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Práctica 1: Determinación del contenido proteico total: determinación de nitrógenopor el método Kjeldahl.

Objeto de la práctica.

Determinación del contenido en proteínas de una muestra de queso por el método de Kjeldahl. Sevalorarán, junto con las habilidades de los estudiantes para llegar a un resultado final correcto, desde elpunto de vista no sólo de la exactitud, sino también de la precisión, los conocimientos teóricos,relacionados con la determinación propuesta, que estudió con anterioridad.

Introducción.

Las proteínas son compuestos altamente polimerizados, que están formados por aminoácidos. Tambiénse unen a componentes no proteicos. Las proteínas se encuentran entre los nutrientes más importantes,junto con los lípidos y los carbohidratos. Además de su función energética (1 g de proteína proporciona4,1 Kcal al organismo), dada su naturaleza nitrogenada, son necesarias para la síntesis de compuestospropios del organismo implicados en la estructura de las membranas junto con los lípidos, comoglicoproteidos en funciones de lubrificación y como nucleidos que posibilitan la síntesis de lasproteínas propias del organismo, así como la formación de los cromosomas y la división celular.

El valor nutritivo de las numerosas proteínas alimentarias existentes depende de su digestibilidad, quedepende a su vez de la estructura, es decir, de su composición aminoacídica. El contenido deaminoácidos esenciales (de los aproximadamente 30 aminoácidos 8 son esenciales para el hombre dadoque éste no es capaz de sintetizarlos) determina el valor biológico, es decir, el mayor aprovechamientofisiológico de una proteína por parte del organismo. Rige la ley del mínimo, esto es, si la oferta deaminoácidos esenciales es demasiado limitada, el conjunto del rendimiento de las reacciones de síntesisdependerá del aminoácido que esté presente en menor cantidad (aminoácido limitante). Losaminoácidos limitantes más importantes son la lisina (cereales y patatas) y la metionina (carne y leche).

Se da el nombre de queso al producto fresco o madurado obtenido por separación del suero, después dela coagulación de la leche natural, parcial o totalmente desnatada. Si bien la leche puede proceder dediversos animales, corrientemente se usa la de vaca, oveja o cabra. La caseina de la leche, por accióndel cuajo, un enzima que se obtiene del estómago de las terneras, coagula, a una temperartura alrededorde unos 30 ºC y tras agitación continua, formando una masa insoluble, más o menos rica en fosfatosalcalinotérreos, según la acidez del medio. La leche debe de estar a una acidez de 8 a 9 grados Soxhlet(grado Soxhlet número de mililitros de NaOH 0,25 N necesarios para neutralizar a la fenolftaleína 100g de leche). La acidez de la leche se debe al ácido láctico y, en menor medida, al anhídrido carbónico ya las funciones ácidas albuminoideas. En la leche se encuentran diversas proteínas: fracción caseínica(76-86%); fracción sérica (14-24%) y fracción anticuerpo.

Los métodos para la cuantificación del contenido proteico en alimentos se basan en distintos principios:a) Método de Kjeldahl (determinación del contenido en nitrógeno).b) Métodos espectrofotométricos:

b.1) Reacción química del enlace peptídico y posterior medida en el VIS (p.e. método de Biuret enel que se forma un compuesto azul con cobre en medio básico).

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b.2) Reacción química de determinados aminoácidos de la proteína y posterior medida en el VIS(p.e. método de Folin-Ciocalteu –ácido fosfomolíbdico y fosfovolframico- en el que reaccionafundamentalmente la tirosina).

b.3) Reacción química con colorantes y posterior medida en el VIS (precipitación de las proteínas ymedida del exceso de colorante).

b.4) Medida en el UV (determinación de los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina yfenilalanina cuyos máximos de absorción se encuentran en torno a 280 nm).

b.5) Medida en el IR cercano (medidas de reflectancia difusa).

En el análisis de alimentos, el método de Kjeldahl es el que ha alcanzado mayor impotancia. Comoconsecuencia de su estructura a base de aminoácidos individuales, el contenido de nitrógeno de lasproteínas varía sólo entre unos límites muy estrechos (15 a 18% y como promedio 16%). Para ladeterminación analítica del contenido en proteína total o “proteína bruta”, se determina por lo general elcontenido de nitrógeno tras eliminar la materia orgánica con ácido sulfúrico (método de Kjeldahl quedata de 1883), calculándose finalmente el contenido de proteína con ayuda de un factor (en general6,25). Se asume que el trióxido de azufre que se forma durante el tratamiento a altas temperaturas seadiciona como ácido de Lewis al grupo NH del enlace peptídico (base de Lewis) de la proteína,formándose el correspondiente ácido amidosulfónico. El ácido amidosulfónico es resistente a unaposterior oxidación y se transforma en sulfato amónico por degradación. El sulfato amónico sedetermina a continuación, tras liberación del NH3 y destilación, por medio de una valoración ácido-base.

