD Biosciences) ท� 4ºC น า น 1

ช�วโมง จากน� นป�นลางดวย 2% FBS/PBS และ fix เซลลดวย 4% paraformaldehyde/PBS สาหรบ

เซลลท�ยอมดวย unconjugated antibody ตอ CD90 ตองทาการยอมอกคร� งดวย antibody ท�ตดฉลาก

ส า ร เ ร อ ง แ ส ง ค อ goat-anti-mouse-FITC-conjugated secondary antibody (BD Biosciences) ท�

อณหภมหอง นาน 1 ช�วโมง จากน�นป�นลางดวย 2% FBS/PBS และทาการตรงโครงสรางของเซลลดง

ขางตน จากน�นนาเซลลท�ยอมไปวเคราะหโปรตนบนผวเซลลโดยเคร�อง Flow cytometry รน FACS

Calibur (Becton Dickinson)และวเคราะหขอมลโดย Cell Quest Software (Becton Dickinson)

5. การสกด RNA และตรวจหาการแสดงออกของยนโดยวธ RT-PCR

ใช เซ ลลจ าน วน 1 x 106 cells เพ� อส กด RNA โดยใช ช ด Total RNA Mini Kit (Tissue)

(Geneaid) ซ� งมวธการสกดตาม protocol ท�แนบมากบสนคา จากน�นทาการตรวจหาการแสดงออก

ของยนในระดบ RNA โดยข�นแรกตองทาการเปล�ยน RNA ใหเปน cDNA กอนดวยชด RevertAidTM

First Stand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) จากน�นจงทาข�นตอนตอไปคอตรวจหาการแสดงออก

ของยนท�บงช� ถงความเปน stem cells โดยใช primer ท�จาเพาะตอยนเหลาน� ดงท�แจกแจงในตารางท� 1

และตรวจหาการแสดงออกของยนท�บงช� ถงความเปนเซลลตบโดยใช primer ท�จาเพาะตอยนเหลาน�

ดงท�แจกแจงในตารางท� 2 ซ� งปฏกรยาในการทา RT-PCR ประกอบไปดวย 10X PCR buffer, 1 U Taq

polymerase, 25 mmol/L MgCl2, 10 mmol/L dNTP mixed และ 10 µmol/L of each primer ใน final

volume 25 µl เม�อเสรจส�นปฏกรยาแลว product ท�ไดจะถกแยกตอดวยวธ gel electrophoresis โดยใช

 

 

 

 

 

 

 

 

��

2% agarose gel และ band ของ product จะถกตรวจจบโดยการยอมดวย ethidium bromide ซ� ง

สามารถมองเหน band ไดจากการอานผานแสง UV ในเคร�อง gel doc

ตาราง 1. รายการแสดงช�อและ sequences ของ primer ท�จาเพาะตอยนท�บงช� ถงความเปน stem cells

Genes Primer sequence (5’ to 3’) Annealing

Temp. Size (bp) References

Oct-4 GAGCAAAACCCGGAGGAGT 60 310 (Yao et al., 2006)

TTCTCTTTCGGGCCTGCAC

Nanog GCTTGCCTTGCTTTGAAGCA 60 255 (Yao et al., 2006)

TTCTTGACTGGGACCTTGTC

Oct-3/4 CTCACCCTGGGGGTTCTATT 60 230 (Darr, Mayshar, & Benvenisty, 2006)

CTCCAGGTTGCCTCTCACTC

C-myc TGGTCTTCCCCTACCCTCTCAAC 55 265 (Han et al., 2007)

GATCCAGACTCTGACCTTTTGCC

Klf-4 GTTTTGAGGAAGTGCTGAG 55 332 (Chiambaretta et al., 2004)

CAGTCACAGTGGTAAGGTTT

Sox-2 GCCCCCAGCAGACTTCACA 64 170 (Tsukamoto et al., 2005)

CTCCTCTTTTGCACCCCTCCCATTT

GAPDH AGCCACATCGCTCAGACACC 60 302 (Yao et al., 2006)

GTACTCAGCGGCCAGCATCG

 

 

 

 

 

 

 

 

��

6. การกระตน WJ-MSCs ใหเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะชนดตางๆในสาย mesoderm

เล� ยงเซลลใหไดความหนาแนนประมาณ 90-100% confluence จากน�นจงกระตนเซลลให

เปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะในสาย mesoderm คอ adipocytes, chondrobalst และ osteoblast โดย

ใชอาหารสาเรจรปเพ�อชวยกระตนไดแก STEM PRO Adipogenesis Differentiation Kit, STEM PRO

Chondrogenesis Differentiation Kit แ ล ะ STEM PRO Osteogenesis Differentiation Kit (all from

Gibco-Invitrogen) เม�อกระตนเซลลสาเรจแลว ข�นตอนตอไปคอการทดสอบประสทธภาพของเซลลท�

เปล�ยนไป สาหรบเซลลไขมนหรอ adipocytes สามารถตรวจวดโดยการยอมสเมดไขมนท�อยภายใน

เซลลดวยส oil red O solution (Sigma-Aldrich) สาหรบเซลลกระดกออนหรอ chondroblast สามารถ

ตรวจวดโดยการยอมสช�น proteoglycan ของเซลลดวยส 1% alcian blue solution (Sigma-Aldrich)

และสาหรบเซลลกระดกหรอ osteoblast สามารถตรวจวดโดยการยอมสผลกของแคลเซยมท�เซลล

สรางข�นดวยส 2% alizarin red S solution (Sigma-Aldrich)

7. การวเคราะหวฎจกรของเซลลหรอ cell cycle

ใชเซลลจานวน 1 x 106 cells เพ�อเปนกลมตวอยางในการตรวจหาวฎจกรของเซลล โดยนา

เซลลมาป�นลางดวย PBS และตรงโครงสรางของเซลลดวย ice cold 70% ethanol ท� 4°C เปนเวลา 1

