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Departamento
de Engenharia Química e Biológica
Determinação de Óleos e Gorduras e
Hidrocarbonetos Totais, por Espectrofotometria de
Infravermelho por Transformada de Fourier, com
recurso ao solvente de extração tetracloroetileno
Relatório de Estágio apresentado para a obtenção do grau de Mestre
em Processos Químicos e Biológicos
Autor
Alain Lopes da Costa
Orientadores
Doutor Luís Miguel Moura Neves de Castro
Instituto Superior de Engenharia de Coimbra
Drª. Elsa Cláudia Correia Barracho
CESAB- Centro de Serviços do Ambiente.
Coimbra, Dezembro, 2012
ii
iii
“O débil, acovardado, indeciso e servil não conhece,
nem pode conhecer o generoso impulso
que guia aquele que confia em si mesmo,
e cujo prazer não é de ter conseguido a vitória,
se não de sentir capaz de conquistá-la.”
William Shakespeare
iv
v
AGRADECIMENTOS
O presente trabalho apresenta-se como o culminar de uma fase muito importante da
minha vida, ao qual dediquei bastante tempo e empenho.
Quero expressar um enorme agradecimento à minha família, pai, mãe e irmã pelo apoio
incondicional que me deram ao longo destes anos. Obrigado pela amizade, preocupação e
pelos ensinamentos na disciplina da Vida. Obrigado por me terem proporcionado mais
esta etapa feliz da minha vida.
Quero também expressar um enorme agradecimento à minha namorada, Eva Rodrigues,
pelo apoio, carinho, amizade e por todos os momentos de felicidade pura que ao longo
dos anos me tem presenteado. Muito Obrigado.
Ao meu Orientador, Professor Doutor Luís Miguel Moura de Castro, agradeço o seu
apoio, a partilha do seu conhecimento e a disponibilidade demonstrada ao longo do meu
percurso académico e na realização deste trabalho.
À Dr.ª Elsa Cláudia Correia Barracho, agradeço pela oportunidade, paciência,
disponibilidade e partilha de conhecimento ao longo do estágio no CESAB.
A todos os colaboradores do CESAB pela partilha de conhecimento, paciência e pelos
momentos de descontração que foram proporcionando.
Estou muito grato aos meus amigos do ISEC e aos amigos de infância pelos bons
momentos que me fizeram passar ao longo da elaboração deste trabalho.
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator RESUMO
vii
RESUMO
O presente relatório de estágio foi realizado no âmbito da unidade curricular
dissertação/projeto/estágio do Mestrado em Processos Químicos e Biológicos no
Departamento de Engenharia Química e Biológica (DEQB) do Instituto Superior de
Engenharia de Coimbra (ISEC).
A realização deste estágio teve lugar no Centro de Serviços do Ambiente-CESAB, um
laboratório acreditado de análises físico-químicas e biológicas, sedeado na Zona
Industrial Ponte de Viadores, na Mealhada, desde 1998. O estágio teve a orientação do
Doutor Luís Miguel Moura Neves de Castro, professor adjunto do DEQB do ISEC e da
Drª. Elsa Cláudia Correia Barracho, diretora técnica do CESAB.
O estágio teve como objetivo principal o desenvolvimento do plano para a validação do
método analítico ―Determinação de Óleos e Gorduras e Hidrocarbonetos Totais, por
Espectrofotometria de Infravermelho por Transformada de Fourier, com recurso ao
solvente de extração tetracloroetileno‖. A necessidade de validação deste método teve
origem na proibição da utilização do solvente de extração 1,1,2-tricloro-1,2,2-
trifluoretano anteriormente usado no processo de extração. Para além da validação do
método analítico, o estágio teve como objetivo a familiarização com a legislação em vigor
referente a análises de águas, o desenvolvimento de competências no uso de equipamento,
material de laboratório e reagentes utilizados assim como a familiarização com as práticas
do laboratório envolvendo acompanhamento de técnicos na execução das várias
metodologias em vigor e a execução analítica das metodologias em amostras reais com
supervisão. Teve ainda como objetivo, a integração num ambiente empresarial no seio de
um laboratório acreditado. Apesar de não ter sido inicialmente planeado, foi ainda
iniciado o processo de validação de um método de determinação da carência química de
oxigénio (CQO) através da utilização de kits.
Em jeito de balanço final, pode afirmar-se que o estágio foi desenvolvido com sucesso,
uma vez que o método de análise sujeito inicialmente a validação se encontra a funcionar
como metodologia de rotina, encontrando-se acreditado para amostras de águas de
consumo e residuais após validação do Instituto Português da Acreditação (IPAC). Foi
atingido também um dos objetivos principais deste estágio, o desenvolvimento de
competências na área da engenharia química, mais propriamente em análises físico-
químicas de águas por parte do aluno, tendo beneficiado ao mesmo tempo o Centro de
Serviços do Ambiente-CESAB, pelos serviços prestados pelo aluno ao longo dos 8 meses
em que decorreu o estágio.
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ABSTRACT
ix
ABSTRACT
This report was part of Post – graduate /Thesis curricular unit for Chemical and
Biological Processes Mastership at Chemical and Biological Engineering Department
(CBED) of Instituto Superior de Engenharia de Coimbra (ISEC). This mastership took
place at Centro de Serviços do Ambiente CESAB, a credited laboratory for physico-
chemical and biological analysis, located at Zona Industrial Ponte de Viadores, in
Mealhada since 1998. The Mastership was supervised by Doutor Luis Miguel Moura
Neves de Castro, assistant teacher at CBED of ISEC and Drª. Elsa Cláudia Correia
Barracho, technical director of CESAB.
The mastership’s main goal was to develop a validation plan for ―Determining Oils and
Fats and Total Hydrocarbons, by Infrared Spectrophotometer by Fourier’s Transformed,
through tetrachlorethylene extraction solvent method. The need for validating this method
when previously used extraction solvent 1,1,2-Trichlorum-1,2,2- trifluoroethane, become
prohibited. Besides validating this analytical method, the mastership had also as goal the
familiarization of legislation concerning to water analysis, the development of
competences to use the equipment, laboratory material and reagents used, as well as
familiarization with laboratory practices involving attendance of technicians when
performing several methodologies in force and analytical performance of methodologies
in real samples under supervision. Although not initially planned, process for validating
the determation of chemical oxygen demand (COD)‖ through reagents kits.
In general, one can say the mastership was developed successfully, since the analysis
method previously subjected to validation is implemented as routine methodology and
presents no problems. One of this mastership’s main goals was also achieved: to develop
competences in chemical engineering, especially in water physico-chemical and
biological analysis, performed by the student while, at the same time, Centro de Serviços
do Ambiente, CESAB, was benefiting from services performed by the student during the
8 months period.
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE
Alain Costa xi
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
1.1. Contexto e enquadramento ......................................................................................... 1
1.2. Regime jurídico .......................................................................................................... 2
1.3. Organização da tese .................................................................................................... 4
PARTE I
2. Óleos, Gorduras e Hidrocarbonetos ......................................................................... 7
2.1. Ácidos gordos. ............................................................................................................ 7
2.2. Glicerol ....................................................................................................................... 8
2.3. Glicerolipidos ............................................................................................................. 9
2.4. Hidrocarbonetos ......................................................................................................... 9
2.4.1. Hidrocarbonetos alifáticos ................................................................................. 10
2.4.1.1. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia aberta...................................................... 10
2.4.1.2. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia fechada ................................................... 11
2.4.2. Hidrocarbonetos aromáticos .............................................................................. 11
3. Espectrofotometria de infravermelho por transformada de Fourier - FTIR ..... 13
3.1. Espectrofotometria no infravermelho ....................................................................... 13
3.2. Instrumentação FTIR ................................................................................................ 15
4. Princípios do método de determinação de OG e HDE por FTIR ........................ 17
5. Alteração de solvente extrator ................................................................................. 21
5.1. Freon-113, enquadramento histórico ........................................................................ 21
5.2. Depleção da camada de ozono ................................................................................. 22
5.3. Políticas internacionais de controlo dos CFC ........................................................... 24
5.4. Tetracloroetileno, uma possível solução. ................................................................. 26
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE
xii
6. Materiais e método. .................................................................................................. 29
6.1. Materiais e equipamento........................................................................................... 29
6.2. Método ...................................................................................................................... 29
6.3. Interferências/ limitações do método ........................................................................ 30
7. Validação do método ................................................................................................ 33
7.1. Avaliação indireta ..................................................................................................... 33
7.1.1. Seletividade ........................................................................................................ 34
7.1.2. Quantificação ..................................................................................................... 35
7.1.2.1. Curvas de calibração .......................................................................................... 35
7.1.2.1.1. Verificação de linearidade ................................................................................. 36
7.1.2.1.2. Teste de homogeneidade de variâncias ............................................................ 38
7.1.2.2. Limite de deteção e limite de quantificação ...................................................... 40
7.1.2.3. Sensibilidade ...................................................................................................... 42
7.1.3. Precisão .............................................................................................................. 44
7.1.3.1. Repetibilidade .................................................................................................... 44
7.1.3.2. Reprodutibilidade .............................................................................................. 46
7.1.3.3. Precisão intermédia ........................................................................................... 48
7.1.4. Incerteza ............................................................................................................. 50
7.2. Avaliação direta ........................................................................................................ 53
7.2.1. Materiais de Referência Certificados (MRC) ...................................................... 54
7.2.2. Ensaios interlaboratoriais .................................................................................. 55
7.2.3. Testes comparativos .......................................................................................... 57
8. Controlo de qualidade do método. .......................................................................... 61
8.1. Controle de qualidade Interno .................................................................................. 61
8.1.1. Cartas de Controlo ............................................................................................. 62
8.1.1.1. Cartas de controlo de médias ou indivíduos ...................................................... 62
8.1.1.2. Cartas de amplitudes. ........................................................................................ 63
8.1.2. Carta de aceitação de declives. .......................................................................... 64
8.1.3. Materiais de referência internos ....................................................................... 66
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE
Alain Costa xiii
8.1.4. Testes de recuperação........................................................................................ 68
8.1.4.1. Teste de recuperação na gama baixa (0,8 a 6mg/L) ........................................... 69
8.1.4.1.1. Recuperações em amostras salinas .................................................................... 69
8.1.4.1.2. Recuperações em amostras de águas subterrâneas. ......................................... 70
8.1.4.1.3. Recuperações em amostras superficiais ............................................................ 71
8.1.4.2. Testes de recuperação na gama alta (6 a 30mg/l) ............................................. 72
8.1.4.2.1. Recuperações de amostras em águas residuais ................................................. 72
8.1.4.3. Carta de aceitação para os ensaios de recuperação .......................................... 73
8.1.5. Análise de Duplicados ......................................................................................... 76
8.1.6. Análise de brancos .............................................................................................. 77
8.2. Controlo de qualidade externo .................................................................................. 78
9. Influência da agitação na extração de OG ............................................................. 79
9.1. Amostras limpas (gama alta) .................................................................................... 79
9.2. Amostras residuais (gama alta) ................................................................................ 81
9.3. Conclusão ................................................................................................................. 82
PARTE II
10. Validação dos kits de determinação rápida de CQO ............................................. 83
10.1. Gama de trabalho 10 – 150 mgO2/L ......................................................................... 84
10.2. Gama de trabalho 25 – 1500 mgO2/L ...................................................................... 85
10.3. Gama de trabalho 500 – 10000 mgO2/L .................................................................. 87
10.4. Testes comparativos ................................................................................................. 88
10.5. Analise Económica ................................................................................................... 91
10.6. Conclusão ................................................................................................................. 92
11. Métodos de análise realizadas no estágio ............................................................... 95
11.1. Determinação da carência química de oxigénio (CQO) e da Carência bioquímica de
oxigénio (CBO5). ............................................................................................................... 96
11.1.1. Determinação de CQO por espectrofotometria de absorção molecular. .......... 96
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE
xiv
11.1.1.1. Interferências / limitações. ................................................................................ 97
11.1.2. Determinação de CBO5 pelo método manométrico. ........................................ 97
11.1.2.1. Interferências. / Limitações ............................................................................... 98
11.2. Determinação de Azoto Amoniacal por Espectrofotometria de absorção molecular.
98
11.2.1. Interferências / Limitações ................................................................................ 99
11.3. Cromatografia Gasosa .............................................................................................. 99
11.3.1. Determinação de compostos orgânicos voláteis por Cromatografia Gasosa
acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS). ................................................................... 99
11.3.1.1. Interferências / Limitações .............................................................................. 103
11.3.2. Determinação de Pesticidas Organoclorados por Cromatografia Gasosa
acoplada ao Detetor de Captura de Eletrões (GC-ECD). ...................................................... 103
11.3.2.1. Interferências / Limitações .............................................................................. 105
12. Conclusões gerais e propostas para trabalhos futuros ........................................ 107
13. Referências bibliográficas ...................................................................................... 108
ANEXOS ......................................................................................................................... 113
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE DE FIGURAS
Alain Costa xv
ÍNDICE FIGURAS
Figura 2-1 – Representação de um triglicerídeo 7
Figura 2-2 – Diferença entre ligações cis e trans. A- ligação trans encontrada em alguns
ácidos gordos que passaram por processos artificiais; B- Ligação cis dos
ácidos gordos naturais. 8
Figura 2-3 - Estrutura do Glicerol (Arruda, 2006). 8
Figura 2-4- Representação esquemática de glicerolípidos. (A)- monoacilglicerol, (B)-
diacilglicerol, (C)-triacilglicerol. 9
Figura 2-5- Divisão dos hidrocarbonetos 10
Figura 2-6- Representação de um anel benzénico. 11
Figura 3-1 - Representação dos diferentes tipos de vibrações moleculares (adaptado de
Wishart, 2009b). 14
Figura 3-2 - Esquema relativo ao funcionamento do FTIR, representando o interferómetro
de Michelson e a conversão do interferograma num espectro de absorção
(adaptado de Wishart, 2009a) 16
Figura 4-1- Espectro FTIR realizado numa solução de óleos de referência representativa
dos comprimentos de onda absorvido pelas ligações C-H( adaptado de
Pinho,2011). 18
Figura 5-1- Estrutura química do Freon-113. 22
Figura 7-1- Distinção dos termos exatidão e precisão. 44
Figura 7-2- Avaliação do fator de desempenho "Z-score" 56
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE DE TABELAS
Alain Costa xvii
ÍNDICE TABELAS
Tabela 3-1- Distinção entre as diferentes regiões do infravermelho (Wishart, 2009a). 13
Tabela 4-1-Bandas de comprimento de onda associadas ao infravermelho, representativas
da absorção por parte das ligações C-H (Ruiz, 2009). 18
Tabela 5-1- Tabela resumo contendo as substâncias regulamentadas 25
Tabela 6-1- Diferenças relativamente às duas gamas de trabalho e aos dois solventes
extratores. 30
Tabela 7-1 - Resultados de absorvância para cada marca de tetracloroetileno 34
Tabela 7-2 - Resultados obtidos na execução do "Teste de Mandel" 37
Tabela 7-3- Apresentação dos resultados obtidos para o teste de homogeneidade de
variâncias. 39
Tabela 7-4 - Sensibilidade apresentada pelo método nas duas gamas de trabalho 42
Tabela 7-5 -Tabela resumo referente à gama baixa de trabalho (0,8 mg/L a 6 mg/L) 43
Tabela 7-6-Tabela resumo referente à gama alta de trabalho (6 mg/L a 30 mg/L) 43
Tabela 7-7- Desvios padrão da repetibilidade e limites de repetibilidade obtidos para cada
extremo das duas gamas de trabalho 45
Tabela 7-8- Coeficientes de repetibilidade obtidos para os extremos das duas gamas de
trabalho. 46
Tabela 7-9- Desvio padrão relativo à precisão intermédia na gama baixa de trabalho 49
Tabela 7-10- Desvio padrão relativo à precisão intermédia na gama alta de trabalho 50
Tabela 7-11- Parâmetros relativos à determinação da recuperação média obtida. 52
Tabela 7-12 -Parâmetros relativos à determinação da incerteza padrão 53
Tabela 7-13 – Desempenho do Laboratório no ensaio interlaboratorial. 56
Tabela 7-14 -Erro normalizado determinado através do ensaio interlaboratorial. 57
Tabela 7-15 - Resultados obtidos na análise de amostras com Freon-113 e
tetracloroetileno 58
Tabela 7-16-Parâmetros estatísticos determinados para os testes comparativos. 60
Tabela 8-1- Quadro resumo para a carta de aceitação de declives, na gama de 0,8 - 6mg/L
(gama baixa) 65
Tabela 8-2- Quadro resumo para a carta de aceitação de declives, na gama de 6 - 30mg/L
(gama alta). 66
Tabela 8-3- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas
salinas de gama baixa. 70
Tabela 8-4 - Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas
subterrâneas de gama baixa. 71
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator ÍNDICE DE TABELAS
xviii
Tabela 8-5- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas
superficiais de gama baixa 72
Tabela 8-6- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras residuais. 73
Tabela 8-7- Limites de aceitação utilizados nos ensaios de recuperação 73
Tabela 8-8-Limites de aceitação atualizados utilizados nos ensaios de recuperação da
gama baixa 74
Tabela 8-9- Resultados obtidos nas análises de duplicados. 76
Tabela 8-10- Amplitude média e limite superior de controlo usados na carta de controlo
de amplitudes dos duplicados 77
Tabela 9-1- Modos e tempos de agitação utilizados na extração das amostras. 79
Tabela 9-2- Percentagem de recuperação obtida em amostras limpas da gama alta com
concentração real de 1,19mg/L para quatro procedimentos distintos. 80
Tabela 9-3- Percentagem de recuperação obtida em amostras carregadas com resíduos da
gama alta para quatro procedimentos distintos. 81
Tabela 10-1- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 10-150
mgO2/L 84
Tabela 10-2 - Resultados obtidos na análise de duplicados. 85
Tabela 10-3- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 25-1500
mgO2/L. 85
Tabela 10-4- Resumo dos resultados obtidos para a análise de duplicados, a comparação
de métodos e os ensaios de recuperação para a gama de 25- 1500mgO2/L. 86
Tabela 10-5- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 500-
10000 mgO2/L 87
Tabela 10-6- Resumo dos resultados obtidos para a análise de duplicados, a comparação
de métodos e os ensaios de recuperação para a gama de 500-10000 mgO2/L. 88
Tabela 10-7- Resultados obtidos na análise de amostras com o método validado e com os
kits de determinação rápida. 89
Tabela 10-8 - Parâmetros estatísticos determinados para os testes comparativos de CQO 90
Tabela 10-9- Preços dos reagentes necessários para a determinação de CQO. 91
Tabela 10-10- Preços dos reagentes e custo associado à solução de digestão. 91
Tabela 10-11- Preços dos reagentes e custo associado à solução de ácido sulfúrico. 92
Tabela 10-12- Preços associados á determinação de CQO 92
Tabela 11-1- Descrição dos VOC analisados seu tempos de retenção e os iões de
quantificação 101
Tabela 11-2- Pesticidas organoclorados e respetivos tempos de retenção. 104
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator INDICE DE GRÁFICOS
Alain Costa xix
Índice de Gráficos
Gráfico 7-1- Comparação dos resultados obtidos usando Freon-113 e Tetracloroetileno. 59
Gráfico 8-1- Carta de aceitação de declives das retas de calibração na determinação de
óleos gorduras e hidrocarbonetos na gama de 0,8 - 6mg/L (gama baixa). 64
Gráfico 8-2 - Carta de aceitação de declives das retas de calibração na determinação de
óleos gorduras e hidrocarbonetos na gama de 6 - 30mg/L (gama alta). 65
Gráfico 8-3- Carta de controlo para o padrão de verificação de limite de quantificação da
gama baixa. 67
Gráfico 8-4 - Carta de controlo para o padrão de verificação de limite de quantificação da
gama alta. 67
Gráfico 8-5- Carta de aceitação para ensaios de recuperação da gama baixa utilizando os
limites iniciais. 74
Gráfico 8-6 -Carta de aceitação para ensaios de recuperação da gama baixa utilizando
atualizados. 75
Gráfico 8-7- Carta de controlo para ensaios de recuperação da gama alta utilizando os
limites iniciais. 75
Gráfico 8-8- Carta de controlo de amplitudes usada para ensaios de duplicados. 77
Gráfico 8-9- Carta de controlo de brancos 78
Gráfico 10-1- Teste de correlação linear utilizado para comparar os dois reagentes. 90
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator
SIMBOLOGIA E ABREVIATURAS
Alain Costa xxi
SIMBOLOGIA E ABREVIATURAS
CBO5 – Carência Bioquímica de Oxigénio após 5 dias
CQO – Carência Química de Oxigénio
CFC – Clorofluorcarboneto
ECD – Detetor de Captura de Eletrões
EM – Eletromagnética
ETA – Estação de Tratamento de Água
ETAR – Estação de Tratamento de Águas Residuais
FTIR – Espetroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier
GC – Cromatografia Gasosa
HDE – Hidrocarbonetos dissolvidos e emulsionados
LD – Limite de Deteção
LIA – Limite Inferior de Aviso
LIC – Limite Inferior de Controlo
LQ – Limite de Quantificação
LSA – Limite Superior de Aviso
LSC – Limite Superior de Controlo
MRC – Material de Referência Certificado
MS – Espectrometria de Massa
ODS – Substâncias Destruidoras de Ozono
OG – Óleos e Gorduras
SPME – Micro Extração em Fase Sólida
VMA – Valores Máximos Admissíveis
VMR – Valores Máximos Recomendados
VP – Valores Paramétricos
VOC – Compostos Orgânicos Voláteis.
Determinação de OG e HDE com recurso de Tetracloroetileno como solvente extrator
xxii
CAPÍTULO 1
Alain Costa 1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Contexto e enquadramento
A água é uma substância essencial à vida, sendo um recurso precioso e dos mais
abundantes no planeta. Esta encontra-se principalmente nos oceanos e sob a forma de
gelo nos glaciares polares, pelo que apenas uma fração muito pequena (cerca de 1%) se
encontra disponível diretamente para o consumo Humano.
Olhando para a água como composto químico, verifica-se que esta é constituída por dois
átomos de hidrogénio e um átomo de oxigénio ligados por ligações covalentes, formando
uma estrutura polar, que lhe confere as propriedades particulares que a tornam tão útil. A
estrutura das moléculas básicas da vida, proteínas, lípidos, hidratos de carbono e ácidos
nucleicos resultam diretamente das suas interações com o meio aquoso, existindo
importantes associações intramoleculares e intermoleculares destas estruturas com a água
que não são possíveis com nenhum outro solvente. Desta forma, a organização estrutural
e química dos seres vivos não poderia existir sem ser num meio aquoso (Voet, 2011).
