Determinación de la actividad antibacteriana de los extractos y ... · hemolinfa de larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae) Abstract Lucilia eximia is a neotropical species

Determinación de la actividad antibacteriana de los

extractos y hemolinfa de larvas de Lucilia eximia

(Diptera: Calliphoridae)

Paula Andrea Giraldo Hincapié

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2014

Determinación de la actividad

antibacteriana de los extractos y

hemolinfa de larvas de Lucilia eximia

(Diptera: Calliphoridae)

Paula Andrea Giraldo Hincapié

Bióloga

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias - Entomología

Director:

PhD., Sergio Orduz Peralta

Línea de Investigación:

Sustancias bioactivas para el control de patógenos

Grupo de Investigación: Ecología y Sistemática de Insectos

Facultad de Ciencias, Escuela de Biociencias

Medellín, Colombia

2014

Resumen

Lucilia eximia es una especie neotropical, de importancia médica y forense que ha sido

utilizada en la terapia larval como método de desinfección, desbridamiento y cicatrización

de heridas ulcerativas en pacientes en la ciudad de Medellín.

En el presente trabajo, mediante técnicas de ultrafiltración y cromatografía de alta

resolución (HPLC) se realizó una búsqueda preliminar de compuestos con actividad

antibacteriana, presentes en exosecreciones y hemolinfa de larvas de Lucilia eximia.

La evaluación de la actividad biológica de las fracciones de exosecreciones obtenidas

por HPLC indica la presencia de compuestos activos sobre bacterias gram positivas y

gram negativas, con pesos moleculares en el rango de 3-10 kDa y menores a 3 kDa. No

se encontraron diferencias significativas en cuanto a la inhibición del crecimiento de las

bacterias tratadas con excreciones y secreciones (E/S) expuestas y sin exposición a

patógenos.

Se encontraron ocho fracciones activas en un rango de peso entre 3-10 kDa y tres de

tamaño molecular menor a 3 kDa, en la hemolinfa de larvas expuestas a patógenos.

Las cepas Gram positivas, son más susceptibles a la exposición tanto de hemolinfa

como de E/S provenientes de larvas de L. eximia de tercer estadio.

Palabras clave: Lucilia eximia, respuesta inmune insectos, antimicrobianos, péptidos

antimicrobianos.

VI Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y

hemolinfa de larvas de Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)

Abstract

Lucilia eximia is a neotropical species of medical and forensic importance, which has

been used in maggot therapy as a method of disinfection, debridement and ulcerative

wound healing in diabetic patients in Medellín.

In this thesis, by ultrafiltration techniques and high performance liquid chromatography

(HPLC ) a preliminary search of compounds with antibacterial activity present in larval

hemolymph and exosecretions of L. eximia was made.

The evaluation of the biological activity of exosecretions's fractions obtained by HPLC,

indicates the presence of active compounds on Gram positive and Gram negative

bacteria, with molecular weights between 3 and 10 kDa and less than 3 kDa. No

significant difference in growth inhibition was observed between bacterial strains treated

with exosecretions previously exposed or not exposed to pathogenic bacteria.

Eight active fractions were found in a range between 3 and 10 kDa and three 3-fractions

lower than 3 kDa molecular weight, in the hemolymph of larvae exposed to pathogens.

The Gram-positive strains are more susceptible to exposure to both of hemolymph as

exosecretions from third instar larvae of L. eximia

Keywords: L. eximia, antimicrobial peptides, insect immunology.

VII

Contenido

Pág.

Resumen ....................................................................................................................... V

Lista de figuras ............................................................................................................. IX

Lista de tablas .............................................................................................................. XI

Introducción .................................................................................................................. 13

1 Objetivos ............................................................................................................... 17

1.1 Objetivo General ................................................................................................ 17

1.2 Objetivos Específicos ........................................................................................ 17

2 Estado del Arte ...................................................................................................... 18

2.1 Características generales de Lucilia eximia ..................................................... 20

2.2 Excreciones y secreciones (E/S) de larvas medicinales .................................. 21

2.3 Sistema Inmune en insectos ............................................................................. 23

2.3.1 Respuesta Celular .................................................................................. 24

2.3.2 Respuesta Humoral ................................................................................ 31

3 Metodología ........................................................................................................... 41

3.1 Colección de especímenes y mantenimiento en laboratorio ............................ 42

3.2 Aislamiento de compuestos antibacterianos .................................................... 42

3.3 Inducción de la respuesta inmune .................................................................... 43

3.3.1 Preparación de inóculo bacteriano......................................................... 43

3.3.2 Inoculación de especímenes .................................................................. 44

VIII Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y


3.4 Colección de secreciones y excreciones (E/S) ................................................. 46

3.5 Colección de hemolinfa ..................................................................................... 46

3.6 Pre-purificación y fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa ................. 47

3.7 Fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa y purificación por HPLC ..... 47

3.8 Ensayos de actividad antibacteriana ................................................................ 48

3.9 Análisis de resultados........................................................................................ 49

4 Resultados y Discusión ..........................................................................................51

4.1 Actividad antibacteriana de E/S ........................................................................ 51

4.2 Actividad antibacteriana en hemolinfa .............................................................. 60

5 Conclusiones y recomendaciones ...........................................................................69

5.1 Conclusiones ..................................................................................................... 69

5.2 Recomendaciones ............................................................................................. 70

A. Anexo ....................................................................................................................71

6 Bibliografía .............................................................................................................72

Contenido IX

Lista de figuras

Figura 2-1 Caracteres morfológicos de importancia taxonómica en L. eximia ................. 21

Figura 2-2. Subtipos de hemocitos en Drosophila ............................................................ 28

Figura 2-3 Esquema de la respuesta inmune en insectos . ............................................... 32

Figura 2-4 Identificación de péptidos antimicrobianos en diferentes órdenes de insectos34

Figura 2-5 Sitios de expresión de péptidos antimicrobianos (AMP) en larvas de

Drosophila ........................................................................................................................... 35

Figura 2-6 Cecropinas en Diptera ...................................................................................... 37

Figura 2-7 Conformación estructural de las defensinas en insectos. ................................ 38

Figura 3-1. Trampa para insectos adultos, cebada con hígado fresco de cerdo. ............. 43

Figura 3-2 Grupos de tratamiento para obtención de muestras. ....................................... 45

Figura 4-1 Efecto de las E/S crudos de L. eximia sobre el crecimiento bacteriano. ......... 53

Figura 4-2 Cuartil-Cuartil (QQ-plot) .................................................................................... 55

Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas

con fracciones de exosecreciones ..................................................................................... 58

Figura 4-4 Q-Q plot para el índice de sobreviviencia de bacterias tratadas con hemolinfas

de L. eximia ......................................................................................................................... 61

Figura 4-5 Efecto de las hemolinfas sin fraccionar sobre tres cepas bacterianas. ........... 63

Figura 4-6 Diagrama de cajas y bigotes de los índices de viabilidad de bacterias tratadas

con diferentes clases de hemolinfa de L. eximia. .............................................................. 64

X Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y


Figura 4-7 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas

con hemolinfa fraccionada de L. eximia. ............................................................................ 66

Contenido XI

Lista de tablas

Tabla 2-1. Tipos de hemocitos en insectos ........................................................................ 26

Tabla 2-2: Categorización de los hemocitos en diferentes insectos. ................................ 27

Tabla 2-3 Receptores celulares homólogos en insectos y mamíferos involucrados en la

respuesta inmune (80) ........................................................................................................ 29

Tabla 2-4. Diptericinas de diversas especies de insectos dípteros ................................... 39

Tabla 4-1 Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con ESH y ESM de L. eximia ....... 54

Tabla 4-2 Pruebas de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia .................... 54

Tabla 4-3 Prueba de homogeneidad de varianza .............................................................. 54

4-4 Análisis de la Varianza para el Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con E/S.. 55

4-5 Comparación de medias entre las fracciones según tipo de extracto......................... 57

Tabla 4-6 Fracciones de E/S con actividad inhibitoria, separadas por HPLC ................... 59

4-7 Test de normalidad de Shapiro-wilk ............................................................................. 61

4-8 Prueba de homogeneidad de varianza de Levene ...................................................... 62

Tabla 4-9 Comparación de Índices de sobrevivencia entre las cepas tratadas con

diferentes hemolinfas procedentes de L. eximia. ............................................................... 64

Tabla 4-10 Fracciones activas de hemolinfa de L. eximia, separadas por HPLC............. 68

13

Introducción

Los insectos conforman uno de los grupos animales más exitosos. Desde su aparición

hace 400 millones de años (1), han colonizado todos los hábitats a excepción del mar y

se estima que conforman el 90% de la biodiversidad animal (2).

La diversidad bioquímica y molecular que han alcanzado ha sido aprovechada por el

hombre al incorporar los insectos como fuente alimentaria (3,4), recurso medicinal

(5,6,7), en la agricultura y de manera reciente en la industria tecnológica, como

inspiración intelectual para el desarrollo e innovación en ingeniería de materiales,

robótica, entre otras(8).

En los últimos años, los estudios sobre fisiología y ecología de insectos se han enfocado

no solo en investigación básica sino también en el área bioprospectiva, permitiendo

explorar el uso funcional de moléculas que estos producen(9). De esta manera, se han

identificado proteínas, péptidos y otras compuestos con actividad antimicrobiana(10),

antiviral y antitumoral(11), analgésica(12), antiinflamatoria(13), entre otros.

Las moléculas aisladas a partir de diversas fuentes como tejidos, venenos y el sistema

inmune de insectos, han sido caracterizadas e incluso modificadas por medio de técnicas

moleculares y de ingeniería genética con el fin mejorar su eficiencia. De esta manera se

han sintetizado por ejemplo, compuestos de interés para la industria médica y

farmacéutica(5,14).

La resistencia a antimicrobianos es considerada como un problema de salud pública por

la Organización Mundial de la Salud desde 1999 (15). En consecuencia, la búsqueda de

14 Determinación de la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de

Lucilia eximia (Diptera: Calliphoridae)

compuestos con actividad antibacteriana es uno de los temas de investigación de mayor

relevancia en la actualidad. En este sentido, se han constituido compañías dedicadas a la

búsqueda de moléculas con actividad biológica derivadas de insectos, llevando a cabo

propuestas como el proyecto “Drugs from Bugs” de la División de Entomología de

CSIRO, quienes desarrollan una librería de extractos derivados de insectos para la

búsqueda de moléculas con potencial farmacéutico (goliath.ecnext.com/.../Drugs-from-

bugs-the-promise.html). También se ha conformado recientemente un consorcio francés

para desarrollar entre otras cosas, productos naturales derivados de insectos, mediante

la creación de un “Life Science Corridor” que se propone producir las “innovaciones

terapéuticas del mañana” (www.alsace-biovalley.com/). China es otro de los países

interesados en el área farmacéutica. Compañías como Jiangsu Protelight Pharmaceutical

(www.protelight.com) especializada en la búsqueda de medicamentos basados en

péptidos y el Center of Excellence (COE) con su programa "Research for utilization of

insect properties", están incursionando en el campo bioprospectivo de insectos en la

búsqueda de compuestos no solo con actividad antimicrobiana sino también aquellos con

actividad anticancerígena e inhibidores de crecimiento tumoral(16).

Según Melgarejo y cols.(17), la bioprospección en el área animal en Colombia es un

tema que apenas comienza a ser explorado, donde se destaca el estudio de organismos

marinos.

En cuanto a los insectos, se conoce sobre el uso medicinal de algunas especies (18) y se

encuentra publicado un trabajo en bioprospección que implica la caracterización de un

péptido antimicrobiano presente en el vector de Chagas Rhodnius prolixus, con actividad

biológica contra cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas (19). Aunque se

cuenta con alrededor de 71 grupos de investigación colombianos que trabajan en

bioprospección(20), los estudios prospectivos en insectos son poco abordados en

nuestro país.

http://www.protelight.com/

15

Las moscas de la familia Calliphoridae son consideradas de importancia ecológica,

médica y sanitaria (21). Su fuerte preferencia por asentamientos humanos y sustratos

como carne u otra materia orgánica en descomposición, permite que estén en contacto

con organismos potencialmente patógenos y por lo tanto se pueden considerar como un

grupo promisorio para la búsqueda de antimicrobianos.

En Colombia, se ha avanzado en el inventario de califóridos debido a su importancia

forense para la determinación de intervalos post-mortem. También se han llevado a cabo

estudios sobre sus ciclos de vida, índice de sinantropia (22) y se dispone de claves

taxonómicas para la determinación de adultos e inmaduros de las especies locales

(23,24). Por lo tanto se puede considerar como un grupo de insectos bien caracterizado

en el país y de potencial interés en bioprospección.

