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Determinación de Tetrahidrocannabinol y Cocaína en muestras de sangre seca. Su posible aplicación en el tráfico
rodado
Grupo de investigación
Servicio de Toxicología Forense
Instituto of Ciencias Forenses
Universidad of Santiago de Compostela
Prof. Manuel López-RivadullaCatedrático de Toxicología
MARCO LEGAL
• Artículo 14 Bebidas alcohólicas y drogas • 1. No puede circular por las vías objeto de esta ley el conductor de cualquier vehículo con tasas de alcohol
superiores a las que reglamentariamente se determine.• Tampoco puede hacerlo el conductor de cualquier vehículo con presencia de drogas en el organismo, de
las que se excluyen aquellas sustancias que se utilicen bajo prescripción facultativa y con una finalidadterapéutica, siempre que se esté en condiciones de utilizar el vehículo conforme a la obligación de diligencia,precaución y no distracción establecida en el artículo 10.
• 2. El conductor de un vehículo está obligado a someterse a las pruebas para la detección de alcoholo de la presencia de drogas en el organismo, que se practicarán por los agentes de la autoridadencargados de la vigilancia del tráfico en el ejercicio de las funciones que tienen encomendadas. Igualmentequedan obligados los demás usuarios de la vía cuando se hallen implicados en un accidente de tráfico o hayancometido una infracción conforme a lo tipificado en esta ley.
• 3. Las pruebas para la detección de alcohol consistirán en la verificación del aire espirado mediante dispositivosautorizados, y para la detección de la presencia de drogas en el organismo, en una prueba salivalmediante un dispositivo autorizado y en un posterior análisis de una muestra salival en cantidadsuficiente.
• No obstante, cuando existan razones justificadas que impidan realizar estas pruebas, se podrá ordenar elreconocimiento médico del sujeto o la realización de los análisis clínicos que los facultativos del centro sanitarioal que sea trasladado estimen más adecuados.
• 4. El procedimiento, las condiciones y los términos en que se realizarán las pruebas para la detección de alcoholo de drogas se determinarán reglamentariamente.
• 5. A efectos de contraste, a petición del interesado, se podrán repetir las pruebas para ladetección de alcohol o de drogas, que consistirán preferentemente en análisis de sangre, salvocausas excepcionales debidamente justificadas. Cuando la prueba de contraste arroje un resultado positivo seráabonada por el interesado.
Real Decreto Legislativo 6/2015, de 30 de octubre, por el que se aprueba el texto refundido de la Ley sobre Tráfico, Circulación de Vehículos a Motor y Seguridad Vial
MARCO LEGAL• CONTROLES DE DROGAS ILICITAS EN
SALIVA CON DISPOSITIVOS INDICIARIOSObligación de obtener una segunda muestra desaliva que confirme el resultado del test.
Sanción penal Sanción administrativa
Tolerancia cero“Bajo influencia”
MARCO LEGAL
• POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTORPUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DECONTRASTE EN SANGRE
Vía penal Vía administrativa
Tolerancia cero“Bajo influencia”
�LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORESCUANTITATIVOS EN LA SALIVA ESCOMPLICADA