Tomando como exemplo o corpo humano, este é constituído por 75-80% de água que
atua em diversos processos metabólicos, é reguladora da temperatura corporal interna
através da transpiração, é utilizada como meio de transporte de nutrientes e outros
compostos através do sangue (que é constituído por cerca de 80% de água). Também
intervém em numerosos metabolismos como a digestão, a depuração renal, a evolução
celular e assegura o adequado equilíbrio iónico. Por tudo isto, é recomendado a cada
individuo a ingestão diária de cerca de dois litros de água. (Mendes, 2004).
Apesar da sua importância, alguma negligência e falta de planeamento em relação a este
recurso têm posto em causa a sua disponibilidade e qualidade. É pois importante fazer um
esforço no sentido de gerir de forma adequada e expedita os recurso hídricos terrestres,
manter os seus reservatórios naturais e salvaguardar a sua pureza para não comprometer o
homem e os ecossistemas.
O consumo exagerado de água e a sua contaminação podem ter inúmeras consequências
para a saúde das populações e para o equilíbrio dos ecossistemas, podendo levar à sua
escassez, isto é, ao desequilíbrio entre a água necessária e a água disponível para
consumo humano. A poluição da água pode definir-se como a presença de substâncias
estranhas, em solução ou em suspensão, que a tornam a água inadequada para uma
determinada utilização. A diferença entre a presença de determinadas substâncias que são
habituais e em quantidades normais na água e a presença de substâncias que não são
habituais ou em quantidades excessivas permite avaliar a qualidade da água.
Qualquer modificação na água, quer natural ou artificial, que direta ou indiretamente
modifique a sua qualidade, altere ou destrua o equilíbrio dos ecossistemas e dos recursos
Introdução
2
naturais pode provocar perigos para a saúde pública, diminuir a sua adequabilidade para o
bem-estar do homem e reduzir os usos benéficos da água (WHO, 2011).
Para que se possa avaliar se uma água possui qualidade de acordo com o uso requerido,
devem-se fazer análises das suas propriedades físico-químicas e biológicas. Estas análises
deverão ser realizadas em laboratórios especializados e acreditados, com profissionais
habilitados na área e devem incluir diversos parâmetros (físico-químico e biológicos)
selecionados de acordo com o objetivo do estudo, do uso da água e da legislação em
vigor. Desta forma, nota-se a importância da realização de análises de água, visando não
só adequar à legislação específica de cada uso requerido, como também prevenir danos à
saúde humana e ao meio ambiente. Com este controlo podem ser evitados problemas
económicos e ambientais, possibilitando o uso sustentável da água para as gerações atuais
e futuras.
O Centro de Serviços do Ambiente, CESAB, desenvolve atividades de apoio técnico aos
seus associados e controlo de qualidade das suas águas desde 1993, estando sedeado na
Zona Industrial Ponte de Viadores, na Mealhada desde 1998. O CESAB é um laboratório
acreditado de análises físico-químicas e biológicas de águas tendo como missão
contribuir para a melhoria da qualidade da água nos sistemas de abastecimento publico e
privados, para defesa e controlo da qualidade da água nos sistemas hídricos naturais, bem
como para a proteção dos solos que possam receber lamas ou resíduos compatíveis. Na
sua valência de laboratório o CESAB utiliza metodologias analíticas otimizadas, com
reconhecimento externo da sua exatidão, proporcionando aos seus associados resultados
exatos dos parâmetros definidos para análise. O CESAB presta também aos seus
associados serviços de análise e monitorização da qualidade das águas assim como de
controlo e de apoio técnico à melhoria do funcionamento das estações de tratamento de
água (ETA) e de águas residuais (ETAR).
1.2. Regime jurídico
A importância da água é reconhecida nas sociedades atuais e por isso é necessário fazer
um esforço para que a qualidade desta seja isenta de riscos. O recurso água não sendo um
produto comercial deve ser encarado como património que deve ser protegido e
defendido.
No espaço europeu são várias as diretivas relativas à análise e proteção dos recursos
hídricos, destacando-se a diretiva nº 98/83/CE de 3 de Novembro que define os critérios e
normas de qualidade de água (EU, 1998).
Na legislação nacional, o Decreto de Lei nº 236/98 de 1 de Agosto define os requisitos
necessários a observar na utilização das águas para os seguintes fins:
Introdução CAPÍTULO 1
Alain Costa 3
Águas de consumo Humano:
o Água doce superficial destinada à produção de água para consumo
humano;
o Água subterrânea destinada à produção de água para consumo humano
(entretanto revogado);
o Água de abastecimento para consumo humano (entretanto revogado);
Água para suporte da vida aquícola:
o Água doce superficial para fins aquícolas- águas piscícolas;
o Água do litoral e salobras para fins aquícolas- águas conquícolas;
o Água do litoral e salobras para fins aquícolas- águas piscícolas;
Água balnear.
Água de rega (DR, 1998)
O Decreto de Lei nº 236/98, de 1 de Agosto define também os Valores Máximos
Recomendados (VMR) e os Valores Máximos Admissíveis (VMA) para cada parâmetro
nos diferentes tipos de água (DR, 1998).
O documento jurídico que atualmente legisla a qualidade da água para consumo humano
em Portugal é o Decreto-Lei nº306/2007, de 27 de Agosto, que procedeu à revisão do
Decreto-Lei nº243/2001 de 5 de Setembro (e que por sua vez revoga em muitos aspetos o
Decreto-Lei nº236/98, de 1 de Agosto). Para além dos aspetos de qualidade, este diploma
estabelece, ainda, os princípios de repartição da responsabilidade pela gestão dos sistemas
de abastecimento publico (DR, 2001; DR, 2007).
Desta forma, as normativas em vigor estabelecem o regime de qualidade da água
destinada aos vários fins, tendo por objetivo proteger a saúde humana e o ambiente dos
efeitos nocivos resultantes da eventual contaminação dessa água, assegurando desta
forma a sua disponibilidade com a qualidade desejada para os fins em que esta é utilizada.
No sentido de regular a qualidade da água foi criada uma autoridade competente, o
Instituto Regulador de Águas e Resíduos (IRAR), atualmente designado por Entidade
Reguladora dos Serviços de Águas e Resíduos (ERSAR), entidade reguladora dos
serviços de abastecimento público de água, de saneamento de águas residuais urbanas e
de gestão de resíduos urbanos (DR, 2007; DR, 2009).
O Decreto-Lei nº306/2007 introduziu também a designação de valor paramétrico (VP)
que veio substituir o Valor Máximo Admissível (VMA) e o Valor Máximo Recomendado
(VMR) que constavam dos documentos legislativos anteriores. O valor paramétrico é
definido como o valor máximo ou mínimo fixado para cada um dos parâmetros a
controlar. Os valores paramétricos são classificados como parâmetros obrigatórios ou
como parâmetros indicadores. Dentro dos valores paramétricos obrigatórios, incluem-se
os parâmetros químicos e os parâmetros microbiológicos, para os quais os valores dos
resultados das análises não podem ultrapassar os valores indicados no decreto de lei em
Introdução
4
vigor. No caso dos parâmetros indicadores, o valor paramétrico deve ser considerado
apenas como um valor guia (DR, 2007).
A amostra satisfaz os requisitos de qualidade, quando o resultado da análise é inferior ou
igual ao valor paramétrico fixado na legislação em vigor para o tipo de água em causa.
Sempre que os resultados não sejam conformes são tomadas medidas que visam a
informação da autoridade competente (ERSAR), cabendo à entidade gestora definir um
plano com o objetivo de ultrapassar o incumprimento (DR, 2007).
1.3. Organização da tese
O presente relatório de estágio é composto por 12 capítulos. Os 9 primeiros capítulos
prendem-se com o objetivo principal do estágio, o de validar o método de determinação
de óleos, gorduras e hidrocarbonetos por FTIR com recurso ao tetracloroetileno como
solvente de extração. Os restantes capítulos descrevem o trabalho realizado no âmbito do
estágio durante toda a sua duração.
Após este capítulo introdutório, segue-se o Capitulo 2 ―Óleos Gorduras e
Hidrocarbonetos Totais‖, que tem como objetivo fornecer informação relativa aos
analítos em estudo na validação do método ―Determinação de óleos, gorduras e
hidrocarbonetos por FTIR com recurso ao tetracloroetileno como solvente de extração‖.
No capítulo 3 é efetuada a descrição do equipamento associado à espectrofotometria de
infravermelho por transformada de Fourier. Neste capítulo são apresentados os conceitos
teóricos relativos à energia eletromagnética na região do infravermelho e a sua interação
com as ligações entre os átomos de uma molécula. É descrito, também, o funcionamento
do equipamento FTIR.
O capítulo 4, sustentado nos dois Capítulos anteriores, descreve o método de
determinação da concentração de óleos, gorduras e hidrocarbonetos presente numa
amostra através do equipamento FTIR. Neste capítulo encontra-se a descrição detalhada
do método de análise utilizado no presente estágio.
No capítulo 5 explica-se a necessidade de alteração do solvente extrator que era utilizado
na metodologia anterior. Neste capítulo é realizada a contextualização histórica que levou
à produção e ao consumo de CFC, a sua capacidade destrutiva da camada de ozono e a
consequente proibição das substâncias depletoras da camada de ozono (ODS) por
diversos protocolos internacionais. No final do capítulo 5 é sugerido o solvente de
extração substituto do Freon-113.
O capítulo 6 apresenta os materiais e métodos utilizados na determinação de óleos,
gorduras e hidrocarbonetos por FTIR com recurso ao tetracloroetileno como solvente de
extração.
Introdução CAPÍTULO 1
Alain Costa 5
No capítulo 7 descrevem-se as etapas realizadas na validação do método com o novo
solvente de extração. Este capítulo possui informação detalhada (quer teórica, quer de
avaliação de resultados) sobre a validação do novo método de análise, seguindo as
indicações dos vários guias para validação de métodos e resultados.
O capítulo 8 apresenta os resultados obtidos no controlo de qualidade do método em
estudo. Neste capítulo é realizado uma introdução sobre a importância do controlo de
qualidade nos resultados obtidos pelos laboratórios e a importância que as cartas de
controlo possuem na análise dos resultados obtidos.
No capítulo 9 estão apresentados os resultados obtidos na otimização do processo de
extração de óleos gorduras e hidrocarbonetos totais. Neste capítulo é feita a comparação
entre a extração manual e a extração assistida por um agitador mecânico.
O capítulo 10 tem como objetivo apresentar a metodologia de validação da determinação
rápida da carência química de oxigénio, por meio de kits. Neste capítulo para além de
alguns ensaios de validação do método, é apresentada a análise económica de eventual
utilização dos kits, com objetivo de avaliar a sua viabilidade económica para utilização no
laboratório.
O capítulo 11 descreve sucintamente os métodos analíticos realizados ao longo de todo o
estágio no CESAB.
No capítulo 12 encontram-se as conclusões finais retiradas no âmbito do trabalho
desenvolvido no estágio.
CAPÍTULO 2
Alain Costa 7
2. Óleos, Gorduras e Hidrocarbonetos
Os óleos e as gorduras são essencialmente formadas por lípidos, e constituem um
conjunto de biomoléculas insolúveis em água e solúveis em solventes não polares. Os
lípidos repelem a água, servem de reserva de energia e são utilizados como componentes
estruturais, principalmente na formação de membranas celulares.
Para compreender melhor a estrutura química dos óleos e gorduras, é necessário
compreender o que são ácidos gordos e a sua ligação com o glicerol na formação de
glicerolípidos (McMurry, 2012)
2.1. Ácidos gordos.
Os ácidos gordos são ácidos carboxílicos de cadeia longa, possuindo uma extremidade
polar e uma extremidade apolar. A extremidade polar é constituída por um grupo
carboxílico (-COOH) que confere a esta extremidade propriedades hidrófilas. A
extremidade apolar é constituída por uma cadeia hidrocarbonatada ((CH2)nCH3) que
confere a esta extremidade propriedades hidrofóbicas (Guardado et al, 2006).
Figura 2-1 – Representação de um triglicerídeo
Regra geral, os ácidos gordos encontrados nos lípidos naturais possuem as seguintes
características comuns:
O tamanho dos ácidos varia entre 10 e 20 átomos de carbono que se apresentam
em número par (incluindo o carbono do grupo carboxílico)
São ácidos carboxílicos de cadeia linear (não possuem ramificações) podendo ser
saturados (sem ligações duplas entre os carbonos) ou insaturados (contendo uma
ou mais ligações duplas entre carbonos).
Óleos Gorduras e hidrocarbonetos totais
8
Nos ácidos gordos insaturados que possuem mais do que uma ligação dupla, estas
ligações estão separadas por um grupo metileno (ligações não conjugadas do tipo1).
A presença de ligações duplas com configuração cis nos ácidos gordos insaturados
provoca uma dobra característica na cadeia que não é encontrada nos ácidos gordos
saturados. Esta dobra na cadeia de ácidos gordos insaturados provoca uma organização
mais desordenada, formando, desta forma, agregados mais fluidos. Assim, como os
ácidos gordos saturados não possuem esta dobra, a sua cadeia possui uma estrutura mais
linear, organizando-se de uma forma compacta, formando agregados rígidos.
Para além das diferenças nas organizações estruturais, a presença de ligações duplas cis
influencia também as forças intermoleculares, sendo estas mais fracas nos ácidos gordos
insaturados (Guardado et al, 2006).
Figura 2-2 – Diferença entre ligações cis e trans. A- ligação trans encontrada em alguns ácidos gordos que
passaram por processos artificiais; B- Ligação cis dos ácidos gordos naturais.
2.2. Glicerol
O glicerol (também conhecido por 1,2,3-propanotriol) é um poliálcool cuja fórmula
estrutural se apresenta na figura que se segue.
Figura 2-3 - Estrutura do Glicerol (Arruda, 2006).
Entre as características físico-químicas do glicerol, destaca-se sobretudo o seu grande
poder higroscópico. Esta característica é fundamental na ligação à extremidade polar
(-COOH) dos ácidos gordos.
1 Ligações não conjugadas, são ligações em que os átomos de carbono só formam uma ligação dupla
Óleos Gorduras e hidrocarbonetos totais CAPÍTULO 2
Alain Costa 9
2.3. Glicerolipidos
Os glicerolípidos são formados a partir da ligação entre ácidos gordos e o glicerol. O
glicerol pode formar três ligações com os ácidos gordos formando um triacilglicerol.
Apesar de esta configuração ser a mais frequente, podem existir também
monoacilglicerois (o glicerol está ligado apenas a um ácido gordo) e diacilglicerois (o
glicerol está ligado a dois ácidos gordos). Para o caso do triacilglicerol, quando estes
possuem apenas um tipo de ácidos gordos são designados de triacilglicerois simples,
sendo que, quando possuem ácidos gordos diferentes são designados de triacilglicerois
mistos, sendo estes os mais frequentes (McMurry, 2012).
Figura 2-4- Representação esquemática de glicerolípidos. (A)- monoacilglicerol, (B)- diacilglicerol, (C)-
triacilglicerol.
Os óleos são triacilglicerois formados por ácidos gordos insaturados, que têm uma
organização mais desordenada (devido às ligações cis), possuindo também forças
intermoleculares mais baixas. Desta forma, os óleos apresentam-se na fase líquida à
temperatura ambiente.
As gorduras são triacilglicerois formados por ácidos gordos saturados que, por não terem
ligações cis, se organizam de forma mais compacta, possuindo, assim, forças
intermoleculares mais altas. Desta forma, as gorduras apresentam-se na fase sólida à
temperatura ambiente (McMurry, 2012).
2.4. Hidrocarbonetos
Os Hidrocarbonetos, são compostos químicos em que apenas estão presentes átomos de
carbono e hidrogénio, existindo apenas dois tipos de ligações, carbono-hidrogénio e
carbono-carbono.
As ligações carbono-carbono podem ser de três tipos destintos, ligações covalentes
simples, duplas e triplas. Estas ligações afetam as propriedades do hidrocarboneto de que
fazem parte. Quando na cadeia carbonatada apenas existem ligações covalentes simples,
trata-se de um hidrocarboneto saturado, quando existem ligações covalentes duplas ou
triplas entre os átomos de carbono, trata-se de um hidrocarboneto insaturado. No que diz
Óleos Gorduras e hidrocarbonetos totais
10
respeito à solubilidade, os hidrocarbonetos, por serem compostos apolares, dissolvem-se
apenas em solventes apolares ou fracamente polares, propriedade físico-química muito
importante na sua separação dos óleos e gorduras como se constatará mais à frente, neste
trabalho.
Os hidrocarbonetos podem dividir-se em dois grandes grupos, os hidrocarbonetos
alifáticos e os hidrocarbonetos aromáticos (contêm pelo menos um anel benzénico).
Dentro dos alifáticos pode ainda haver a possibilidade de serem formados por cadeias
carbonatadas abertas (lineares e ramificadas) ou fechadas (McMurry, 2012).
Os hidrocarbonetos estão divididos da seguinte forma:
Figura 2-5- Divisão dos hidrocarbonetos
2.4.1. Hidrocarbonetos alifáticos
2.4.1.1. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia aberta
Apesar da simplicidade dos alcanos, estes desempenham um papel de grande importância
na nossa sociedade já que são componentes do petróleo e dos seus derivados, assim como
do gás natural. Os alcanos apenas apresentam ligações simples, assim sendo, cada átomo
de carbono está ligado a outros quatro átomos. O alcano mais simples é o metano, possui
apenas um carbono e apresenta a fórmula molecular CH4, segue-se então o etano com
dois átomos de carbono e de fórmula molecular C2H6. A fórmula geral dos alcanos é
CnH2n+2.
Os átomos nas moléculas de metano, etano e propano, não possuem a possibilidade de se
agrupar de um outro modo, no entanto, quando o número de carbonos na cadeia
Óleos Gorduras e hidrocarbonetos totais CAPÍTULO 2
Alain Costa 11
carbonatada é superior a três, as hipóteses de ligação entre os átomos de carbono
aumentam e as suas cadeias carbonatadas podem exibir ramificações (Guardado et al,
2006).
Os alcenos, também chamados olefinas ou hidrocarbonetos etilénicos, são
hidrocarbonetos insaturados que contêm pelo menos uma ligação dupla C=C. Os alcenos
que apenas contêm uma ligação dupla por molécula, apresentam a fórmula molecular
CnH2n, sendo n um número inteiro maior ou igual a dois. De forma análoga ao que
acontece com os alcanos, também os alcenos podem formar ramificações quando o
número de carbonos na cadeia carbonatada é superior a três.
Os alcinos, ou hidrocarbonetos acetilénicos, são hidrocarbonetos insaturados que contêm
pelo menos uma ligação tripla C C. Os alcinos que contêm apenas uma ligação tripla na
sua molécula apresentam fórmula molecular CnH2n-2, com n maior ou igual a dois.
Quando o número de carbonos na cadeia carbonatada é superior a quatro existe a
possibilidade dos carbonos se agruparem formando ramificações (McMurry, 2012).
2.4.1.2. Hidrocarbonetos alifáticos de cadeia fechada
Existem hidrocarbonetos em que os átomos de carbono se ligam entre si formando anéis,
sendo denominados de hidrocarbonetos alifáticos de cadeia fechada ou cíclicos. Os
hidrocarbonetos cíclicos podem ser saturados se só existirem ligações simples (ciclo-
alcanos), ou insaturados se nos seus anéis existirem ligações duplas (ciclo-alcenos), ou
triplas (ciclo-alcinos) de acordo com o que foi mencionado anteriormente (McMurry,
2012).
2.4.2. Hidrocarbonetos aromáticos
Os hidrocarbonetos aromáticos são compostos que são assim chamados devido ao odor
característico, muitas vezes agradável, que possuem, embora sejam, na sua generalidade
tóxicos. São compostos caracterizados por apresentarem como cadeia principal um ou
vários anéis benzénicos.
O anel benzénico presente nos hidrocarbonetos aromáticos não é mais que uma cadeia
carbonatada fechada contendo seis carbonos e três ligações duplas intercaladas.
Devido ao facto dos hidrocarbonetos aromáticos serem uma família muito vasta, não é
possível estabelecer uma fórmula geral que englobe todos os hidrocarbonetos aromáticos
(McMurry, 2012).
Figura 2-6- Representação de um anel benzénico.
Óleos Gorduras e hidrocarbonetos totais
12
CAPÍTULO 3
Alain Costa 13
3. Espectrofotometria de infravermelho por transformada de
Fourier - FTIR
3.1. Espectrofotometria no infravermelho
A designação FTIR refere-se à espectrofotometria de infravermelho por transformada de
Fourier. Em espectrofotometria é estudada a interação da radiação eletromagnética (EM)
com a matéria, sendo um dos seus principais objetivos, o estudo dos níveis de energia de
átomos e moléculas.
A espectrofotometria na região ultravioleta/visível (UV/V) abrange absorções de radiação
EM com comprimento de onda que se situa entre 200-800 nm, o que corresponde a níveis
de energia de 50-200 kcal/mol que é suficiente para levar a transições eletrónicas. A
utilização de radiação EM na região do infravermelho (IV), com níveis de energia de 1-15
kcal/mol, induzem transições vibracionais. Transições rotacionais, são obtidas com a
utilização de radiação EM na região de micro-ondas ou, em casos particulares na região
do infravermelho longínquo onde as energias associadas são mais baixas (Wishart,
2009a).
A região do espectro que corresponde ao infravermelho compreende o comprimento de
onda da radiação EM que se estende entre 0,70 µm e os 1 mm, sendo que, na análise
química tem especial interesse a região do espectro que corresponde a comprimentos de
onda que variam entre 2,5 e os 25 µm (4000 a 400cm-1
), conhecido como região
fundamental ou infravermelho médio. A região de baixa frequência (600 a 200cm-1
) é
conhecida como infravermelho longínquo e a região de alta frequência (4000cm-1
até a
região do visível) como infravermelho próximo (Wishart, 2009a).
A Tabela 3-1 pretende identificar as diferentes regiões do Infravermelho
Tabela 3-1- Distinção entre as diferentes regiões do infravermelho (Wishart, 2009a).