Recientemente se ha documentado la inducción de angiogénesis y la actividad

bactericida y bacteriostática de péptidos y metabolitos de bajo peso molecular aislados

de larvas de Lucilia sericata (Meigen, 1826) (Diptera: Calliphoridae) (25,26). Esta mosca

es de especial interés a nivel mundial como especie de elección en la terapia larval,

terapia de desbridamiento o biocirugía. Un tratamiento terapéutico reintroducido en los

años 80 en Estados Unidos, como alternativa al tratamiento de ulceras varicosas y

heridas crónicas en pacientes que no responden a los métodos convencionales, como en

el caso de infecciones óseas y cutáneas por cepas resistentes a meticilina y

vamcomicina (27).

La eficiencia de L. sericata en la desinfección de heridas infectadas se explica

parcialmente por la presencia de moléculas con actividad antibacteriana presentes en su

hemolinfa, secreciones y excreciones. Estos compuestos han sido descritos como

proteasas, péptidos y moléculas de naturaleza no proteica, con actividad bactericida o

bacteriostática, incluso sobre cepas meticilino-resistentes (25).



Así mismo, se han aislado péptidos antibacterianos de la familia de las defensinas

(Lucifensina I y II), presentes en larvas de L. sericata y L. cuprina (28,29).

L. eximia (Wiedeman, 1819) es una especie neártica y neotropical, de amplia distribución

en Colombia, que ha sido registrada como primera colonizadora de cuerpos en

descomposición en un amplio rango altitudinal. Además, es considerada de importancia

médica y forense en Suramérica y Colombia, donde ha sido utilizada en la terapia larval

como método de desinfección, desbridamiento y cicatrización de heridas ulcerativas en

pacientes en la ciudad de Medellín (30).

En el presente trabajo, mediante técnicas de ultrafiltración y cromatografía de alta

resolución (HPLC), se realizó una búsqueda preliminar de los compuestos con actividad

antibacteriana, presentes en las exosecreciones (secreciones y excreciones) y la

hemolinfa de larvas de L. eximia. Las pruebas de actividad biológica se realizaron sobre

tres cepas bacterianas consideradas como patógenas humanas.

17

1 Objetivos

1.1 Objetivo General

Determinar la actividad antibacteriana de extractos y hemolinfa de larvas de

Lucilia eximia.

1.2 Objetivos Específicos

Caracterizar la actividad antimicrobiana de la hemolinfa de larvas de L. eximia

inmunizadas con bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Caracterizar la actividad antimicrobiana de secreciones y excreciones de L.

eximia sobre cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas.

Verificar la actividad antimicrobiana de las diferentes fracciones de la hemolinfa y

extractos de larvas de L. eximia.



2 Estado del Arte

Las moscas de la familia Calliphoridae comparten una línea evolutiva común cuyo estado

ancestral es la saprofagia, es decir, el desarrollo de individuos sobre materia en

descomposición (31). En esta familia ha ocurrido una diversificación de hábitos que

incluye además de la saprofagia, el parasitismo facultativo, en el cual los estados

inmaduros se desarrollan sobre tejido necrosado de animales heridos y el parasitismo

obligado, que consiste en el desarrollo de individuos sobre tejidos sanos de vertebrados

inclusive en el hombre. Este último caso se conoce en el ámbito medico sanitario como

miasis(32).

La terapia larval o biocirugía es una miasis controlada, que consiste en la aplicación de

larvas de moscas sobre heridas cutáneas(33). Surgió como terapia clínica a partir de las

observaciones de los efectos beneficiosos que resultaron de las infestaciones por parte

de larvas, en lesiones de soldados heridos durante la época napoleónica (34). Tales

efectos consistieron en la aceleración del proceso de cicatrización y la prevención del

desarrollo de infecciones, debido a la presencia de larvas que se alimentaban del tejido

necrosado (27). Actualmente, la terapia larval es utilizada en pacientes que no responden

a los tratamientos antibióticos convencionales o que tienen su sistema inmune

comprometido como en el caso de pacientes diabéticos (35).

19

En Colombia se han registrado 12 géneros y 29 especies de califóridos, de las cuales por

lo menos 13 están asociadas a cadáveres en descomposición (23,24). Por lo tanto, se

presume que tienen una estrategia inmune eficiente que les permite sobrevivir en

ambientes potencialmente patógenos. En este sentido, las especies de la familia

Calliphoridae son un recurso valioso no sólo para la búsqueda de especies alternativas

en bioterapia sino también de compuestos antimicrobianos.

De particular interés se considera el género Lucilia representado en el país por cinco

especies de amplia distribución geográfica, dos de las cuales han sido utilizadas en

terapia larval (30,36). Así mismo, de manera reciente se ha avanzado en el estudio de las

propiedades antibacterianas y composición molecular de la hemolinfa y exosecreciones

de Sarconesiopsis magellanica, una especie que en nuestro país está asociada a

cadáveres en descomposición (37,38).

L. sericata, es una especie parásita facultativa, que tiene preferencia por el tejido

necrosado. Desde 1931, es la especie de uso convencional en bioterapia debido a que

fue la primera especie que se utilizó con éxito en seres humanos, probada en pacientes

con osteomielitis crónica (39). Además se distribuye en un amplio rango geográfico lo

que ha permitido colonizarla en países como Inglaterra, Alemania, Estados Unidos y

Colombia.

La investigación científica en el contexto de la terapia larval se ha enfocado en la

búsqueda y selección de especies alternativas(27,30), así como en la comprensión del

mecanismo de acción de las larvas sobre la herida (40) y el aislamiento y caracterización

de los compuestos implicados en potenciamiento del proceso de cicatrización (41,42) y la

actividad antibacteriana (25,26,43,44). Al respecto se destaca el desarrollo de hidrogeles

utilizados para prevenir la infección de pieles en proceso de cicatrización, que contienen

péptidos antimicrobianos aislados de califóridos(45,46).



2.1 Características generales de Lucilia eximia

L. eximia es una especie neártica y neotropical frecuentemente encontrada en áreas

urbanas, que se alimenta primariamente de carroña, pero también de frutas y desechos

urbanos (22). En el Neotrópico se encuentra en Argentina, Brasil, Colombia, Costa Rica,

Ecuador, Guatemala, México, Panamá, Puerto Rico, Guyana y Trinidad y Tobago (47).

Ha sido registrada como causante miasis primaria en animales (48), pero también ha sido

utilizada desde el 2002 en la terapia larval como método de desbridamiento y para

disminuir el mal olor resultante de la descomposición bacteriana en úlceras de gran

tamaño debidas a tumores o escaras(30). En Colombia es considerada de importancia

forense, debido a que se ha registrado como primera colonizadora de cuerpos en

descomposición (49,50).

L. eximia atraviesa por cuatro estados de desarrollo, huevo, larva con tres estadios, pupa

y adulto. Las hembras pueden ovipositar hasta 92 huevos, durante por lo menos dos

momentos de su ciclo de vida. Según observaciones en campo sobre trampas cebadas

con hígado, las hembras tienen preferencia de ovipositar a la sombra (datos no

publicados).

Las larvas son de comportamiento gregario. Atraviesan por tres estadíos denominados

L1 a L3 diferenciados por características como la presencia de una a tres hendiduras en

las placas espiraculares posteriores y el desarrollo del esqueleto cefalofaríngeo (Figura

2-1). La duración del estado de larva es de aproximadamente 100 horas bajo una

temperatura promedio de 28ºC. El periodo de pupación puede durar, bajo esta misma

temperatura, diez días.

Los adultos son de coloración variable, desde verde hasta azul con visos violáceos y

rojizos, siempre con brillo metálico. La diferenciación entre machos y hembras puede

hacerse a simple vista debido a que en los machos los ojos llegan a unirse uno con el

21

otro mediante una delgada sutura (ojos holópticos) mientras que en las hembras están

separados (ojos diópticos). La identificación taxonómica de los adultos se basa en

características como el ancho relativo de la frente y la forma de los genitalia en los

machos (47).

2.2 Excreciones y secreciones (E/S) de larvas medicinales

El uso de larvas para el tratamiento de heridas tiene tres efectos importantes en el

proceso de restauración: (a) desbridamiento del tejido necrosado, (b) estimulación para la

formación del tejido de granulación y (c) acción antiséptica debido a las secreciones y

excreciones antibacterianas de las larvas (34).

B

TDI

TD

M

TDE TVE

TVM

TVI

D E

B

C

(A) Hembra de L. eximia. (B) larva L3. (C) Segmento terminal de larva L3 de L. eximia. (D) placa espiracular de

una larva en L3, tratada con KOH al 10%. Fotografía en microscopía óptica. 40X aumento. TD: tubérculos

dorsales;TDI: tubérculos dorsales internos; TDM: tubérculos dorsales medios; TDE: tubérculos dorsales

externos; TVE: tubérculos ventrales externos; TVM: tubérculos ventrales medios; TVI: tubérculos ventrales

internos. (E) Vista lateral del esqueleto cefalofaríngeo de una larva en L3, tratada con KOH al 10%. (dc: Cuerno

dorsal; vc: Cuerno ventral; tnt phgm: Fragma tentorial; hyp: Hypostoma; de: Dentículo; md: Esclerito mandibular).

Fotografía en microscopía óptica. 10X aumento. Fotografías Paula Giraldo.

A

Figura 2-1 Caracteres morfológicos de importancia taxonómica en L. eximia



Las E/S larvales se componenen de productos secretados por el intestino y las glándulas

salivales. Contienen principalmente las enzimas proteolíticas necesarias para la

degradación del sustrato alimenticio y posterior ingestión (51). También están presentes

compuestos con actividad antibacteriana lo cual fue demostrado por Simmonns (52) en

los años 30. Así mismo se comprobó la destrucción en el tracto intestinal de las bacterias

ingeridas por las larvas, estimando el número de células de E. coli viables en las

diferentes secciones intestinales de larvas de L. sericata, mediante microscopia confocal

(40), lo que permite pensar que existen sustancias antibacterianas en el intestino que

pueden ser secretadas en el sustrato alimenticio de las larvas.

A la fecha se han realizado diferentes estudios sobre las propiedades antimicrobianas de

las exosecreciones de las especies utilizadas en terapia larval. Estos estudios han

demostrado que las E/S son más eficientes sobre bacterias gram positivas que sobre

gram negativas (25,26,53). Los trabajos iniciales sobre las propiedades de las E/S

describieron características fisicoquímicas y biológicas como, la estabilidad térmica,

condiciones óptimas de pH, resistencia a proteasas y actividad antimicrobiana sobre

cepas patógenas humanas, entre ellas algunas con conocida resistencia a

antibióticos(28,29,40).

Las moléculas con actividad antimicrobiana aisladas de estas especies reportadas en la

literatura, han sido identificadas básicamente según su peso molecular. Se han

encontrado moléculas entre 3 y 10 kDa, de naturaleza proteica, dos de las cuales han

sido identificadas como péptidos antimicrobianos tipo defensinas con marcada actividad

sobre bacterias Gram positivas y sobre Candida albicans (28,29,40). Estos péptidos al

parecer se expresan de manera constitutiva en las glándulas salivales de las larvas de

primer estadio y se mantienen hasta el momento previo a la pupación, lo que explicaría

su presencia en las exosecreciones. Así mismo han sido encontrados en el intestino y

tejido graso de larvas expuestas a ambientes infecciosos(28,54).

23

También se han encontrado moléculas de bajo peso molecular (menor a 1 kDa) con

actividad sobre cepas resistentes a meticilina (26). Entre ellos aminoácidos libres como el

L- valinol y ácidos orgánicos como el ácido hidroxibenzoico (138 Da) y el ácido (p–

hydroxifenil) acético (152 Da) y dímeros de prolina(42,55).

Los estudios recientes sobre E/S de larvas medicinales apuntan hacia la caracterización

de enzimas proteolíticas (56) y a la identificación de compuestos que estimulan el

proceso de cicatrización mediante la degradación de la matriz extracelular y la

atenuación del proceso inflamatorio(42). También se ha diseñado un prototipo de

hidrogel que contiene exosecreciones de L. sericata, el cual acelera el cierre de heridas

mediante al promover el crecimiento de fibroblastos y queratinocitos, in vitro (45).

2.3 Sistema Inmune en insectos

La inmunidad se refiere a todas aquellas funciones biológicas que le confieren protección

a un organismo contra los efectos nocivos de factores de diversos tipos como, moléculas,

células, órganos y organismos(57).

La inmunidad puede ser innata o adquirida. La inmunidad innata se refiere a la capacidad

intrínseca de un organismo para detectar y contrarrestar los efectos potencialmente

nocivos de factores ajenos a él (58), mientras que la inmunidad adquirida, se desarrolla

en respuesta a una infección y su intensidad y capacidad defensiva aumentan, después

de cada exposición subsiguiente a un determinado agente(59).