La degradación oxidativa acelerada catalíticamente de compuestos orgánicos con ácido sulfúrico atemperaturas comprendidas entre 360 y 410°C se denomina tratamiento Kjeldahl. Las transformacionesquímicas que tienen lugar son:

23

322

2/)5,05,12/()5,25,12/2(

NcbHNOaNHOHbamnCOObalmnNOHC cbadlmn

++++−−+→+−−++++=

La degradación de grupos nitrogenados orgánicos funcionales tiene lugar dependiendo del compuestoque forme el nitrógeno a través de muchas etapas intermedias a sulfato amónico, ácido nítrico onitrógeno elemental. Los grupos funcionales nitrogenados de moléculas orgánicas y suscorrespondientes productos de degradación están representados en la tabla.

CH

C

O

NH

CH

SO

O

O

+

T

CH

C

O

NH

CH

S

O

O

O

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En el tratamiento Kjeldahl de alimentos no se determinan sólo proteínas o aminoácidos libres, sinotambién ácidos nucleicos y sales de amonio. También se determina el nitrógeno ligado de compuestosaromáticos, como pirazina, ciclopentapirazina, pirrol y oxazol, así como el nitrógeno orgánico ligado delas vitaminas, tales como la B1 (tiamina), la B2 (riboflavina) y la nicotinamida.

No obstante, como por lo general los alimentos sólo contienen cantidades traza de compuestosaromáticos nitrogenados y de vitaminas, el error así cometido se considera despreciable. Además, poreste método no se determinan el nitrógeno nítrico, el cianhídrico, el de la hidracina, ni el del grupo azo,por lo cual el método es particularmente interesante y relativamente específico para la determinación delas proteínas.

Clasificación1 Grupo funcional Nombre Producto de degradaciónA

B

C

-CONH--CONH2-OCN-NCO-SCN-NCS-CN-NC-NH2=NH=N-

-NO-NO2-NOOH-NHOH=NOH

-NHNH2=N-NH-R-N=N-=N-N=-N≡N

Grupo peptídicoCarbámico (amida)OxocianatoIsooxocianatoTiocianatoIsotiocianatoNitriloIsocianidaAminoIminoNitrógeno heterogéneosin enlaces N-N

NitrosoNitroIsonitroHidroxilaminoOxima

HidrazinaHidrazonaAzoAzinoDiazonio

NH3

HNO3

N2

Fundamento.

La sustancia a investigar se somete a un tratamiento oxidativo con ácido sulfúrico concentrado enpresencia de un catalizador (sulfato férrico2), un oxidante (peróxido de hidrógeno) y un elevador delpunto de ebullición del sulfúrico (sulfato potásico). Del sulfato amónico formado se libera el amoníacopor tratamiento alcalino y éste se transporta con ayuda de una destilación en corriente de vapor a un

1 La relación de productos de degradación de los grupos nitrogenados de los apartados A, B y C corresponden a loscoeficientes a, b y c de la ecuación anterior.2 R. Moro, M.L. Bartolomé, J.A. López, Alimentaria, 226 (1991) 55.

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recipiente con ácido bórico y se realiza su valoración con una disolución valorada de ácido clorhídrico3.El contenido de proteína en la muestra se calcula teniendo en cuenta el contenido medio de nitrógenoen la proteína en cuestión.

Procedimiento.

Aparatos y material.

a) Aparatos.- Balanza y granatario (sala de balanzas)- Calefactor/agitador (armarios de los alumnos).- Estufa (sala del profesor).- Digestor Kjeldahl (campana extractora).- Destilador Kjeldahl (campana extractora).b) Material.- Matraces Kjeldahl de 250 mL con bandeja (campana extractora).- Bureta de 50 mL (meseta).- Matraz aforado de 500 mL (armarios de los alumnos).- Matraces Erlenmeyer de 250 mL (armarios de los alumnos).- Probeta (armarios de los alumnos).- Vidrios de reloj (armarios de los alumnos).- Varillas de vidrio (armarios de los alumnos).- Pipetas Pasteur (armarios de los alumnos).- Desecador (sala del profesor).

Reactivos.

a) Disoluciones.- Naranja de metilo 0,1% (p/v) (armarios de los alumnos).- Hidróxido sódico 30% (p/v) (campana extractora).- Acido bórico 4% (p/v) con indicador mixto (campana extractora).b) Líquidos.- Acido sulfúrico (armarios de los alumnos).- Acido clorhídrico (armarios de los alumnos).- Peróxido de hidrógeno (armarios de los alumnos).c) Sólidos.- Carbonato sódico (estufa).- Sulfato potásico (armarios de los alumnos).- Sulfato férrico (armarios de los alumnos).- Naranja de metilo (armarios del profesor).- Hidróxido sódico (armarios del profesor).

