Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la

souris

Gametogenèse, compensation de dose, empreintes génomiques, souris mutantes-t,déterminisme de sexe

Le sexe est déterminé par le gonade

XX:développement des ovairessystème Mullerianorganes génitaux femelle

XY:développement des testiculesSystème Wolffianorganes génitaux mâle

Enlève les gonades avant que le sexe soit déterminé:

-chez les souris XX et XY développement du système Mullerian

Greffe d’un testicule à coté d’une ovaire à 12 jours:

-Wolffian développe et le Mullerian disparaît.

Donc: L’ovaire n’est pas essentiel pour le développement du système

Mullerian

-Le testicule est essentiel pour le développement du

Système Wolffian

-Le testicule produit une molécule qui inhibe le développement du système Mullerian

Développement mâle et femelle

Zfy et Sxr• A Oxford en 1971 ils ont trouvé une souris sex-reversed: Sxr• XX mais mâle à cause d’une translocation• Cherchez dans cette région pour le gène commutateur

• Page et al: ont trouvé un gène Zfy• -zinc finger facteur de transcription• Par Southern blot ils ont détecté deux bandes: une séquence sur le

chromosome X et l’autre sur le chromosome Y????• 3 explications: • -allèles X et Y sont des sous-unités d’une protéine• -allèle X est non fonctionnel• -inactivation du chromosome X chez la femelle donne un seul allèle actif

chez le femelle, deux chez la mâle• BUT: Zfy n’est pas exprimé dans les testicules des souris Steel…donc c’est

pas le bon candidat.

Quels sont les cibles de Sry

• Sry se fixent sur une séquence de 6/7 nucléotides ( AACAAT oligonucléotide sélection).

• Cherchez des gènes qui s’expriment après Sry et où la séquence de 6/7 nucléotides est présente dans le promoteur.

• Sox 9 ( 20 gènes Sox chez la souris: important pendant le développement: SrybOX)

• Souris transgènique: Sry promoteur+myc. Regarde l’expression de la protéine MYC et l’expression de la protéine SOX9.

• MYC ensuite MYC+SOX9 ensuite SOX9• Conclusion: Sry gène est transcrit pour une période courte et la protéine

SRY active le promoteur du gène SOX9.• SOX9 peut changer le sexe d’une souris.• SRY peut probablement activer le gène AMH ( anti-Mullerian hormone)

dégénération des structures femelles• Sox3: inhibiteur du gène Sox9???

Expression de la protéine SRY

Régulation de l’expression du gène SryWT1=Wilms Tumour Gene: +/- KTS ( +/- lysine threonine serine

dans un des doigts à zinc qui se fixe sur l’ADN)

Sry/SRY murine et humainPeu de conservation en dehors de la boîte HMG

Murine protéine tronquée ne fonctionne plusProtéine humaine fonctionne chez la souris

L’activité de SRY dépend de son état de phosphorylation?

Un gène pour le développement femelle?

• La majorité des XY femelles n’ont pas de mutation dans le gène Sry.

• La duplication d’un gène sur le chromosome X-Dax1-peut donner des XY femelles

• Dax-1 s’exprime dans les même cellules que Sry, au même moment mais l’expression continue après

• Sur-exprime Dax-1 chez M.musculus musculus: pas d’effet• Sur-exprime chez M.musculus poschiavinus ( allèle faible de Sry)

faible changement dans les gonades.• Plus probable que le rôle de Dax-1 est d’empêcher le

développement mâle chez la femelle • intéraction avec SF1, molécule essentiel pour le développement

mâle.

Rôle de Sox3 ?

• >100 XX mâle où Sry ne s’exprime pas• Beaucoup plus probable qu’il s’agit d’une inhibiteur de l’expression

de Sry qui est muté qu’un gain-of function.• Modèle:

• SOX9 est essentiel pour devenir mâle• SOX3 peut inhiber Sox9femelle• SRY peut inhiber Sox3

• Donc SRY et SOX3 sont des inhibiteurs et pas des activateurs?