Los insectos han desarrollado estrategias de respuesta innata eficientes que les ha

permitido habitar ambientes diversos, algunos de los cuales están enriquecidos con

microorganismos potencialmente patógenos. Estas estrategias son de tipo humoral y

celular. La respuesta humoral consiste en moléculas efectoras solubles que incluyen

péptidos antimicrobianos (AMP por sus siglas en inglés), proteínas y productos

generados por cascadas de complejos proteolíticos como especies reactivas de oxígeno



e intermediarios de nitrógeno que se producen durante la melanización, la cual es

inducida por la activación de la cascada de la Profenoloxidasa (pro-PO por sus siglas en

inglés), (10,60).

La respuesta celular se refiere a mecanismos como la fagocitosis, encapsulación y

formación de nódulos, en los cuales intervienen directamente los hemocitos (61).

Aunque se pensaba que los insectos carecen de inmunidad adaptativa, un estudio

reciente con moscas adultas de Drosophila melanogaster indica la existencia de un

mecanismo de respuesta similar a la memoria adaptativa en vertebrados (62). En esa

investigación se demostró que la inmunización de moscas adultas de Drosophila con una

dosis subletal de Streptococcus pneumoniae fue suficiente para proteger los individuos

expuestos a una segunda exposición con S. pneumoniae, pero no para protegerlos de

infecciones con otras cepas patógenas. El efecto protector de la inmunización con S.

pneumoniae fue específico y persistente durante la vida de la mosca.

2.3.1 Respuesta Celular

2.3.1.1 Hemocitos

La respuesta celular en insectos está mediada por células especializadas presentes en la

hemolinfa, que reconocen, controlan y eliminan patógenos cuando estos han traspasado

las barreras estructurales como la cutícula de exoesqueleto y el tejido epitelial y han

alcanzado el hemocele.

La comprensión actual del desarrollo de los hemocitos y las respuestas de defensa

celular se deriva principalmente del estudio de insectos modelo como D. melanogaster

(63), algunos Lepidoptera de importancia en la agricultura (64) e insectos vectores (65).

25

Los hemocitos también han sido descritos en especies de órdenes como Orthoptera,

Blattodea, Coleoptera, Hymenoptera, Hemiptera y Colembolla (61). Sin embargo la

mayor parte de estos estudios son de carácter morfológico y carecen de información

suficiente sobre su función. Por lo tanto diferentes morfotipos celulares pueden tener

funciones similares. Un ejemplo de ello es la tipificación de los Plasmatocitos, las Células

Cristalinas y los Lamelocitos en Drosophila, los cuales a su vez son morfológica y

funcionalmente similares a los Granulocitos, Oenocitos y Plasmatocitos en Lepidoptera,

respectivamente(66). En las Tabla 2-1 y Tabla 2-2 se listan los tipos de hemocitos que

han sido descritos en diferentes insectos (67).

En larvas de Drosophila los hemocitos se diferencian en tres tipos:

Plasmatocitos. Son células fuertemente adherentes in vitro que representan el

90-95% del total de hemocitos maduros en la hemolinfa. Participan en la

fagocitosis de bacterias y cuerpos apoptóticos (68) y en procesos de cicatrización.

También producen péptidos antimicrobianos y secretan componentes de la matriz

extracelular (ECM por sus siglas en ingles), (69).

Células cristal ó hialinas. Son células no adherentes que comprenden

aproximadamente el 5% de los hemocitos en circulación y expresan componentes

de la cascada de las Fenoloxidasas (PO por sus siglas en inglés), los cuales a su

vez son importantes para la activación del mecanismo de melanización(70).

Lamelocitos. Son hemocitos planos de gran tamaño y adherentes. Están

prácticamente ausentes en larvas de Drosophila sanas, pero se ha observado que

se diferencian rápidamente a partir de Prohemocitos en larvas expuestas al

ataque de parasitoides y durante la metamorfosis. Su función es la encapsulación

de parasitoides y otros cuerpos extraños de gran tamaño (71).



Tabla 2-1. Tipos de hemocitos en insectos

Hemocito Acrónimo Hemocito Acrónimo

Plasmatocitos PLs Vermicitos VEs

Granulocitos GRs Podocitos POs

Esferulocitos SPs Coagulocitos Cos

Adipohemocitos ADs Lamelocitos Las

Espinocitos SNs Trombocitoides THs

Oenocitoides Oes Prohemocitos PRs

Los hemocitos se producen durante la embriogénesis de la cabeza o el mesodermo

dorsal y durante el estado larval o ninfal en órganos hematopoyéticos derivados del

mesodermo (72). Los órganos hematopoyéticos en Drosophila son ganglios linfáticos que

se forman bilateralmente a lo largo de la parte anterior del vaso dorsal durante la

embriogénesis. Contienen precursores de prohemocitos (pre-prohemocitos) los cuales se

diferencian en los tres tipos de hemocitos anteriormente mencionados. Los hemocitos

diferenciados que se encuentran en circulación también proliferan y ayudan a mantener

las poblaciones de hemocitos (73). En figura 2-1 se ilustran los tipos de hemocitos en

Drosophila.

27

Tabla 2-2: Categorización de los hemocitos en diferentes insectos.

Investigadores Organismo Subtipo de Hemocito reportado

Yeager (1945) Prodenia eridania

Proleucocytoides, células cromofilicas derivadas de

proleucocitoides, OEs, PLs, POs, VEs, Cystocitoides,

Esferoidocitos, células eruptivas inestables y células

degradadas.

Jones (1959) Prodenia eridania PRs, OEs, PLs, Pos, Ves, GRs, cystocitos, Esferoidocitos y SPs.

Jones (1962) Insectos PRs, PLs, GRs, Ads y OEs.

Gupta (1979) Insectos Tipos de Hemocitos, su estructura, sinonimias, relaciones y

significancia taxonómica.

Zachary et al.,

(1973)

Calliphora

erythrocephala PLs, OEs, THs.

Arnold (1982) 85 especies de la

Familia Noctuide

PRs, PLs, GRs, Ads and OEs, the VEs, POs, Cos, Los, THs y

SNs tambien han sido documentados.

Ashhurst (1982) Galleria mellonella

4 tipos de celulas funcionales; PLs, GRs, SPs y OEs con base

en estudios de inmunohistoqúimica.Mas tarde se confirmó la

presencia de PRs, PLs, SPs, ADs y OEs.

Mishra (1999) Dysdercus koenigii PRs, PLs, GRs, ADs y OEs, presencia de VEs en estados

específicos del desarrollo.

Pandey et al.,

(2003) Papilio demoleus

PRs, PLs, GRs, SPs, ADs y OEs. POs y VEs como variantes de

PLs.

Tulin et al.,

(2003) Calliphora vicina

PRs,PLs, Oes, POs, Histolisocitos y Células con inclusiones

cristalinas.

Pandey y Tiwari

(2005) Danais chrysippus

PRs, PLs, GRs, SPs, ADs y OEs, presencia de POs VEs en

estados específicos del desarrollo.

Tiwari at al.,

(2006) D. koenigii PRs, PLs, GRs, ADs y OEs. No se encontraron SPs.

Pandey et al.,

(2010) Antheraea mylitta

PRs, PLs GRs, SPs, ADs and OEs. Los VEs y POs fueron

encontrados en estados larval y pupal como variantes de PLs.



Figura 2-2. Subtipos de hemocitos en Drosophila (74)

Los plasmatocitos se asemejan al linaje de macrófagos de monocitos de mamíferos y están involucrados en

la fagocitosis, encapsulación y la producción de péptidos antimicrobianos. Los Lamelocitos, que rara vez se

ven en larvas sanas, son más grandes que otros hemocitos y están involucrados en la encapsulación de los

patógenos invasores. Muchos Lamelocitos derivan directamente de plasmatocitos, como se indica por la

flecha. Las células cristal se rompen para liberar componentes de la cascada de fenoloxidasa, que participan

en el proceso de encapsulación de los organismos invasores, la coagulación y la cicatrización.

No existe evidencia de hematopoyesis en el estado adulto de Drosophila, sin embargo,

se sabe que tienen una población fija de hemocitos sésiles, localizada principalmente en

la porción anterodorsal del abdomen, los cuales solo tienen función fagocítica (75).

En estudios morfológicos sobre hemocitos de larvas y pupas jóvenes de Calliphoridae, se

han registrado cuatro tipos morfológicos, prohemocitos, oenocitoides, plasmatocitos y

trombocitoides. Además se ha descrito la presencia de filopodocitos, células cristal e

histolisocitos, los cuales poseen una serie de características específicas y representan

tres líneas de células independientes, lo cual apoya la hipótesis poligénica de la

hematopoyesis en los insectos (76,77).

Los plasmatocitos de Calliphora vicina, tienen actividad citotóxica análoga a las células

natural killers (NK) en mamíferos. Reconocen las células blanco como no propias,

29

mediante la formación de un conjugado e induciendo el proceso de apoptosis que

conduce a la muerte del blanco celular. Así mismo, el aumento en el número de

plasmatocitos en la hemolinfa en el estado previo a la metamorfosis, sugiere que pueden

inducir apoptosis en las células de las larvas utilizando el mismo mecanismo citotóxico

(78). Aunque las células NK están presentes en otros Phyla de invertebrados, solo han

sido descritos en Calliphoridae (79).

Los mecanismos de respuesta celular fagocitosis, nodulación y encapsulación son

inducidos por la presencia de organismos patógenos que son reconocidos por proteínas

de superficie presentes en los hemocitos, algunos de los cuales tienen homólogos en

mamíferos. En la Tabla 2-3 se presentan los receptores celulares involucrados en el

reconocimiento de patógenos en Diptera.

Tabla 2-3 Receptores celulares homólogos en insectos y mamíferos involucrados en la respuesta inmune

(80)

Receptor Función que activa Drosophila Mosquitos Mamíferos

Intreginas Encapsulación + + +

Dscam Fagocitosis Bacterias + + +

Nimrod Fagocitosis + + +

PGRP-CL Fagocitosis Gram + + + +

dSR-Cl Reconocimiento Gram +/- + - -

Croquemort Fagocitosis de cuerpos apoptóticos + - +

Eater Fagocitosis Gram +/- + - +

Draper Fagocitosis de cuerpos apoptóticos + - +

Peste Reconocimiento de Mycobacterias + - +

LRP Fagocitosis - + +

Noduler Nodulación - - -



2.3.1.2 Fagocitosis

La fagocitosis es una respuesta de defensa altamente conservada. Se refiere al

reconocimiento, captación y la destrucción intracelular de patógenos, cuerpos

apoptóticos (81) y objetos pequeños por hemocitos individuales (61). En insectos, es

llevada a cabo principalmente por los plasmatocitos, granulocitos y oenocitoides que

circulan en la hemolinfa (82,83).

La fagocitosis requiere múltiples interacciones sucesivas entre el fagocito y el patógeno,

así como eventos de transducción de señales secuenciales. Se induce cuando los

receptores de la superficie de los fagocitos son activados por células diana, seguido por

la formación de un fagosoma y la internalización del blanco a través de un mecanismo de

polimerización dependiente de actina. Finalmente, el fagosoma madura a fagolisosoma a

través de una serie de eventos de fisión y fusión con endosomas y lisosomas(84).

Los hemocitos de insectos pueden fagocitar diferentes tipos de bacterias, hongos,

levaduras y protozoos, aunque la respuesta depende del organismo blanco. Por ejemplo,

en Anopheles albimanus y Aedes aegypti, la respuesta inicial de los hemocitos a la

presencia de Escherichia coli es la fagocitosis. Mientras que frente a Micrococcus luteus

inicialmente ocurre melanización y luego fagocitosis (85,86). También se ha observado

que existen diferencias en la eficacia y la rapidez con la que ocurre la fagocitosis.

Estudios en líneas celulares de An. gambiae y hemocitos aislados de Ceratitis capitata,

demuestran que E. coli es fagocitada más fácilmente que Staphylococcus aureus (82,87).

2.3.1.3 Encapsulación

La encapsulación se refiere a la unión de hemocitos a cuerpos extraños de gran tamaño

tales como parásitos, protozoos y nemátodos, que no pueden ser fagocitados, e implica

31

la adhesión de múltiples capas de hemocitos que rodean el organismo invasor así como

la inducción de la respuesta de melanización (61).

Se conocen dos tipos de encapsulación. La encapsulación celular, ampliamente descrita

en Lepidoptera (64) y la encapsulación melanótica (humoral), mediada por la actividad de

la profenoloxidasa (PO), que puede ocurrir sin la participación de hemocitos (88).