3 Alternativamente se puede recoger el amoniaco destilado sobre un volumen conocido de ácido sulfúrico de concentracióntambién conocida y valorando el exceso de ácido sulfúrico con hidróxido sódico previamente valorado con un patrónprimario (ftalato ácido de potasio).

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Determinación.

a) Preparación y valoración de una disolución de HCl 0,1 N.

Para preparar medio litro de disolución se mide en una probeta el volumen aproximado de HClconcentrado necesario para, de acuerdo con los datos de densidad y tanto por ciento en pesoconsignados en la etiqueta de la botella, lograr la concentración deseada. Este volumen se lleva a unmatraz aforado de 500 mL y se enrasa con agua destilada.

Como el HCl no es patrón primario, para conocer la concentración exacta se procede a su valoracióncon carbonato sódico. El carbonato sódico anhidro es patrón primario pero debe haber sido secadopreviamente durante al menos 1 hora a 270-300°C (luego se mantiene en la estufa a 100°C).

Cuando se vaya a emplear, se coloca el recipiente que contiene el carbonato sódico seco en undesecador y se espera a que alcance la temperatura ambiente. A continuación se toman tres muestras,exactamente pesadas por diferencia en la balanza analítica (trasvasar directamente a erlenmeyers), deaproximadamente 0,1000 g de carbonato sódico anhidro anotando en la libreta de laboratorio el pesoexacto tomado. El recipiente, con el carbonato sódico seco, se vuelve a depositar en la estufa.

Las muestras tomadas se disuelven con unos 25 mL de agua destilada y se añaden 5 gotas de naranja demetilo 0,1% (p/v). Se homogeniza y carga la bureta con el HCl 0,1 N a valorar y se deja caer, poco apoco, sobre la solución de carbonato sódico hasta viraje del indicador del amarillo al rojo-naranja. Lareacción de valoración es la siguiente:

Na CO HCl NaCl H CO2 3 2 32 2+ → +

El ácido carbónico generado se descompone en CO2 (ácido) por lo que tras el primer cambio de colorse procede a la eliminación del CO2 mediante ebullición durante dos o tres minutos (el indicador debevolver al color amarillo). Se continúa la valoración hasta nuevo viraje del indicador (suelen sersuficiente con una o dos gotas más) anotando en la libreta de laboratorio el volumen total de HCl 0,1Ngastado. Se lleva a cabo la valoración con cada una de las tres muestras de carbonato sódico tomadas.Finalmente se calcula el factor del HCl 0,1N. Este factor se emplea en todas aquellas valoraciones enque se utilice esta disolución.

b) Tratamiento de la muestra.

Se anota en la libreta de laboratorio el tipo de producto y/o marca comercial. Sobre papel de filtro sepesan con exactitud en la balanza analítica tres muestras de aproximadamente 1,0000 g anotando en lalibreta de laboratorio el peso exacto tomado. Se trasvasan las muestras a los tubos de ataque y seañaden sucesivamente a cada tubo (en campana extractora):

- Aproximadamente 10,00 g de sulfato potásico y 0,10 g de sulfato férrico pesados sobre vidrio dereloj en el granatario.- Aproximadamente 15 mL de ácido sulfúrico y 3 mL de peróxido de hidrógeno medidos en unaprobeta.

Siguiendo las instrucciones del profesor, se introducen los tubos en el digestor calentado a 400°C hastaque el contenido de los tubos esté perfectamente transparente.

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c) Destilación.

Una vez destruida la materia orgánica, la muestra se deja enfriar y se coloca en el destilador.Nuevamente siguiendo las instrucciones del profesor, se añaden, de acuerdo con el manual deldestilador, 115 mL de agua destilada y 100 mL de NaOH 30% (p/v). Se destilan unos 120-150 mLrecogiendo el destilado sobre 30 mL de ácido bórico 4% (p/v).

d) Valoración.

A continuación se procede a la valoración del amoníaco. Se homogeniza y carga la bureta con HCl0,1N. Se va dejando caer la disolución poco a poco sobre la muestra hasta viraje del indicador mixtoque contiene el ácido bórico del azul al incoloro anotando en la libreta de laboratorio el volumen deHCl 0,1 N gastado.

Cálculos.

Se calcula el contenido de nitrógeno total. Para expresar el contenido en proteínas de la muestraanalizada es necesario multiplicar la cantidad de nitrógeno por un factor de acuerdo con la tablasiguiente:

Alimentos FactorGelatinaLeche, productos lácteosCarne, pescado, huevosFrutos secos y semillas oleaginosasVerduras, frutas y derivados cerealesMaíz, leguminosas

5,556,386,255,46,256,25

Bibliografía.

- “Análisis de los alimentos”. R. Matissek, F.M. Schnepel y G. Steiner. Ed. Acribia.- “Lecciones de Bromatología”. F. Moreno Martín y M.C. Torre Boronat. Universidad de Barcelona.