� Gran variabilidad del “producto” en el mercado
� Gran variabilidad en la respuesta de los consumidores� Consumidores habituales� Consumidores esporádicos
LA TOXICOLOGIA A DIA DE HOYNO TIENE UNA RESPUESTACLARA A ESTE PROBLEMA
�LA INTERPRETACIÓN DE LOS VALORESCUANTITATIVOS EN LA SALIVA ESCOMPLICADA
� Menor importancia en la vía administrativa� Presencia de drogas en el organismo
� Importante en la vía penal� “Bajo Influencia”
PREVALENCIA DEL USO DE DROGAS EN CONDUCTORES
• ESULTADOS PROYECTO DRUID (2008-2010
Estudio de prevalencia en España, Principales Resultados
Porcentaje de casos positivos en sustancias/agrupac iones de sustancias
THC Cocaína Benzodiacepinas Anfetaminas Opiáceos
Medicamentos
(codeína, metadona)
Opiáceos
Ilícitos
Total Total (N=3302)
7,69 3,51 1,60 0,21 0,45 0,41
Sexo Hombre (N=2690)
9,11 4,09 1,64 0,19 0,56 0,00
Mujer (N=612)
1,47 0,98 1,47 0,33 0,00 0,33
Rango edad
18-24 años (N=708)
15,11 3,53 0,28 0,57 0,00 0,00
25-34 años (N=1144)
9,35 4,55 0,70 0,17 0,52 0,26
35-49 años (N=995)
3,62 3,62 2,21 0,00 0,80 0,70
> 50 años (N=414)
0,24 0,72 4,83 0,00 0,00 0,00
MARCO LEGAL
• POSIBILIDAD DE QUE EL CONDUCTORPUEDA REALIZAR UNA PRUEBA DECONTRASTE EN SANGRE
Requiere que la persona que lo solicite acuda a un Centro hospitalario
Problemas:Transcurre un tiempo entre el hecho acaecido y la llegada al hospital
Se producen los fenómenos de biotransformación en el organismo, quecontribuyen a eliminar las sustancias a las que se ha estado expuesto, oconvertirlas en otras.Puede desaparecer la sustancia, o puede transformase en otra
SANGRE¿Por qué se utiliza como muestra biológica?
�La concentración de la sustancia analizada secorrelaciona con el efecto producido
�Corta ventana de detección, informa de consumo reciente
INCONVENIENTES:�Adición de conservantes�Composición compleja�Técnica invasiva
Gotas secas de sangre (DBS)� Muestras de sangre recogidas mediante punción capilar sobre una tarjeta.
VENTAJAS:� Toma de muestras sencilla y no invasiva
� Fácil transporte y almacenamiento
� Mayor estabilidad
� Menor riesgo biológico
� Obtención inmediata
Gotas secas de sangre (DBS)
Aplicaciones de las DBS�Metabolopatías
�Estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos
�Monitorización terapéutica de fármacos
�ANÁLISIS TOXICOLÓGICO�Tratamientos de deshabituación
�Detección de drogas en el trabajo
�Controles en carretera
ObjetivosEl desarrollo y validación de un método analítico para ladeterminación de Δ9-tetrahidrocannabinol (THC),cannabidiol (CBD) y cannabinol (CBN) en gotas secas desangre mediante cromatografía líquida asociada aespectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
El desarrollo y validación de un método analítico para la
determinación de Cocaína y sus metabolitos en gotas
secas de sangre mediante cromatografía líquida asociada
a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).
Preparación de la muestra
Adición de 50 µl de sangre en DMScard Agilent Bond Elut
Se dejan secar 24h a Tª ambiente (20-25 ºC)
Extracción
Cortamos la gota seca yse añaden:2 mL metanol:NH4OH
(95:5) +
25 μL PI a 0,1 ng/mL
Agitación horizontal durante 30 min a 280 rpm
En corriente de N2
a 35ºC.