Infravermelho
próximo
Infravermelho
médio
Infravermelho
longínquo
Frequência (cm-1
) 14,300-4000 4000-650 650-200
Comprimento de onda
(µm) 0,7-2,5 3,5-25 15-100
Fenómeno Sobretons de
absorção de C-H
Vibrações e
dobras
Espécies de baixa
energia
Para que haja absorção da radiação infravermelha é necessário existir uma variação do
momento dipolo elétrico da molécula como consequência do seu movimento vibracional
FTIR
14
ou rotacional, sendo que o momento dipolo é determinado pela magnitude da diferença de
carga e a distância entre dois centros de carga. Só nestas circunstâncias, o campo elétrico
alternante de radiação incidente interage com a molécula, originando os espectros, ou de
outra forma se pode dizer que, o espectro de absorção de um determinado componente, na
região do infravermelho tem origem quando a radiação EM incidente tem uma
componente com frequência correspondente a uma transição entre dois níveis
vibracionais (Wishart, 2009a).
A absorção de radiação infravermelha é o resultado da radiação EM (de energia
apropriada) induzindo excitações vibracionais nas ligações covalentes dos átomos nas
moléculas. Fotões com energia na ordem dos 1-15kcal/mol não são ―fortes‖ o suficiente
para excitar ou promover eletrões (o que acontece na absorção de UV), mas são ―fortes‖ o
suficiente para levar à deformação de ligações covalentes. As ligações covalentes em
moléculas não são rígidas, são mais parecidas com molas, com a capacidade de esticar ou
dobrar. Os movimentos experienciados por moléculas são característicos dos seus
componentes atómicos. Como consequência, teoricamente todos os componentes
orgânicos podem absorver radiação infravermelha que corresponde a excitações
vibracionais (Wishart, 2009a).
Existem dois tipos gerais de vibrações moleculares:
1. Stretching (estiramento), esta é uma vibração de movimento rítmico ao longo da
ligação de tal forma que a distância interatómica aumenta ou diminui como uma
mola.
2. Bending (dobra ou deformação angular), esta é uma vibração que tipicamente
consiste na variação do ângulo das ligações (Wishart, 2009b).
Na Figura 3-1 estão representadas os diferentes tipos de vibrações moleculares.
Figura 3-1 - Representação dos diferentes tipos de vibrações moleculares (adaptado de Wishart, 2009b).
FTIR CAPÍTULO 3
Alain Costa 15
De acordo com a Figura 3-1, A representa o estiramento simétrico, em que as ligações
encolhem e estendem de forma simétrica e coordenada. Em B verifica-se o estiramento
assimétrico, onde as ligações encolhem e estendem de forma descoordenada. Quanto à
deformação angular, em C observa-se a deformação em tesoura (no plano), em que o
movimento das ligações se assemelha ao movimento realizado por uma tesoura. Em D
verifica-se a torção das ligações (fora do plano), em que o movimento das ligações varia
de forma descoordenada. Na deformação angular representada em E, verifica-se o
―abanar‖ das ligações (fora do plano) de forma coordenada. Finalmente em F observa-se
o balançar das ligações (no plano) no mesmo sentido (Nikolić, 2011).
3.2. Instrumentação FTIR
A base de qualquer espectrómetro FTIR é o interferómetro de Michelson, que consiste em
dois espelhos colocados ortogonalmente, sendo um fixo e um móvel, e um ―semi-
espelho‖ (beamsplitter). Neste tipo de sistema, a radiação parte de uma fonte
monocromática hipotética e é dividida em dois feixes (idealmente cada feixe contem 50%
do original) no beamsplitter (divisor de feixes). Após passar pelo divisor de feixes, um
dos feixes (A) segue na direção do espelho que se encontra fixo no qual é refletido de
volta para o divisor de feixes, daí parte desse feixe é refletido de volta para a fonte e a
outra parte passa pela amostra e vai para o detetor. O outro feixe (B) parte do
beamsplitter em direção ao espelho móvel. Quando chega ao espelho móvel, o feixe B é
refletido de volta, parte para a fonte e a outra parte passa pela amostra e vai para o
detetor. Quando a posição do espelho móvel é tal que o feixe B percorre a mesma
distância para chegar ao detetor que o feixe A (δ=nλ, onde n=0,1,2,...), então os dois
feixes estão em fase, reforçando um ao outro (interferência construtiva), desta forma a
energia que chega ao detetor será máxima. De outra forma, se a posição do espelho móvel
for tal que o caminho que o feixe B percorre para chegar ao detetor seja diferente do feixe
A por (n+1)λ/2, então o feixe A e B estarão 90º fora de fase, cancelando-se um ao outro.
Neste caso a energia que chega ao detetor será mínima. À medida que o espelho móvel se
vai movimentando, a intensidade da radiação EM varia, sendo desta forma possível
―varrer‖ a região do espectro desejável a partir de uma fonte de luz monocromática
(Nikolić, 2011; Strong, 1979).
À medida que o espelho móvel se vai movimentando, a intensidade da radiação EM que
chega ao detetor vai variando e assim se forma o interferograma. Apesar do
interferograma conter toda a informação necessária para a análise de uma amostra sob um
dado conjunto de condições, a forma como essa informação é apresentada não é muito
útil para os analistas. Assim sendo, essa informação é convertida num espectro
relacionando as intensidades com as respetivas frequências através da transformada de
Fourier (Nikolić, 2011).
FTIR
16
A Figura 3-2 representa a instrumentação usada num FTIR.
Figura 3-2 - Esquema relativo ao funcionamento do FTIR, representando o interferómetro de Michelson e a
conversão do interferograma num espectro de absorção (adaptado de Wishart, 2009a)
CAPÍTULO 4
Alain Costa 17
4. Princípios do método de determinação de OG e HDE por FTIR
A determinação de óleos e gorduras (OG) e hidrocarbonetos (HDE) realizada através da
instrumentação FTIR baseia-se na determinação da energia eletromagnética na região do
infravermelho que é absorvida pelas ligações C-H presentes na amostra. Este princípio
tem origem na grande quantidade de ligações C-H que os óleos, gorduras e
hidrocarbonetos possuem. O processo de extração utilizado é o método de extração
liquido-liquido em que o solvente extrator tem de ser imiscível com a amostra para que
possa haver separação de fases, sendo que, o solvente terá necessariamente de estar livre
de ligações C-H para não interferir com a concentração real do analíto presente na
amostra.
O método de análise utilizado é baseado no que é proposto no ―Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater‖. (APHA, 2005 a,b) De acordo com esse método,
o solvente de extração é o 1,1,2-Trichloro-1,2,2-trifluoroethane (também conhecido como
CFC-113 ou Freon-113). No entanto, como será referido no Capítulo 5, a sua utilização é
atualmente proibida para extração.
O processo de determinação de óleos e gorduras inicia-se numa ampola de decantação,
onde uma toma representativa da amostra e com volume conhecido é colocada. Após o
processo de transferência da amostra para a ampola de decantação são colocados 20mL
de Freon-113 e é iniciado um processo de agitação vigoroso durante 2min para aumentar
a área de contacto das fases que são imiscíveis (amostra aquosa e Freon-113). A ampola é
posteriormente colocada num suporte de ampolas a repousar até se atingir a separação de
fases. Quando as fases estiverem separadas, a parte inferior (contendo o solvente e os OG
e HDE) é drenada através de um funil contendo sulfato de sódio (Na2SO4) para dentro de
um balão de diluição de 50mL. O sulfato de sódio é utilizado para remover a humidade
que a fase do solvente drenado possa conter. Este processo de separação liquido-liquido é
repetido mais duas vezes. No final das extrações, o sulfato de sódio é lavado com o
solvente extrator com objetivo de o limpar do analíto em análise sendo o balão de
diluição posteriormente aferido. O extrato é então analisado num equipamento FTIR
através de uma célula de quartzo para se determinar os óleos, gorduras e hidrocarbonetos
presentes na amostra.
Quando o objetivo é a determinação de hidrocarbonetos presentes na amostra é necessário
adicionar sílica gel ao balão de diluição e agitar para promover o contacto entre a sílica
gel e o extrato. A sílica gel tem a capacidade de remover compostos polares tais como os
óleos e gorduras, deixando apenas os compostos apolares como os hidrocarbonetos. O
extrato contendo a sílica é então filtrado através de fibra de vidro e analisado no
equipamento FTIR (Pinho, 2011).
Princípios do método de determinação de OG e HDE por FTIR
18
Como foi descrito no Capítulo 3, o equipamento FTIR tem a capacidade de varrer a zona
do espectro eletromagnético referente ao infravermelho. É nesta zona do espectro que
ocorre a absorção correspondente às ligações C-H. A Figura 4-1 demonstra o espectro de
absorção e a gama de comprimentos de onda absorvidos referentes às ligações C-H.
Figura 4-1- Espectro FTIR realizado numa solução de óleos de referência representativa dos comprimentos de
onda absorvido pelas ligações C-H( adaptado de Pinho,2011).
A Tabela 4-1 apresenta de uma forma mais detalhada os comprimentos de onda
absorvidos pelas ligações C-H.
Tabela 4-1-Bandas de comprimento de onda associadas ao infravermelho, representativas da absorção por parte
das ligações C-H (Ruiz, 2009).
Comprimento de
Onda (cm-1
) Tipo de vibração Intensidade Grupo Funcional
3080-3010 =C-H estiramento
vibracional Média =C-H (aromático)
2975-2950 C-H estiramento
vibracional assimétrico Média-Grande -CH3
2940-2915 C-H estiramento
vibracional assimétrico Média-Grande -CH2-
2870-2840 C-H estiramento
vibracional simétrico Média -CH2-
2885-2865 C-H estiramento
vibracional simétrico Média -CH3
Assim sendo a determinação do analíto é realizada através de scans no intervalo de
comprimento de onda que compreende os 3200cm-1
e os 2700cm-1
, e a determinação do
analíto realizada através do registo da absorvância (em altura) no comprimento de onda
Princípios do método de determinação de OG e HDE por FTIR CAPÍTULO 4
Alain Costa 19
de 2930cm-1
. É utilizado este comprimento de onda, pois a ligações -CH2- estão presentes
em maior quantidade nos óleos, gorduras e hidrocarbonetos.
CAPÍTULO 5
Alain Costa 21
5. Alteração de solvente extrator
Conforme se referiu anteriormente, o método de análise de OG e HDE por FTIR utilizado
é baseado no ―Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater‖
(APHA, 2005a,b). De acordo com esse método, o solvente de extração é o 1,1,2-Tricloro-
1,2,2-trifluoroetano (também conhecido como CFC-113 ou Freon-113). Neste capítulo
será abordada o enquadramento que motivou a necessidade de mudar de solvente extrator.
5.1. Freon-113, enquadramento histórico
Os frigoríficos no final dos anos 1800 inícios dos anos 1900 usavam gases tóxicos, tais
como amónia (NH3) cloreto de metilo (CH3Cl) e dióxido de enxofre (SO2) como fluido
refrigerante. Após uma série de acidentes fatais em 1920, principalmente em resultado de
fugas de cloreto de metilo, foram encetados esforços no sentido de descobrir um
substituto menos tóxico. Esta pesquisa foi liderada por três grandes empresas americanas,
a Frigidair, a General Motors e a Du Pont. Em 1928 Thomas Midgley Jr, um químico da
General Motors, produziu o diclorodifluormetano (CCl2F2), o primeiro CFC
(clorofluorcarboneto). A sigla CFC é usada para descrever compostos halogenados
derivados do metano (CH4) e do etano (C2H6). Estes compostos são atóxicos, não
corrosivos, não inflamáveis e muito estáveis, encontrando-se geralmente no estado gasoso
à temperatura ambiente, o que permitiu que fossem utilizados em larga escala em
aerossóis, sistemas de refrigeração (frigoríficos e ar condicionado), sistemas de limpeza
de material eletrónico e como solventes de extração (Bellis, 2012). Durante décadas, os
CFC foram largamente utilizados devido às suas propriedades particulares, tendo sido
considerados como insubstituíveis pelas propriedades descritas anteriormente e pelo facto
de possuírem um processo de fabricação simples e serem facilmente armazenados.
O grande potencial dos CFC levou à sua produção em massa e ao desenvolvimento de
novos tipos de moléculas. Em particular para o presente estudo, é de referir o
aparecimento do composto 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoretano (conhecido como Freon-
113), cuja capacidade como solvente orgânico assumiu grande importância na
determinação de óleos, gorduras e hidrocarbonetos por FTIR. A sua estabilidade, as suas
propriedades atoxicas, bem como o facto de não possuir ligações carbono-hidrogénio
fizeram do Freon-113 o solvente de eleição para o método de determinação de OG e HDE
por FTIR durante um largo período de tempo.
Alteração de solvente extrator
22
A Figura 5-1 apresenta a estrutura química do Freon-113
Figura 5-1- Estrutura química do Freon-113.
A propriedade de ser quimicamente estável, é umas das suas maiores vantagens, mas
também um dos seus maiores defeitos, que, em última analise, está na origem da sua atual
proibição.
5.2. Depleção da camada de ozono
O ozono é uma forma alotrópica do oxigénio, tratando-se de um gás tóxico, explosivo e
um poderoso oxidante. A forma mais estável do oxigénio é a molécula diatómica (O2)
constituindo cerca de 21% da atmosfera terrestre. As moléculas de ozono contêm três
átomos de oxigénio (O3), apresentando uma menor estabilidade comparativamente às
moléculas de O2.
A atmosfera terrestre está dividida em várias camadas, sendo que o ozono se encontra
sobretudo na estratosfera, entre os 15 e os 50 kms acima da superfície terrestre. A maior
concentração deste composto ocorre a altitudes aproximadamente entre os 15 e os 35kms,
constituindo o que se convencionou chamar de ―Camada de Ozono‖. Nesta camada está
presente cerca de 90% de todo o ozono existente na atmosfera terrestre.
Quando o oxigénio diatómico presente na estratosfera absorve radiação solar ultravioleta
com comprimento de onda inferior a 200nm, ocorre a seguinte reação química:
( ) ( )→ ( ) (5-1)
Os átomos de oxigénio formados vão se combinar com o O2 e formar ozono segundo a
reação:
( ) ( ) ( ) (5-2)
Alteração de solvente extrator CAPÍTULO 5
Alain Costa 23
Esta reação é exotérmica e o resultado final das equações anteriores é a conversão de três
moléculas de O2 em duas moléculas de O3 com a conversão de radiação eletromagnética
em calor.
De outra forma, o ozono também é capaz de absorver radiação eletromagnética com
comprimentos de onda entre os 200 e os 315nm (região do ultravioleta). Esta radiação
causa a decomposição do ozono em oxigénio molecular e oxigénio atómico segundo a
equação:
( ) ( )→ ( ) (5-3)
Desta forma, existe um equilíbrio dinâmico entre o oxigénio atómico (O), o oxigénio
molecular (O2) e o ozono (O3) na estratosfera. As reações anteriores são de importância
extrema, uma vez que é através delas que 97% a 99% da radiação ultravioleta proveniente
do sol na faixa de comprimento de onda entre as 150 e os 315nm é retida. Do equilíbrio
verificado entre estes compostos resulta um filtro de UV e um estado estacionário na
concentração de ozono existente (Barreto, 2008).
O equilíbrio verificado na concentração de ozono estratosférico pode ser destruído
quando existe um radical livre com grande eletronegatividade capaz de reagir com a
molécula de ozono. A grande estabilidade do CFC permite que este migre desde a
troposfera à estratosfera inalterado. Quando o CFC chega à parte superior da estratosfera
é atingido por radiação eletromagnética mais energética, o que provoca a sua dissociação
fotolítica libertando um átomo de cloro (Cl), segundo a equação química:
( )→
(5-4)
O cloro que desta forma é libertado vai atacar o ozono, dando origem ao monóxido de
cloro.
Por sua vez, o monóxido de cloro reage com o oxigénio atómico e recicla o cloro que
desta forma pode voltar a reagir com outra molécula de ozono segundo as equações
químicas:
(5-5)
Alteração de solvente extrator
24
(5-6)
É estimado que através deste mecanismo, um único átomo de cloro possa degradar cerca
de 100,000 moléculas de ozono antes que este seja removido da estratosfera ou reaja e se
torne parte de um composto inativo (Tanimoto, 2000).
5.3. Políticas internacionais de controlo dos CFC
Em 1973, Mário Molina e Rowland juntaram-se numa investigação chegando à conclusão
que efetivamente a camada de ozono estava a ser destruída, por efeito dos CFC.
Em 1977, 32 países das Nações Unidas acordaram o ―Plano Mundial de Acão para a
proteção da camada de Ozono‖, visando dinamizar a investigação e estabelecendo-se o
Comité Coordenador para a Camada do Ozono. Quatro anos mais tarde, em 1981 são
realizadas as primeiras negociações com vista à concretização de uma convenção global,
que se viria a realizar no dia 22 de Março de 1985 em Viena, denominada ―Convenção de
Viena para a Proteção da Camada do Ozono‖. Esta convenção foi adotada por 28 países,
que se comprometeram a:
Proteger a saúde humana e o ambiente dos danos causados pela destruição da
camada do ozono.
Adoção de medidas de controlo das atividades humanas capazes de causar essa
destruição.
Cooperar em ações de investigação e na adoção de medidas legislativas, na
formulação de procedimentos e medidas.
No dia 16 de Setembro de 1987 foi assinado o ―Protocolo de Montreal sobre Substâncias
que Empobrecem a Camada do Ozono‖. Neste protocolo foram regulamentadas sob a
forma de lista, as substâncias sobre as quais deviam incidir os esforços para reduzir e/ou
proibir a sua produção e consumo. Como exemplo das metas estabelecidas estão a
obrigação em reduzir em 50%, os níveis de produção e consumo de cinco CFC para os
níveis verificados em 1986, até 1999. Para além desta meta, os subscritores ficaram
sujeitos à obrigação de:
Proibir a importação e exportação para qualquer estado não presente no protocolo
de Montreal.
Desencorajar a exportação de tecnologias de produção ou utilização de
substâncias regulamentadas para esses estados.
Alteração de solvente extrator CAPÍTULO 5
Alain Costa 25
Comunicar, num prazo de 3anos, os dados estatísticos de produção, importação e
exportação destas substâncias.
O protocolo de Montreal foi seguido de quatro emendas que vieram reforçar o protocolo
inicial. Emenda de Londres em 1990 que veio acrescentar 12 produtos químicos à lista
inicial de substâncias controladas. Em 1992 deu-se a emenda de Copenhaga que veio
adicionar os hidroclorofluorocarbonetos (HCFC), os hidrobromofluorcarbonetos (HBFC)
e o brometo de metilo à lista de substâncias controladas. No ano de 1997 a emenda de
Montreal estabeleceu uma data para a eliminação do brometo de metilo (2005) e uma
calendarização para a sua redução, assim como um sistema de licenças de importação e
exportação das substâncias regulamentadas com o objetivo de controlar o comércio ilegal.
Em 1999 surgiu a emenda de Pequim que veio adicionar o bromoclorometano à lista de
substâncias controladas assim como estender o controlo à produção de HCFC (UN,
1987).
Atualmente encontra-se em vigor o Regulamento (CE) nº. 1005/2009 de 16 de Setembro
que proíbe a utilização das substâncias que empobrecem a camada de ozono (também
apelidadas de ODS do termo inglês ―Ozono Depleting Substances‖). As ODS que se
encontram regulamentadas estão separadas por grupos e estão identificadas na Tabela 5-1.
Tabela 5-1- Tabela resumo contendo as substâncias regulamentadas
Grupo Abreviatura Descrição
Grupo I e II CFC Clorofluorcarbonetos (dos quais é
exemplo o Freon-113)
Grupo III HAL Halons
Grupo IV CTC Tetracloreto de Carbono
Grupo V TCA 1,1,1 - Tricloroetano
Grupo VI MB Brometo de Metilo
Grupo VII HBFC Hidrobromofluorocarbonetos
Grupo VIII HCFC Hidroclorofluorocarbonetos
Grupo IX BCM Bromoclorometano
Torna-se importante salientar que o regulamento (CE) nº. 1005/2009 de 16 de Setembro
regula não só as substâncias supra mencionadas, como também todos os seus isómeros.
As misturas, produtos ou equipamentos que contenham ou dependam destas substâncias
para funcionar encontram-se também abrangidos pelo regulamento (CE) nº. 1005/2009 de
16 de Setembro.
Alteração de solvente extrator
26
Relativamente ao 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoretano (Freon-113), este está incluído no
Grupo I, o grupo dos clorofluorcarbonetos e possui um potencial de empobrecimento da
camada de ozono de 0,8.
As empresas que pretendam beneficiar da isenção prevista para utilizações em
laboratórios deverão registar-se na base de dados dos ODS para laboratórios, com o
objetivo de obter um número de identificação (numero ID). Desta forma é possível
analisar os consumos de cada entidade. Contudo, apesar de ser possível utilizar o Freon-
113 na realização de padrões de referência ou padrões de calibração, é expressamente
proibido a utilização deste como solvente extrator na determinação de óleos, gorduras e
hidrocarbonetos em águas (Regulamento (CE) nº 1005/2009, 2009).
Sendo o Freon-113 o mais comum solvente de extração utilizado pelos laboratórios na
determinação de óleos, gorduras e hidrocarbonetos através da instrumentação FTIR, a
proibição do seu uso conduziu à necessidade de encontrar um substituto com capacidade
de extração e propriedades semelhantes, mas que não provocasse os danos ambientais que
lhe estão associados.
5.4. Tetracloroetileno, uma possível solução.
Conforme se referiu anteriormente, a proibição do Freon-113 para fins de extração levou
as entidades laboratoriais a repensar o método de análise de óleos, gorduras e
hidrocarbonetos. A necessidade de continuar com as análises de rotina abriu as portas a
dois grupos de alterações que podiam ser realizadas para assegurar a determinação de
óleos, gorduras e hidrocarbonetos. Essas alterações seriam:
Mudança de técnica de análise - envolve a mudança completa do método
analítico, isto é, mudança de equipamento, mudança de processo de extração e/ou
solvente de extração.
Mudança de solvente extrator - envolve mudança para um solvente de extração
com propriedades semelhantes às do Freon-113, que possibilitasse realizar a
análise FTIR.