Se ha observado que la introducción de parasitoides, por ejemplo huevos de

Hymenoptera en larvas de Drosophila, induce cambios morfológicos en los plasmatocitos

y en sus propiedades adhesivas, permitiendo que formen una cápsula alrededor de la

matriz extracelular, de manera similar al proceso de agregación plaquetaria que ocurre

durante la trombosis en mamíferos. Los plasmatocitos adheridos comienzan a apilarse

sobre el huevo y a unirse ente si formando capas delgadas de plasmatocitos, hasta

separar el huevo del hemocele (89). Dentro de la cápsula el invasor muere a causa de la

producción local de los radicales libres citotoxicos como ROS y RNS o por asfixia.

2.3.1.4 Nodulación

La nodulación es el mecanismo de defensa celular predominante en los insectos y se

refiere a los agregados multicelulares de hemociticos que atrapan un gran número de

bacterias. También se pueden formar de agregados de hemocitos que se asemejan a los

nódulos, en presencia de lipopolisacárido (LPS) y glicoproteínas. La formación de

nódulos es un proceso mediado por lectinas, eicosanoides, la profenoloxidasa y la

dopadescarboxilasa (DDC), (88).

2.3.2 Respuesta Humoral

La respuesta humoral implica la inducción rápida de cascadas proteolíticas en la

hemolinfa, que inducen la melanización y coagulación, así como la síntesis de péptidos

antimicrobianos en el tejido graso, equivalente funcional del hígado de los mamíferos.



La respuesta humoral se origina en presencia de patrones moleculares que son

característicos de los polisacáridos presentes en hongos y bacterias (90). La inyección de

peptidoglicano ó bacterias completas en larvas de Manduca sexta y Bombyx mori

estimula la síntesis de proteínas como lisozimas, cecropinas y hemolina por el tejido

graso (64). Lo que sugiere que existen receptores de peptidoglicano en las células del

tejido graso. Así mismo, han sido identificados compuestos termoestables de naturaleza

hidrofóbica, menores de 3 kDa, que son secretados por el tejido graso en larvas de

Calliphora vicina y en epiteliocitos del integumento, que liberan factores humorales para

la síntesis de péptidos en respuesta a la infección con bacterias(91).

Esquema que representa la respuesta inmune ante la exposición a diferentes antígenos. Los recuadros

denotan los principales receptores y vías de señalización.

Figura 2-3 Esquema de la respuesta inmune en insectos (135).

33

2.3.2.1 Péptidos Antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos (AMPs por sus siglas en inglés) son antibióticos naturales

producidos por casi todos los organismos desde bacterias hasta plantas y animales(92).

Están conformados por aminoácidos y pueden ser sintetizados en diferentes tejidos de

un mismo organismo. Los péptidos AMPs de la clase RAMPs - por su mecanismo de

producción vía ribosomal- incluye aquellos con actividad antimicrobiana a excepción de

las enzimas producidas por bacterias y hongos (no RAMPs), que eliminan

microorganismos mediante su actividad hidrolitica y en cuya síntesis se incorporan

aminoácidos inusuales, que pueden ser modificados por procesos como por ejemplo la

glicosilación (93).

Los péptidos antimicrobianos se caracterizan por su interacción hidrofóbica y

electrostática con las membranas microbianas, resultando en dos posibles mecanismos,

de acción, dependiendo del péptido y de la especie de microorganismo. Pueden causar

lisis celular ó la formación de poros transmembranales que permiten su transporte al

interior de las células donde inhiben la síntesis de ARN y algunas proteínas entre las

cuales se encuentran aquellas asociadas a la síntesis de la pared celular (94). Los

detalles sobre los mecanismos de acción de los péptidos antimicrobianos han sido

ampliamente descritos por diferentes autores(10,95,96).

Se han descubierto numerosos péptidos antimicrobianos en insectos. El primero de ellos

de la familia de las cecropinas, fue aislado y caracterizado inmunizando pupas de

Hyalophora cecropia con cepas bacterianas. Desde entonces, se han aislado y descrito

alrededor de 300 péptidos antimicrobianos en insectos principalmente de los órdenes

Hymenoptera, Lepidoptera, Diptera y Coleoptera (10,95). En la Figura 2-4 se presenta el

porcentaje de péptidos antimicrobianos de diferentes órdenes de insectos que se han

registrado en la base de datos APD (97).



La expresión de los péptidos antimicrobianos en insectos es regulada

transcripcionalmente mediante las rutas de señalización Toll e Imd, como respuesta a la

infección por hongos y bacterias gram positivas y bacterias gram negativas

respectivamente, ó con la exposición a patrones moleculares asociados a patógenos

(PAMPS) (95). Aunque al igual que las Lisozimas los péptidos pueden encontrarse de

manera constitutiva en la hemolinfa (98).

Figura 2-4 Identificación de péptidos antimicrobianos en diferentes órdenes de insectos

El orden Hymenoptera representa el mayor número de péptidos antimicrobianos caracterizados, no solo en

hemolinfa, sino también en sus venenos, los cuales han sido estudiados para la búsqueda de

antimicrobianos, antivirales, antitumorales y péptidos con actividad insecticida, debido al gran número de

especies parásitas y depredadoras de otros insectos, representadas en este orden.

En insectos hemimetábolos, los AMP son producidos por hemocitos en individuos sanos

y son secretados a la hemolinfa cuando ocurre una infección (99). En insectos

holometábolos los AMPs son inducibles en el tejido graso al inicio de la etapa larval

donde son secretados posteriormente a la hemolinfa. También se expresan en células

epiteliales de los tejidos que están en contacto con el ambiente y en los cuales se

22%

9%

11% 42%

1% 6%

1% 5% 3%

Porcentaje de péptidos antimicrobianos

caracterizados en insectos.

Diptera

Lepidoptera

Coleoptera

Hymenoptera

Orthoptera

Hemiptera

Isoptera

Trichoptera

Odonata

35

pueden encontrar microorganismos patógenos como en el tracto respiratorio (98), la

región oral y el tracto digestivo (100), los túbulos de Malpighi y los tractos reproductivos,

tanto en machos como en hembras (101,102). Los AMPs no solo son activos contra

microorganismos sino además contra virus y células tumorales (11).

D. melagnogaster es uno de los modelos de estudio en insectos mejor caracterizado en

cuanto a su respuesta inmune. En el género Drosophila se han identificado 20 genes

codificantes para péptidos antimicrobianos con sus respectivos productos (103), los

cuales se agrupan en 7 familias, Diptericinas, Drosocinas y Ataccinas, producidas como

respuesta a bacterias gram negativas; Defensinas y Cecropinas que son activas contra

microorganismos gram positivos y las Drosomycinas y Metchkowinas que tienen

actividad antifúngica y solo han reportado en Drosophila. En la Figura 2-4se esquematiza

los sitios de expresión de AMPs en larvas de Drosophila, los cuales también pueden ser

inducidos en regiones particulares de la superficie epitelial, como respuesta a la infección

local y sistémica (98).

La infección sistémica induce la expresión de siete tipos de genes que codifican péptidos antimicrobianos en

el tejido graso. La infección local desencadena la expresión de subconjutos de AMPs, según la región

afectada.

Figura 2-5 Sitios de expresión de péptidos antimicrobianos (AMP) en larvas de

Drosophila (103)



Según su estructura y composición los AMPs en insectos se dividen en tres grupos: (a)

péptidos que conforman hélices alfa (102,104,105); (b) ricos en un aminoácido particular

como Glicina ó Prolina (106,107) y (c) péptidos estabilizados por puentes disulfuro

(108,109).

A continuación se describen los principales péptidos antimicrobianos que se encuentran

en Diptera.

2.3.2.1.1 Cecropinas

Son los péptidos alfa-helicolidales mas abundantes conformados por cadenas de 29-42

residuos. En Diptera conforman un grupo particularmente homólogo con mas del 70% de

identidad entre sus secuencias. En la Figura 2-6 se observa el alineamiento de

secuencias de cecropinas en especies de Diptera representativos.

Las cecropinas no solo son activas contra bacterias, sino tambien contra hongos y

protistas. Además, han mostrado actividad lítica sobre lineas celulares de leucemia e

inhibición de la adhesion celular en el carcinoma hepatocelular humano BEL7402 (110).

Las membranas bacterianas, al igual que en las tumorales, estan cargadas

negativamente debido a la presencia de LPS y lípidos aniónicos en bacterias, lípidos

aniónicos y el aumento de la glicosilación en células tumorales. Por lo tanto, estas

moléculas aniónicas facilitan la unión de la Cecropina a la membrana mediante

interacciones electrostáticas, mientras que las células normales con carga neutra no son

afectadas (6).

La Sarcotoxina 1A es una Cecropina alfa helicoidal presente en Sarcophaga peregrina,

que tiene actividad bactericida, siendo las bacterias gram negativas mas suceptibles. La

Sarcotoxina 1A, ha sido utiizada para el diseño de plantas tránsgénicas de tabaco,

potenciando la resistencia a patógenos como Erwinia carotovora subsp. carotovora y

Pseudomonas syringae pv tabaci (111).

37

Las cecropinas toman su nombre de Hyalophora cecropia, primer insecto del cual fueron aisladas. Sin

embargo se conocen en otras especies como; Bactericidinas, Lepidópterinas, Sarcotoxinas, etc., que están

estructuralmente relacionados. (A) Sarcotoxina 1A; (B) Cecropina 1; Los modelos estructurales fueron

extraídos de http://pfam.sanger.ac.uk/family/Cecropin. (C) Alineamiento de secuencias de Cecropinas

aisladas de dípteros representativos. Se observa el carácter conservado de sus secuencias. El alineamiento

fue realizado a partir de secuencias registradas la base de datos APD. Cada aminoácido está diferenciado

por un color.

2.3.2.1.2 Defensinas

Las defensinas se han encontrado en todos los insectos que se han estudiado hasta hoy.

Son péptidos cationicos, estabilizados por puentes disulfuro, compuestos por 33 a 46

residuos. Al igual que las cecropinas, la defensinas en Diptera son moléculas con

secuencias muy conservadas, con porcentajes de identidad entre el 70 y el 100%, con un

patrón de puentes disulfuro Cys1–Cys4, Cys2–Cys5 y Cys3–Cys6 (figura 2-7). A este

grupo pertenecen péptidos como las Sapencinas (111), Formicinas (112) y Lucifensinas

(28,29). Las defensinas son expresadas de manera constitutiva en el tejido graso,

intestino y glándulas salivales (28,113).

Las defensinas son activas principalmente contra bacterias gram positivas aunque

algunas pueden ser activos contra bacterias gram negativas y hongos (10).

A B

C

Figura 2-6 Cecropinas en Diptera

http://pfam.sanger.ac.uk/family/Cecropin



Estudios realizados con Formicinas recombinantes han demostrado que estos péptidos

afectan de la permeabilidad de la membrana citoplasmática de M. luteus, resultando en la

pérdida del potasio y disminución del ATP citoplasmatico, además de la despolarización

parcial de la membrana interna e inibición del proceso de respiración. Estudios con

liposomas soportan la hipótesis de que las defensinas de Phormia afectan la

permeabilidad formando canales en la membrana de M. luteus (114).

Las Lucifensinas son defensinas aisladas de larvas de mosca del género Lucilia

utilizadas en terapia larval. Estas defensinas se expresan de manera constitutiva en el

tejido graso. Se han encontrado además en el intestino, glándulas salivales y en las

secreciones y excreciones de las larvas. Por lo tanto, se considera que las Lucifensinas

son uno de los factores antimicrobianos que actúan en el control de la infección por lo

menos de bacterias gram positivas, en la terapia larval (28,29).

Figura 2-7 Conformación estructural de las defensinas en insectos.

A. Esquema de la estructura secundaria de la Lucifensina I(115). B. Conformación estructural de Defensinas

en insectos. Los círculos amarillos representan los residuos de Cisteínas que conforman los puentes

disulfuro característicos de esta familia de péptidos (Fuente, www.uniprot.org).

2.3.2.1.3 Péptidos ricos en Glicina.

En esta categoría se encuentran péptidos que tienen un porcentaje entre 14 y 22% de

Glicina, como la Sarcotoxina IIA, las Atacinas y las Diptericinas. Las Diptericinas se

diferencian por tener un dominio pequeño de prolina en la region amino terminal y una

región de mas o menos 60 residuos de glicina en la region carboxi terminal. Ambos

A

B

39

dominos presentan una O-glicosilación necesaria para su actividad biológica (116). Los

péptidos ricos en glicina son activos contra bacterias gram negativas. En la Tabla 2-4 se

presenta la secuencia de algunas Diptericinas que se encuentran anotadas en la base de

datos Uniprot (www.uniprot.org).