ชม. จากน�นนามาป�นลางอกคร� งและยอม DNA ของเซลลดวยส propidium iodide/RNase A solution

(Becton Dickinson) ท� 37°C เปนเวลา 15 นาท ในท�มด จากน�นนาเซลลเหลาน� ไปตรวจหาวฎจกรของ

เซลลดวยเคร�อง Flow cytometry รน FACS Calibur (Becton Dickinson)และวเคราะหขอมลโดย Cell

Quest Software (Becton Dickinson)

 

 

 

 

 

 

 

 

��

8. วธวเคราะหขอมล

ใน ก ารศ ก ษ าน� ไดใช Student’s t-test ใน ก ารว เค ราะ ห ขอ ม ล โดย statistical software

SPSS17.0 ซ� งถอวาขอมลใดๆมความแตกตางอยางมนยยะสาคญทางสถตท� P 0.05 และทกขอมลถก

แสดงผลเปน mean ± standard deviation

 

 

 

 

 

 

 

 

��

บทท� 3

ผลการวจยและผลการวเคราะหขอมล

1. อตราการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ในหองปฏบตการ

การศกษาน� ไดทาการเล� ยง WJ-MSCs ในอาหารเล� ยงเซลล ESCM ท�เตม growth factor คอ

EGF เพ�อศกษาคณสมบตของเซลลในแงมมตางๆ ซ� งพบวาอาหารเล�ยงเซลลชนดน�สามารถสนบสนน

การเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ไดเปนอยางด และเซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารชนดน� มรปรางเรยวยาว

เหมอน fibroblast ไมแตกตางจากลกษณะของ MSCs ท�วไป (ภาพ 1) เปนท�เดนชดวา ESCM+EGF

สามารถกระตนการเจรญเตบโตของเซลลไดเปนอยางด จากการทดลองเล�ยงเซลลภายในเวลา 12 วน

หรอประมาณ 2 สปดาหพบวา เซลลท�ถกเล� ยงดวย ESCM ท�ม 10 ng/mL EGF เปนสวนประกอบ

สามารถขยายเพ�มจานวนเซลลไดสงถง 21.24 2.58 x 106 เซลลและสามารถกระตนใหเซลลมอตรา

การเพ�มจานวนไดสง 424.88 14.62 เทาเม�อเทยบกบจานวนเร�มตน (ภาพ 2) จากขอมลเหลาน� สรป

ไดวา ESCM+EGF สามารถสนบสนนและกระตนการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ไดเปนอยางด

โดยเฉพาะในชวงระยะเวลาส� นๆซ� งเปนผลดตอความตองการเพ�มจานวนเซลลเพ�อใชในทางคลนก

นอกจากน� เม�อทาการทดสอบหาคาเฉล�ยของเวลาท�เซลลใชในการแบงตวพบวา เซลลเหลาน� มการ

แบงตวคอนขางเรวประมาณ 33.57 1.00 ชม.ในชวง passage ตนๆ (P4) และ 35.70 1.60 ชม.

ในชวง passage ปลายๆ (P7) (ภาพ 3)

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาพ 1. รปรางลกษณะของ WJ-MSCs ท�ถกเล�ยงดวยอาหารเล�ยงเซลล ESCM+EGF นาน 8 วน ภายใต

สภาวะท�มออกซเจนต�า (A) ลกษณะความหนาแนนของเซลลแบบ sub-confluence (B) และแบบ

confluence (C) กาลงขยาย 40x

A B C

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาพ 2. อตราการเจรญเตบโต (A) และอตราการเพ�มจานวน (B) ของ WJ-MSCs ท�ถกเล�ยงดวยอาหาร

เล�ยงเซลล ESCM+EGF ในระยะเวลา 12 วนภายใตสภาวะออกซเจนต�า ขอมลถกแสดงเปน mean

SD (n = 3)

0

5

10

15

20

25

30

0 3 6 9 12

Time (days)

Cell

nu

mb

ers

(x 1

06)

ESCM+EGF

0

60

120

180

240

300

360

420

480

0 3 6 9 12

Time (days)

Fo

ld i

ncre

ase

ESCM+EGF

B

A  

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาพ 3. ระยะเวลาโดยเฉล�ยท�เซลลใชในการแบงตว (PDT) เม�อ WJ-MSCs ถกเล� ยงดวยอาหารเล� ยง

เซลล ESCM+EGF ภายใตสภาวะออกซเจนต�าท�งในชวงตน (P4) และปลาย (P7) ของการเล�ยงเซลล

ขอมลถกแสดงเปน mean SD (n = 3)

2. วฎจกรของเซลลหรอ cell cycle

เพ�อศกษาผลกระทบของอาหารเล� ยงเซลล ESCM+EGF ตอความเปนปรกตของเซลล

การศกษาน�ไดนาเซลลมาวเคราะหหาวฎจกรของเซลล ซ� งพบวาเซลลในชวง passage ตนๆ (P4) วงจร

ชวตของเซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารชนดน� เขาสระยะท� เซลลมการเตรยมพรอมกอนท�จะมการ

สงเคราะห DNA หรอระยะ G0/G1 เทากบ 84.72 1.1% เขาสระยะท�เซลลมการสงเคราะห DNA

หรอระยะ S เทากบ 0.81 0.08% และเขาสระยะท�เซลลมการเตรยมพรอมสาหรบการแบงเซลลหรอ

ระยะ G2/M เทากบ 8.08 0.05% (ภาพ 4A) นอกจากน� เซลลในชวง passage ปลายๆ (P7) วงจรชวต

ของเซลลเขาสระยะ G0/G1 เทากบ 87.96 0.12% เขาสระยะ S เทากบ 0.9 0.16% และเขาสระยะ

G2/M เทากบ 9.59 0.49% (ภาพ 4B) จากขอมลเหลาน� สรปไดวาเซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารเล� ยง