Apesar de existirem alguns métodos analíticos que têm a capacidade de determinar a
quantidade de hidrocarbonetos com limites de quantificação muito baixos, estes não se
aplicam a óleos e gorduras. Por outro lado, implicariam alterações de equipamentos
relativamente ao método que estava em uso, o que incorre em custos avultados. Entre
estas técnicas incluem-se a extração de fase sólida seguida da análise do extrato num
aparelho de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas
(SPE-GC-MS), a microextraçao de fase sólida seguida da análise do extrato num aparelho
de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas (SPME-GC-MS)
ou a extração liquido-liquido com n-hexano como solvente extrator seguida de análise do
Alteração de solvente extrator CAPÍTULO 5
Alain Costa 27
extrato num aparelho de cromatografia em fase gasosa com detentor de ionização de
chama (LL-GC-FID) (Kvernheim, 1999).
O método de análise de SPME-GC-MS é eliminado como alternativa, pois a utilização
desta metodologia está limitada a hidrocarbonetos solúveis em água limpa (contendo
poucos resíduos). Apesar dos métodos SPE-GC-MS e LL-GC-FID permitirem a
determinação de OG e HDE em águas mais carregadas de resíduos, estes possuem
algumas limitações no processo de extração uma vez que, as amostras que chegam ao
laboratório, estão muitas vezes sobrecarregadas de resíduos.
Assim sendo, a mudança de solvente extrator tornou-se a solução mais simples e com
menor grau de exigência para a sua validação como método de análise.
Existem vários solventes orgânicos disponíveis, no entanto, há algumas propriedades
físico-químicas que o solvente tem de possuir para que a sua utilização neste método seja
viável. De acordo com que o foi referido no Capítulo 4, que faz referência aos princípios
do método de análise, o solvente extrator tem de satisfazer os seguintes critérios:
Não pode possuir na sua composição ligações carbono-hidrogénio (C-H).
Tem de possuir um elevado poder de extração de compostos orgânicos.
Ser imiscível com a água.
Estar disponível com grau de pureza apropriado para espectroscopia de
infravermelho.
Para além dos critérios supra mencionados que viabilizam o solvente, é necessário ter em
consideração os aspetos de segurança, tais como a toxicidade do solvente e os aspetos
financeiros como o custo que este possui.
Existem no mercado alguns solventes viáveis para o uso neste método analítico, tais
como:
Tetracloreto de Carbono
S-316
Tetracloroetileno
O tetracloreto de carbono apesar de satisfazer os critérios necessários encontra-se de
momento no Grupo IV das ODS, possuindo um potencial de empobrecimento da camada
de ozono de 1,1. Tal como o Freon-113, a sua utilização também é proibida para
extrações de acordo com o regulamento (CE) nº. 1005/2009 de 16 de Setembro, pelo que
não constitui alternativa.
O S-316, com fórmula química de CClF2CClFCClFCClF2 (dímero/trímero do
clorotrifluoretileno) é um solvente desenvolvido pela empresa Horiba. Satisfaz todos os
critérios necessários, possui um grande poder de extração e possui muito pouca
toxicidade. No entanto o S-316 possui um elevado custo de aquisição (EPA, 2005)
Alteração de solvente extrator
28
O Tetracloroetileno não possui ligações C-H, tem um grande poder de extração com a
capacidade de extrair dos hidrocarbonetos mais leves aos mais pesados e o seu custo de
aquisição é até inferior ao do Freon-113. No entanto o Tetracloroetileno possui elevada
toxicidade desenvolvendo alguns efeitos a curto/médio prazo na saúde humana, estando
ainda a ser efetuados testes relativamente ao potencial cancerígeno deste composto. A
ficha de dados de segurança do composto tetracloroetileno encontra-se no ANEXOS I.
Apesar da sua elevada toxicidade, este tem sido o solvente de eleição na substituição do
Freon-113, e será este o solvente que será utilizado na extração de óleos, gorduras e
hidrocarbonetos no presente relatório de estágio.
CAPÍTILO 6
Alain Costa 29
6. Materiais e método.
A determinação de óleos, gorduras e hidrocarbonetos por FTIR com recurso ao Freon-113
como solvente de extração é efetuada de acordo com o método 5520-C do ―Standard
Methods for the Examination of Water and Waterwaste‖ (APHA, 2005a).
6.1. Materiais e equipamento.
Para a realização do método em validação foram utilizados os seguintes materiais e
equipamentos:
Espectrofotómetro de Infravermelho Perkin Elmer RX I FT-IR
Células de 1cm e de 5cm de percurso óptico
Balança analítica AND ER 120A
Funis de vidro, ampolas de decantação, balões volumétricos, provetas de 50mL e
1000mL
Exsicador
Papel de filtro (ϕ=150mm marca ALBET- Labscience)
Micro-seringas e micro-pipetas.
6.2. Método
A determinação da concentração do analíto presente no extrato através do equipamento
FTIR é iniciada com a realização da leitura do background do solvente de extração. Este
procedimento tem o objetivo de registar o espectro de absorção correspondente ao
solvente. Tendo em consideração que o solvente não possui ligações C-H trata-se de um
―zero‖ do analíto. A quantidade de energia eletromagnética absorvida acima desse valor é
consequência da presença de óleos, gorduras ou hidrocarbonetos. A absorvância obtida na
análise do extrato é então comparada com a calibração realizada previamente com uma
solução de n-hexadecano, isooctano e benzeno (compostos de referência para este
método). A calibração é realizada através do método das diluições e está dividida em duas
gamas de trabalho, a gama baixa e a gama alta. A necessidade de realizar duas gamas de
trabalho apresenta não só implicações ao nível de retas de calibração como também
relativamente ao método e procedimento em causa. A utilização do novo solvente
(tetracloroetileno) trouxe também implicações no método de análise. A Tabela 6-1 tem
como objetivo exibir as diferenças existentes nas duas gamas de trabalho e nos dois
solventes utilizados na extração.
Materiais e método
30
Tabela 6-1- Diferenças relativamente às duas gamas de trabalho e aos dois solventes extratores.
Descrição Solvente: Freon-113 Solvente: Tetracloroetileno
Gama Baixa Gama Alta Gama Baixa Gama Alta
Célula 10 cm de percurso
ótico
1 cm de
percurso ótico
5 cm de
percurso ótico
1 cm de
percurso ótico
Volume da toma
de amostra
Normalmente
2000 mL
Normalmente
1000 mL
Normalmente
2000 mL
Normalmente
1000 mL
Técnica para
determinação de
volume de amostra
Método
Gravimétrico
Método
volumétrico
Método
Gravimétrico
Método
volumétrico
Volume de
solvente extrator
adicionado
15mL + 15mL +
10mL
30 mL + 30 mL
+ 30 mL
15mL + 15mL +
10mL
30 mL + 30
mL + 30 mL
Volume do extrato 25 mL 50 mL 25 mL 50 mL
Após se ter concluído o processo de extração e preparação do equipamento, a
concentração presente na amostra pode então ser determinada através da equação:
(6-1)
Em que:
Camostra – concentração presente na amostra,
Clida – concentração determinada através da absorvância obtida em FTIR por interpolação
das curvas de calibração realizadas,
Vext – volume total de extrato,
Vamostra – volume da toma de amostra,
D – fator de diluição utilizado que enquadra a absorvância dentro das gamas de trabalho.
6.3. Interferências/ limitações do método
Os solventes orgânicos têm a capacidade de dissolver não só óleos e gorduras mas
também outras substâncias orgânicas que não são necessariamente óleos e gorduras ou
hidrocarbonetos. Todas as substâncias que, apesar de não serem OG ou HDE possuem
ligações C-H vão ser quantificadas como tal, uma vez que nenhum solvente conhecido
tem a capacidade de extrair seletivamente apenas óleos, gorduras e hidrocarbonetos.
Materiais e método CAPÍTULO 6
Alain Costa 31
Assim sendo, a existência de compostos na amostra que, apesar de não serem óleos e
gorduras, são quantificados como tal, constituem uma interferência positiva. Por outro
lado resíduos mais pesados de petróleo podem conter uma porção significativa de
materiais que não são facilmente extraíveis, dificultando dessa forma a sua extração. A
dificuldade em extrair estes compostos com o solvente provoca que os compostos fiquem
retidos na amostra e constitui uma interferência negativa.
CAPÍTILO 7
Alain Costa 33
7. Validação do método
Um método de ensaio analítico é um processo que envolve manipulações suscetíveis de
acumularem erros (quer sistemáticos, quer aleatórios), podendo desta forma, em algumas
situações, alterar de forma significativa o valor do resultado final.
Quando é objetivo de um laboratório praticar métodos internos de ensaio capazes de
produzir resultados credíveis, é fundamental que estes disponham de meios e critérios
objetivos, para demostrarem através da validação, que os métodos internos de ensaio que
praticam conduzem a resultados adequados à qualidade pretendida. Na adequação do
rigor dos resultados à qualidade pretendida, é conveniente salientar que esse rigor não
deve ser nem demasiado baixo ao ponto de por em causa os resultados obtidos, nem
demasiado elevado, causando um aumento dos custos desnecessário (Eurachem, 1998).
Desta forma, a validação dos métodos internos deve ser adaptada a cada caso, sendo no
entanto requisito mínimo para a validação de métodos internos o estudo e conhecimento
dos seguintes parâmetro:
Gama de trabalho/linearidade;
Limiares analíticos (deteção e quantificação);
Sensibilidade;
Precisão;
Exatidão.
Estes parâmetros serão estudados nos próximos capítulos e seguem o descrito no Guia
Relacre nº13 (Relacre, 2000).
Com objetivo de facilitar a compreensão do processo de validação do método
―Determinação de óleos, gorduras e hidrocarbonetos por FTIR com o recurso ao
tetracloroetileno como solvente de extração‖, os subcapítulos que se seguem apresentam
inicialmente uma contextualização teórica, seguindo-se a apresentação dos resultados
obtidos durante o processo de validação.
O processo de validação do método pode ser decomposto por dois grupos de avaliação, a
avaliação indireta e a avaliação direta.
7.1. Avaliação indireta
Neste grupo de validação é efetuada a determinação e evidência dos parâmetros
característicos do método, tais como:
Seletividade,
Quantificação,
Precisão,
Exatidão.
Validação do método
34
7.1.1. Seletividade
A seletividade de um método é definida como sendo a capacidade que esse método possui
para identificar e distinguir o analíto numa mistura complexa sem a interferência de
outros componentes. Assim sendo, é necessário definir claramente o objeto de estudo da
análise com o objetivo de se evitar a ambiguidade nos resultados obtidos.
Um método de análise diz-se específico quando permite discriminar o analíto
relativamente a outras substâncias eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja,
quando este oferece garantias que a grandeza medida provem apenas do analíto em
estudo. O estudo de interferências, muitas vezes associadas a diferentes matrizes pode ser
realizado através de ensaios ou testes de recuperação utilizando uma série de amostras
representativas daquela matriz (Relacre, 2000; ISO/TS 13530, 2009). Os testes de
recuperação serão analisados em pormenor no Capítulo 8.1.4 uma vez que estes se
enquadram no controlo de qualidade.
Tendo em conta o princípio físico-químico que está na base deste método de análise, é
conveniente estudar a qualidade de diferentes fornecedores do solvente tetracloroetileno,
uma vez que a presença de ligações C-H, mesmo que em quantidades vestigial, afeta
gravemente a qualidade do resultado obtido. Devido à existência de várias marcas a
fornecer o solvente tetracloroetileno no mercado e tendo em conta que nem todas estas
marcas se adequam à extração de OG e HDE, foram realizados ensaios com o objetivo de
escolher a marca que garante a qualidade desejada.
Os ensaios consistiram em analisar o solvente tetracloroetileno após a extração de águas
que não possuíam OG (conhecido como branco extraído) e registar o seu espectro de
absorvência em FTIR. A determinação da qualidade do solvente foi determinada
procedendo-se à leitura da absorvância para o comprimento de onda de 2927 cm-1
relativamente ao seu background.
A Tabela 7-1 exibe os resultados de absorvância obtidos para cada marca.
Tabela 7-1 - Resultados de absorvância para cada marca de tetracloroetileno
Marca ABS do branco extraído
Merk -0,217
Fisher Chemical -0,153
Panreac PAI -0,024
Panreac PRS -0,224
Panreac PS -0,208
J.T. Baker 0,014
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 35
Através da análise da tabela, verifica-se que a marca que mais se adequa à extração em
fase aquosa é a J.T.Baker, pois esta apresentou a menor interferência após o seu contacto
com a água.
O facto de se verificar a existência de marcas com elevadas absorvâncias negativas
(relativamente ao seu background), poderá sugerir que o tetracloroetileno fornecido por
estas marcas em contacto com água perdem alguma capacidade de absorver radiação
eletromagnética no intervalo de frequência que varia entre os 2750cm-1
e os 3150cm-1
,ou
seja, o tetracloroetileno fornecido por estas marcas, poderá conter impurezas que são
miscíveis com a água, passando essas impurezas para a água no ato da extração. Desta
forma não é aconselhada a sua utilização na extração de OG e HDE, uma vez que
possuem a capacidade de mascarar a existência de grandes quantidades do analíto em
estudo falseando os resultados obtidos. Os espectros obtidos na determinação da
seletividade do solvente extrator encontram-se nos ANEXOS II.
7.1.2. Quantificação
Para grande parte dos métodos analíticos, o objetivo principal é a quantificação caso haja
a presença do analíto em estudo (no caso de analises qualitativas o objetivo é verificar a
presença ou ausência do analíto). Tendo em vista este objetivo, o analista deve apoiar-se
no cálculo de vários parâmetros, tais como:
Curvas de calibração;
Limiares analíticos do método de ensaio (limite de deteção e limite de
quantificação);
Sensibilidade.
7.1.2.1. Curvas de calibração
A calibração é um processo pelo qual a resposta de um sistema de medida é relacionada
com a concentração de um analíto.
A função calibração (sinal medido vs. concentração do analíto) obtém-se geralmente por
regressão linear do conjunto de pares ordenados, usando o método dos mínimos
quadrados. A aplicação do método dos mínimos quadrados exige que o eixo vertical, eixo
dos Y (variável dependente) seja sempre a resposta instrumental do equipamento e o eixo
horizontal, eixo dos X (variável independente), seja sempre a concentração do analíto.
Esta exigência resulta do facto dos erros estarem associados essencialmente aos valores
de Y.
Validação do método
36
Nos métodos instrumentais de análise a calibração analítica dos equipamentos geralmente
processa-se do seguinte modo:
Prepara-se uma série de soluções padrão em que a concentração do analíto
é conhecida.
Estas soluções padrão de calibração são medidas no equipamento analítico,
nas mesmas condições das amostras a analisar.
Estabelece-se o gráfico de calibração que relaciona o sinal do equipamento
com a concentração das soluções padrão (Relacre, 2000).
Após terem sido estabelecidas as gamas preliminares, cuja gama de concentrações está
compreendida no intervalo de 0,8-6mg/L para a gama baixa, e 6-30mg/L na gama alta,
foram efetuadas medidas de seis soluções padrão para cada gama. As concentrações das
soluções padrão foram preparadas a partir da solução padrão principal através do método
das diluições.
7.1.2.1.1. Verificação de linearidade
A linearidade é a capacidade de um método analítico produzir um sinal (neste caso
absorvância) que seja diretamente proporcional à concentração do analíto nas amostras.
Na verificação de linearidade de uma curva de calibração pode-se partir numa primeira
fase da análise da correlação linear.
O coeficiente de correlação r estabelece o nível da relação entre duas variáveis. O r pode
ter valores que variam no intervalo de [-1 ; +1], sendo que quando o r é igual a +1 ou -1
diz-se que a correlação é perfeita. O sinal indica o sentido da correlação, ou seja, se esta
for positiva indica que quando y cresce, x também cresce e quando é negativa significa
que quando y cresce, x decresce (Britto, 2009).
O coeficiente de correlação r pode ser calculado pela expressão:
∑ (∑ ) (∑ )
√[ ∑ (∑ ) ] [ ∑ (∑ ) ] (7-1)
Segundo os procedimentos de controlo de qualidade do CESAB, para o método sujeito a
validação é aceite uma correlação com valor R2>0,995.
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 37
No entanto, apesar de se obter um bom valor de coeficiente correlação, isto não significa
que a correlação linear seja a correlação que mais se ajusta. A utilização deste parâmetro
estatístico deverá ficar sujeita a alguns cuidados, nomeadamente a observação visual da
curva de calibração na realização de um gráfico de Y em função das concentrações dos
padrões com vista a detetar tendências não lineares dos resultados (Relacre, 2000).
A verificação de linearidade entre as variáveis pode efetuar-se comparando o ajuste linear
e um ajuste não linear (normalmente utiliza-se o ajuste polinomial de 2º grau), segundo o
―Teste de Mandel‖, apresentando-se para cada ajuste um desvio padrão residual sy1 e sy2
respetivamente.
A diferença das variâncias DS2 é calculada através da equação:
( ) ( )
(7-2)
DS2 e a variância da função calibração não linear são submetidas a um teste F com o
objetivo de se verificar se existem diferenças significativas. O valor PG necessário para o
teste F é calculado segundo a equação:
(7-3)
Quando PG<F, verifica-se que a função de calibração linear possui um melhor ajuste do
que a função não linear.
Quando PG>F, verifica-se que a análise da função calibração deverá ser efetuada através
de uma função de calibração não linear ou a gama de trabalho deverá ser reduzida o mais
possível com a finalidade de se obter uma função de calibração linear (Relacre, 2000).
A tabela que se segue apresenta os resultados obtidos na execução do ―Teste de Mandel‖
para as duas gamas de trabalho.
Tabela 7-2 - Resultados obtidos na execução do "Teste de Mandel"
PG Ftabelado
Gama baixa (0,8-6 mg/L) 0,90 9,12
Gama alta (6-30 mg/L) 3,81 9,12
Validação do método
38
De acordo com o resultados obtidos (com PG<F) verifica-se que a função linear possui
um melhor ajuste do que a função não linear para as gamas em causa, desta forma a
equação da reta que relaciona as duas variáveis é dada por:
(7-4)
Onde:
y = resposta dada pelo equipamento (altura do pico de absorvância)
x = concentração do analíto
a = declive da reta
b = intercessão da reta com o eixo dos y`s.
7.1.2.1.2. Teste de homogeneidade de variâncias
A norma ISO 8466 :Water Quality-Calibration and Evalution of Analytical Methods and
Estimation of Performance Characteristics, Part 1: Statistical Evaluation of the Liner
Calibration Function (ISO 8466 , 1990) indica que após a delimitação da gama de
trabalho com pelo menos 5 padrões (sendo recomendado 10) se verifique a
homogeneidade de variâncias ao longo das funções de calibração não ponderadas. Estas
partem do pressuposto que existe homogeneidade de variâncias ao longo da curva, o que
nem sempre é verdadeiro. Desta forma, é importante que se apliquem testes estatísticos de
forma a verificar que as variâncias associadas a cada padrão são independentes da
concentração e que portanto os erros associados aos padrões são similares (ISO 8466 ,
1990).
Segundo a ISO 8466 (1990) o teste estatístico conhecido como Teste de Fisher é o mais
recomendado e baseia-se na comparação de duas variâncias, a do padrão mais
concentrado (s2
M) com a do menos concentrado (s2
m) da curva, pois são estes os valores
que normalmente apresentam maiores variâncias.
Para se verificar a homogeneidade de variâncias, efetuam-se dez repetições do padrão
mais baixo (x1) e dez do padrão mais alto (x10) de cada gama de trabalho, obtendo-se
desta forma 10 valores da variável medida (yij).
As variâncias para as concentrações x1 e x10 são calculadas pela expressão:
∑ ( )
(7-5)
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 39
para i=1 e i=10, sendo:
∑
(7-6)
O valor de teste (PG) é calculado pelas equações que se seguem e o seu valor é
comparado com o valor tabelado na distribuição de Fisher.
(7-7)
(7-8)
A decisão estatística é a seguinte:
Se PG≤F a diferença entre variâncias não é significativa
Se PG>F a diferença entre variâncias é significativa e a gama de trabalho
deve ser reduzida até que esta se deva apenas a erros aleatórios (Relacre,
2000).
A Tabela 7-3 apresenta os resultados obtidos para o teste de homogeneidade de variâncias
efetuado nas duas gamas de trabalho.
Tabela 7-3- Apresentação dos resultados obtidos para o teste de homogeneidade de variâncias.
Gama de
Trabalho Parâmetros Resultado
Gama Baixa
(s2
m) 9,00E-07
(s2
M) 3,51E-06
PG 3,90
F 5,35
Gama Alta
(s2
m) 7,67E-07
(s2
M) 2,67E-06
PG 3,48
F 5,35
De acordo com os resultados obtidos e com as especificações descritas anteriormente,
verifica-se que as duas gamas de trabalho estão ajustadas e passam no teste de
Validação do método
40
homogeneidade das variâncias, estando assim provado que as gamas preliminares se
adequam e que a diferença entre as variâncias se deve exclusivamente a erros aleatórios.
7.1.2.2. Limite de deteção e limite de quantificação
Os conceitos de limite de deteção (LD) e limite de quantificação (LQ) têm grande
importância em química analítica pois é a partir destes que o analista traça os limiares
analíticos alcançáveis com o método que vai utilizar.
O limite de deteção, em termos gerais é a menor quantidade ou concentração de analíto
presente na amostra que pode ser fiavelmente distinguida do zero ou branco. Corresponde
ao início do intervalo em que é possível distinguir com uma dada confiança estatística
(normalmente 95%), o sinal do branco do sinal da amostra e desta forma indicar se o
analíto em questão está presente ou ausente. Desta forma, o limite de deteção é o limiar
analítico correspondente à mais pequena quantidade de analíto que pode ser detetada
numa amostra, mas não necessariamente quantificada com um valor exato. Obviamente
uma leitura inferior ao limite de deteção não significa que a ausência de analíto, significa
apenas que não se pode afirmar com a probabilidade definida a sua presença (IPAC,
2011).
Para a obtenção da definição correta de limite de deteção é necessário introduzir dois
conceitos estatísticos que dizem respeito a análises laboratoriais, o erro do tipo I e o erro
do tipo II.
O erro do tipo I (também conhecido como risco α) é a probabilidade de chegar à
conclusão da presença do analíto em estudo numa amostra, quando de facto ele
está ausente.
O erro do tipo II (também conhecido como risco β) é a probabilidade de chegar à
conclusão da ausência do analíto em estudo numa amostra, quando de facto ele
está presente.