Tabla 2-4. Diptericinas de diversas especies de insectos dípteros

ESPECIE NOMBRE SECUENCIA

Musca domestica Diptericina

MKYLWAIVLLCALSAALVVADDKSQPPPPQIKDPQVRVDVGGSPKDGYNV

NADVRKNIWTSDNGRHSFDATAGYGQHLGGPYGNSRPDYRGGGIYTYRW

Drosophila melanogaster

Diptericina DDMTMKPTPPPQYPLNLQGGGGGGSGDGFGFAVQGHQKVWTSDNGRHE

IGLNGGYGQHLGGPYGNSEPSWKVGSTYTYRFPNF

Stomoxys calcitrans

Diptericina A

MKTIFVAALIVAVFGALGSARPSRDDSKPFEINRAEVTHTHGKGTDVYVDGQ

ARVYQSDN KRHEVYVNGQYGQHLGGPYGNSRPSYGGGVSYTHRF

Phormia terranovae

Diptericina A DEKPKLILPTPAPPNLPQLVGGGGGNRKDGFGVSVDAHQKVWTSDNGGH

SIGVSPGYSQHLPGPYGNSRPDYRIGAGYSYN

Phormia terranovae

Diptericina D MKLFYLLVICALSLAVMADEKPKLILPTPAPPNLPQLVGGGGGNRKDGFGVS

VDAHQKVWTSDNGRHSIGVTPGYSQHLGGPYGNSRPDYRIGAGYSYNFG

2.3.2.2 Melanización

La reacción de melanización es la respuesta inmune más inmediata contra la invasión de

patógenos. Además de ser importante para la cicatrización de heridas, la melanina puede

encapsular y secuestrar los agentes patógenos en Lepidoptera (70) y Diptera como

Drosophila (117). En mosquitos, es una respuesta inmune importante contra el parásito

de la malaria (118). La melanización se hace visible mediante el oscurecimiento del sitio

de la herida, que resulta de la síntesis y deposición de melanina. Los intermediarios

reactivos de la reacción de melanización son tóxicos para los microorganismos (119).

http://www.uniprot.org/



La melanización es dependiente del metabolismo de la tirosina. Durante la melanización,

la enzima fenoloxidasa (PO) cataliza la oxidación de fenoles a quinonas, las cuales se

polimerizan de manera no enzimática para formar la melanina. En Drosophila y otros

artrópodos, la PO se produce y se libera en la hemolinfa como un zimógeno inactivo

llamado profenoloxidasa (PPO). En estudios bioquímicos de especies de insectos más

grandes se han identificado proteasas implicadas en la melanización, como la enzima

activadora de PPO, (PPAE) la cual se escinde y activa la PPO, después de la infección

microbiana(120).

Los metabolitos derivados de la dopamina ya sea por la vía de la PO ó por medio de

otras enzimas, también son usados en otras rutas metabólicas asociadas con la

neurotransmisión y la esclerotización cuticular (121).

41

3 Metodología

Durante el desarrollo de este trabajo fue preciso mantener grupos de larvas asépticas,

bajo un régimen alimentario esterilizable reduciendo la exposición de los individuos al

contacto con bacterias con el fin de realizar ensayos de inmunización con bacterias

específicas (Gram +/-) y así observar las posibles diferencias en cuanto a los

componentes antibacterianos encontrados. De igual manera, se utilizaron individuos

alimentados con hígado fresco de cerdo, el cual es el sustrato de cría convencional para

las especies necrófagas de la familia Calliphoridae, con el propósito de mantener la

colonia y obtener secreciones y excreciones de larvas expuestas a microorganismos.

Los factores antimicrobianos estudiados se obtuvieron a partir de muestras de hemolinfa

y secreciones y excreciones (E/S) de larvas en tercer estadío (L3). La separación de los

componentes se llevó a cabo mediante las técnicas de ultrafiltración y cromatografía

líquida de alta precisión (HPLC).

La actividad biológica fue evaluada mediante ensayos turbidimétricos (TB) en microplaca

y difusión en agar doble capa.

A continuación se detalla la metodología.



3.1 Colección de especímenes y mantenimiento en

laboratorio

Se estableció una colonia de Lucilia eximia en el laboratorio del Grupo de Ecología y

Sistemática de Insectos en la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, a partir

de huevos y adultos colectados en el campus (N:06°15'91'', W:075°34'51''). Para la

captura se utilizó una trampa para moscas adultas cebada con hígado fresco de cerdo

Figura 3-1.

Los adultos fueron mantenidos en jaulas metálicas de 30x30x30 cm bajo condiciones de

humedad relativa y temperatura ambiente (53% - 64% HR; 24ºC - 28ºC), fotoperiodo

12:12h y alimentados con leche en polvo azucarada y agua. Como sustrato para la

oviposición se les proporcionó hígado fresco de cerdo.

El repoblamiento de la colonia se llevó a cabo a partir de individuos criados en hígado de

cerdo. Las larvas fueron mantenidas a temperatura ambiente (24ºC - 28ºC) hasta su

estado postalimentario e inmediatamente transferidas a tarros plásticos con arena

esterilizada para facilitar la pupación.

La identidad taxonómica de la especie se determinó a partir de la propuesta de Whitworth

(47) para individuos adultos y Flórez y Wolff (24) para larvas en tercer estadío.

3.2 Aislamiento de compuestos antibacterianos

Las masas de huevos procedentes de hembras de la colonia fueron removidas del

sustrato y sumergidas en sulfito de sodio al 0,05 % agitándolas hasta individualizar los

huevos. A continuación, fueron aclarados con agua estéril y desinfectados mediante

43

Figura 3-1. Trampa para insectos adultos, cebada con hígado fresco de cerdo.

Foto. Paula Giraldo

tratamiento con formaldehido al 2,5 % durante 3 minutos, enjuagados con solución

amortiguadora PBS y sembrados en medio de cultivo artificial esterilizable compuesto por

leche en polvo, germen de trigo, levadura y Agar, según la propuesta de Zhang y

cols.(122). Los huevos fueron incubados a 26°C con el fin de obtener larvas asépticas

para los ensayos de extracción e inmunización con bacterias. La esterilidad de los

huevos sembrados en agar fue evaluada por triplicado mediante siembra de huevos en

agar LB.

Una vez los individuos alcanzaron el tercer instar (L3), fueron removidos del sustrato y

dispuestos en grupos para obtener las secreciones, excreciones ó hemolinfa Figura 3-2.

3.3 Inducción de la respuesta inmune

3.3.1 Preparación de inóculo bacteriano

La preparación de los inóculos se llevó a cabo ajustando los protocolos establecidos por

Apidianakis y cols. (123) y Bulet (124) para modelos de infección bacteriana de D.

melanogaster.

Se eligieron las cepas Escherichia coli ATCC 25922 y un aislado clínico de Bacillus

subtilis, como modelos Gram negativo y Gram positivo respectivamente, debido a que



son modelos bacterianos utilizados frecuentemente en laboratorio en razón a su fácil

mantenimiento, rápida tasa de desarrollo y requerimientos nutricionales simples

(125,126).

Se inoculó un volumen de 5 mL de caldo Luria Bertani (LB) a partir de 4 ó 5 colonias de

E. coli ó B. subtilis provenientes de cultivos en agar Luria Bertani (LB) de 24 horas de

crecimiento. El inóculo fue incubado over nigth (O/N) a 35°C y 220 r.p.m. para B. subtilis

y 37° 220 r.p.m para E. coli. Al día siguiente, se realizaron subcultivos (1:100) del inóculo,

en 5 mL de caldo LB hasta ajustar el cultivo a una turbidez de 0,05 a OD600nm. Una vez

ajustado, el cultivo se incubó por 6 horas hasta obtener una turbidez de 3,0 medida a una

OD600nm, lo cual corresponde a 4-5 109 UFC mL-1 (123).

Se centrifugó 1 mL de cada cultivo por 3 minutos a 11.000 gravedades. Se descartó el

sobrenadante y el pellet obtenido fue lavado y centrifugado nuevamente en 1 mL de

MgSO4 (10 mM), con el fin de remover restos de caldo LB. Se determinó la turbidez

OD600nm.

Finalmente mediante dilución seriada del cultivo en MgSO4 se preparó un inóculo de

OD600nm igual a 0,03 lo cual corresponde a 3-5 106 UFC mL-1, con el cual se procedió a

infectar las larvas. Esta concentración permitió tomar menos de 100 UFC por vez con

lancetas, parar inócular cada larva. Con esta cantidad de inóculo fue posible observar

infección a nivel local y la sobrevivencia de los individuos por más de 24 horas.

3.3.2 Inoculación de especímenes

Se seleccionaron grupos de larvas en estadío L3 (38 horas después de la eclosión de los

huevos aproximadamente) provenientes del cultivo aséptico. Se enjuagaron con agua

destilada y posteriormente fueron adormecidas en frio (4°C 12 min). Se inocularon las

larvas con cada cepa bacteriana, punzándolas suavemente en la región posterior, con

45

una lanceta previamente sumergida en el pellet de la bacteria de interés (E. coli ó B.

subtilis), de esta manera, las larvas fueron infectadas con un promedio de 50 UFC, lo

cual fue comprobado sembrando en agar LB muestras de la bacterias tomadas con la

lanceta. Según los protocolos consultados (123,124), cuando se utiliza la técnica de

punción para infectar insectos se recomienda que la dosis empleada sea menor a 100

UFC por individuo. Esta metodología es considerada de buena reproducibilidad, además

permite la infección del espécimen a nivel local y la valoración de los efectos de la

infección tanto a nivel local como sistémico.

La extracción de los factores antibacterianos se realizó 24 horas después de la infección

de los especímenes, tiempo suficiente para que la proliferación bacteriana induzca una

respuesta local y sistémica (127).

Figura 3-2 Grupos de tratamiento para obtención de muestras.

Larvas medio convencional

(hígado) Incubación en agua

Colección secreciones y excreciones

Larvas medio esterilizable

Colección de hemolinfa de larvas

sin inmunizar

Inmunización

Colección de Hemolinfa de larvas

inmunizadas con E.coli

Colección de Hemolinfa larvas inmunizadas con

B.subtilis

Incubación en agua Colección

secreciones y excreciones

A



3.4 Colección de secreciones y excreciones (E/S)

La colección de extractos (E/S) se realizó a partir de la metodología modificada de

Bexfield (25,26) y Kerridge (128) según la cual se removieron del cultivo larvas (L3) y se

deprivaron de alimento por 24 horas. Posteriormente fueron enjuagadas con etanol al

70% y PBS, e incubadas por 3 horas a 28°C en 6 mL de agua destilada. El líquido

sifonado fue centrifugado a 10.000 g x 5 min con el fin de precipitar contaminantes y

restos celulares. La purificación del sobrenadante se realizó utilizando filtros de celulosa

de 0,2 µm. Los ensayos de actividad antibacteriana fueron realizados como se describe

mas adelante. Los extractos que mostraron indicios de actividad, fueron liofilizados y

conservados a -20ºC para ser sometidos a ultrafiltración y posterior fraccionamiento

mediante cromatografía HPLC.

3.5 Colección de hemolinfa

Grupos de larvas fueron adormecidos a 4ºC por 15 minutos y mantenidos en hielo para

ser disectados.

Se retiraron las piezas bucales cuidadosamente con el fin de no romper las glándulas

salivales. A continuación de comprimió suavemente la región posterior del especimen

para expulsar suavemente la hemolinfa sin romper el intestino. La hemolinfa fue

colectada en tubos capilares y transferida a tubos eppendorf con buffer anticoagulante

(10% citrato de sodio pH 7, suplementado con 200 μM de feniltiourea como inhibidor de

melanización y 40 μg/ml de aprotinina como inhibidor de proteasas,(129).

Posteriormente se eliminaron los hemocitos por centrifugación a 500 x g por 7 minutos. El

sobrenadante fue llevado nuevamente a centrifugación a 20.000 x g por 15 minutos a 4ºC

con el fin de remover restos celulares y bacterias.

47

En el caso de los individuos inmunizados, la colección de hemolinfa se realizó 24 horas

después de la inmunización(123) .

3.6 Pre-purificación y fraccionamiento de exosecreciones y

hemolinfa

Con el fin de limitar el rango de búsqueda de las moléculas de interés, los extractos y la

hemolinfa fueron fraccionados mediante la técnica de ultrafiltración, utilizando filtros

Amicon® Ultra (Millipore) con puntos de corte de 10000 MWCO y 3000 MWCO,

siguiendo las instrucciones del fabricante. Esto permitió separar los compuestos menores

a 10000 y 3000 Da respectivamente, que fueron estudiados en este trabajo.