0

200

400

600

800

1000

1200

P4 P7

Ce

ll n

um

be

rs (X

10

00

) D0

D1

D2

D3

D4

D5

D6

PDT (P4) = 33.57 1.00 h

PDT (P7) = 35.70 1.60 h

 

 

 

 

 

 

 

 

��

เซลล ESCM+EGF มวงจรชวตของเซลลเปนปรกตซ� งสวนใหญแลวอยในระยะ G0/G1ไมแตกตางจาก

เซลลท�วไป แมเขาสชวงปลายของการเล�ยงเซลล

ภาพ 4. สดสวนของการแสดงออกโปรตนบนผวเซลลของ WJ-MSCs ในชวงปลาย (P7) ของการเล�ยง

เซลลในสภาวะออกซเจนต�าหรอ hypoxic เม�อเปรยบเทยบกนระหวางการเล� ยงดวยอาหารเล�ยงเซลล

ท�วไป DMEM-LG+10% FBS (A) และอาหาร ESCM (B) คาเปอรเซนตการแสดงออกโปรตนบนผว

เซลลของแตละโปรตนสรปในกราฟแทงโดยเฉล�ย (C) ขอมลถกแสดงเปน mean SD (n = 3)

3. การทดสอบคณลกษณะและคณสมบตของ WJ-MSCs

เพ�อศกษาผลกระทบของอาหารเล� ยงเซลล ESCM+EGF ตอความสามารถของเซลลในการ

รกษาคณลกษณะและคณสมบตของความเปน MSCs อนดบแรกคอการแสดงออกของกลมโปรตนท�

จาเพาะบนผวเซลลซ� งเปน positive markers ของ MSCs ไดแก CD29, CD44 และ CD90 พบวาเซลลท�

ถกเล� ยงดวยอาหารเล� ยงเซลลชนดน� มการแสดงออกของ CD29และ CD44 มากกวา 90% ในชวงตน

ของการเล� ยงเซลล (P4) และเม�อเขาสชวงปลายของการเล� ยงเซลล (P7) กลมโปรตนเหลาน� ยงคงถก

แสดงออกในสดสวนใกลเคยงกน สาหรบ CD90 พบวามการแสดงออกของโปรตนชนดน� สง

เชนเดยวกนในชวงตนของการเล�ยงเซลล แตอยางไรกตามเม�อเขาสชวงปลายของการเล�ยงเซลล พบวา

B A

 

 

 

 

 

 

 

 

��

มการแสดงออกของ CD90 ในสดสวนท�ลดลงเลกนอย (ภาพ 5) นอกจากน� พบวาเซลลมการ

แสดงออกของกลมโปรตนท�จาเพาะตอ Haematopoietic stem cells คอ CD34 และ CD45 ซ� งใชเปน

negative markers ในสดสวนท�ต �ามากไมถง 1%

การทดสอบความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะในสายของ mesoderm ก

เปนอกหน� งคณสมบตท�สาคญของ MSCs ซ� งพบวาเซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารเล� ยงเซลลชนดชนดน�

สามารถถกกระตนใหเปล�ยนแปลงไปเปนเซลล adipocytes, chondroblast และ oseteoblast ไดเปน

อยางดท�งในชวงตนและปลายของการเล�ยงเซลล ซ� งสามารถตรวจวดไดโดยการยอมตดสแดงของเมด

ไขมนท�ถกสรางและสะสมอยภายในเซลล adipocytes ยอมตดสน� าเงนของ proteoglycan ท�ถกสราง

ข� นโดยเซลล chondroblast และยอมตดสสมแดงของผลกแคลเซยมท�ถกสรางข� นโดยเซลล

oseteoblast (ภาพ 6) จากขอมลเหลาน� บงช� ไดวา นอกจาก ESCM+EGF จะสามารถสนบสนนและ

สงเสรมการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ไดแลว ยงสามารถรกษาคณลกษณะและคณสมบตของความ

เปน MSCs ของเซลลไดเปนอยางด

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาพ 5. สดสวนการแสดงออกของโปรตนบนผวเซลลของ WJ-MSCs ท�ถกเล� ยงดวยอาหารเล�ยงเซลล

ESCM+EGF ภายใตสภาวะออกซเจนต�าท�งในชวงตน (P4) (A) และปลาย (P7) (B) ของการเล�ยงเซลล

A

B

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาพ 6. ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลล adipocytes, chondroblast และ osteoblast ของ

WJ-MSCs ท�ถกเล� ยงดวยอาหารเล�ยงเซลล ESCM+EGF ภายใตสภาวะออกซเจนต�าท�งในชวงตน (P4)

(A-C) และปลาย (P7) (D-F) ของการเล�ยงเซลล กาลงขยายสาหรบภาพ adipocytes, chondroblast และ

osteoblast คอ 200x, 100x และ 40x ตามลาดบ

4. การแสดงออกของยนท�บงช�ถงความเปน stem cells

การศกษาผลกระทบของอาหารเล� ยงเซลลชนดน� ตอความสามารถของเซลลในการรกษา

สภาพความเปน stem cells พบวาเซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารเล� ยงเซลล ESCM+EGF สามารถ

แสดงออกของยนท�บงช� ถงความเปน stem cells ได เชน Oct-4, Oct-3/4, Nanog, Klf-4, C-Myc และ