Para uma correta análise dos limiares analíticos do método, estes dois tipos de erros
devem ser minimizados, optando-se por definir que α=β=5% (Relacre, 2000).
A determinação do limite de deteção nos casos em que o método envolve a utilização de
uma calibração linear é realizada segundo a equação:
(7-9)
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 41
sendo:
Sy/x – desvio padrão residual da curva de calibração;
b – declive da reta de calibração.
O intervalo compreendido entre o LD e o LQ deve ser entendido como uma zona de
deteção semi-quantitativa e não quantitativa, desta forma não devem ser reportados
valores numéricos neste intervalo (IPAC, 2011 ; ISO/TS, 2009).
O limite de quantificação (LQ) é estritamente a menor concentração de analíto que pode
ser determinada com um nível aceitável de precisão, corresponde ao início da gama em
que o coeficiente de variação do sinal se reduziu a valores razoáveis (normalmente 10%)
para se poder efetuar uma deteção quantitativa. Deste modo, na prática só podem ser
reportados valores de concentrações superiores ao LQ pelo que a curva de calibração do
equipamento para ser aceite deverá possuir um LQ inferior ao primeiro padrão da gama
(Relacre, 2000).
A determinação do limite de quantificação nos casos em que o método envolva a
utilização de calibração linear é realizada segundo a equação:
(7-10)
com:
Sy/x – desvio padrão residual da curva de calibração;
b – declive da reta de calibração.
Apesar do limite de quantificação teórico estar definido para o método, é necessário
proceder a atualizações dos limites experimentais sempre que ocorram alterações na
rotina do método.
Validação do método
42
7.1.2.3. Sensibilidade
A sensibilidade avalia a capacidade que um método ou equipamento possuem para
distinguir pequenas diferenças de concentração do analíto em estudo. Desta forma a
sensibilidade pode ser definida como sendo o quociente entre o acréscimo do valor lido
ΔAbs e a variação da concentração ΔC correspondente àquele acréscimo, segundo a
expressão:
(7-11)
Do ponto de vista matemático é possível determinar a sensibilidade de um método sujeito
a curva de calibração determinando a sua derivada de primeira ordem. Neste caso
particular a curva de calibração é definida por um modelo linear seguindo a expressão:
(7-12)
Desta forma a sensibilidade é constante ao longo de toda a gama de trabalho e igual ao
declive das retas de calibração de cada gama (Relacre, 2000).
A sensibilidade das gamas foi determinada através da média dos declives de cada gama
para as 10 retas de calibração efetuadas.
A Tabela 7-4 apresenta as sensibilidades de cada gama.
Tabela 7-4 - Sensibilidade apresentada pelo método nas duas gamas de trabalho
Gama de Trabalho Sensibilidade
Baixa (0,8 a 6 mg/L) 0,013
Alta (6 a 30 mg/L) 0,002
Verifica-se através dos resultados obtidos que a gama alta possui uma maior
sensibilidade.
De seguida serão apresentadas em forma de conclusão relativa à quantificação, duas
tabelas resumo referentes às 10 retas de calibração efetuadas para as duas gamas de
trabalho. A Tabela 7-5 e a Tabela 7-6 contem os coeficientes de correlação linear, os
declives das retas, as ordenadas na origem e os limites de quantificação experimental
obtidos. Os detalhes das 10 retas de calibração encontram-se no ANEXOS III.
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 43
As Tabela 7-5 e Tabela 7-6 apresentam um resumo dos resultados obtidos para as curvas
de calibração da gama baixa e da gama alta de trabalho.
Tabela 7-5 -Tabela resumo referente à gama baixa de trabalho (0,8 mg/L a 6 mg/L)
R2
Declive da Reta Ordenada na
Origem
Limite de Quantificação
Experimental
0,9998 0,0123 0,00129 0,172
0,9997 0,0132 0,00028 0,396
0,9998 0,0128 0,00165 0,334
0,9996 0,0133 0,00093 0,464
0,9998 0,0127 0,00001 0,338
0,9997 0,0134 0,00068 0,404
0,9995 0,0131 0,00261 0,510
0,9998 0,0128 -0,00101 0,334
0,9995 0,0129 0,00059 0,472
0,9998 0,0128 0,00099 0,330
Tabela 7-6-Tabela resumo referente à gama alta de trabalho (6 mg/L a 30 mg/L)
R2
Declive da Reta Ordenada na
Origem
Limite de Quantificação
Experimental
0,9995 0,0020 -0,00367 4,791
0,9997 0,0020 -0,00341 3,779
0,9997 0,0020 -0,00380 3,625
0,9995 0,0020 -0,00079 5,847
0,9997 0,0019 -0,00103 3,590
0,9995 0,0020 -0,00310 4,803
0,9995 0,0019 -0,00172 4,753
0,9996 0,0019 -0,00141 4,000
0,9996 0,0019 0,00034 4,414
0,9998 0,0019 0,00002 2,811
Validação do método
44
Através da análise Tabela 7-5 e Tabela 7-6, é possível verificar que os coeficientes de
correlação linear são superiores a 0,995 e que o limite de quantificação experimental é
inferior ao primeiro padrão de cada gama de trabalho.
7.1.3. Precisão
O cálculo da precisão tem como função avaliar a dispersão dos resultados obtidos por um
método em ensaios independentes, repetidos sobre a mesma amostra ou sobre padrões em
condições definidas. Desta forma, é possível analisar se o método é capaz de repetir e
reproduzir os resultados obtidos em análises anteriores sobre a mesma amostra/padrão. É
importante salientar a diferença existente entre precisão e exatidão (abordado no Capítulo
7.2). A Figura 7-1 facilita a compreensão dos termos precisão e exatidão.
Figura 7-1- Distinção dos termos exatidão e precisão.
Apesar de a precisão poder ser estudada em amostras reais ou padrões, é aconselhado, no
entanto, que se use amostras reais para minimizar o efeito matriz que poderá influenciar
os resultados obtidos e a determinação da precisão. De acordo com as diretrizes da
Relacre e da ICH (International Conference on Harmonisation), a precisão pode ser
considerada em três níveis: repetibilidade, reprodutibilidade e uma medida intermédia
designada por precisão intermédia ou variabilidade intralaboratorial (González et al,
2010; Relacre, 2000).
7.1.3.1. Repetibilidade
A repetibilidade expressa a precisão avaliada nas mesmas condições experimentais ao
longo de um intervalo de tempo curto. Por vezes, é denominado como intra-ensaio ou
intra-precisão e refere-se ao erro denominado como ―puro‖ aleatório associado com o
processo de medição de um ensaio. Desta forma, o método de ensaio deve ser efetuado no
mesmo padrão, em condições de operação tão estáveis quanto possível, tais como:
Mesmo laboratório
Mesmo equipamento
Mesmo tipo de reagentes
Mesmo analista
Realizado no mínimo intervalo de tempo possível.
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 45
A determinação da repetibilidade de um método dentro do próprio laboratório efetua-se
numa série de medições (com n≥10) sobre um mesmo padrão nas condições de
repetibilidade mencionadas anteriormente. Este procedimento poderá ser repetido em
séries de padrões com vários níveis de concentração com o objetivo de cobrir todo o
domínio das gamas de trabalho. No entanto, a determinação da repetibilidade nos
extremos de cada gama de trabalho é por si só satisfatória uma vez que são estes padrões
que mais estão sujeitos a desvios (González et al, 2010; Relacre, 2000).
O limite de repetibilidade designado de ―r‖ é o valor abaixo do qual se deve situar com
uma probabilidade específica (normalmente é 95%), a diferença absoluta entre dois
resultados obtidos em ensaio independentes nas condições mencionadas anteriormente.
Desta forma são aceites resultados de duas determinações efetuadas em condições de
repetibilidade quando:
| | (7-13)
Para o nível de confiança de 95%, o limite de repetibilidade é dado segundo a expressão:
√ (7-14)
Com Srj igual ao desvio padrão da repetibilidade (ISO 5725-6, 1994).
No método estudado foram realizadas 50 medições nos extremos de cada uma das gamas
de trabalho tendo sido obtidos os seguintes limites de repetibilidade.
Tabela 7-7- Desvios padrão da repetibilidade e limites de repetibilidade obtidos para cada extremo das duas
gamas de trabalho
Padrão Srj r
1º Padrão da gama baixa (0,8 mg/L) 0,074 0,207
Ultimo padrão da gama baixa (6 mg/L) 0,143 0,400
1º Padrão da gama Alta (6 mg/L) 0,574 1,600
Ultimo padrão da gama Alta (60 mg/L) 3,364 9,419
Validação do método
46
Outro fator a ter em conta no estudo da repetibilidade é o coeficiente de variação de
repetibilidade (CVr) expresso em percentagem que é numericamente igual ao desvio
padrão da repetibilidade (Srj) a dividir pela média dos resultados obtidos segundo a
expressão (ISO 5725-6, 1994):
(7-15)
A Tabela 7-8 apresenta os coeficientes de repetibilidade obtidos para os limites das duas
gamas de trabalho.
Tabela 7-8- Coeficientes de repetibilidade obtidos para os extremos das duas gamas de trabalho.
Padrão CVr (%)
1º Padrão da gama baixa (0,8 mg/L) 9,05
Ultimo padrão da gama baixa (6 mg/L) 2,45
1º Padrão da gama alta (6 mg/L) 9,04
Ultimo padrão da gama alta (60 mg/L) 5,52
Pela análise dos resultados expostos na tabela anterior verifica-se que os padrões iniciais
de cada gama de trabalho são os mais críticos, apresentando os coeficientes de
repetibilidade superiores. Desta forma pode-se concluir que os padrões iniciais se
encontram sujeitos a um maior número de erros aleatórios associados ao processo de
medição.
7.1.3.2. Reprodutibilidade
A reprodutibilidade expressa a precisão de um método efetuado em condições de ensaio
diferentes. Utiliza-se o mesmo método de ensaio, sobre a mesma amostra no entanto as
condições de trabalho são diferentes, tais como:
Operadores diferentes
Equipamentos diferentes
Laboratórios diferentes
Intervalo temporal diferente
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 47
O estudo de reprodutibilidade de um método tem importância fundamental quando se
pretende introduzir um novo método de análise na comunidade científica, uma vez que é
necessário averiguar se este é preciso sobre diferentes condições de trabalho. No entanto a
reprodutibilidade não tem tanta importância na validação de um método num laboratório
de análises, uma vez que se pretende que o método seja executado dentro desse mesmo
laboratório, utilizando o mesmo equipamento e com condições de trabalho que vão variar
pouco ao longo do tempo (González et al, 2010).
O limite de reprodutibilidade designado de ―R‖ é o valor abaixo do qual se deve situar
com uma probabilidade específica (normalmente é 95%), a diferença absoluta entre dois
resultados obtidos em ensaio independentes nas condições mencionadas anteriormente.
| | (7-16)
determinação do limite de reprodutibilidade pode ser efetuado a partir de ensaio
interlaboratoriais, desta forma são enviadas amostras com o teor de analíto igual para os
laboratórios participantes, os quais realizam o mesmo ensaio sobre essa mesma amostra.
O valor da reprodutibilidade é obtido do seguinte modo:
(7-17)
com:
- Variância da reprodutibilidade
-Variância interlaboratorial (associada aos erros sistemáticos)
-Variância da repetibilidade (associada aos erros aleatórios)
Através dos resultados obtidos no ensaio interlaboratorial realizado pela AQUACHECK
(Aquacheck Proficiency Scheme, march 2012) verificou-se que o método em estudo
apresenta um desvio padrão da reprodutibilidade (SRj) igual a 20,28.
Para o nível de confiança de 95%, o limite de reprodutibilidade é dado segundo a
expressão (ISO 5725-6, 1994):
√ (7-18)
Tendo sido obtido um limite de reprodutibilidade (R) igual a 57,56. Assim sendo, para
esta amostra, os resultados obtidos em laboratórios diferentes, com equipamentos
Validação do método
48
diferentes e operadores diferentes e num intervalo temporal diferente, serão considerados
satisfatórios se o módulo da diferença entre esses resultados, não ultrapassar 57,56.
O coeficiente de variação de reprodutibilidade (CVr) expresso em percentagem é
numericamente igual ao desvio padrão da reprodutibilidade (SRj) a dividir pela média dos
resultados obtidos segundo a expressão:
(7-19)
Tendo sido obtido um coeficiente de reprodutividade CVr igual a 16,34%. Verifica-se
desta forma que a mesma amostra analisada em laboratórios diferentes, com
equipamentos e analistas diferentes está sujeita a um coeficiente de variação de 16,34%.
7.1.3.3. Precisão intermédia
A precisão intermédia também conhecida como variabilidade intralaboratorial refere-se à
precisão avaliada sobre a mesma amostra ou padrão, utilizando o mesmo método, dentro
do mesmo laboratório, definindo exatamente quais as condições a variar tais como:
Operadores diferentes
Equipamentos diferentes
Intervalo temporal diferente
A precisão intermédia é reconhecida como sendo a mais representativa da variedade dos
resultados num laboratório (ou seja intralaboratorial), pelo que a sua determinação toma
um papel de grande importância.
A quantificação da precisão intermédia consiste em efetuar n medições sobre uma
amostra, ou neste caso um padrão (devido ao método em estudo ser destrutivo para a
toma de amostra), fazendo variar entre análises os parâmetros experimentais descritos
anteriormente. A determinação da precisão intermédia será realizada através das cartas de
controlo de amplitudes (abordada no capitulo referente controlo de qualidade), admitindo
que ao se efetuar ensaios em dias diferentes se faz variar aleatoriamente grande parte dos
parâmetros experimentais não controlados que afetam o desempenho do método (ISO,
1994; IPAC, 2007).
O valor da precisão intermédia é função da gama de concentração como tal, foram
analisadas as duas gamas em estudo.
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 49
A determinação da precisão intermédia é calculada reunindo os resultados de t padrões,
em que os t padrões têm de ser analisados em replicado as mesmas n vezes segundo a
equação:
√∑ ∑ ( )
( ) (7-20)
onde:
Sprecisão – desvio padrão relativo á precisão intermédia;
n- número de replicados;
yjk- resultado replicado k ( variando k entre 1 e n) do padrão j (variando j entre 1 e t);
-média aritmética dos resultados de n ensaios realizados sobre o padrão j (ISO 5725-3,
1994).
Tal como é evidenciado pela equação, a precisão intermédia calculada desta forma é
baseada na dispersão dos resultados obtidos entre ensaios.
A utilização desta equação na determinação da precisão intermédia exige que o termo t(n-
1) seja superior a 15.
A precisão intermédia foi calculada para a gama baixa realizando replicados dos padrões
de 0,8mg/l, 2mg/l e 4mg/l. A Tabela 7-9 apresenta os resultados obtidos.
Tabela 7-9- Desvio padrão relativo à precisão intermédia na gama baixa de trabalho
Parâmetro Valor
S0,8 0,054
S2 0,145
S4 0,106
Sprecisão 0,109
Validação do método
50
Para a gama alta a precisão intermédia foi calculada realizando replicados dos padrões de
6mg/l, 15mg/l, 45mg/l e 60 mg/l. A Tabela 7-10 apresenta os resultados obtidos.
Tabela 7-10- Desvio padrão relativo à precisão intermédia na gama alta de trabalho
Parâmetro Valor
S6 0,530
S15 0,757
S45 1,060
S60 1,427
Sprecisão 1,002
Tal como era expectável, existe uma maior dispersão dos resultados obtidos na gama alta.
7.1.4. Incerteza
Na linguagem comum, a incerteza está associada a um conceito geral de dúvida. Em
química analítica, incerteza refere-se ao conhecimento limitado acerca de um
determinado resultado obtido na realização de um método de análise. Incerteza numa
medição não implica que se coloquem dúvidas sobre a validade dessa medição, antes pelo
contrário, o conhecimento da incerteza implica a confiança acrescida na validade do
resultado obtido na medição efetuada. Desta forma é importante salientar a diferença
existente entre erro e incerteza. Erro, é definido como sendo a diferença entre o resultado
obtido e o valor tido como verdadeiro, assim sendo, erro é um valor único, e pode ser
aplicado na correção do resultado. A incerteza, por outro lado, toma a forma de uma gama
de valores, que quando avaliada para um método analítico e para um determinado tipo de
amostra, pode aplicar-se a todas as determinações realizadas por esse método, nesse tipo
de amostra (Camões, 2001; IPAC, 2007)
Apesar da sua importância na apresentação dos resultados obtidos, a incerteza é muito
provavelmente o parâmetro que menos consenso reúne junto da comunidade analítica.
Principalmente pelo facto de existirem diversos métodos aceites para a sua determinação,
que apresenta contudo resultados díspares. A dispersão dos resultados obtidos em cada
método na determinação da incerteza tem origem principalmente na forma como os
mesmos são obtidos e nos componentes que são abrangidos para a determinar. Alguns
destes componentes podem ser avaliados a partir da distribuição estatística dos resultados
de séries de medições, sendo caracterizados por desvios padrão. Outros componentes, que
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 51
também podem ser caracterizados por desvios padrão, são avaliados pela distribuição de
probabilidades convencionada, baseada na experiencia e em fontes adicionais. Estas duas
formas de avaliação são conhecidas como avaliações do Tipo A e do Tipo B,
respetivamente (Camões, 2001; IPAC, 2007).
Para a determinação da incerteza de um método é necessário determinar a incerteza
associada à componente da exatidão e à componente da precisão.
A determinação da incerteza associada à componente da precisão pode ser calculada a
partir da precisão intermédia calculada no Capítulo 7.1.3.3.
A determinação da incerteza associada à exatidão pode ser calculada através da análise de
amostras com analíto nativo sujeitas a fortificação. A incerteza associada à exatidão foi
quantificada através desta abordagem, uma vez que os ensaios de fortificação (também
apelidados de recuperações) abrangem as operações que mais contribuem para a incerteza
do método (extração da amostra, medição de volumes, retas de calibração) (IPAC, 2007).
No ensaio realizado para a determinação da incerteza associada à exatidão foram
efetuadas cinco extrações de uma amostra contendo o analíto nativo e cinco extrações
dessa mesma amostra fortificada com analíto nativo. O ensaio foi realizado procedendo-
se de acordo com o método em estudo.
A recuperação média do ensaio pode ser determinada pela equação:
(7-21)
Onde:
- Recuperação média
- Concentração média de analito nativo, ou seja concentração média da amostra
não fortificada;
- Concentração média da amostra observada após sua fortificação;
- Concentração da fortificação utilizada (IPAC, 2007).
A Tabela 7-11 apresenta os resultados obtidos para o ensaio em estudo.
Validação do método
52
Tabela 7-11- Parâmetros relativos à determinação da recuperação média obtida.
Parâmetro Resultado
16,351
9,986
24,367
0,803
A incerteza padrão u( ) que está associada a pode ser calculada segundo a
equação:
( ) √(
( ) ) (
( )
)
(7-22)
Onde:
Snativa- desvio padrão de uma série de análises da amostra não fortificada;
Sobs- desvio padrão de uma série de análises da amostra fortificada;
n – número de análises efetuada na amostra fortificada (IPAC, 2007).
O último termo da equação facilmente se torna desprezável através de uma seleção
cuidada dos padrões e operações volumétricas envolvidas na fortificação da amostra.
Desta simplificação resulta a equação:
( ) √(
( ) ) (7-23)
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 53
A Tabela 7-12 apresenta os resultados obtidos para o ensaio em estudo.
Tabela 7-12 -Parâmetros relativos à determinação da incerteza padrão
Parâmetro Resultado
0,257
0,381
5
( ) 0,031
Uma vez que o método sujeito a validação possui gamas de trabalho restritas, o resultado
final ―y‖ seria corrigido através da conjugação da incerteza associada à precisão (Sprecisão)
e a precisão associada à exatidão ( ) segundo a expressão IPAC, 2007):
( ) √ ( ( ) ) (7-24)
que para o teste realizado na gama alta fica:
( ) √ ( ) ) (7-25)
7.2. Avaliação direta
A avaliação direta tem como principal objetivo conhecer a exatidão dos métodos de
ensaio, ou seja, analisar a concordância entre o resultado fornecido pelo método em
análise e o valor de referência aceite como convencionalmente verdadeiro. Quando
aplicado a uma série de resultados, o termo exatidão combina os componentes de erros
aleatórios e componentes de erros sistemáticos (também conhecido como ―bias‖).
Na avaliação da exatidão de uma metodologia são utilizados os seguintes processos:
Materiais de Referência Certificados (MRC)
Ensaios Interlaboratoriais
Testes comparativos
Validação do método
54
7.2.1. Materiais de Referência Certificados (MRC)
Os materiais de referência certificados (MRC) destacam-se por possuir um valor de
concentração (ou outra grandeza) conhecida para um determinado parâmetro e com uma
incerteza associada a esse valor. Os MRC estabelecem a rastreabilidade das medições
químicas e permitem controlar a exatidão do método utilizado. Assim, poderão ser
utilizados durante a fase inicial de validação, na implementação ou como controlo de
qualidade na utilização quotidiana (IPAC, 2011).
A aquisição de um MRC deverá ser feita a um organismo fornecedor reconhecido e
credível tais como:
Instituto de Medições e Materiais de Referência (IRMM) da União Europeia
(anteriormente Bureau Comunitário de Referência (BCR));
National Institute of Standards and Technology (NIST) dos Estados Unidos da
América;
US Environmental Protection Agency dos Estados Unidos da América;
National Research Council do Canadá.
O uso do MRC consiste na sua análise para avaliar o desempenho do método usado pelo
laboratório. O valor obtido pelo método na análise de um MRC deve ser comparado com
o valor certificado determinando-se o erro e exatidão da análise. Quando o valor obtido
na análise do MRC não se encontra dentro do intervalo de incerteza indicado para o valor
certificado, o laboratório deverá procurar as causas na origem desse desvio e tentar
elimina-las ou aceita-las. A avaliação dos resultados obtidos na análise de um MRC pode
ser feita usando processos suplementares tais como:
Erro relativo
Teste de hipóteses (t-test)
Fator de desempenho Z (Z-scores)
Erro normalizado
Apesar do valor que a análise de MRC apresenta na validação de um método, não foram
realizados nenhuns ensaios pois estes tipos de materiais certificados envolvem alguns
custos.