Una vez comprobada la actividad antibacteriana de las fracciones seleccionadas, se

procedió a realizar una extracción en fase sólida (SPE por sus siglas en inglés) de las

fracciones, utilizando cartuchos Sep-Pak C18 (Waters). La elución de los compuestos fue

realizada utilizando un gradiente lineal de 10% a 80% de Acetonitrilo (AcN) en agua

acidificada con ácido trifluoroacético (TFA 0,1%) y nuevamente se realizaron ensayos

para evaluar las fracciones con actividad sobre bacterias. Las fracciones activas fueron

congeladas -80ºC, liofilizadas y conservadas para ser separadas mediante RP-HPLC.

3.7 Fraccionamiento de exosecreciones y hemolinfa y

purificación por HPLC

Las fracciones activas fueron separadas mediante cromatografía líquida de alta precisión,

en fase reversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés), utilizando un cromatógrafo (Agilent

1200 series). La elección de este método se debió a su alta eficiencia en la separación

de péptidos y polipéptidos (8). Las fracciones activas obtenidas por SPE fueron

resuspendidas en 0,05% de TFA y dispuestas en una columna semipreparativa (Eclipse

XDB-C18, 9.4x250 mm; 5 µm). La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del



0,5% al 40% durante 60 minutos para los extractos y 0,5% al 60% durante 60 minutos

para las hemolinfas, mediante el registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las

muestras se recogieron manualmente a una velocidad de flujo de 1 ml min-1. Las

fracciones obtenidas fueron congeladas y secadas al vacío. Posteriormente cada fracción

fue resuspendida en 100 µl de agua desionizada, para realizar los ensayos de actividad

antibacteriana.

3.8 Ensayos de actividad antibacteriana

La actividad antibacteriana de los extractos crudos, fraccionados por tamaño y separados

en fase sólida fue evaluada mediante ensayos turbidimétricos.

La actividad antibacteriana fue evaluada en E. coli y B. subtilis, cepas con las cuales se

llevó a cabo la inoculación de las larvas. Además se incluyó la cepa de Staphylococcus

aureus ATCC 25923 debido a que es especies patógena en humanos, con conocidos

problemas de resistencia a antibióticos(15,130,131). Las cepas fueron cultivadas en

caldo LB durante toda la noche (entre 12 a 24 horas), hasta su fase logarítmica de

crecimiento. Pasado este tiempo, se midió la densidad óptica a 600 nm (DO 600 nm)

hasta alcanzar valores de absorbancia entre 0,75 y 0,8, lo cual corresponde

aproximadamente a 1x108 UFC mL-1, equivalente a 0,5 en la escala de Mcfarland (132) A

partir de estos cultivos se realizaron diluciones en caldo LB al 1% desde 1×103 hasta

1×104 UFC mL-1). La actividad antimicrobiana se evaluó utilizando placas de polipropileno

estériles de 96 pozos (Nunc), a los cuales se les agregaron 50 µl de la suspensión

bacteriana (1×103 - 1×104 UFC mL-1) y 50 µl de cada extracto. Como control positivo los

extractos o hemolinfas fueron reemplazados por Triton x-100, detergente que causa lisis

celular en bacterias (133). Las placas se incubaron a 30 y 37°C, según la requerimientos

de cada cepa, durante 24 horas en un lector de placas de ELISA acoplado a

espectrofotómetro (Multiskan GoTM Thermo) y se tomaron medidas de absorbancia a 600

49

nm, con intervalos de 1 hora. Se calculó el porcentaje de bacterias viables en el cultivo

mediante el índice de sobrevivencia (25,26) según el cual se tomaron los puntos de

densidad óptica correspondientes a la fase log del control y el valor correspondiente a

cada uno de ellos en los tratamientos y se aplicó la siguiente fórmula.

IS =DO600 tratamiento en el punto correspondiente * 100

DO600 control en fase logarítmica

La actividad antibacteriana de cada muestra obtenida mediante separación por HPLC,

fue evaluada sobre las cepas de E. coli, B. subtilis y S. aureus, mediante la técnica de

difusión de gota en doble capa, según la metodología de Cerovsky cols. (28).

Brevemente, se dispusieron 20 mL de agar LB en de cajas petri (90 mm de diámetro).

Una vez solidificado, sobre su superficie se adicionaron 2 mL de agar LB semisólido

(caldo LB + 0,5% agar), el cual fue previamente inoculado con 1x107 UFC mL-1 de cada

cepa a evaluar. De cada fracción (cada una resuspendida en 100 µl de agua ultra pura)

se adicionaron 2 µl sobre el agar semisólido. Las placas se incubaron a 37ºC por 24

horas. Se midieron los halos de inhibición de las fracciones activas.

3.9 Análisis de resultados

Los resultados se presentan en términos de la Media ± Desviación estándar de tres

repeticiones independientes con tres observaciones por cepa para los extractos crudos, y

dos repeticiones por cepa con dos observaciones, para los extractos fraccionados por

tamaño.

Para el análisis de datos se elaboró un diseño experimental completamente aleatorizado

de dos factores, con efectos fijos: Donde es el índice de

sobreviviencia la media general es el efecto del valor A (cepa) el efecto del valor B

(tipo de extracto) efecto de la interacción de ambos factores, el efecto de error

aleatorio. =3.



Se plantearon las siguientes hipótesis para cada diseño y así probar el efecto de cada

factor y el efecto de la interacción de los mismos.

Se realizaron análisis de la varianza y comparación de medias utilizando la prueba t-

student para muestras independientes, en el caso de las exosecreciones, la prueba no

paramétricas de la U de Mann-whitney para los resultados de las hemolinfas. El nivel de

significancia para todas las pruebas utilizadas fue de 95%.

Los test estadísticos fueron realizados con los paquetes IBM SPSS (IBM Corp) y Minitab

® 15.1.30.0 (© 2007 Minitab Inc).

51

4 Resultados y Discusión

4.1 Actividad antibacteriana de E/S

Mediante método turbidimétrico, se estudió la actividad antimicrobiana de las

exosecreciones de larvas alimentadas con hígado (ESH), las cuales han estado en

contacto con los microorganismos presentes en este sustrato. Esta actividad fue

comparada con la actividad encontrada en exosecreciones obtenidas a partir de larvas

alimentadas con un medio de cultivo esterilizable (ESM), donde se esperaba que las

larvas tuvieran el mínimo contacto con microorganismos.

El análisis turbidimétrico es una medida indirecta del número total de células en una

suspensión, que permite monitorear cambios en el número de células en pequeños

volúmenes. Un aumento en la DO indica generalmente un incremento en el número de

bacterias presentes en suspensión. Mientras que el decrecimiento, el aumento lento en el

tiempo con respecto a los controles ó la ausencia de cambio, podría suponer un efecto

bacteriostático, citotóxico ó que por lo menos, el número de células muertas es mayor

que el número de células viables. Así mismo, bajo ciertas circunstancias, pequeños

aumentos en la DO pueden indicar un incremento en el tamaño de las células, debido al

hinchamiento de las mismas, previo al fenómeno de lisis celular, ó cualquier otro cambio

morfológico que afecte la viabilidad de las bacterias(26,53).

En consecuencia, los resultados se presentan en términos del porcentaje de viabilidad el

cual se refiere al crecimiento de las bacterias tratadas, como un porcentaje del



crecimiento de los controles. Esto debido a que mediante el seguimiento de los cambios

en la absorbancia únicamente, no es posible determinar el efecto bactericida ó

bacteriostático de las E/S. Sin embargo la viabilidad de las bacterias fue comprobada

mediante la resiembra en agar LB después de 24 horas de tratamiento, donde se

observó crecimiento de todas las cepas.

Los cambios en la densidad óptica que se aprecian en la figura 4-1 señalan claramente

un efecto inhibitorio sobre el crecimiento bacteriano causado por las exosecreciones de

larvas expuestas a microorganismos (ESH) y en menor proporción la inhibición causada

por las exosecreciones provenientes de larvas con exposición mínima a los mismos

(ESM). Esto último al parecer se debe a la baja concentración de los componentes

antimicrobianos presentes en la muestra y no a diferencias en cuanto a los componentes

activos presentes en los dos tipos de exosecreciones. Para este escaneo preliminar de

actividad con los extractos crudos, fue necesario repetir el proceso de colección de E/S,

hasta alcanzar una concentración de 160 mg mL-1 de peso seco en el caso de ESH y 280

mg*mL-1 de ESM y así observar el efecto sobre las bacterias.

En la tabla 4-1 se observa el índice de sobrevivencia (porcentaje de células viables) de

cada cepa para los dos tratamientos, con una diferencia aproximada del 10% de

viabilidad entre los mismos. Para estimar los efectos del el tipo de cepa y tipo de

extractos sobre el índice de sobrevivencia se efectuó un análisis de varianza (tabla 4-4),

con el cual se puede constatar que tanto las ESH como las ESM tienen el mismo efecto

inhibitorio sobre las cepas estudiadas.

53

Figura 4-1 Efecto de las E/S crudos de L. eximia sobre el crecimiento bacteriano.

(ESH) extractos de larvas alimentadas con hígado 160 mg mL1; (ESM) 280 mg mL-1; extractos de larvas

alimentadas de medio de cultivo esterilizable. (A) B. subtilis; (B) S. aureus; (C) E. coli. Los cambios en la

absorbancia se utilizaron para calcular el porcentaje de bacterias viables en el cultivo mediante el índice de

sobrevivencia, tomando los puntos de densidad óptica correspondientes a la fase de crecimiento exponencial

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0 5 10 15 20

Ab

sorb

an

cia

OD

60

0n

m

Control positivo

Triton x-100

Tratamiento ESH

Tratamiento ESM

Crecimiento B.subtilis

A

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1 6 11 16 21

Ab

sorb

an

cia

O.D

60

0n

m

Crecimiento S. aureus

Tratamiento ESM

Tratamiento ESH

S. aureus tratada con

Triton x-100

B Tiempo (h)

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Ab

sorb

an

cia

O.D

60

0n

m

Crecimiento E.coli

Tratamiento ESM

Tratamiento ESH

E. coli tratada con Triton

x-100

C

Tiempo (h)

Tiempo (h)



de los controles y el valor correspondiente a cada uno de ellos en los tratamientos. IS = (DO600 tratamiento en

el punto correspondiente/ DO600 control en fase logarítmica) * 100.

Tabla 4-1 Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con ESH y ESM de L. eximia

CEPA S.I(%)

ESH

S.I (%)

ESM

B. subtilis 23 ± 4 33 ± 5

E. coli 31 ± 6 42 ± 6

S. aureus 45± 16 51 ±18

Índice de sobrevivencia (I.S) de las cepas tratadas con exosecreciones de larvas expuestas a patógenos

(ESH), 160 mg mL-1 y exosecreciones de larvas no expuestas (ESM), 280 mg mL-1. Los datos se presentan

como la media ± desviación estándar de tres repeticiones por cepa.

Los supuestos de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia fueron

comprobados a partir del gráfico QQ-plot (figura 4-2) el test de normalidad de Shapiro-

wilk y la prueba de homogeneidad de varianza de Levene tablas (4-2 y 4-3).

Tabla 4-2 Pruebas de Normalidad para la variable índice de sobrevivencia

Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. se acepta

Ho con un nivel de confianza del 95%.

Tabla 4-3 Prueba de homogeneidad de varianza

Estadístico

de Levene df1 df2 Sig.

Índice

Sobrevivencia

Se basa en la media ,002 1 34 ,968

Se basa en la mediana ,012 1 34 ,914

Las varianzas son homogéneas. (p>0.05)

Tipo extracto Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig.

Indice

Sobrevivencia

Extracto Hígado

Extracto medio

,914 18 ,102

,972 18 ,835

55

La normalidad se observa mediante el gráfico Cuartil-Cuartil (QQ-plot) con intervalo de confianza de 95%. Así

mismo, se confirmó el resultado mediante el test de normalidad de Shapiro wilk.

4-4 Análisis de la Varianza para el Índice de sobrevivencia de cepas tratadas con E/S

Origen Tipo III de suma

de cuadrados gl

Cuadrático

promedio F Sig.