L’expression de Sry dans le cerveau

• Testosterone est central pour le développement du comportement mâle

• SRY est produite dans les même cellules qui produisent tyrosine hydroxylasesynthèse de dopamine

• Anti-sens oligonucléotides inhibition de SRY empêche la fonction des cellules essentielles dans les fonctions moteurs chez le rat

• Chez la femelle les oestrogens peuvent assurer la fonction de SRY

• De plus…..• Sry peut agir comme facteur d’épissage• Les transcrits de Sry sont parfois circulaire et non-fonctionnels

Role du gène Foxl2

• Mutations dans ce gène empêche le développement de l’ovaire et sont associées avec XX sex-reversal

• Absence de l’expression de Foxl2 change le développement de 2 linéages:

• Les granulosa cells Sertoli like

• Les theca cells ( synthèse des steroids) synthetisent le précurseur de la testosterone

• Rôle de Foxl2: réprime l’expression de Sox9 dans l’ovaire

• Foxl2 fonctionne avec le récepteur de l’oestrogen ( ce qui explique en partie le sex reversal associé avec des problèmes des hormones)

L’activation de Sox9 est inhibe par l’expression de FOXL2a) TESCO ( Testis specific enhancer of Sox9) active un gène rapporteur dans

le testis mais pas dans l’ovairec) Par ChiP FOXL2 peut se fixer sur la séquence TESCO

d) FOXL2 peut reprimer l’expression d’un gène rapporteur sous le contrôle de TESCO

Model of Sox9 Regulation Required for Maintenance of Gonadal Phenotype in MammalsCell 139, 1130 2009

DMRT1Double-sex and Mab3-related transcription factor 1

• Nature 476: delete Dmrt1FoxL2 expressiontestis become ovaries

Tortoiseshell cat/ Ecaille de tortue

X-linked diseases

a

L’inactivation du chromosome X pendant la vie d’une souris

a

L’inactivation aléatoire du chromosome X chez la femelleL’embryon a reçu un allèle normal et un allèle mutant de ses parents.

Dans le cas où la mutation désavantage les cellules, ces cellules peuvent être éliminé et donc le résultat de l’inactivation est biaisé.

Le gène Xist

Xic ( X Inactivation Center ) identifié par les translocations

Cherchez un gène dans cette région qui s’exprime uniquement à partir

du chromosome X inactif

Xist: X Inactive chromosome Specific Transcript: 17kb, pas de cadre ouverte de lecture, toujours dans le noyau, jamais dans les polyribosomes

Pas d’expression chez les mâles

Présent dans plusieurs espèces différents

Conservation des séquences dans les gènes Xist: les A repeats (1) sont le plus conservées ainsi que la région 4. Les transcrits Xist sans les A repeats ne

fonctionnent plus ( les transcrits sont localisés sur le chromosome en cis mais sans inactiver).

H=human M=mouse R,A,T,K= 4 compagnoles (voles)

La région Xic: a) 5 ARN non-codantes sont détectés:

b) Xist s’exprime au début à partir des 2 X chez les cellules femelles et ensuite un des deux X montre une forte expression

Le gène Tsix

• Délétion de 65kb dans le région 3’ du Xist . • Le chromosome X avec cette délétion est toujours inactivé• Dans cette région on trouve la région 5’ d’un gène Tsix transcrit

dans l’autre sens de Xist

• Xist------------------------------• -------------------------------------------------------------------------- Chr X• -----------------------------------Tsix

• -------------------Xic-----------------------------

Plusieurs allèles de Xic

• Les allèles plus ou moins forts de Xic existe: a<b<c<d• Dans une souris Xic a/Xic c: X avec l’allèle a est 80% du temps

inactivé: c’est plus aléatoire• La dominance des allèles est associé avec le niveau de

transcription en amont du début de transcription de Tsix: 6kb région identifié

• a (allèle faible) montre une transcription moins important que l’allèle c

• Introduit les mutations dans cette région--- des transcripts tronqués: pas d’effet sur la dominance.

• Un enhancer?? Stockage des facteurs de transcription?

Histone Code

Modifications des histones du gène Xist

Xist inactivation complèxe

Etapes moléculaires pendant l’inactivation du chromosome X

Counting chromosomes….la suite

• Tel---------------------------------------------------------------------------Cen• Xist----------• ------------------Tsix• -------- Délétion 5’Tsix (a)• --------/------/------ Tr 5’Tsix (b)

• Souris a) toujours le X avec la délétion inactivé: site du blocking factor

• Souris b) Si cette région contient le site pour le blocking factor, ce transgène devrait éponger le factor--X-inactivation chez le male. On ne voit pas cela. On ne trouve pas les transcrits du gène Xist sur le transgène ou le chromosome X.