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 55
7.2.2. Ensaios interlaboratoriais
Os ensaios interlaboratoriais têm como objetivo fazer a inter-comparação dos resultados
obtidos pelo laboratório com o valor aceite como verdadeiro, existindo diversos tipos de
ensaio interlaboratorial consoante os objetivos a que destinam. Entre outros, destacam-se:
Ensaios interlaboratoriais de aptidão, que tem como objetivo avaliar o
desempenho dos laboratórios participantes, funcionando em alguns países como
condição para acreditação do laboratório. Geralmente os participantes podem usar
os métodos que entenderem.
Ensaio interlaboratoriais de normalização, que tem como objetivo estudar as
características de um determinado método de análise, estudando a sua
reprodutibilidade e repetibilidade. Este tipo de ensaio interlaboratorial exige a
utilização exclusiva de um método em causa.
Desta forma se o objetivo de um Laboratório é demonstrar a repetibilidade e a
reprodutividade de um método, demonstrando em simultâneo que tem uma precisão
compatível com a de outros laboratórios pode recorrer a ensaios interlaboratoriais do tipo
de normalização. Quando tem por objetivo evidenciar a exatidão dos seus resultados,
pode participar em ensaios interlaboratorial de aptidão. Os ensaios interlaboratoriais são
também uma ferramenta de grande importância no controlo de qualidade externa uma vez
que asseguram a qualidade do resultado obtido pelo método (Relacre, 2000; IPAC, 2011).
A avaliação do desempenho obtido pelo laboratório pode ser quantificada através da
utilização do fator de desempenho ―Z-score‖. A utilização do fator de desempenho Z-
score engloba o resultado fornecido pelo método de análise em estudo, o resultado aceite
como verdadeiro e o desvio entre os resultados obtidos por todos os laboratórios presentes
naquele ensaio interlaboratorial específico, segundo a fórmula:
( )
(7-26)
Xlab – Valor obtido pelo Laboratório,
Xv – Valor aceite como verdadeiro (estabelecido no ensaio interlaboratorial),
S – Unidade de desvio (pode ser o desvio padrão da média dos laboratórios presentes no
ensaio interlaboratorial, a incerteza de Xv ou outro desvio que assente em critérios de
exigência da entidade organizadora) (Relacre, 2000).
Validação do método
56
O desempenho é avaliado geralmente segundo a seguinte escala de pontuação:
Figura 7-2- Avaliação do fator de desempenho "Z-score"
Ao longo do processo de validação do método foram realizados dois ensaios
interlaboratoriais, o primeiro foi realizado no dia 15 de março de 2011 e o segundo a 09
de março de 2012.
Na Tabela 7-13 representados os resultados obtidos nos ensaios interlaboratoriais.
Tabela 7-13 – Desempenho do Laboratório no ensaio interlaboratorial.
Analíto Data Xlab (mg/L) Xv (mg/L) Z-score
Óleos e Gorduras totais 15 março 2011 109,7 96,6 0,90
Óleos e Gorduras totais 09 março 2012 145,4 170,5 1,15
Pela análise dos resultados obtidos verifica-se que o Laboratório teve um desempenho
aceitável na determinação de óleos e gorduras através de FTIR recorrendo ao
tetracloroetileno como solvente de extração.
Através dos ensaios interlaboratoriais é também possível verificar se a incerteza do
resultado obtido (Ulab) está bem estimada, ou seja se o valor Xv está dentro do intervalo de
incerteza de Xlab. Se tal não acontecer o intervalo relativo à incerteza poderá estar
subestimado e será necessário recorrer ao conceito de erro normalizado (En) para avaliar
o desempenho. O erro normalizado é definido matematicamente como:
( )
√
(7-27)
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 57
onde:
Uref – incerteza associada ao valor Xv.
Se | |≤1, significa que Ulab está bem estimado (Relacre, 2000).
A
Tabela 7-14 apresenta os resultados obtidos na determinação do erro normalizado para os
dois ensaios interlaboratoriais efetuados.
Tabela 7-14 -Erro normalizado determinado através do ensaio interlaboratorial.
Analíto Data Ulab Uref En
Óleos e Gorduras totais 15 março 2011 27,25 0,5 0,48
Óleos e Gorduras totais 09 março 2012 42,63 0,6 0,59
Verifica-se através da análise dos resultados de En que a incerteza estabelecida para os
dois ensaios está bem estimada.
7.2.3. Testes comparativos
Os testes comparativos têm um contributo muito importante na validação de um método
interno de ensaio. Estes consistem na comparação de resultados obtidos a partir do
método em análise com os resultados obtidos com um método de referência validado.
O objetivo principal deste tipo de ensaios é o de comparar a proximidade dos resultados
obtidos pelos dois métodos de ensaio, avaliando desta forma a exatidão do método em
análise relativamente ao método de referência validado. Trata-se de uma forma mais
barata de avaliar a exatidão do método (Relacre, 2000).
Para a realização dos testes comparativos, foram efetuadas analises em replicado,
utilizando os dois solventes (Freon-113 e Tetracloroetileno) em separado sobre as
mesmas amostras.
Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 7-15.
Validação do método
58
Tabela 7-15 - Resultados obtidos na análise de amostras com Freon-113 e tetracloroetileno
[OG] (Tetracloroetileno)
(mg/l)
[OG] (Freon-113)
(mg/l)
Erro Relativo
(%)
Amplitude
Relativa (%)
158,861 157,870 0,63 0,63
88,014 82,860 6,22 6,03
20,190 20,550 1,75 1,77
19,163 19,070 0,49 0,48
223,850 214,710 4,26 4,17
14,357 13,870 3,51 3,45
14,719 14,580 0,96 0,95
1,275 1,270 0,43 0,43
427,981 417,020 2,63 2,59
311,615 320,370 2,73 2,77
124,646 129,960 4,09 4,17
64,378 61,350 4,94 4,82
0,736 0,640 15,00 13,95
36,300 37,170 2,34 2,37
Através da análise dos resultados obtidos, é possível verificar que os resultados obtidos
pelos dois solventes sobre as mesmas amostras são muito semelhantes. No entanto, é
recomendada a utilização de técnicas de análise estatística para melhor comparar os
resultados obtidos, nomeadamente:
Teste de Hipótese: teste t das médias
Teste de Hipótese: Teste t das diferenças
Teste da correlação linear entre os dois solventes utilizados.
O teste de correlação linear entre os dois solventes foi a técnica escolhida para a
comparação de resultados, uma vez que esta técnica é utilizada quando se pretende
comparar dois métodos com gamas de trabalho mais alargadas. A uniformidade entre os
resultados obtidos é avaliada pela equação do tipo y=b.x+a, ou de outra forma, para a
utilização do método dos mínimos quadrados e tendo em conta que se trata da
comparação entre solventes extratores, teremos a seguinte equação:
Validação do método CAPÍTULO 7
Alain Costa 59
(7-28)
A equação anterior representa a equação de regressão linear entre os dois solventes,
podendo-se considerar que os dois solventes não apresentam desvios sistemáticos quando
a equação anterior não for significativamente diferente de:
(7-29)
Ou seja:
O intervalo de confiança associado à ordenada na origem (a ± Sa.t), deve conter o
valor zero (0)
O intervalo de confiança associado ao declive (b ± Sb.t), deve conter o valor um
(1).
Em que Sa e Sb representam o desvio padrão da ordenada na origem e do declive
respetivamente, t representa o valor t tabelado para um nível de confiança de 95% e com
N-2 graus de liberdade, sendo N o número de amostras analisadas.
Caso se verifiquem estas duas condições simultaneamente poderá dizer-se que os dois
solventes são estatisticamente concordante para a gama de concentrações em estudo e
para o nível de confiança estabelecido (95%) (Relacre, 2000).
O Gráfico 7-1 apresenta as concentrações obtidas usando Freon-113 como solvente
extrator vs. concentrações obtidas usando tetracloroetileno como solvente extrator.
Gráfico 7-1- Comparação dos resultados obtidos usando Freon-113 e Tetracloroetileno.
y = 1,0101x - 0,0153 R² = 0,9986
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 100 200 300 400
Co
nce
ntr
ação
ob
tid
a co
m
Tetr
aclo
roe
tile
no
(m
g/l)
Concentração obtida com Freon-113 (mg/l)
Validação do método
60
Através da análise do gráfico verifica-se que os resultados obtidos pelos dois solventes
são bastante semelhantes, possuindo um coeficiente de correlação linear (R2) igual a
0,9986, o que indica que a reta obtida descreve a distribuição dos resultados obtidos.
O desvio padrão associada a ordenada na origem (Sa) e o desvio padrão associado ao
declive (Sb) foram calculados através do uso da ferramenta estatística ―Regressão‖ da
análise de dados da folha de cálculo do ―Microsoft Excel‖.
Na Tabela 7-16 estão apresentados os resultados obtidos nesta análise estatística.
Tabela 7-16-Parâmetros estatísticos determinados para os testes comparativos.
Parâmetro Resultado
Sa 0,003
Sb 0,514
t 2,179
t.Sa 0,007
t.Sb 1,120
Desta forma a equação que descreve a distribuição dos resultados obtidos, com o
intervalo de confiança considerado associado à ordenada na origem e ao declive é:
( ) ( ) (7-30)
Apesar do intervalo de confiança associado ao declive não conter o valor de um (1), a sua
proximidade a esse valor, assim como o fato do intervalo de confiança associado à
ordenada na origem conter o valor zero (0), permite concluir que os dois solventes são
estatisticamente semelhantes para um nível de confiança de 95%.
CAPÍTILO 8
Alain Costa 61
8. Controlo de qualidade do método.
Hoje em dia o controlo de qualidade ao nível de análises físico-químicas engloba ações
concretas, no dia-a-dia, com o objetivo de garantir que os resultados obtidos sejam de
confiança, ou seja, a ausência de erros nos ensaios que são realizados. Com o objetivo de
determinar se uma amostra tem ou não a qualidade pretendida devem medir-se
sistematicamente as concentrações dos compostos que são representativos da qualidade
da dessa mesma amostra. No procedimento normal de análises físico-químicas, as
manipulações envolvidas são suscetíveis de acumularem erros (quer erros aleatórios quer
erros sistemáticos) que podem afetar de uma forma mais ou menos significativa os
resultados finais obtidos. Assim sendo, é de extrema importância para um laboratório
dispor de meios e critérios objetivos para demonstrar que os métodos de ensaio que são
praticados apresentam resultados confiáveis e adequados à qualidade pretendida (Relacre,
2000).
O controlo de qualidade num laboratório é geralmente dividido em controlo de qualidade
interno e controlo de qualidade externo. O controlo de qualidade interno depende dos
meios do próprio laboratório e o controlo de qualidade externo depende de ações que
sirvam de comparação com outros laboratórios.
8.1. Controle de qualidade Interno
O controlo de qualidade interno é o conjunto dos procedimentos postos em prática no
laboratório em análises de rotina, com o objetivo de permitir o controlo da qualidade dos
resultados obtidos à medida que as mesmas são executadas. Em análises físico-químicas,
utilizam-se procedimentos como análise das curvas de calibração obtidas através de cartas
de aceitação de declives, análise de brancos, análise de padrões de controlo, análise de
duplicados, ensaios de recuperação e cartas de controlo.
O controlo de qualidade interno estabelecido num laboratório para controlo das analises
de rotina devem ser baseados em:
Uso de Materiais de Referencia Internos (MRI);
Uso de técnicas complementares de controlo de qualidade;
Uso de cartas de controlo estatístico – (Relacre, 1996)
Os materiais de referência internos (MRI), normalmente preparados no laboratório
(padrões de controlo), devem possuir uma estabilidade que permita o controlo da precisão
ao longo do tempo.
As técnicas complementares incluem a análise de brancos em paralelo com as amostras,
uso de análise de duplicados e testes de recuperação.
Controlo de qualidade
62
8.1.1. Cartas de Controlo
As cartas de controlo são uma ferramenta muito útil e com elevada eficiência para exercer
e visualizar um controlo continuo sobre os resultados produzidos. Através destas é
possível detetar erros que possam ocorrer, verificando-se desta forma se o processo se
encontra sob controlo ou não. As cartas de controlo foram introduzidas por Shewhart em
1931, e o conceito subjacente à sua utilização não mudou desde então, ou seja, permitir o
controlo de qualidade dos resultados obtidos através de uma representação gráfica
(Relacre, 1996).
Existem três tipos básicos de cartas de controlo, as cartas de Shewhart de médias ou
indivíduos, as cartas de amplitudes e as cartas de somas cumulativas. Cada um destes
tipos de cartas tem as suas vantagens e inconvenientes, pelo que consoante os objetivos
de cada controlo convém optar pelo tipo mais adequado. Apesar das diferenças existentes
entre as cartas, existe um ponto em comum que é a necessidade de se ter o método
analítico sob controlo estatístico para as cartas poderem ser utilizadas, sendo que, um
método analítico se encontra sobre controlo estatístico quando estiver sujeito apenas a
fontes de variação estáveis (embora este possa estar afetado por erros sistemáticos).
Assim, a obtenção de um estado de controlo estatístico, por si só não garante a exatidão
dos resultados. No entanto, sem se ter atingido essa estabilidade, não faz sentido fazer
qualquer afirmação ou análise sobre a exatidão dos resultados obtidos por um laboratório,
uma vez que não há garantia de representatividade (Relacre, 1996).
Neste relatório serão utilizadas as cartas de controlo de médias ou indivíduos ou as cartas
de amplitudes.
8.1.1.1. Cartas de controlo de médias ou indivíduos
As cartas de controlo partem do princípio que a ocorrência de erros é puramente aleatória,
pelo que a distribuição de pontos em torno do valor médio (Xm) segue a Lei Normal de
Gauss. Assim sendo, a probabilidade de um ponto se situar a mais de dois desvios-padrão
(2S) do valor médio é 5%, e a mais de 3 desvios-padrão (3S) não excede os 0,3%.
Assim sendo, além de uma linha central correspondente ao valor médio (Xm) costumam
representar-se também uma série de linhas de referência tais como:
Limite Inferior de Controlo (LIC) que corresponde a Xm-3S
Limite Inferior de Aviso (LIA) que corresponde a Xm-2S
Limite Superior de Aviso (LSA) que corresponde a Xm+2S
Limite Superior de Controlo (LSC) que corresponde a Xm+3S.
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 63
As cartas de controlo de indivíduos são baseadas em observações individuais e apesar de
serem mais simples de construir, são menos sensíveis que as cartas de controlo de médias.
No entanto, ambas são elaboradas de forma análoga.
A elaboração de uma carta de Shewart começa com a análise de pelo menos 10 ensaios
prévios, estabelecendo-se o valor médio e o respetivo desvio-padrão. Estes ensaios
prévios devem ser realizados num espaço de tempo semelhante ao que depois será
utilizado para representar os dados. Após realização destes ensaios e a respetiva
determinação da média e do desvio-padrão, traça-se a carta de controlo e inicia-se a
representação dos pontos correspondentes às análises a controlar. Os vários guias
recomendam a realização de pelo menos um controlo por cada série de análises e por lote
de 20 análises (IPAC, 2011; Relacre, 1996).
A atualização das cartas de controlo são realizadas normalmente a cada 50 pontos e o
novo valor médio e desvio-padrão é calculado a partir de todos os pontos (excluindo os
fora-de-controlo) obtidos e representados na última carta, ou apenas a partir dos pontos
mais recentes. A nova carta irá ser construída com base nestes valores atualizados, e nela
irão ser representados os novos pontos de controlo, dando continuidade desta forma ao
processo de controlo estatístico (Relacre, 1996).
8.1.1.2. Cartas de amplitudes.
As cartas de controlo de amplitudes assumem que estando o método sob controlo
estatístico, os desvios entre réplicas se mantêm dentro de limites pré-determinados.
Assim, como nas cartas de médias ou indivíduos, as cartas de amplitudes também
implicam a realização de estudos prévios para conhecer o valor médio (Rm) das diferenças
entre duplicados ou da amplitude (diferença entre o máximo e o mínimo) para maior
número de réplicas. Geralmente a linha de controlo nas cartas de amplitude tomam o
valor de 3,27Rm (Relacre, 1996).
Controlo de qualidade
64
8.1.2. Carta de aceitação de declives.
A carta de aceitação de declives tem como principal objetivo verificar a validade dos
declives das retas de calibração. A validação dos declives é conseguida através de um
―histórico‖ de declives que são recolhidos ao longo da execução das sucessivas
calibrações. O fundamento básico deste critério de aceitação baseia-se na média dos
declives determinados anteriormente.
A carta de aceitação de declives dá ao analista a capacidade de rejeitar retas de calibração
que possam ter sido afetadas por interferentes que influenciem de forma proporcional
cada padrão de calibração, originando desta forma uma calibração que apesar de cumprir
os critérios de aceitação (LQ inferior ao primeiro padrão de calibração da gama de
trabalho e coeficiente de correlação linear superior a 0,995) não traduz a verdadeira
concentração de analíto.
Para a obtenção da carta de aceitação de declives foram utilizados as 10 curvas de
calibração de cada gama.
O Gráfico 8-1 apresenta a carta de aceitação de declives da gama baixa (0,8-6mg/L)
Gráfico 8-1- Carta de aceitação de declives das retas de calibração na determinação de óleos gorduras e
hidrocarbonetos na gama de 0,8 - 6mg/L (gama baixa).
0,0018
0,0019
0,0020
0,0021
0,0022
1 3 5 7 9 11
De
cliv
es
Ensaios
Carta de aceitação de declives da gama baixa
LS
X
LIC
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 65
Na Tabela 8-1 apresenta os limites de aceitação para a carta de aceitação de declives na
gama baixa (0,8-6mg/L).
Tabela 8-1- Quadro resumo para a carta de aceitação de declives, na gama de 0,8 - 6mg/L (gama baixa)
Em que:
= Média dos declives de n ensaios de calibração
S = Desvio padrão de n ensaios de calibração
LSC = + 3S = Limite Superior de Controlo
LIC = - 3S = Limite Inferior de Controlo
De Gráfico 8-2 apresenta a carta de aceitação de declives para a gama alta (6 – 30mg/L)
Gráfico 8-2 - Carta de aceitação de declives das retas de calibração na determinação de óleos gorduras e
hidrocarbonetos na gama de 6 - 30mg/L (gama alta).
0,0017
0,0018
0,0019
0,0020
0,0021
0,0022
1 3 5 7 9 11
De
cliv
es
Ensaios
Carta de aceitação de declives da gama alta
LSC
X
LIC
Parâmetro Valor Absoluto
1,29E-02
S 3,58E-04
3S 1,01E-03
LSC 1,40E-02
LIC 1,19E-02
Controlo de qualidade
66
Na Tabela 8-2 estão representados os limites de aceitação para a carta de aceitação de
declives na gama de 6 - 30mg/L (gama alta).
Tabela 8-2- Quadro resumo para a carta de aceitação de declives, na gama de 6 - 30mg/L (gama alta).
8.1.3. Materiais de referência internos
Os materiais de referência internos (MRI), muitas vezes designados como materiais de
referência do laboratório, são um auxiliar precioso e fundamental do controlo de
qualidade interno e devem possui as seguintes características:
Estáveis a médio/longo prazo, de modo a permitir a comparação de lotes de MRI
novos com antigos e assim avaliar continuamente a variabilidade de resultados no
tempo.
A homogeneidade de cada lote de MRI ser igual ou superior à precisão/fidelidade
exigida nos resultados.
O valor de referência do MRI deve ser atribuído tomando as precauções
necessárias para garantir a sua exatidão (por exemplo, por aferição com um MRC
ou por confrontação de técnicas) (IPAC, 2011; Relacre, 1996).
É através dos MRI que são efetuados os padrões de calibração e de controlo. No entanto,
os padrões de calibração e de controlo devem ser efetuados a partir de MRI
independentes. As concentrações usadas nos padrões de controlo devem ser parecidas
com as das amostras (para as analises de rotina) e estabelecidas perto de zonas de
interesse (é obrigatório a utilização de padrões nos limiares das gamas de trabalho).
Por principio, o controlo de qualidade interno através de padrões deve corresponder a
pelo menos 5% do volume de amostras (a menos que a norma de ensaio ou a legislação
especifique outra frequência), ou seja, a cada 20 análises de amostras (IPAC, 2011). No
método em estudo no presente trabalho é realizado o controlo de qualidade a cada 28
amostras.
Parâmetro Valor Absoluto
1,90E-03
S 4,84E-05
3S 1,45E-04
LSC 2,10E-03
LIC 1,80E-03
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 67
Os resultados obtidos na análise de MRI podem ser usados e representados em cartas de
controlo, e desta forma podem-se obter informações sobre a estabilidade da resposta do
equipamento, estados dos reagentes e desempenho do analista (Relacre, 1996).
Apesar de serem analisados vários padrões de controlo ao longo das gamas de trabalho
possuindo estas também cartas de controlo de indivíduos, apenas serão analisadas as
cartas de controlo de indivíduos para os padrões de limite de quantificação das duas
gamas de trabalho (0,8mg/L na gama baixa, 6mg/L na gama alta). O intervalo de
aceitação utilizada para estes padrões corresponde a 20% do valor teórico submetido a
análise.
O Gráfico 8-3 apresenta a carta de controlo para o Padrão de limite de quantificação da
gama baixa.
Gráfico 8-3- Carta de controlo para o padrão de verificação de limite de quantificação da gama baixa.
O Gráfico 8-4 apresenta a carta de controlo para o Padrão de limite de quantificação da
gama alta.
Gráfico 8-4 - Carta de controlo para o padrão de verificação de limite de quantificação da gama alta.
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Pad
rão
Co
ntr
olo
Ensaios
Carta de controlo do padrão 0,8 mg/L
LSC
LIC
X
4,5
5
5,5
6
6,5
7
7,5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Pad
rão
Co
ntr
olo
Ensaios
Carta de controlo do padrão 6 mg/L
LSC
LIC
X
Controlo de qualidade
68
Verifica-se através da análise dos Gráfico 8-3 e Gráfico 8-4 que os padrões de verificação
de limite de quantificação obtidos para as duas gamas de trabalho se encontram dentro do
intervalo de aceitação.
8.1.4. Testes de recuperação
Em análises laboratoriais uma importante fonte de erros aleatórios e sistemáticos nos
resultados obtidos resultam da presença de interferentes característicos de certas matrizes,
que causam um aumento ou diminuição da resposta analítica obtida (efeito matriz). Tal
como foi descrito anteriormente, os testes de recuperação poderiam estar inseridos no
capítulo referente à seletividade do método, no entanto, como são realizados testes de
recuperação recorrentemente como ferramenta de controlo de qualidade, optou-se por
descrevê-los neste capítulo.