Modelo corregido 3310,556a 5 662,111 5,709 ,001

Interceptación 51680,444 1 51680,444 445,649 ,000

Tipo extracto 693,444 1 693,444 5,980 ,021

Cepa 2565,389 2 1282,694 11,061 ,000

Tipo extracto * Cepa 51,722 2 25,861 ,223 ,801

Error 3479,000 30 115,967

Total 58470,000 36

Total corregido 6789,556 35

a. R al cuadrado = ,488 (R al cuadrado ajustada = ,402)

Existen diferencias entre los Índices de sobrevivencia de las cepas tratadas (p< 0,05), y diferencias entre los

índices de sobrevivencia de los tipos de extracto (p< 0,05). No hay un efecto significativo entre la interacción

cepa-tipo de extracto (p>0,05) por lo tanto, la influencia del tipo de extracto sobre el índice de sobrevivencia

es el mismo entre las cepas.

La detección de la actividad antibacteriana de las E/S fue un proceso complejo que

requirió ensayar diferentes metodologías para detectar la inhibición del crecimiento,

concentraciones de extracto y caldos de cultivo. Siendo en nuestro caso, el método

turbidimétrico el más sensible.

Figura 4-2 Cuartil-Cuartil (QQ-plot)



La actividad antibacteriana no solo se vio influenciada por el tipo de microorganismo, sino

también por la concentración de E/S utilizada. En un estudio similar sobre

exosecreciones de larvas de L. sericata (44), fueron necesarias concentraciones de

extracto crudo del orden de 500 mg mL-1 para observar actividad sobre E. coli y 250 mg

mL-1 sobre M. luteus (medida en mm2, mediante la técnica de difusión en agar). Mientras

que Cazander y cols. (134), registraron la inhibición de la formación de biofilm por

Pseudomonas aeruginosa de hasta el 100%, con concentraciones entre 10 y 30 µg mL-1

(en volúmenes de reacción de 200 µl), dependiendo del tipo de material sobre el que se

formaba el biofilm.

Trabajos como los de Bexfield y cols. (25,26) y Thomas et al. (53), en los cuales se

demostró la actividad de E/S de larvas de L. sericata, mediante turbidimetría, no

describen las concentraciones utilizadas. Así mismo, otros autores no solo, no han

detectado actividad antibacteriana con el método turbidimétrico sino que por el contrario

observaron un incremento en la viabilidad de bacterias como S. aureus de hasta el 600%

(43). Con respecto a esta observación, es importante resaltar que la investigación sobre

las propiedades de las exosecreciones de larvas de Calliphoridae, en el contexto de la

terapia larval, han permitido establecer la presencia de moléculas que inhiben la

respuesta inflamatoria de fagocitos, inductores de remodelamiento de matriz extracelular

e inductores de crecimiento de células endoteliales humanas y fibroblastos(38,41), que

podrían incidir en el crecimiento bacteriano.

Después de evaluar los extractos crudos, se realizó una extracción en fase sólida (SPE)

como se describe en la sección más atrás3.6, con el fin de concentrar las muestras y

separarlas según su polaridad. Se colectaron cinco muestras de cada tipo de extracto,

según fueron eluidas con 20, 40, 60, 80 y 100 % de AcN. Se evaluó su actividad

antimicrobiana por turbidimetría con dos repeticiones. Se encontró actividad

antibacteriana sobre E. coli, S. aureus y B.subtilis en las fracciones eluidas con 20 y 40%

57

de AcN. Estas fracciones fueron mezcladas y filtradas para separarlas nuevamente

según su tamaño molecular utilizando filtros con punto de corte entre 3 y 10 kDa y <3

kDa.

En la Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia se presenta el

esquema de cajas y bigotes, donde se puede observar la variabilidad del indice de

sobreviviencia de las bacterias tratadas con las diferentes fracciones. En las fracciones

de entre 3-10 kDa y aquellas de peso inferior a 3 kDa, provenientes de ambos tipos de

dieta, se encontró un porcentaje de viabilidad cercano al 50%, siendo las bacterias gram

positivas más susceptibles. Las bacterias tratadas con los extractos de tamaño superior

a 10 kDa fueron viables en más del 100%, por lo tanto no fueron estudiadas en

adelante.

Estas observaciones fueron corroboradas a través de la aplicación de la prueba de t.-

student para muestras independientes. De esta manera, fueron comparados los

promedios de la viabilidad bacteriana de cada cepa según fueron expuestas a extractos

de diferente peso y extracto ESH –ESM. El resultado de cada prueba se resume en la

tabla. El detalle del cálculo estadístico se encuentra en el anexo A.

4-5 Comparación de medias entre las fracciones según tipo de extracto

Cepa Fracción p- valor

B. sutilis Mayor 10 kDa 0.078

B. sutilis 3-10 kDa 0,023

B. subtilis Menor 3 kDa 0,035

E. coli Mayor 10 kDa 0,230

E. coli 3-10 kDa 0,137

E. coli Menor 3 kDa 0,031

S. aureus Mayor 10 kDa 0,517

S. aureus 3-10 kDa 0,064

S. aureus Menor 3 kDa 0,000

H0= No hay diferencia en las medias de indice de sobrevivencia; HA= Existen diferencias entre las medias del

indice de sobrevivencia. Se rechaza H0 si p> α (0,05).



El indice de sobrevivencia se refiere al porcentaje de bacterias viables en cada tratamiento. Los extremos

corresponden a los valores máximo y minimo del indice de sobreviviencia. Fracciones obtenidas de

exosecreciones de larvas alimentadas con hígado de cerdo (>10 kDa-H, 3.10 kDa-H, <3 kDa-H). Fracciones

obtenidas de larvas aliemntadas con dieta esterilizable ((>10 kDa-M, 3.10 kDa-M, <3 kDa-M).

Los extractos activos fueron fraccionados utilizando un método cromotagráfico como se

describe en la sección 3.7. Se evaluó la actividad antimicrobiana de cada fracción

mediante la técnica de difusión de gota en agar de doble capa. Esta prueba cualitativa

permite visualizar las fracciones activas utilizando cantidades muy pequeñas de muestra.

En la tabla 4-6, se presentan los porcentajes de acetonitrilo a los cuales fueron

colectadas las fracciones separadas por HPLC y que fueron activas. La actividad se

Figura 4-3 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas con fracciones de

exosecreciones

59

observa como el diámetro del halo de inhibición de crecimiento para cada tipo de

bacteria.

En la fracción 3-10 kDa se encontraron tres fracciones una de las cuales fue capaz de

inhibir el crecimiento de las tres cepas. Mientras que en la fracción menor a 3 kDa se

encontró una sola fracción la cual fue activa sobre las tres cepas, siendo el halo de

inhibición de S. aureus el de mayor tamaño.

Tabla 4-6 Fracciones de E/S con actividad inhibitoria, separadas por HPLC

La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del 0,5% al 40% durante 60 minutos, mediante el

registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las muestras se recogieron manualmente a una velocidad

de flujo de 1 ml min-1. La tabla presenta el porcentaje de AcN al cual fue colectada la fracción activa, así

como el tamaño en mm del halo de inhibición formado por la fracción, medido a las 24 horas.

Este es el primer trabajo realizado sobre la actividad antibacteriana de exosecreciones de

L. eximia. Estudios similares realizados por diversos investigadores sobre E/S de L.

sericata, presumen la presencia de componentes nutritivos adicionales, que dificultan la

evaluación de los componentes antibacterianos. En por lo tanto, la estimación de la

actividad antibacteriana de E/S realizada en trabajos previos, donde se utilizan diferentes

concentraciones, test de actividad medios de cultivo y procedencia de las exosecreciones

(larvas estériles y no estériles) ha contribuido a la variación en los resultados reportados

a la fecha(25,26,28,43,44,53,128). Nuestros hallazgos se acercan a lo reportado por

CEPA

ESH 3-10 kDa ESH <3 kDa

% AcN Halo inhibición

mm2 % AcN

Halo inhibición

mm2

B. subtilis

7-9

12-13.7

30-34

3

4

3

9-11

3

S. aureus 7-9

30-34

2

3 9-11 4

E. coli 7-9 4 9-11 2



Bexfield y cols. (25,26), quienes evaluaron la actividad antibacteriana de fracciones

moleculares inferiores a 500 Da, encontrando porcentajes de inhibición de crecimiento de

B. subtilis cercanos al 100%, efecto bacteriostático sobre S. aureus con un porcentaje de

inhibición de alrededor del 70% y la inducción de un estado viable pero no cultivable de

E. coli, con índice de sobrevivencia del 30%. Mientras que en nuestro estudio sobre la

fracción menor a 3 kDa, se encontraron porcentajes de inhibición entre el 50 y 90%

según la procedencia de las exosecreciones.

Así mismo, las fracciones separadas por HPLC que fueron activas en nuestro trabajo, se

acercan a aquellas obtenidas por Kruglikova (44), quien determinó la actividad de

fracciones de exosecreciones con el método de difusión en agar utilizando como modelo

Gram positivo M. luteus y E. coli como modelo Gram negativo y una cepa MRSA,

observando actividad sobre M. luteus en las fracciones que corresponden a 30 y 31% de

AcN y 32 a 34 % en E. coli. Con respecto a la cepa MRSA, observó actividad en las

fracciones menos hidrofóbicas que correspondieron a porcentajes entre 3 y 5 % de AcN.

4.2 Actividad antibacteriana en hemolinfa

Se evaluó la actividad antibacteriana de la hemolinfa extraída de larvas sin inmunizar, así

como de larvas inmunizadas con E. coli y B. subtilis. Se realizaron test de normalidad y

homogeneidad de varianzas (tablas 4-8 y 4-9). Se determinó que los datos no cumplen

con el supuesto de homocedasticidad, se llevó a la prueba no paramétricas de Mann-

Whitney para la comparación entre las medias de dos grupos independientes.

La actividad antibacteriana de la hemolinfa fue significativamente mayor que la

encontrada en las exosecreciones. La actividad de las E/S fue detectada solo con

concentraciones superiores a 120 mg mL-1 de peso seco, mientras que para la hemolinfa

61

procedente de larvas sin inmunizar fue de 1.3 mg mL-1 y entre 0.7 y 1 mg mL1 para las

hemolinfas procedentes de larvas inmunizadas.

Tabla 4-7 Test de normalidad de Shapiro-wilk

Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. se acepta


Hemolinfa Shapiro-Wilk

Estadístico gl Sig.

Sin inmunizar ,962 18 ,637

Inmunizada B.

subtilis ,883 18 ,029

Inmunizada E. coli ,922 18 ,141

Figura 4-4 Q-Q plot para el índice de sobreviviencia de bacterias tratadas con hemolinfas de L. eximia

Hipótesis Ho: los errores tienen distribución normal y H1: los errores no tienen distribución normal. No se acepta




Tabla 4-8 Prueba de homogeneidad de varianza de Levene

Estadístico de

Levene df1 df2 Sig.

Indicesobreviviencia Se basa en la media 11,709 2 51 ,000

Se basa en la mediana 5,692 2 51 ,006

Coa significancia del 95%, se rechaza la hipótesis nula. Las varianzas no son homogéneas.

En la figura 4-5 se puede apreciar los cambios en la DO de los cultivos bacterianos con

los diferentes tratamientos. La fase de crecimiento exponencial de las bacterias tratadas

con hemolinfa de larvas sin retar, se retrasó con respecto al crecimiento de los controles

según lo esperado, debido a la acción de componentes antimicrobianos que hacen parte

de la inmunidad básica de las larvas. De igual manera, al comparar los porcentajes de

viabilidad de los cultivos tratados con hemolinfa proveniente de larvas inoculadas, se

observa una disminución en la viabilidad. La hemolinfa base inhibió el crecimiento de E.

coli en un 35% (índice de sobrevivencia 65%) mientras que la hemolinfa de larvas

retadas con E. coli provocó un aumento en el porcentaje de inhibición de hasta 77% (1-%

sobrevivencia). Así mismo el porcentaje de inhibición de E. coli alcanzó el 70 % cuando

fue tratada con hemolinfa que provenía de larvas retadas con B. subtilis. En cuanto a las

bacterias gram positivas, la sobrevivencia de B. subtilis paso de 52% a 24% y 13% en el

tratamiento con hemolinfa retada con E. coli ó B. subtilis respectivamente. S. aureus, al

contrario de lo esperado obtuvo los niveles más bajos de de sobrevivencia (8%) cuando

se sometió a tratamiento con hemolinfa de larvas retadas con E. coli y 20% con la

hemolinfa de larvas retada con B. subtilis. El diagrama de cajas y bigotes de la figur, pa

4-6 proporciona un panorama general de esta la variación. Los extremos de las cajas son

los valores mínimos y máximos del Índice de sobrevivencia.

63

Para estimar si tales observaciones son significativas, se realizó la prueba de Mann-

Whitney contrastando los porcentajes de viabilidad obtenidos a partir del tratamiento de

hemolinfa base Vs los tratamientos de hemolinfa retada, para cada cepa tabla 4-9

Figura 4-5 Efecto de las hemolinfas sin fraccionar sobre tres cepas bacterianas.