Sox-2 ซ� งเปนยนท�แสดงถงความออนเยาวของเซลล โดยสามารถตรวจพบการแสดงออกของยน

เหลาน� ในระดบท�ใกลเคยงกนท�งในชวงตนและปลายของการเล�ยงเซลล (ภาพ 7) และเปนท�นาสนใจ

วาแมเขาสชวงปลายของการเล�ยงเซลลแลว เซลลท�ถกเล� ยงดวยอาหารชนดน� ยงคงสามารถรกษาความ

ออนเยาวของความเปน stem cells เอาไวไดเปนอยางด จากขอมลเหลาน� ช� ให เหนวานอกจาก

A B C

D E F

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ESCM+EGF จะสามารถสนบสนนและสงเสรมการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ไดเปนอยางดแลว

ESCM+EGF ยงสามารถรกษาสภาพความออนเยาวของ stem cells ไดดอกดวย

ภาพ 7. การแสดงออกของยนท�เก�ยวของกบความเปน stem cells ของ WJ-MSCs ท�ถกเล�ยงดวยอาหาร

เล�ยงเซลล ESCM+EGF ภายใตสภาวะออกซเจนต�าท�งในชวงตน (P4) (lane1) และปลาย (P7) (lane2)

ของการเล�ยงเซลล

 

 

 

 

 

 

 

 

��

บทท� 4

ขอวจารณ

การศกษาเรวๆน� พบวา MSCs มความสามารถในการรกษาโรคทางคลนกบางชนดเชน

osteogenesis imperfecta (Horwitz et al., 1999) และ myocardial infarction (Stamm et al., 2003) เปน

ตน ซ� งจาเปนตองใชเซลลจานวนมาก ดงน�นการเพ�มหรอขยายจานวนเซลลในหองปฏบตการจงม

ความสาคญ การศกษาท�ผานมาพบวา สายสะดอรกจากเดกแรกเกดโดยเฉพาะสวน Wharton’s jelly

เปนอกแหลงหน� งท�อดมไปดวย MSCs ซ� งมขอดเหนอกวาแหลงอ�นๆเน�องจากสายสะดอรกมความ

ออนเยาวและ primitive มากกวา (Weiss & Troyer, ����)นอกจากน� ยงงายตอการเกบตวอยางอกดวย

การศกษาน� ไดทาการเล� ยง WJ-MSCs ในอาหารเล� ยงเซลล ESCM ท�ผสมดวย growth factor คอ EGF

เพ�อศกษาคณสมบตของเซลลในแงมมตางๆไดแก อตราการเจรญเตบโต, รปรางลกษณะของเซลล,

การแสดงออกของโปรตนบนผวเซลล, ความสามารถในการเปล�ยนแปลงไปเปนเซลลจาเพาะในสาย

mesoderm, การแสดงออกของยนท�บงช� ถงความเปน stem cells และวฎจกรของเซลลหรอ cell cycle

เม�อพจารณาถงประสทธผลของการแยกเซลลพบวา การศกษาน�สามารถแยก MSCs ออกจาก

เน�อเย�อสายสะดอรกสวน Wharton’s jelly ไดสงถง 5,000 เซลลตอกรมของช�นเน�อ แตอยางไรกตาม

อตราน� ย งค งต� าก วา เม� อ เป รยบ เท ยบ ป ระส ท ธ ผ ล ข องก ารแยก เซ ล ลจาก ก ารศ ก ษ าอ� น ๆ

(Karahuseyinoglu et al., ����; Schugar et al., ����) ซ� งความแตกตางน� อาจสบเน�องมาจากความ

หลากหลายของวธการแยกเซลลรวมท�งสภาวะท�ใชเล� ยงเซลลของแตละการศกษา นอกจากน� พบวา

ESCM+EGF สามารถกระตนใหเซลลมอตราการเพ�มจานวนไดสง 424.88 14.62 เทาเม�อเทยบกบ

จานวนเร� มตน การคนพบน� แสดงให เหนวา ESCM+EGF สามารถสนบสนนและสงเสรมการ

 

 

 

 

 

 

 

 

��

เจรญเตบโตของ WJ-MSCs ไดดโดยเฉพาะในระยะเวลาส� นๆภายใน 2 สปดาห ซ� งสามารถตอบรบ

กบความตองการใชเซลลจานวนมากในทางคลนกไดเปนอยางดโดยเฉพาะในเวลาท�จากด

ยน Oct-4, Sox-2 และ Nanog คอกลมยนท�เก�ยวของกบ transcription factors ท�สาคญในการ

รกษาสภาวะ pluripotency และ self-renewal ของ ES เซลล (Chambers & Tomlinson, 2009) สาหรบ

MSCs พบวากลมยนเหลาน� กมความสาคญในการรกษาสภาพความออนเยาวของเซลลเชนเดยวกน

จากการศกษาท�ผานมาพบวา การปรบแตงยนของ MSCs โดยใช lentiviral system เพ�อกระตนใหเกด

overexpression ของยน Oct-4 และ Nanog สามารถกระตนใหเซลลเหลาน�นมอตราการเจรญเตบโตท�

สงข� นในขณ ะท� ย งคงรกษาสภาพความออนเยาวของ stem cells เอาไวได (Liu et al., ����)

เชนเดยวกนกบการศกษาน� เปนท�นาสนใจวาแมเขาสชวงปลายของการเล�ยงเซลลแลว เซลลเหลาน� ยง

มการแสดงออกของยนท�บงช� ถงความออนเยาวของ stem cells จากขอมลเหลาน� ช� ให เหนถง

ประสทธภาพของ ESCM+EGF ในการสนบสนนและสงเสรมการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs พรอม

ท�งสามารถคงสภาพความออนเยาวของ stem cells เอาไวได

เม�อพจารณาถงสาเหตท�ทาให ESCM มประสทธภาพชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของเซลล

ไดเปนอยางด พบวาปจจยหลกๆนาจะมาจาก growth factors หรอ cytokines ตางๆท�อยในอาหารน�

จากการศกษาท�ผานมาพบวา human foreskin fibroblast ซ� งทาหนาท� เปน feeder ใหกบ ES เซลล