Os testes de recuperação desempenham um papel essencial na análise da ―qualidade‖ da
resposta analítica obtida em diversas matrizes, devendo ser realizados regularmente em
extrações de rotina. Estes testes têm como objetivo identificar a viabilidade do método em
diferentes matrizes que correspondem a amostras reais e consistem na introdução de uma
quantidade conhecida de analíto numa amostra real, formando desta forma, uma amostra
fortificada. As duas amostras são posteriormente analisadas e é determinada a
percentagem de recuperação. Como a amostra fortificada é obtida adicionando uma
quantidade fixa de uma solução padrão à amostra real, a percentagem de recuperação
pode ser calculada usando a seguinte equação:
( )
(8-1)
em que:
V e Ca são o volume e a concentração da solução padrão (os seus valores são
conhecidos),
V1 e Cr são o volume e a concentração da amostra real (os seus valores são
medidos),
V+V1 e Cs representam o volume e a concentração da amostra fortificada (os seus
valores são medidos) (ISO, 2009).
A percentagem de recuperação indica a eficácia com que o analíto introduzido numa
amostra é recuperado, e o seu valor deve rondar os 100%. Apesar de para diversos
métodos a percentagem de recuperação ideal se encontre no intervalo de 90-110%, neste
método as recuperações são consideradas satisfatórias para percentagens de recuperação
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 69
que se encontrem no intervalo 70-130% uma vez que podem existir muitas perdas no
processo de extração.
Apesar dos testes de recuperação serem uma ferramenta muito importante na análise da
―qualidade‖ da resposta analítica em diversas matrizes, na metodologia em causa o uso de
testes de recuperação não reúne consenso, uma vez que para a realização destes testes é
necessário subdividir as amostras, e no procedimento normal em rotina de análise tal não
pode acontecer pois a amostra deve ser analisada como um todo.
8.1.4.1. Teste de recuperação na gama baixa (0,8 a 6mg/L)
Neste capítulo serão apresentados os resultados obtidos nas experiências de recuperações
na gama baixa de trabalho, tendo sido efetuadas recuperações em amostras salinas,
amostras de água subterrâneas e em amostras de água superficial.
8.1.4.1.1. Recuperações em amostras salinas
De acordo com a necessidade de analisar a capacidade de extração do solvente
tetracloroetileno em amostras salinas, foram realizados testes de recuperação em amostras
contendo diferentes concentrações de OG dentro da gama baixa. Para obter águas salinas
foram adicionadas 70g de NaCl a cada amostra de água limpa (água ultrafiltrada) tendo
sido lida posteriormente a sua condutividade. A amostra ―Branco‖ refere-se a uma
extração realizada com água limpa não fortificada. As amostras A, B, C, D, E, e F
referem-se a amostras fortificadas.
O processo de extração seguiu o procedimento normal para análise de amostras de gama
baixa.
A Tabela 8-3 apresenta os resultados obtidos para os testes de recuperação em águas
salinas realizados no processo de validação do método.
Controlo de qualidade
70
Tabela 8-3- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas salinas de gama baixa.
Amostra Condutividade
(mS)
Contaminação
(mg/L)
[OG] na amostra lida
por FTIR (mg/L)
Percentagem de
Recuperação (%)
Branco 42,5 0 7,92E-03
A 40,5 9,79E-03 1,76E-02 98,61
B 40,9 1,96E-02 1,95E-02 94,67
C 42,2 2,94E-02 2,63E-02 93,69
D 40,2 3,92E-02 3,49E-02 92,06
E 40,6 4,90E-02 4,36E-02 91,25
F 41,6 1,96E-02 5,14E-02 88,79
Verifica-se, através da análise das percentagens de recuperação obtidas que o método em
causa é viável para determinação de OG em matrizes de águas salinas, uma vez que as
percentagens de recuperação se encontram dentro do intervalo aceitável para este método.
8.1.4.1.2. Recuperações em amostras de águas subterrâneas.
Com o objetivo de analisar a capacidade de extração do solvente tetracloroetileno em
amostras de águas subterrâneas, foram realizados ensaios de recuperação em cinco
amostras de águas subterrâneas contendo diferentes concentrações de OG dentro da gama
baixa. As amostras foram retiradas de um ―furo‖ de extração de água, procedendo-se à
sua fortificação e posterior extração. A amostra designada de ―Branco‖ refere-se à
extração de uma amostra de água subterrânea não fortificada. As amostras A, B, C, D e E
referem-se a amostras contaminadas.
O processo de extração seguiu o procedimento normal para análise de amostras de gama
baixa.
A Tabela 8-4 apresenta os resultados obtidos para os testes de recuperação em águas
subterrâneas realizados no processo de validação do método.
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 71
Tabela 8-4 - Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas subterrâneas de gama
baixa.
Amostra Contaminação
(mg/L)
[OG] na amostra lida
por FTIR (mg/L)
Percentagem de
Recuperação (%)
Branco 0,00 5,02E-03
A 9,79E-03 1,47E-02 98,61
B 1,96E-02 2,34E-02 93,69
C 2,94E-02 3,11E-02 88,77
D 3,92E-02 3,88E-02 86,31
E 4,90E-02 4,94E-02 90,76
Verifica-se, através da análise das percentagens de recuperação obtidas que o método em
causa é viável para determinação de OG em matrizes de águas subterrâneas, uma vez que
as percentagens de recuperação se encontram dentro do intervalo aceitável para este
método.
8.1.4.1.3. Recuperações em amostras superficiais
De acordo com a necessidade de analisar a capacidade de extração do solvente
tetracloroetileno em amostras de águas superficiais, foram realizados ensaios de
recuperação em cinco amostras de águas superficiais contendo diferentes concentrações
de OG dentro da gama baixa. As amostras foram recolhidas de um ribeiro, procedendo-se
à sua fortificação e posterior extração. A amostra designada de ―Branco‖ refere-se à
extração de uma amostra de água subterrânea não fortificada. As amostras A, B, C, D e E
referem-se a amostras fortificadas.
O processo de extração seguiu o procedimento normal para análise de amostras de gama
baixa.
A Tabela 8-5 apresenta os resultados obtidos para os testes de recuperação em águas
superficiais realizados no processo de validação do método.
Controlo de qualidade
72
Tabela 8-5- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras de águas superficiais de gama baixa
Amostra Contaminação
(mg/L)
[OG] na amostra lida
por FTIR (mg/L)
Percentagem de
Recuperação (%)
Branco 0,00 3,09E-03
A 9,79E-03 1,18E-02 88,75
B 1,96E-02 2,24E-02 98,62
C 2,94E-02 2,92E-02 88,77
D 3,92E-02 3,88E-02 91,24
E 4,90E-02 5,14E-02 98,65
Verifica-se, através da análise das percentagens de recuperação obtidas que o método em
causa é viável para determinação de OG em matrizes de águas superficiais, uma vez que
as percentagens de recuperação se encontram dentro do intervalo aceitável para este
método.
8.1.4.2. Testes de recuperação na gama alta (6 a 30mg/l)
Neste capítulo serão efetuadas recuperações na gama alta de trabalho, tendo sido
efetuadas recuperações em amostras de águas residuais.
8.1.4.2.1. Recuperações de amostras em águas residuais
Com o objetivo de analisar capacidade de extração do solvente tetracloroetileno em
amostras residuais, foram realizados ensaios de recuperação numa amostra residual
contendo diferentes concentrações em OG dentro da gama alta. Uma amostra residual foi
dividida em cinco tomas de amostra contendo volumes iguais (100 ml). A amostra
designada de ―Branco‖ refere-se à extração de uma amostra de água residual não
fortificada. As amostras A, B, C, e D referem-se a amostras fortificadas.
O processo de extração segue o procedimento normal para análise de amostras de gama
alta.
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 73
A Tabela 8-6 apresenta os resultados obtidos para os testes de recuperação em águas
residuais realizados no processo de validação do método.
Tabela 8-6- Resultados obtidos para os testes de recuperação em amostras residuais.
Amostra Contaminação
(mg/l)
[OG] na amostra lida
por FTIR (mg/l)
Percentagem de
Recuperação (%)
Branco 0,00 16,351
A 3,33 19,948 110,09
B 6,66 21,747 83,26
C 9,99 23,802 77,04
D 13,31 29,454 101,42
Verifica-se, através da análise das percentagens de recuperação obtidas que o método em
causa é viável para determinação de OG em matrizes de águas residuais, uma vez que as
percentagens de recuperação se encontram dentro do intervalo aceitável para este método.
8.1.4.3. Carta de aceitação para os ensaios de recuperação
Como foi visto anteriormente, os ensaios de recuperação possuem resultados satisfatórios
quando são atingidas percentagens de recuperação que se incluam no intervalo de 70-
130%.
As cartas de controlo de indivíduos aqui utilizadas englobam os resultados obtidos na
validação do método e os resultados obtidos ao longo do controlo de qualidade efetuado
por rotina.
Assim sendo a Tabela 8-7 refere os limites de aceitação para a carta de controlo dos
ensaios de recuperação.
Tabela 8-7- Limites de aceitação utilizados nos ensaios de recuperação
Parâmetro Percentagem de
recuperação (%)
100
LIC 70
LSC 130
Controlo de qualidade
74
O Gráfico 8-5 apresenta a carta de controlo dos ensaios de recuperação para a gama
baixa.
Gráfico 8-5- Carta de aceitação para ensaios de recuperação da gama baixa utilizando os limites iniciais.
Como se verifica pela análise do gráfico, parece existir uma tendência nos resultados
obtidos. Assim sendo é necessário fazer a atualização da carta de aceitação para ensaios
de recuperação da gama baixa. A nova carta de aceitação é determinada através da
determinação média e do desvio padrão calculado nos testes realizados, de acordo com o
descrito anteriormente.
A Tabela 8-8 que se segue apresenta os novos limites de aceitação para a carta de
controlo de testes de recuperação.
Tabela 8-8-Limites de aceitação atualizados utilizados nos ensaios de recuperação da gama baixa
Parâmetro Percentagem de
recuperação (%)
91,66
S 4,14
LIC 79,23
LSC 104,08
60
70
80
90
100
110
120
130
140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pe
rce
nta
gem
de
Re
cup
eaç
ão (
%)
Ensaios
Carta de aceitação para ensaios de recuperação da gama baixa
LSC
X
LIC
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 75
O Gráfico 8-6 apresenta a carta de controlo atualizada com os novos limites utilizados nos
ensaios de recuperação da gama baixa.
Gráfico 8-6 -Carta de aceitação para ensaios de recuperação da gama baixa utilizando atualizados.
O Gráfico 8-7 apresenta a carta de controlo dos ensaios de recuperação para a gama alta.
Gráfico 8-7- Carta de controlo para ensaios de recuperação da gama alta utilizando os limites iniciais.
70
80
90
100
110
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Pe
rcen
tage
m d
e R
ecu
pea
ção
(%
)
Ensaios
Carta de Controlo para Ensaios de Recuperação
LSC
X
LIC
60
70
80
90
100
110
120
130
140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pe
rce
nta
gem
de
Re
cup
eaç
ão (
%)
Ensaios
Carta de controlo para ensaios de recuperação da gama alta
LSC
LIC
X
Controlo de qualidade
76
Como se verifica através da análise do Gráfico 8-7, parece não existir uma tendência nos
resultados obtidos, assim sendo não será necessário fazer uma atualização dos limites
iniciais.
8.1.5. Análise de Duplicados
A realização de duplicados é muito importante na química clássica, bem como na química
instrumental. Considera-se duplicado (ou replicado) a realização de ensaios sobre duas
(ou mais) tomas de amostra submetidas em separado a todo o processo analítico não
devendo ser confundido com a realização de várias medições ou leituras sobre a mesma
toma de amostra (IPAC, 2011).
O guia da IPAC recomenda a realização de análises de duplicados com uma frequência
não inferior a 5% das amostras analisadas, apesar disso, tendo em conta o método em
análise, a realização de análise em duplicado deverá ser efetuada pelo menos 24 vezes por
ano em amostras representativas das diferentes matrizes analisadas (IPAC, 2011).
A Tabela 8-9 apresenta os resultados obtidos para três análises de duplicados realizados
no processo de validação do método.
Tabela 8-9- Resultados obtidos nas análises de duplicados.
Amostra [OG] (mg/L) Amplitude Relativa (%)
A 297,848 1,72
A duplicado 303,014
B 705,869 7,60
B duplicado 654,202
C 451,028 6,64
C duplicado 482,028
No controlo de qualidade dos duplicados são utilizadas as cartas de amplitudes relativas.
A carta de controlo aqui utilizada engloba os resultados obtidos na validação do método e
os resultados obtidos ao longo do controlo de qualidade efetuado por rotina. Assim sendo
a Tabela 8-10 refere os limites de aceitação para a carta de controlo dos ensaios de
recuperação.
Controlo de Qualidade CAPÍTULO 8
Alain Costa 77
Tabela 8-10- Amplitude média e limite superior de controlo usados na carta de controlo de amplitudes dos
duplicados
Parâmetro Valor Absoluto
Rm 8,03
LSC 26,25
O Gráfico 8-8 apresenta a carta de amplitudes dos ensaios de duplicado.
Gráfico 8-8- Carta de controlo de amplitudes usada para ensaios de duplicados.
Como se verifica através da análise do Gráfico 8-8, os resultados óbitos nos ensaios de
duplicado encontram-se dentro dos limites de aceitação definidos referidos anteriormente.
8.1.6. Análise de brancos
A representação da resposta de brancos em cartas de controlo ajuda a detetar eventuais
contaminações ou deteriorações de reagentes, pela análise da flutuação do respetivo sinal.
Permitem também controlar de uma forma indireta o limite de deteção e/ou o limite de
quantificação. O controlo de brancos nesta metodologia apenas é efetuado na gama baixa
de trabalho. Assim sendo, o limite superior de controlo foi calculado através da realização
de 10 leituras do padrão de limite de quantificação da gama baixa (0,8mg/L), sendo o
limite superior de controlo igual a um terço da média dessas 10 leituras efetuadas no
padrão de limite de quantificação.
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Am
plit
ud
e R
ela
tiva
Ensaios
Carta de amplitudes usada na análise de duplicados
LSC
Rm
Controlo de qualidade
78
O Gráfico 8-9 apresenta a carta de indivíduos na análise de brancos.
Gráfico 8-9- Carta de controlo de brancos
Como se verifica através da análise do Gráfico 8-9, os brancos efetuados encontram-se
abaixo do limite superior de controlo.
8.2. Controlo de qualidade externo
O controlo de qualidade externo é indispensável para situar o método de análise e o
Laboratório na comunidade laboratorial, ou seja, serve para verificar em que medida o
resultado obtido pelo Laboratório se compara com os resultados obtidos pelos outros
laboratórios, assim sendo tem como objetivo principal avaliar a exatidão dos resultados
obtidos.
Genericamente o controlo de qualidade divide-se em:
Materiais de referência certificados (MRC).
Ensaios interlaboratoriais.
Os ensaios interlaboratoriais são um excelente indicador da exatidão do método de
análise. No entanto, pelo facto do método estar implementado há muito pouco tempo,
ainda não foram realizados ensaios interlaboratoriais, tendo contudo sido realizados dois
ensaios interlaboratoriais na fase de validação do método, em que se obteve um fator de
desempenho Z-score aceitável, conforme se referiu no Capitulo 7.2.2.
0,0000,0010,0010,0020,0020,0030,0030,0040,0040,005
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ab
sorv
anci
a
Ensaios
Carta de controlo de brancos
LSC
CAPÍTILO 9
Alain Costa 79
9. Influência da agitação na extração de OG
No procedimento de determinação de OG e HDE por FTIR com recurso ao
tetracloroetileno como solvente extrator, o processo de extração das amostras é, sem
dúvida, a operação que mais tempo despende.
Sendo o processo de extração, a parte mais morosa do procedimento de análise de
amostras, foram realizados ensaios de extração com o objetivo de analisar a possibilidade
de utilizar a extração mecânica com auxílio de um agitador.
Na Tabela 9-1 está apresentado o modo como as amostras foram tratadas, para que seja
possível fazer posteriormente uma comparação entre os modos de agitação em estudo.
Tabela 9-1- Modos e tempos de agitação utilizados na extração das amostras.
Amostra Modo de Agitação Tempo de Agitação (min)
A Manual 2+2+2
B Mecânica (260rpm) 20+20+20
C Mecânica (260rpm) 10+10+10
D Mecânica (260rpm) 5+10+15
Os testes que se seguem visam a comparação dos vários métodos de extração.
9.1. Amostras limpas (gama alta)
O primeiro ensaio foi realizado numa amostra contendo uma concentração real em óleos e
gorduras de 1,19 mg/L (gama alta) obtida por fortificação de uma amostra de água que
não continha o analíto. Este ensaio teve como objetivo analisar a influência do tempo e do
modo de agitação na extração de OG de uma amostra. Para tal, foram realizados quatro
ensaios recorrendo-se aos modos de agitação referidos anteriormente.
Influência da agitação na extração de OG
80
A Tabela 9-2 apresenta os resultados obtidos nestes ensaios de recuperação.
Tabela 9-2- Percentagem de recuperação obtida em amostras limpas da gama alta com concentração real de
1,19mg/L para quatro procedimentos distintos.
Amostra [OG] Real na
Amostra (mg/L)
[OG] medida
por FTIR
(mg/L)
Percentagem de
Recuperação (%)
A 1,190 1,096 92,07
B 1,190 1,121 94,23
C 1,190 0,941 79,12
D 1,190 0,890 74,80
Verifica-se através da análise dos resultados obtidos, que as amostras A e B tiveram
recuperações satisfatórias apresentando percentagens de recuperação de 92,07% e 94,23%
respetivamente. As amostras C e D não obtiveram resultados tão satisfatórios uma vez
que a percentagem de recuperação obtida se situou nos 79,12% e 74,80% respetivamente,
no entanto estes enquadram-se nos limites definidos para os testes de recuperação (70 –
130%). A boa percentagem de recuperação obtida em A deve-se ao facto da extração
realizada à mão ser mais eficiente, uma vez que a agitação vigorosa aliada à aleatoriedade
de movimentos impede que o tetracloroetileno percorra percursos preferenciais dentro da
ampola o que aumenta a sua exposição à amostra. Apesar da agitação mecânica ser menos
eficiente, a amostra B atingiu a melhor percentagem de recuperação. Este resultado é
explicado pelo elevado tempo de agitação a que a amostra esteve sujeita (20min + 20 min
+ 20min), o que constitui uma desvantagem no tratamento de amostras. A redução do
tempo de agitação mecânica traduz-se numa diminuição da percentagem de recuperação,
como é visível nas amostras C e D.
Apesar da amostra B ter obtido os melhores resultados, é necessário ter em conta que
todas as amostras se encontravam totalmente limpas (sem resíduos, partículas em
suspensão, etc.) o que não acontece com grande parte das amostras residuais.
Influência da agitação na extração de OG CAPÍTULO 9
Alain Costa 81
9.2. Amostras residuais (gama alta)
O ensaio que se segue foi realizado numa amostra de gama alta carregada com resíduos, e
consistiu em dividir uma amostra residual em quatro tomas de amostra com volumes
iguais (100mL), procedendo-se à sua extração como descrito na Tabela 9-1. O método
não prevê a divisão da amostra, no entanto a divisão da amostra é a única forma de
realizar este teste. Este ensaio tem como objetivo analisar a capacidade de extração
mecânica em amostras carregadas com resíduos e comparar a sua eficácia com os
resultados obtidos em amostras limpas.
Na Tabela 9-3 encontram-se representados os resultados obtidos.
Tabela 9-3- Percentagem de recuperação obtida em amostras carregadas com resíduos da gama alta para quatro
procedimentos distintos.
Amostra [OG] medida por FTIR
(mg/L)
A 589,62
B 473,37
C 266,70
D 189,20
Como se pretendia demonstrar, em amostras residuais carregadas, a extração manual é a
mais aconselhada uma vez que nas extrações mecânicas se obteve uma menor
concentração do analíto em estudo.
Através deste ensaio em amostras residuais carregadas, foi possível demonstrar que com a
existência de resíduos na amostra a capacidade de extração diminui significativamente.
Esta descida deve-se à dificuldade do agitador mecânico em manter a exposição da
amostra ao tetracloroetileno.
CAPÍTILO 9
Alain Costa 82
9.3. Conclusão
Através destes ensaios foi possível comparar a eficiência na extração de óleos e gorduras
pelo método de extração manual e pelo mecânico recorrendo a diferentes tempos de
extração.
Conclui-se que para amostras da gama alta com poucos resíduos é possível fazer extração
do analíto com uma série de três extrações de 20 minutos através de agitação mecânica. A
introdução da extração mecânica vem aumentar o rendimento do processo de extração
uma vez que torna possível realizar a extração de um maior número de amostras.
Para amostras da gama alta carregada com resíduos, o processo de extração mecânica
revelou-se pouco eficaz, concluindo-se desta forma que este tipo de extração é
desadequado para este tipo de amostras.
CAPÍTILO 10
Alain Costa 83
10. Validação dos kits de determinação rápida de CQO
No decorrer do estágio no Centro de Serviços do Ambiente, CESAB, surgiu a
necessidade de validar um método de análise de carência química de oxigénio (CQO) que
para além de permitir analisar toda gama de trabalho das amostras que chegam
diariamente ao CESAB tivesse também a capacidade de poupar tempo ao analista na
preparação dos reagentes necessários na determinação do analíto. Atualmente as análises
de CQO são realizadas segundo dois métodos distintos. O método de absorção molecular
UV-VIS (radiação eletromagnética na região do ultravioleta-visível) com a gama de
trabalho de 100 mgO2/L a 900 mgO2/L e o método de titulação volumétrica com o limite
de quantificação de 10 mgO2/L. As amostras que contêm uma concentração de CQO
inferior aos 100 mgO2/L (limite de quantificação do método de absorção molecular UV-
VIS) são determinadas por titulação volumétrica, o que implica o despender de muito
tempo de trabalho ao analista. Para além disso, a gama de trabalho total está dividida em
dois métodos completamente distintos, o que pode acarretar complicações e grandes
perdas de tempo quando as amostras possuem CQO no limiar dos 100mgO2/L, uma vez
que a decisão de utilizar um dos métodos de análise pode não ser a mais correta.