Cepas (A) B. subtilis, (B) S. aureus, (C) E. coli.

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

1 6 11 16 21

Ab

sorb

an

cia

O.D

60

0n

m Crecimiento B. subtilis

Sin inmunizar

Inmunización E.coli

Inmunización B. subtilis

B. subtilis tratada con

Triton X-100

Tiempo (h)

-0.05

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Ab

sorb

an

cia

O.D

60

0n

m

Crecimiento S. aureus

Sin inmunizar

Inmunizada E. coli

Inmunizada B. subtilis

S. aureus tratada con Triton

x-100

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

1 6 11 16 22

Ab

sorb

an

cia

O.D

60

0n

m

Crecimiento E. coli

Sin inmunizar

Inmunización E. coli

Inmunización B.

subtilis

Control positivo

triton x-100

A

B

C

Tiempo (h)

Tiempo (h)



Figura 4-6 Diagrama de cajas y bigotes de los índices de viabilidad de bacterias tratadas con diferentes

clases de hemolinfa de L. eximia.

Tabla 4-9 Comparación de Índices de sobrevivencia entre las cepas tratadas con diferentes hemolinfas

procedentes de L. eximia.

Cepa tratada Muestras comparadas p-valor

B. subtilis

Hemolinfa + B. subtilis – Hemolinfa sin inmunizar 0,0027

Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa + B. subtilis 0,0030

Hemolinfa + E.coli - Hemolinfa sin inmunizar 0,0004

E. coli




S. aureus




Se utilizó el test de Mann-whitney para muestras independientes, bajo las hipótesis: H0= No hay diferencia

entre las medianas los de índices de sobrevivencia; HA= Existen diferencias entre las medianas los índices

de sobrevivencia. Se rechaza H0 si p> α (0,05). Existen diferencias estadísticamente significativas entre los

índices de sobrevivencia de las cepas, excepto para E. coli, donde el índice de sobrevivencia no fue

significativamente diferente cuando se trató con hemolinfa procedente de larvas inmunizadas tanto con B.

subtilis como con E. coli.

65

Se realizó una extracción en fase sólida de cada tipo de hemolinfa, utilizando un

gradiente de elución de AcN de 20 a 100%. Las muestras fueron liofilizadas y

resuspendidas en agua ultra pura para los ensayos de actividad. Las fracciones eluidas

con 20, 40 y 60% de AcN presentaron actividad antimicrobiana sobre las tres cepas. Las

fracciones fueron reunidas y sometidas a ultrafiltración según se describió previamente,

obteniendo tres grupos de fracciones, mayores a 10 kDa, entre 3-10 kDa y menores a 3

kDa.

En la figura 4-7 puede observarse que los factores con actividad antimicrobiana que se

circulan en la hemolinfa de L. eximia, tienen pesos moleculares menores a 10 kDa, y son

activos tanto para el modelo Gram positivo como para el modelo Gram negativo

utilizados en este estudio. La mayor actividad se presenta en la fracción 10-3 kDa. Rango

en el cual según la literatura se encuentran péptidos antimicrobianos (10,28,29,44,79).

Los extractos activos con pesos moleculares entre 3-10 kDa y 3 kDa fueron fraccionados

utilizando un método cromotagráfico como se describe en la sección 3.7 y se evaluó la

actividad antimicrobiana de cada fracción mediante la técnica de difusión de gota en agar

de doble capa. En la tabla 4-10, se presenta los porcentajes de AcN a los cuales fueron

colectadas las fracciones separadas por HPLC y que fueron activas. La actividad se

observa como el diámetro del halo de inhibición de crecimiento para cada tipo de

bacteria.

Las fracciones obtenidas por HPLC indican la presencia de moléculas antimicrobianas en

un amplio rango de hidrófóbicidad. Los compuestos en la fracción menor a 3 kDa, son

poco hidrofóbicas, con rangos de elución entre 3 y 8 % de AcN, mientras que la fracción

de entre 3-10 kDa, contiene compuestos de mayor hidrofobicidad, con halos de inhibición

de mayor tamaño.



Figura 4-7 Diagrama de cajas y bigotes del Índice de sobrevivencia de bacterias tratadas con hemolinfa

fraccionada de L. eximia.

Los extremos corresponden a los valores máximo y minimo del indice de sobreviviencia de bacterias tratadas

con fracciones de hemolinfa de larvar retadas con B. subtilis ( ) E. coli ( ), ó sin inmunizar ( ).

Con respecto a la diferencia en la presencia de compuestos inducidos por la infección

diferencial de bacterias Gram positivas o Gram negativas, podemos decir que aunque las

bacterias Gram positivas fueron más susceptibles a la hemolinfa, el número de fracciones

activas sobre B. subtilis fue mayor que el numero de fracciones activas sobre S. aureus.

Sin embargo, una fracción eluída entre el 30-34% del gradiente de AcN, parece ser un

factor común tanto en la hemolinfa base asi como en la hemolinfa retada con el Gram

modelo positivo y en la fracción 3-10 kDa de las exosecreciones obtenidas de larvas

alimentadas con hígado. Este hallazgo es de particular interés debido a que se acerca en

cuanto al rango de tamaño y porcentaje de hidrofobicidad reportado para los péptidos

Lucifensina I y II (28,29) que fueron aislados de Lucilia sericata y Lucila cuprina

respectivamente.

67

En cuanto a la hemolinfa proveniente de larvas expuestas a E. coli fue posible observar

actividad en una fracción eluida con 47% de AcN, que no fue encontrada en la hemolinfa

sin inmunizar. Así mismo, al comparar las fracciones activas entre hemolinfas y E/S, hay

coincidencia en cuanto a la presencia de moléculas poco hidrofóbicas, con actividad

sobre S. aureus (tabla 4-10).

Estos hallazgos coinciden con lo reportado con Kruglikova (44), quien encontró

fracciones activas a partir de hemolinfa inmunizada con una mezcla de bacterias Gram+/-

en las fracciones eluidas entre 30 y 33 % de AcN contra M. luteus y 28-38 % contra E.

coli.

Los resultados presentados en este estudio son un ejemplo del potencial bioprospectivo

que representan los insectos. Y en particular de las larvas de Calliphoridae. Otros

estudios sobre hemolinfa de larvas de califóridos revelan la presencia de péptidos

antimicrobianos del tipo defensinas (28,29) con actividad sobre bacterias Gram positivas.

Cecropinas, diptericinas y péptidos ricos en prolina con actividad sobre gram negativas

(79), los cuales están siendo utilizados para el desarrollo de productos farmacéuticos

(45,79). Asi mismo se han encontrado moléculas con actividad antitumoral y antiviral

como por ejemplo aloferonas (Calliphora vicina), las cuales han sido utilizadas para el

desarrollo un prototipos de vacunas contra el herpes genital y la hepatitis B (11), (Federal

Drug Application Guide, 5 edición, Moscú, 2004, sección 20.1.2.2.3.2).



Tabla 4-10 Fracciones activas de hemolinfa de L. eximia, separadas por HPLC.

La elución se realizó con un gradiente lineal de AcN del 0,5% al 60% durante 60 minutos, mediante el

registro de cambios en la absorbancia a 220 nm. Las muestras se recogieron manualmente a una velocidad

de flujo de 1 ml min-1. La tabla presenta el porcentaje de AcN al cual fue colectada la fracción activa, así

como el tamaño en mm del halo de inhibición formado por la fracción, medido a las 24 horas.

CEPA

3-10 kDa

Sin inmunizar

3-10 kDa


3-10 kDa



mm % AcN

Halo inhibición

mm % AcN

Halo

inhibición

mm

B. subtilis

40

30- 33

27-29

3

3

4

41

3

3

5

16-18

43

11-20

28-31

4

7

7,5

3

S. aureus 30-32

11-20

2

3

4

12-14

5

3

4-7

15

4

3

E. coli 12-14 4 47

5-8

3.8

5 15 2

CEPA

<3 kDa

Sin inmunizar

<3 kDa


<3 kDa



mm % AcN

Halo inhibición

mm % AcN

Halo

inhibición

mm

B. subtilis 4-6 3 3-8 4 28 2

S. aureus 4-5 2 6-7 2 6-8 3

E. coli 6-7 2 4-7 2 3-5 2

69

5 Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

Se encontraron dos fracciones con actividad antibacteriana en exosecreciones de larvas

expuestas a patógenos, en un rango de pesos entre 3-10 kDa y una fracción con un peso

menor a 3 kDa.

Las diferencias en cuanto a la inhibición del crecimiento de las bacterias tratadas con E/S

expuestas y sin exposición a patógenos, se debieron a la concentración de extractos

utilizados en los ensayos y no diferencias en la composición de las mismas. Por lo tanto,

es posible sugerir que la actividad bacteriostática fue una consecuencia de la baja

concentración de las moléculas con actividad.

Se obtuvieron ocho fracciones con actividad antimicrobiana en la hemolinfa proveniente

de larvas inoculadas y sin inocular con bacterias, siendo la hemolinfa proveniente de

larvas inoculadas más activa sobre las cepas estudiadas.

La metodología utilizada para la inoculación de larvas con E. coli y B. subtilis permitió

obtener la hemolinfa suficiente inhibir el crecimiento de las bacterias y encontrar

diferencias con respecto a la hemolinfa base. Sin embargo, es necesario utilizar una gran

cantidad de individuos para colectar cantidades suficientes de cada de uno de los

compuestos y así poder determinar actividad biológica in vitro.



Fue posible detectar actividad sobre E. coli de una fracción eluida con 47% de

proveniente de hemolinfa inmunizada con esta cepa y que no fue detectada en la

hemolinfa sin inmunizar.

Al comparar las fracciones activas entre hemolinfas y E/S, hay coincidencia en cuanto a

la presencia de moléculas poco hidrofóbicas, con actividad sobre S. aureus.

Una fracción eluida entre 30-34% de AcN, parece ser un factor común tanto en la

hemolinfa base asi como en la hemolinfa retada con el Gram modelo positivo, y en la

fracción 3-10 kDa de las exosecreciones obtenidas de larvas alimentadas con hígado.

Esta fracción se acerca en cuanto al rango de tamaño y porcentaje de hidrofobicidad de

péptidos aislados de otras especies del género Lucilia.

Las cepas Gram positivas fueron más sensibles a la exposición tanto de hemolinfa como

de E/S provenientes de larvas de L. eximia de tercer estadio.

5.2 Recomendaciones

Los hallazgos de este estudio corresponden a una búsqueda preliminar de compuestos

antibacterianos en L. eximia. El paso siguiente consiste en la purificación e identificación

de los compuestos que se encuentran en las fracciones que demostraron actividad

antimicrobiana, mediante HPLC y espectrometría de masas.

Finalmente, como se pudo determinar a partir de la revisión bibliográfica, es posible

encontrar moléculas con otro tipo de actividad biológica en las muestras obtenidas y por

lo tanto es deseable diseñar experimentos para la evaluación de actividad sobre otro tipo

de organismos como parásitos, hongos e incluso virus y células tumorales.

71

Anexo A

A. Anexo

B. subtilis

Prueba de Levene de calidad de varianzas prueba t para la igualdad de medias

F Sig. t gl Sig. (bilateral) Diferencia de medias

Diferencia de error estándar

95% de intervalo de confianza de la diferencia

Inferior Superior

<3 kDa ,329 ,587 -2,126 6 ,078 -11,50 5,40 -24,73 1,73

3-10 kDa ,988 ,359 -3,044 6 ,023 -14,750 4,845 -26,60 -2,89

>10 kDa ,007 ,936 -2,713 6 ,035 -20,250 7,46 -38,51 -1,98

E. coli

Prueba de Levene de calidad de varianzas prueba t para la igualdad de medias




Inferior Superior

<3 kDa 2,436 ,170 -1,336 6 ,230 -8,00 5,98 -22,64 6,64

3-10 kDa ,283 ,614 -1,715 6 ,137 -9,75 5,68 -23,65 4,15

>10 kDa 4,457 ,079 2,796 6 ,031 61,00 21,81 7,614 114,38

S. aureus

Prueba de Levene de calidad de varianzas

prueba t para la igualdad de medias




Inferior Superior

<3 kDa ,020 ,0892 -8,723 6 ,000 -24,25 2.78 -31,05 -17,44

3-10 kDa 4,109 ,089 -2,268 6 ,064 -16,50 7,27 -34,29 1,29

>10 kDa ,476 ,516 1,183 6 ,281 13,50 11,40 -14,41 41,41

La hipótesis nula de la prueba de Levene es la homoscedasticidad (igualdad de varianzas). La significación estadística en todas las pruebas indicó homogeneidad de varianzas p> 0,05.

72

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