75 μL ÁcidoFórmico 0,1%:
Acetonitrilo (90:10)
10 min4500 rpm
EXTRACCIÓN EVAPORACIÓN
RECONSTITUCIÓNCENTRIFUGACIÓN
Recogida del eluyente
CROMATOGRAFÍA
Inyección de 35 µl en el LC-MS/MS
Extracción
Condiciones de la cromatografía líquida
Atlantis T3 3 µm 2,1x50 mm (Waters), 35°C
Tiempo (min)
% Ácido fórmico 0,1% en agua
% ACN Flujo (mL/min)
0.0 90 10 0,3
1.0 90 10 0,3
5.5 40 60 0,3
5.6 10 90 0,3
6.4 10 90 0,3
6.5 90 10 0,3
9.0 90 10 0,3
Condiciones de la espectrometría de masas Quattro Micro™ API ESCI (Waters)
Electrospray en modo positivo (ESI+)
Parámetro Valor
Voltaje del capilar 5,00 kV
Temperatura de la fuente
150ºC
Temperatura del gas de desolvatación
400ºC
Flujo del gas de desolvatación
800 L/h
Flujo del gas del cono 60 L/h
Límite de cuantificación (LOQ)
Concentración más baja del analito que se puedecuantificar con adecuada impresión (%CV≤20%) yexactitud (80-120%), y con relación S/N≥10
• Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de larecta
1 ng/ml
Cocaína
Aplicación a casos reales
Se analizaron 7 muestras reales, previamentepositivas a cocaína y metabolitos
Cocaína (ng/mL) BE(ng/mL) Cocaetileno(ng/mL)
Casos Sangre total DBSSangre total
DBS Sangre total DBS
1 0 0 231,5 195,4 - 0
2 32,6 40,3 959,3 1103,1 - 43,5
3 2,3 0 402 441,96 - 0
4 0 0 159 200,4 - 0
5 0 0 1073,6 1120,2 - 0
6 0 0 13,4 16,2 - 0
7 0 0 97,9 105,7 - 0
R² = 0,9926
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 200 400 600 800 1000 1200
DB
S (
ng
/ml)
Sangre total (ng/ml)
Relación concentración BE
Límite de cuantificación (LOQ)
Concentración más baja del analito que se puedecuantificar con adecuada impresión (%CV≤20%) yexactitud (80-120%), y con relación S/N≥10
• Se estudiaron 5 replicados al valor mas bajo de larecta
50 ng/ml
THC
Aplicación a casos reales
�El método se aplicó a 9 muestras reales positivas
recogidas entre 2013 y 2015.
Resultado:� No se obtuvo ningún resultado positivo
en ninguna de las muestras reales
analizadas.
Muestra Sangre total (ng/ml)
1 1,2
2 2,8
3 1,1
4 2,7
5 1
6 1
7 2,8
8 10,2
9 15,7
Conclusiones
�Se ha desarrollado un método analítico para la determinacióncocaína y dos de sus metabolitos en muestras de sangreobtenidas por DBS y posterior análisis mediante cromatografíalíquida acoplada a espectrometría de masas.
�Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sidosatisfactoriamente validado, demostrando ser un método sensible(LOQ = 1ng/mL) y específico.,
�Su utilidad en los casos reales también fue demostrada, pueslasconcentraciones encontradas mediante las DBS fueron muysimilares a las determinadas empleando métodos rutinariosparael análisis de muestras biológicas de sangre total.
�El método analítico propuesto para la determinación de cocaínay metabolitos mediante DBS ofrece una alternativa claramenteaceptable y con unos resultados prometedores.
Conclusiones
�Se ha desarrollado un método analítico para ladeterminación TETRAHIDROCANNABINOL , CBNYCBD, en muestras de sangre obtenidas por DBS y posterioranálisis mediante cromatografía líquida acoplada aespectrometría de masas.
�Siguiendo los criterios establecidos, el método ha sidosatisfactoriamente validado, demostrando ser un métodoespecífico pero poco sensible (LOQ= 50ng/mL)
�Por esta razón no hemos podido comprobar su efectividad,aunque con nuevos equipos más sensibles podría lograrse.
PREVISONES DE FUTURO
� IMPLEMENTAR MARCO JURIDICO QUE PERMITA LAOBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE SANGRE SECA.
�La voluntariedad del solicitante�La rapidez en su obtención que evite la desaparición de la droga.
� SUGERIR, CON CRITERIOS TOXICOLOGICOS LOS VALORESDE UNOS NIVELES EN SANGRE, QUE ESTEN CLARAMENTERELACIONADOS CON LA “INFLUENCIA” (VÍA PENAL).
� MANTENER EL CRITERIO DE TOLERANCIA CERO PARA LAVIA ADMINISTRATIVA, HOMOGENEIZANDO LOS VALORES DECUTOFF DE LOS DISPOSITIVOS SALIVARES UTILIZADOS.
¡Gracias por su atención!