• Souris a) homozygous: la moitié des cellules meurent: les cellules inactivent soit un, soit deux chromosomes X. Chaotique.

Counting ChromosomesBlocking factor produit par les autosomesun chromosome X est

protégé contre l’inactivation Competence Factor produit par les chromosomes X et il faut deux

doses pour inactiver

Les étapes principaux pendant l’inactivation du chromosome X

Les séquences LINE

Les transcrits du gène Xist sont essentiels pour l’inactivation: c’est pas

juste l’activation du promoteur et une changement dans la chromatine.

2000 transcrits Xist par cellule: pas suffisant pour couvrir tout le

chromosome.

Le chromosome X est riche en séquences LINE ( Long Interspersed

Nuclear Elements). Présent aussi sur les autres chromosomes.

Les transcrits Xist se fixent sur les séquences LINE: un complexe se

forme qui change la conformation du chromosome dans un région

autour de ce complexe

L’inactivation du chromosome X pendant le développement de la souris

Gènes qui echappent à l’inactivation chez l’Homme:Beaucoup moins échappent chez la souris: pas de centromère?

Les gènes qui échappent chez l’homme ont peut être une fonction spécifique aux femmes?

Certains gènes peuvent être inactivé et ensuite réactivéXO chez l’homme et chez la souris?

X-Escapées

• 15% des gènes sur le X échappent chez l’homme• 3% échappent chez la souris

• Les gènes qui échappent ont une expression souvent moins important que la copie sur le X actif

• Chez l’homme les éscapées sont dans les blocs• Chez la souris ils sont isolés et dans la chromatine silencieux

• Chez l’homme les gènes qui échappent sont variables selon l’individuel et selon le tissu

• Les gènes qui échappent peuvent être réactivé

Escapées…la suite

• Les études sur les gènes qui échappent sont importants pour comprendre le mécanisme moléculaire de l’inactivation.

• Pas de ARN Xist sur les éscapées• Moins de séquence LINE • Moins de motif ‘AT rich’ qui sont aussi associés avec l’inactivation• Moins de méthylation des histones, plus d’acetylation

• CTCF: protéine qui peut ‘isoler’ les séquences. • CTCF se fixe sur la chromatine entre un gène qui s’exprime et un

gène qui est inactivé chez la souris: chez l’homme les 2 gènes sont inactivés et CTCF ne se lie pas.

…..et fin

• Les gènes qui sont impliqués dans les différences entre les femelles et les mâles sont très présents sur le X: plutôt les gènes activé par les hormones

. Souris XY KO pour Sry avec Sry transgène sur un autosome (XY-Sry)

( donc Y-=Y moins le Sry). On va avoir des cellules avec le chromosome Y sans ou avec le transgène Sry.

• Croisement avec femelle XX 4 possibilités

• XY-Sry x XXXXSry (mâle) XX (femelle) XY- (femelle) XY-Sry (mâle)

• XX Sry ( mâle) et XY- Sry (mâle) sont différents ( comportement, expression des gènes)

• La majorité des gènes qui échappent chez la souris et la femme ont une fonction dans le cerveau.

• Trisomy XXX: 1/1000 Problèmes comportement variable chez les femmes

The X in sex: how autoimmune diseases revolve around sex chromosomes

• ….’the predominance of affected women, and perhaps its most intriguing putative mechanism is related to sex chromosomes, based on the recent observation that women with autoimmune diseases manifest a higher rate of circulating leukocytes with a single X chromosome.’

• Haploinsufficiency???

Modèle pour expliquer comment des gènes peuvent échapper à l’inactivation

L’inactivation du chromosome X est différente dans les espèces différentes

Quelques observations en plus…….

• Les méthodes utilisé dans les cellules humaines et les cellules murines sont probablement différentes….

• Rôle du Tsix moins clair chez l’homme: les transcrits sont tronqués ou parfois absent

• Rôle possible des RNAi: une hybridation entre les transcrits Xist et Tsix donne une molécule double brin qui est clivée par Dicer: les RNAi sont supposés contrôler l’inactivation. KO pour Dicerpas d’inactivation et léthale chez les femelles.