สามารถหล�ง bFGF ซ� งเปน growth factor ชนดหน�งท�มความสาคญในการรกษาสภาวะ pluripotency

และความออนเยาวของ ES เซลล (Park et al., ����) และการศกษาตอมาไดชวยสนบสนน

ความสาคญของ bFGF ตอ ES เซลล ซ� งพบวาแม ES เซลลไมไดถกเล� ยงบน feeder กสามารถรกษา

สภาวะ pluripotency และความออนเยาวไวได โดยการเตม bFGF เขาไปในอาหารเล�ยงเซลลทดแทน

จากการขาด feeder (Levenstein et al., 2006) สาหรบ MSCs มการศกษาพบวา bFGF สามารถชวย

กระตนการเจรญเตบโตของเซลลไดเชนกน (Bianchi et al., ����) จากขอมลเหลาน� ท าใหไดขอ

 

 

 

 

 

 

 

 

��

สนนษฐานวา bFGF ท�ถกหล�งจาก feeder ออกมาใน ESCM นาจะเปนปจจยสาคญท�ชวยสงเสรมการ

เจรญเตบโตของ WJ-MSCs ในการศกษาน� นอกจากน� ตว ES เซลลเอง นาจะมการหล�ง factors ตางๆ

ออกมารวมดวยใน ESCM ดงน�นนอกจาก bFGF แลวนาจะม growth factors หรอ cytokines อ�นๆดวย

ท�มความสาคญตอการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs ซ� งหน� งในน� นม EGF รวมอยดวย เน�องจาก

การศกษาท�ผานมาพบวา EGF สามารถกระตนการเพ�มจานวนของ MSCs ไดเปนอยางด (Tamama,

Fan, Griffith, Blair, & Wells, ����) เชนเดยวกนกบการศกษาน� นอกจากน� มการรายงานวา human

H1/H9 ES cells line สามารถหล�งโปรตน bFGF และ TGF 1 ออกมาในอาหารเล� ยงเซลลได

(Bendall et al., 2009) ซ� งโปรตนเหลาน� นาจะพบอยใน ESCM และนาจะเปนอกหน� งปจจยสาคญท�

ชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของ WJ-MSCs เน�องจากเคยมการรายงานวาโปรตนเหลาน�มศกยภาพใน

การกระตนการเจรญเตบโตของ MSCs มากอน (Jian et al., 2006)

 

 

 

 

 

 

 

 

��

บทท� �

สรปและขอเสนอแนะ

�. สรป

โครงการน�ประสบความสาเรจในการพฒนาวธการใหมท�สามารถเพ�มจานวน mesesnchymal

stem cells ไดอยางมประสทธภาพสงโดยสามารถเพ�มจานวนเซลลไดมากข�นเปนจานวนหลายเทา

อยางมนยสาคญในระยะเวลาท�ส�นลง ซ� งจะสามารถแกปญหาเร�องการท�มเซลลตนกาเนดอยางจากด

คอมจานวนนอยไมพอตอการรกษาโรค ทาใหการรกษาโรคในผปวยใหผลสาเรจไมสงเทาท�ควร

นอกจากน�วธการเล�ยงเซลลแบบใหมน� ยงสามารถคงคณสมบตความเปน msesenchymal stem cells

ของเซลลท�เล�ยงไดรวมท�งคงความสามารถท�จะเปล�ยนแปลงเปนเซลลชนดตางๆได เม�อไดรบการ

กระตนท�เหมาะสมไดแกการเปล�ยนแปลงของเซลลเปน osteocyte, chondrocyte และ adipocyte ซ� ง

เปนความสามารถหลกของเซลลตนกาเนดชนดน� นอกจากน�หลงจากกระบวนการเพ�มจานวนเซลล

แลว เซลลท�ไดยงสามารถนามาเกบแชแขงและนากลบมาใชใหมไดอกหลายรอบ ทาใหสามารถเกบ

เซลลตนกาเนดไวใชในระยะยาวได อกท�งยงชวยลดงบประมาณในการเล�ยงและเตรยมเซลล รวมท�ง

ไมตองเกบเซลลจากผปวยหรอผบรจาคบอยคร� ง

วธการเล�ยงเซลลแบบใหมน� ยงใชน�ายาท�เปน animal serum free ทาใหสามารถประยกตใช

เทคโนโลยในทางการแพทยและยงสามารถเกบแชแขงเปนธนาคารเซลลตนกาเนดไวใชในอนาคตใน

ยามท�ตองการ ซ� งส�งเหลาน�จะเปนประโยชนตอสงคมโดยสวนรวม อกท�งชวยทาใหการวจยเซลลตน

กาเนดของประเทศมความกาวหนาอกทางหน�งและเพ�มศกยภาพในการแขงขนในระดบนานาชาตของ

ประเทศไทยโดยสวนรวม

 

 

 

 

 

 

 

 

��

2. ขอเสนอแนะ

งานวจยน�ควรมการตอยอดในการศกษาการนาเซลลทผานการเล�ยงเพ�อเพ�มจานวนเซลลน� ไป

ทดสอบการรกษาโรคในสตวทดลอง เชน โรคเบาหวาน โรคหวใจ โรคตบ เปนตน นอกจากน�

โครงการวจยน� สามารถศกษาตอในเชงลกเก�ยวกบกลไกหรอ mechanism ของเซลลท�ตอบสนองตอ

ESCM ในการกระตนการเจรญเตบโตของเซลล โดยทดสอบกบสารโปรตนท�สนใจแตละตวและ

ศกษาถงการแสดงออกท�งในระดบยนและโปรตนของกลม signaling pathway ตางๆท�สนใจตอไปได

 

 

 

 

 

 

 

 

��

บรรณานกรม

Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S. and Farrokhi, A. (2006). Differentiation of

human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. Int J

Dev Biol. 50(7): 645-652.

Baksh, D., Yao, R. and Tuan, R. S. (2007). Comparison of proliferative and multilineage

differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord

and bone marrow. Stem Cells. 25(6): 1384-1392.

Battula, V. L., Bareiss, P. M., Treml, S., Conrad, S., Albert, I., Hojak, S. and Buhring, H. J. (2007).

Human placenta and bone marrow derived MSC cultured in serum-free, b-FGF-containing

medium express cell surface frizzled-9 and SSEA-4 and give rise to multilineage

differentiation. Differentiation. 75(4): 279-291.

Bendall, S. C., Hughes, C., Campbell, J. L., Stewart, M. H., Pittock, P., Liu, S. and Lajoie, G. A.

(2009). An enhanced mass spectrometry approach reveals human embryonic stem cell

growth factors in culture. Mol Cell Proteomics. 8(3): 421-432.

Bianchi, G., Banfi, A., Mastrogiacomo, M., Notaro, R., Luzzatto, L., Cancedda, R. and Quarto, R.

(2003). Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2.

Exp Cell Res. 287(1): 98-105.

Cai, J., Zhao, Y., Liu, Y., Ye, F., Song, Z., Qin, H. and Deng, H. (2007). Directed differentiation of

human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45(5): 1229-1239.

 

 

 

 

 

 

 

 

��

Campard, D., Lysy, P. A., Najimi, M. and Sokal, E. M. (2008). Native umbilical cord matrix stem

cells express hepatic markers and differentiate into hepatocyte-like cells. Gastroenterology.

134(3): 833-848.

Caplan, A. I. (2007). Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative

medicine. J Cell Physiol. 213(2): 341-347.

Chambers, I. and Tomlinson, S. R. (2009). The transcriptional foundation of pluripotency.

Development. 136(14): 2311-2322.

Chao, K. C., Chao, K. F., Fu, Y. S. and Liu, S. H. (2008). Islet-like clusters derived from

mesenchymal stem cells in Wharton's Jelly of the human umbilical cord for transplantation

to control type 1 diabetes. PLoS One. 3(1): e1451.

Chen, X. and Zeng, F. (2011). Directed hepatic differentiation from embryonic stem cells. Protein

Cell. 2(3): 180-188.

Chiambaretta, F., De Graeve, F., Turet, G., Marceau, G., Gain, P., Dastugue, B. and Sapin, V.

(2004). Cell and tissue specific expression of human Kruppel-like transcription factors in

human ocular surface. Mol Vis. 10: 901-909.

Chien, C. C., Yen, B. L., Lee, F. K., Lai, T. H., Chen, Y. C., Chan, S. H. and Huang, H. I. (2006).

In vitro differentiation of human placenta-derived multipotent cells into hepatocyte-like

cells. Stem Cells. 24(7): 1759-1768.

Darr, H., Mayshar, Y. and Benvenisty, N. (2006). Overexpression of NANOG in human ES cells

enables feeder-free growth while inducing primitive ectoderm features. Development.

133(6): 1193-1201.

 

 

 

 

 

 

 

 

��

Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F., Krause, D. and Horwitz,

E. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The

International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8(4): 315-317.

Dos Santos, F., Andrade, P. Z., Boura, J. S., Abecasis, M. M., da Silva, C. L. and Cabral, J. M.

(2010). Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells: a more effective cell

proliferation kinetics and metabolism under hypoxia. J Cell Physiol. 223(1): 27-35.

Enomoto, H., Nakamura, H., Liu, W., Yoshida, K., Okuda, Y., Imanishi, H. and Nishiguchi, S.

(2009). Hepatoma-derived growth factor is induced in liver regeneration. Hepatol Res.

39(10): 988-997.

Enomoto, H., Yoshida, K., Kishima, Y., Kinoshita, T., Yamamoto, M., Everett, A. D. and

Nakamura, H. (2002). Hepatoma-derived growth factor is highly expressed in developing

liver and promotes fetal hepatocyte proliferation. Hepatology. 36(6): 1519-1527.

Han, J. C., Zhang, K. L., Chen, X. Y., Jiang, H. F., Kong, Q. Y., Sun, Y. and Liu, J. (2007).

Expression of seven gastric cancer-associated genes and its relevance for Wnt, NF-kappaB

and Stat3 signaling. APMIS. 115(12): 1331-1343.

Horwitz, E. M., Prockop, D. J., Fitzpatrick, L. A., Koo, W. W., Gordon, P. L., Neel, M. and

Brenner, M. K. (1999). Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived

mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med. 5(3): 309-313.

in 't Anker, P. S., Noort, W. A., Scherjon, S. A., Kleijburg-van der Keur, C., Kruisselbrink, A. B.,

van Bezooijen, R. L. and Fibbe, W. E. (2003). Mesenchymal stem cells in human second-

 

 

 

 

 

 

 

 

��

trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a

heterogeneous multilineage differentiation potential. Haematologica. 88(8): 845-852.

In 't Anker, P. S., Scherjon, S. A., Kleijburg-van der Keur, C., de Groot-Swings, G. M., Claas, F.

H., Fibbe, W. E. and Kanhai, H. H. (2004). Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or

maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22(7): 1338-1345.

Jian, H., Shen, X., Liu, I., Semenov, M., He, X. and Wang, X. F. (2006). Smad3-dependent nuclear

translocation of beta-catenin is required for TGF-beta1-induced proliferation of bone

marrow-derived adult human mesenchymal stem cells. Genes Dev. 20(6): 666-674.

Karahuseyinoglu, S., Cinar, O., Kilic, E., Kara, F., Akay, G. G., Demiralp, D. O. and Can, A.

(2007). Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys.

Stem Cells. 25(2): 319-331.

Levenstein, M. E., Ludwig, T. E., Xu, R. H., Llanas, R. A., VanDenHeuvel-Kramer, K., Manning,

D. and Thomson, J. A. (2006). Basic fibroblast growth factor support of human embryonic

stem cell self-renewal. Stem Cells. 24(3): 568-574.

Liu, T. M., Wu, Y. N., Guo, X. M., Hui, J. H., Lee, E. H. and Lim, B. (2009). Effects of ectopic

Nanog and Oct4 overexpression on mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 18(7): 1013-

1022.

Majore, I., Moretti, P., Hass, R. and Kasper, C. (2009). Identification of subpopulations in

mesenchymal stem cell-like cultures from human umbilical cord. Cell Commun Signal. 7:

6.

 

 

 

 

 

 

 

 

��

Mitchell, K. E., Weiss, M. L., Mitchell, B. M., Martin, P., Davis, D., Morales, L. and Medicetty, S.

(2003). Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21(1): 50-60.

Park, Y., Kim, J. H., Lee, S. J., Choi, I. Y., Park, S. J., Lee, S. R. and Kim, B. S. (2011). Human

Feeder Cells Can Support the Undifferentiated Growth of Human and Mouse Embryonic

Stem Cells Using Their Own Basic Fibroblast Growth Factors. Stem Cells Dev.

Pereira, W. C., Khushnooma, I., Madkaikar, M. and Ghosh, K. (2008). Reproducible methodology

for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord and its potential

for cardiomyocyte generation. J Tissue Eng Regen Med. 2(7): 394-399.

Schugar, R. C., Chirieleison, S. M., Wescoe, K. E., Schmidt, B. T., Askew, Y., Nance, J. J. and

Deasy, B. M. (2009). High harvest yield, high expansion, and phenotype stability of

CD146 mesenchymal stromal cells from whole primitive human umbilical cord tissue. J

Biomed Biotechnol. 2009. 789526.

Sidhu, J. S., Liu, F. and Omiecinski, C. J. (2004). Phenobarbital responsiveness as a uniquely

sensitive indicator of hepatocyte differentiation status: requirement of dexamethasone and

extracellular matrix in establishing the functional integrity of cultured primary rat

hepatocytes. Exp Cell Res. 292(2): 252-264.

Stamm, C., Westphal, B., Kleine, H. D., Petzsch, M., Kittner, C., Klinge, H. and Steinhoff, G.

(2003). Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration.

Lancet. 361(9351): 45-46.

Talens-Visconti, R., Bonora, A., Jover, R., Mirabet, V., Carbonell, F., Castell, J. V. and Gomez-

Lechon, M. J. (2006). Hepatogenic differentiation of human mesenchymal stem cells from

 

 

 

 

 

 

 

 

��

adipose tissue in comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. World J

Gastroenterol. 12(36): 5834-5845.

Tamama, K., Fan, V. H., Griffith, L. G., Blair, H. C. and Wells, A. (2006). Epidermal growth factor

as a candidate for ex vivo expansion of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.

Stem Cells. 24(3): 686-695.

Troyer, D. L. and Weiss, M. L. (2008). Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell

population. Stem Cells. 26(3): 591-599.

Tsai, M. S., Lee, J. L., Chang, Y. J. and Hwang, S. M. (2004). Isolation of human multipotent

mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage

culture protocol. Hum Reprod. 19(6): 1450-1456.

Tsukamoto, T., Mizoshita, T., Mihara, M., Tanaka, H., Takenaka, Y., Yamamura, Y. and

Tatematsu, M. (2005). Sox2 expression in human stomach adenocarcinomas with gastric

and gastric-and-intestinal-mixed phenotypes. Histopathology. 46(6): 649-658.

Wang, H. S., Hung, S. C., Peng, S. T., Huang, C. C., Wei, H. M., Guo, Y. J. and Chen, C. C.

(2004). Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord. Stem

Cells. 22(7): 1330-1337.

Weiss, M. L. and Troyer, D. L. (2006). Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2(2): 155-

162.

Yao, S., Chen, S., Clark, J., Hao, E., Beattie, G. M., Hayek, A. and Ding, S. (2006). Long-term

self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically

defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 103(18): 6907-6912.

 

 

 

 

 

 

 

 

��

Zhang, Y. N., Lie, P. C. and Wei, X. (2009). Differentiation of mesenchymal stromal cells derived

from umbilical cord Wharton's jelly into hepatocyte-like cells. Cytotherapy. 11(5): 548-

558.

Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjian, P., De Ugarte, D. A., Huang, J. I., Mizuno, H. and Hedrick, M. H.

(2002). Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell. 13(12):

4279-4295.

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ภาคผนวก

1. การเตรยม complete DMEM (cDMEM)

ช�งตวงและผสมสารตางๆเหลาน� เขาดวยกน

- DMEM (low glucose) 10.00 g

- FBS 100.00 ml

- NaHCO3 3.70 g

- 1000 U/ml Penicillin/1000 g/ml Streptomycin 10.00 ml

- 2 mg/ml Amphotericin B 0.20 ml

เตมน� า sterile ultra-pure water เพ�อใหไดปรมาตร 1000 ml จากน�นปรบคาความเปนกรดดาง

ท� pH 7.4 และนาไปกรองเพ�อ sterile

2. การเตรยม PBS

ช�งตวงและผสมสารตางๆเหลาน� เขาดวยกน

- NaCl 8.00 g

- Na2HPO4 1.44 g

- KCl 0.20 g

- KH2PO4 0.24 g

เตมน� า sterile ultra-pure water เพ�อใหไดปรมาตร 1000 ml จากน�นปรบคาความเปนกรดดาง

ท� pH 7.4 และนาไป autoclave เพ�อ sterile ท� 121°C นาน 15 นาท

 

 

 

 

 

 

 

 

��

3. การเตรยม 0.25% Trypsin/EDTA

ช�งตวงและผสมสารตางๆเหลาน� เขาดวยกน

- Trypsin 0.25 g

- EDTA 0.04 g

เตมสาร sterile PBS เพ�อใหไดปรมาตร 100 ml จากน�นนาไปกรองเพ�อ sterile

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ประวตผวจย

ผชวยศาสตราจารย เทคนคการแพทยหญง ดร. วไลรตน ล�อนนตศกด� ศร เกดเม�อวนท� ��

มนาคม ���� สาเรจการศกษาระดบปรญญาตร วท.บ. เทคนคการแพทย (พ.ศ. 2535) และ ปรญญาโท

วท.ม. ชวเคมทางการแพทย (พ.ศ. 2539) จากมหาวทยาลยขอนแกน จากน�นไดศกษาตอในระดบ

ปรญญาเอก สาขา Microbiology and Immunology โดยเนนทางดานภมคมกนวทยาทางการแพทย

และ เซลลตนกาเนด ณ Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University ประเทศ

สหรฐอเมรกา จนจบการศกษาในป พ.ศ. ���� กอนท�จะศกษาตอทางดาน stem cell transplantation

and stem cell regulation ในระดบ Post-Doctoral Fellow ณ National Institute of Health ประเทศ

สหรฐอเมรกา (พ.ศ. ����-����) ปจจบน ผศ. ทนพญ. ดร. วไลรตน ทางานในตาแนงอาจารยประจา

สาขาวชาจลชววทยา สานกวชาวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร จ. นครราชสมา ประเทศ

ไทย อาจารยวไลรตน ไดรบรางวลทางดานวชาการหลายรางวล อาทเชน รางวล Excellent Research

Award (Stem cell), USA, Key Stone Symposium (พ.ศ. 2550), American Society of Hematology

Traveling Award, USA (พ.ศ. 2546), Traveling Award, International Society for Stem Cell

Research, Australia (พ.ศ.2547) / USA (พ.ศ. 2551), รางวลสงเสรมบณฑตบณฑต มลนธอานนท

มหดล พ.ศ. 2551-2554 และ รางวลศษยเกาดเดนดานวชาการ คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลย

ขอนแกนในป พ.ศ. 2554 ปจจบนอาจารยวไลรตน มผลงานตพมพในระดบนานาชาต �� ผลงาน

สถานท�ตดตอ สาขาวชาจลชววทยา สานกวชาวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร 111

ถนน มหาวทยาลย ต.สรนาร อ.เมอง จ.นครราชสมา 30000 e-mail : wilairat@g.sut.ac.th

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ประวตผวจย

อาจารย นายแพทย ดร. ชวบลย เดชสขม เกดเม�อวนท� �� กมภาพนธ ���� สาเรจการศกษา

ระดบปรญญาตร วท.บ. แพทยศาสตร (พ.ศ. 2533) จากมหาวทยาลยสงขลานครนทร และ Diploma

Thai Board สาขา Anatomical Pathology จาก ศรราชพยาบาล มหาวทยาลยมหดล จากน�นไดศกษา

ตอในระดบ ปรญญาเอก สาขา Pathology ณ Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth

University ประเทศสหรฐอเมรกา จนจบการศกษาในป พ.ศ. ���� กอนท�จะศกษาตอทางดาน

Molecular Pathology ในระดบ Post-Doctoral Fellow ณ Medical College of Virginia, Virginia

Commonwealth University ประเทศสหรฐอเมรกา (พ.ศ. ����) ปจจบน อาจารย นายแพทย. ดร.

ชวบลย เดชสขม ทางานในตาแหนงหวหนาสาขาวชาพยาธวทยา และเปนอาจารยประจาสาขาวชา

พยาธวทยา สานกวชาแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร จ. นครราชสมา ประเทศไทย

อาจารย นพ. ดร. ชวบลย ไดรบรางวลทางดานวชาการหลายรางวล อาทเชน รางวล King

Scholarship award, Stem Cell Travelling award, International Society for Stem Cell Research

(พ.ศ. 2551) และ รางวลสงเสรมบณฑตบณฑต มลนธอานนทมหดล ปจจบนอาจารย นพ. ดร.

ชวบลย มผลงานตพมพในระดบนานาชาต �� ผลงาน และผลงานจดสทธบตร � เร�อง “A nucleic

acid marker of cancer” Serial No.09/434,620, filed Nov.5, 1999 Joy L Ware,

ChavaboonDechsukhum, Carleton T Garrett (Detection of novel WT1 transcript in human

malignancy, including prostate, breast cancer and acute leukemia) สถานท�ตดตอ สาขาวชาพยาธ

วทยา สานกวชาแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร 111 ถนน มหาวทยาลย ต.สรนาร

อ.เมอง จ.นครราชสมา 30000 e-mail : chavaboon@sut.ac.th

 

 

 

 

 

 

 

 

��

ประวตผวจย

นางสาว พชร ปราศจาก เกดวนท� 4 ธนวาคม พ.ศ. 2523 สถานท�เกด จ.ปราจนบร สาเรจวฒ

การศกษาระดบปรญญาตร วท.บ. สาขาเทคนคการแพทย จากมหาวทยาลยมหดลในป พ.ศ. 2546

และสาเรจวฒการศกษาระดบปรญญาโท วท.ม. สาขาจลชววทยา จากมหาวทยาลยมหดลในป พ.ศ.

2549 น างส าว พช ร ได รบ รางว ล International Society for Stem Cell Research (ISSCR) travel

award in ISSCR 7th Annual Meeting, Barcelona, Spain พ .ศ . � � � � ส ถ า น ท� ต ด ต อ ส าข าว ช า

จลชววทยา สานกวชาวทยาศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยสรนาร 111 ถ.มหาวทยาลย ต.สรนาร

อ.เมอง จ.นครราชสมา 30000