Desta forma surgiu a oportunidade de validar a determinação de CQO através do método
de absorção molecular UV-VIS utilizando kits rápidos e o espectrofotómetro
Spectroquant Pharo 300. Estes kits possuem os reagentes necessários à digestão e
negação de interferências das amostras, podendo, após digestão num digestor comum de
CQO, ser analisados através de um método de determinação de CQO por absorção
molecular UV-VIS num espectrofotómetro dedicado. Os resultados obtidos são
calculados através de reta de calibração. Os kits vêm prontos a usar, sendo apenas
necessário colocar neles a quantidade de amostra necessária para a análise, poupando
desta forma tempo de trabalho ao analista. Após análise, os kits podem ser devolvidas
para reciclagem, o que desta forma diminui o impacto ambiental do laboratório.
Relativamente às gamas de trabalho, os kits de determinação rápida de CQO deveriam
englobar a realidade de amostras presentes no CESAB. Assim, foram escolhidas três
gamas de trabalho. A primeira gama de trabalho possui o limite de quantificação de 10
mgO2/L estando o limite superior da gama situado nos 150 mgO2/L. Nesta gama de
trabalho a reta de calibração encontra-se invertida, ou seja, a absorção da radiação UV-
VIS é realizada pela análise dos reagentes que não reagiram e não pelos produtos que se
formaram. A gama de trabalho intermédia possui limite de quantificação de 25 mgO2/L
estando o limite superior da gama situado nos 1500 mgO2/L. A gama de trabalho mais
elevada possui limite de quantificação de 500 mgO2/L estando o limite superior da gama
situado nos 10000 mgO2/L.
Os próximos capítulos apresentam os resultados obtidos durante o processo de validação
dos kits de determinação rápida de CQO no espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300.
Validação de kits de determinação rápida de CQO
84
10.1. Gama de trabalho 10 – 150 mgO2/L
Nesta secção serão apresentados os resultados obtidos na validação da gama 10-150
mgO2/L através da análise de soluções com concentrações conhecidas (padrões). Os
padrões foram obtidos pelo método das diluições a partir de uma solução ―mãe‖ de
hidrogenoftalato de potássio com a concentração de 10000 mgO2/L As soluções
analisadas foram selecionadas de modo a cobrirem a gama de trabalho tendo
concentrações de 10, 60, 100 e 150 mgO2/L.
Na Tabela 10-1 serão apresentados os resultados obtidos.
Tabela 10-1- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 10-150 mgO2/L
10 mgO2/L 60 mgO2/L 100 mgO2/L 150 mgO2/L
ABS [] mg/L Erro
(%) ABS [] mg/L
Erro
(%) ABS [] mg/L
Erro
(%) ABS [] mg/L
Erro
(%)
1,622 9,0 -10,00 1,396 63 5,00 1,211 107,0 7,00 0,992 159,0 6,00
1,624 9,0 -10,00 1,395 63 5,00 1,212 107,0 7,00 0,987 160,0 6,67
1,618 13,3 33,33 1,408 63 5,56 1,246 93,7 -6,33 0,880 >150 ---
1,619 13,0 30,00 1,415 62 2,78 1,213 106,0 6,00 0,874 >150 ---
1,544 8,7 -13,00 1,310 63 4,44 1,199 109,0 9,00 0,876 >150 ---
1,552 <10 --- 1,309 63 4,44 1,107 111,0 11,00 0,867 >150 ---
1,556 8,7 -13,33 1,314 66 9,44 1,235 101,0 1,00 0,871 >150 ---
1,558 8,2 -18,00 1,316 65 8,33 1,223 104,0 4,00 0,863 >150 ---
1,613 13,0 30,00 1,366 66 10,00 1,200 108,0 8,00 0,907 >150 ---
1,611 13,0 30,00 1,351 70 16,11 1,239 105,0 5,00 0,894 >150 ---
Verifica-se através da análise dos resultados que o equipamento apresenta resultados
satisfatórios para as concentrações de 60 e 100 mgO2/L, apresentando no entanto
resultados insatisfatórios (pois apresentam grandes erros relativamente à concentração
real) para as concentrações de 10 e 150mg/L. Estes resultados insatisfatórios poderão ser
explicados pelo facto de se tratarem das concentrações iniciais e finais da gama, sendo
portanto concentrações criticas para esta gama de trabalho.
Apesar do mau desempenho nesta fase da validação da curva de calibração de origem,
foram realizados análises de duplicados. Os resultados obtidos são apresentados na
Tabela 10-2.
Validação dos kits de determinação rápida de CQO CAPÍTULO 10
Alain Costa 85
Tabela 10-2 - Resultados obtidos na análise de duplicados.
[]Amostra (mgO2/l) []Duplicado (mgO2/l) Amplitude relativa
64 63 1,57%
32 18,5 53,47%
58 58,5 0,86%
54 39,5 31,02%
46 79 52,80%
Verifica-se através da análise da tabela, que a gama de trabalho de 10 a 150mgO2/L não
reúne condições satisfatórias para passar nos ensaios de duplicados tendo em conta as
amplitudes obtidas nos ensaios. Assim sendo e tendo em consideração os resultados
negativos obtidos na análise de padrões foi tomada a decisão de parar os estudos nesta
gama de trabalho, uma vez que esta não reúne as condições necessárias para se prosseguir
na validação.
10.2. Gama de trabalho 25 – 1500 mgO2/L
Nesta secção serão apresentados os resultados obtidos na validação da gama 25 – 1500
mgO2/L através da análise de soluções com concentrações conhecidas. As soluções
analisadas foram selecionadas de modo a cobrirem a gama de trabalho tendo
concentrações de 25, 500, 800 e 1500 mgO2/L.
Na Tabela 10-3 serão apresentados os resultados obtidos.
Tabela 10-3- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 25-1500 mgO2/L.
25 mgO2/L 500 mgO2/L 800 mgO2/L 1500 mgO2/L
ABS []mgO2/L Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%)
0,036 22,00 -12,00 0,339 527,00 5,40 0,517 823,00 2,88 0,891 1446,00 -3,60
0,040 28,00 12,00 0,324 502,00 0,40 0,521 830,00 3,75 0,905 1469,00 -2,07
0,040 26,67 6,67 0,330 511,00 2,20 0,516 823,00 2,88 0,973 1581,00 5,40
0,040 27,33 9,33 0,342 530,00 6,00 0,517 820,00 2,50 0,971 1578,33 5,22
0,034 22,67 -9,33 0,314 489,67 -2,07 0,487 778,33 -2,71 0,892 1452,67 -3,16
0,037 27,33 9,33 0,315 490,33 -1,93 0,488 779,67 -2,54 0,878 1429,00 -4,73
0,033 23,00 -8,00 0,325 509,33 1,87 0,500 802,33 0,29 0,929 1517,00 1,13
0,034 25,00 0,00 0,317 496,33 -0,73 0,493 789,00 -1,38 0,901 1469,00 -2,07
Validação de kits de determinação rápida de CQO
86
Verifica-se através da análise dos resultados que equipamento apresenta resultados
satisfatórios para todas as concentrações analisadas. Apesar dos resultados satisfatórios
obtidos, a gama de trabalho não obedece aos requisitos referentes ao teste de
homogeneidade de variâncias (procedido da mesma forma que o descrito no Capitulo
6.1.2.1.2). No entanto a gama de trabalho pode ser ajustada (reduzida) de modo que a as
variâncias encontradas no primeiro padrão não difiram muito das variâncias encontradas
no último padrão da gama. Esse ajuste apenas será realizado se houver interesse em
continuar a validação nesta gama.
Desta forma, a gama de 25-1500mgO2/L encontra-se apta para próxima fase da validação
podendo-se realizar ensaios de duplicados, comparação com o método de referência e
recuperações.
A Tabela 10-4 apresenta os dados obtidos para a análise de duplicados, a comparação de
métodos e os ensaios de recuperação.
Tabela 10-4- Resumo dos resultados obtidos para a análise de duplicados, a comparação de métodos e os ensaios
de recuperação para a gama de 25- 1500mgO2/L.
Análise de Duplicados Comparação de métodos Ensaios de Recuperação
[]
Amostra
(mgO2/L)
[] Amostra
(dupl.)
(mgO2/L)
Erro
(%)
[] Método de
referência
(mgO2/L)
Erro (%)
[] Real da
amostra
(mgO2/l)
[]
Amostra
(mgO2/l)
%
Recuperação
954,5 943 1,21 1018 -7,30 951,31 980 97,07
272,3 280,5 2,97 286,63 -3,70 282,58 315 89,71
Apesar do pequeno número de amostras analisadas, os resultados obtidos mostram-se
satisfatórios para os testes realizados. No entanto seria necessário efetuar um maior
número de análises para evidenciar o bom desempenho realizado por esta gama de
trabalho neste estudo.
Validação dos kits de determinação rápida de CQO CAPÍTULO 10
Alain Costa 87
10.3. Gama de trabalho 500 – 10000 mgO2/L
Nesta secção serão apresentados os resultados obtidos na validação da gama 500-10000
mgO2/L através da análise de soluções com concentrações conhecidas. As soluções
analisadas foram selecionadas de modo a cobrirem a gama de trabalho tendo
concentrações de 500, 1500, 6000 e 10000 mgO2/L.
Na
Tabela 10-5 serão apresentados os resultados obtidos.
Tabela 10-5- Resultados obtidos para os padrões incluídos na gama de trabalho 500-10000 mgO2/L
500 mgO2/L 1500 mgO2/L 6000 mgO2/L 10000 mgO2/L
ABS [] mgO2/L Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%) ABS []mgO2/L
Erro
(%)
0,137 531,00 6,20 0,364 1577,00 5,13 1,253 5677,00 -5,38 2,314 10563,00 5,63
0,138 539,00 7,80 0,362 1568,00 4,53 1,403 6369,00 6,15 2,218 10121,00 1,21
0,141 551,33 10,27 0,368 1595,33 6,36 1,400 6353,33 5,89 2,278 10400,67 4,01
0,139 541,00 8,20 0,369 1605,00 7,00 1,352 6132,67 2,21 2,307 10530,67 5,31
0,126 496,33 -0,73 0,349 1523,67 1,58 1,206 5475,33 -8,74 2,094 9566,33 -4,34
0,128 505,67 1,13 0,360 1573,33 4,89 1,327 6031,67 0,53 2,154 9841,67 -1,58
0,126 509,33 1,87 0,350 1541,67 2,78 1,371 6244,00 4,07 2,206 10092,67 0,93
0,127 514,00 2,80 0,346 1519,33 1,29 1,302 5928,00 -1,20 2,196 10047,00 0,47
Verifica-se através da análise dos resultados que equipamento apresenta resultados
satisfatórios para todas as concentrações analisadas. Analogamente à gama intermédia, a
gama alta não obedece aos requisitos do teste de homogeneidade de variâncias, sendo
necessário ajustar a gama de trabalho se houver interesse em continuar a validação nesta
gama.
Desta forma a gama de 500-10000 mgO2/l encontra-se apta para passar à fase seguinte da
validação, podendo-se realizar ensaios de duplicados, comparação com o método de
referência e ensaios de recuperação.
Validação de kits de determinação rápida de CQO
88
A Tabela 10-6 apresenta os dados obtidos para a análise de duplicados, a comparação de
métodos e os ensaios de recuperação.
Tabela 10-6- Resumo dos resultados obtidos para a análise de duplicados, a comparação de métodos e os ensaios
de recuperação para a gama de 500-10000 mgO2/L.
Análise de Duplicados Comparação de métodos Ensaios de Recuperação
[]
Amostra
(mgO2/L)
[] Amostra
(dupl.)
(mgO2/L)
Erro
(%)
[] Método de
referência
(mgO2/L)
Erro (%)
[] Real da
amostra
(mgO2/l)
[]
Amostra
(mgO2/l)
%
Recuperação
2542,5 2582,5 1,56 2872 -12,08 2534,4 3030,0 83,64
3012,5 3067,5 1,81 3123 -2,73 2988,0 3552,5 84,11
3469,5 3382,5 2,54 3090 9,81 3354,7 3513,5 95,48
6461,5 6597 2,08 6677 -2,26 6302,8 6132,2 102,79
1126,7 1091,7 3,16 974 12,19 1061,2 1066,0 99,55
3678,5 3447,5 6,48 2968 16,70 3392,4 3250,0 104,38
De acordo com os resultados obtidos verifica-se que a gama de trabalho de 500 a 10000
mgO2/L obteve um bom desempenho nos ensaios efetuados.
10.4. Testes comparativos
No decorrer da validação do método utilizando os kits e o espectrofotómetro
Spectroquant Pharo 300, surgiu a ideia de se utilizar apenas os kits contendo os reagentes
e analisar as amostras no espectrofotómetro presente no Laboratório. Tendo em conta que
o Laboratório possui um método de análise de CQO validado, facilmente se pode
verificar a resposta dada pelos kits de análise rápida utilizando os testes comparativos. Os
testes comparativos foram realizados seguindo as mesmas orientações descritas no
Capitulo 7.2.3.
Para a realização dos testes comparativos, foram efetuadas análises em replicado,
utilizando os dois métodos de análise de CQO, o método validado e o método utilizando
os kits rápidos.
Validação dos kits de determinação rápida de CQO CAPÍTULO 10
Alain Costa 89
Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 10-7.
Tabela 10-7- Resultados obtidos na análise de amostras com o método validado e com os kits de determinação
rápida.
[] Pelo método
validado [] Pelos kits
Erro Relativo
(%)
Amplitude
Relativa (%)
1085,29 1147,03 5,69 5,53
730,00 728,87 0,16 0,16
251,52 250,00 0,60 0,61
653,03 687,60 5,29 5,16
616,55 595,60 3,40 3,46
493,06 474,26 3,81 3,89
586,34 575,48 1,85 1,87
640,00 612,03 4,37 4,47
380 349,46 8,04 8,37
685 650,32 5,06 5,19
Através da análise dos resultados obtidos, é possível verificar que os resultados obtidos
pelos dois tipos de reagentes sobre as mesmas amostras são muito semelhantes.
O teste de correlação linear entre os dois reagentes foi a técnica escolhida para a
comparação de resultados, uma vez que esta técnica é utilizada quando se pretende
comparar dois métodos com gamas de trabalho mais alargadas. O teste de correlação
linear aqui descrito foi realizado de acordo com o descrito no Capitulo 7.2.3.
O Gráfico 10-1 apresenta as concentrações obtidas usando o método validado versus as
concentrações obtidas usando os reagentes dos kits de determinação rápido.
Validação de kits de determinação rápida de CQO
90
Gráfico 10-1- Teste de correlação linear utilizado para comparar os dois reagentes.
Através da análise do gráfico verifica-se que os resultados obtidos na determinação de
CQO pelos dois métodos são bastante semelhantes, no entanto possuem um coeficiente de
correlação linear (R2) igual a 0,9896 o que se revela pouco satisfatório.
O desvio padrão associada a ordenada na origem (Sa) e o desvio padrão associado ao
declive (Sb) foram calculados através do uso da ferramenta estatística ―Regressão‖ da
análise de dados da folha de cálculo do ―Microsoft Excel‖.
Na Tabela 10-8 estão apresentados os resultados obtidos nesta análise estatística.
Tabela 10-8 - Parâmetros estatísticos determinados para os testes comparativos de CQO
Parâmetro Resultado
Sa 0,014
Sb 8,974
t 2,306
t.Sa 0,032
t.Sb 20,694
Desta forma a equação que descreve a distribuição dos resultados obtidos, com o
intervalo de confiança considerado associado à ordenada na origem e ao declive é:
[ ] ( ) [ ] ( ) (10-1)
Tendo em conta as condições descritas anteriormente, verifica-se que os dois métodos de
determinação de CQO não são estatisticamente semelhantes, uma vez que o intervalo de
y = 1,0838x - 56,324 R² = 0,9896
100,00
300,00
500,00
700,00
900,00
1100,00
1300,00
100,00 300,00 500,00 700,00 900,00 1100,00
kits
(m
gO2/
L)
Método validado (mgO2/L)
Validação dos kits de determinação rápida de CQO CAPÍTULO 10
Alain Costa 91
confiança associado à ordenada na origem não contém o valor zero (0) e o intervalo de
confiança associado ao declive não contém o valor um (1).
10.5. Analise Económica
Apesar dos kits rápidos de determinação de CQO poderem ser mais práticos, é necessário
fazer a comparação entre os custos destes e os custos que atualmente envolvem a
determinação de CQO de uma amostra pelo método de espectrofotometria de absorção
molecular com os reagentes utilizados no Laboratório. Desta forma foi realizado uma
análise económica abordando os custos que o método de determinação de CQO antigo
possui.
Será apenas avaliado o custo inerente aos reagentes necessários, uma vez que é difícil
determinar o custo associado ao tempo que o analista necessita para a preparação destes.
Na Tabela 10-9 indica os custos associados aos reagentes necessários na determinação de
CQO.
Tabela 10-9- Preços dos reagentes necessários para a determinação de CQO.
Reagentes Preço (€) Quantidade Preço/Quantidade
Dicromato (K2Cr2O7) 8.74 250 g 0.035 €/g
Ác. Sulfúrico 9.08 2500 mL 0.004 €/mL
Sulfato de Mercúrio (HgSO4) 61.51 250 g 0.246 €/g
Sulfato de Prata 86.00 100 g 0.860 €/g
A Tabela 10-10 apresenta a quantidade dos diferentes reagentes e os custos necessários
para se fazer a solução de digestão necessária na determinação de CQO.
Tabela 10-10- Preços dos reagentes e custo associado à solução de digestão.
Reagentes Quantidade Custo(€)
Dicromato (K2Cr2O7) (g) 10,22 0,357
Ác. Sulfúrico (mL) 1000,00 3,632
Sulfato de Mercúrio (HgSO4) (g) 33,30 8,193
Custo total da solução de digestão (€) 12,182
Custo por volume de solução (€/mL) 0,012
Validação de kits de determinação rápida de CQO
92
A Tabela 10-11 apresenta a quantidade dos diferentes reagentes e os custos necessários
para se fazer a solução de ácido necessário na determinação de CQO.
Tabela 10-11- Preços dos reagentes e custo associado à solução de ácido sulfúrico.
Reagentes Quantidade Custo (€)
Sulfato de Prata (g) 10 8.600
Ac. Sulfúrico (mL) 1000 3.632
Custo total da solução de digestão (€) 12.232
Custo por volume de solução (€/mL) 0.012
Na Tabela 10-12 encontram-se demonstrados a quantidade de reagentes que é necessário
colocar nos tubos de CQO, assim como o custo associado a essa quantidade.
Tabela 10-12- Preços associados á determinação de CQO
Solução Volume por
amostra (mL) Preço por amostra
Preço por 25
amostras
Digestão 1,5 0,018 0,457
Acido Sulfúrico 3,5 0,043 1,070
Assim sendo, verifica-se que a determinação de 25 amostras de CQO com o método em
uso custa ao Laboratório 1,53€. Apesar de não estar a ser contabilizado o custo referente
ao tempo que o analista despende na preparação de reagentes, muito dificilmente os kits
de determinação rápida poderão oferecer um preço inferior ao verificado pelo método
atual.
10.6. Conclusão
O objetivo principal deste estudo era verificar a eficácia dos kits de determinação rápida
de CQO na gama de 10 a 150 mgO2/L uma vez que a determinação de CQO nesta gama
de trabalho é realizado por um método de titulação volumétrica muito moroso. Conclui-se
com os ensaios realizados, que os kits de determinação rápida nesta gama de trabalho não
possuem a capacidade de determinar de forma precisa e exata o CQO presente na
amostra. As gamas de 25mgO2/L a 1500mgO2/L e de 500mgO2/L a 10000mgO2/L
obtiveram resultados satisfatórios nos ensaios efetuados.
Validação dos kits de determinação rápida de CQO CAPÍTULO 10
Alain Costa 93
Apesar de não ter sido contemplado o tempo que o analista despende na preparação dos
reagentes, a análise económica evidencia que cada kit teria de ter um custo aproximado de
1,5 – 2 € para se mostrar competitivo com o método de análise atualmente em uso.
De acordo com o estudo, verifica-se que, por enquanto, os kits não são uma opção viável,
uma vez que as gamas de trabalho teriam de ser ajustadas e o preço dos kits teria de ser
bastante baixo.
CAPÍTILO 11
Alain Costa 95
11. Métodos de análise realizadas no estágio
Conforme se referiu anteriormente, este relatório refere-se ao estágio realizado no Centro
de Serviços do Ambiente, CESAB.
O estágio teve início no dia 21 de Outubro de 2011. Os primeiros dias foram utilizados na
familiarização da documentação utilizada no laboratório (Manual de Gestão da
Qualidade, legislação e protocolos de métodos analíticos), e na familiarização com os
métodos analíticos usados no laboratório.
Para além da validação do método ―Óleos, Gorduras e Hidrocarbonetos Totais por análise
FTIR recorrendo ao tetracloroetileno como solvente extrator‖ e a tentativa de validação
do método de determinação de CQO utilizando os kits de determinação rápida
mencionado nos capítulos anteriores deste documento, o estagiário foi realizando tarefas
de auxilio aos técnicos analistas e realizou alguns métodos de análise sob supervisão.
Ao longo do estágio no CESAB, o estagiário foi adquirindo valências em análise dos
seguintes tipos de águas:
Águas de consumo Humano
Águas Residuais
Lixiviados
Águas Superficiais
Águas Subterrâneas
Águas Balneares
Tendo realizado os seguintes métodos de análise:
Determinação de CQO por espectrofotometria de absorção molecular.
Determinação de CBO5 pelo método manométrico.
Determinação de Azoto Amoniacal por espectrofotometria de absorção molecular.
Determinação de Compostos Orgânicos Voláteis por Cromatografia Gasosa
acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS).
Determinação de Pesticidas Organoclorados por Cromatografia Gasosa com
Detetor de Captura de Eletrões (GC-ECD).
De seguida serão descritos detalhadamente os métodos efetuados.
Métodos de análise realizados no estágio
96
11.1. Determinação da carência química de oxigénio (CQO) e da
Carência bioquímica de oxigénio (CBO5).
A carência química de oxigénio (CQO), também designada de COD (do inglês ―Chemical
Oxigen Demand‖), é usada como uma medida do oxigénio equivalente à fração orgânica
da amostra suscetível de ser oxidada por um oxidante químico enérgico.
A quantidade de oxidante consumido é expresso em termos de oxigénio equivalente.
Devido às suas propriedades químicas, o ião dicromato (Cr2O72-
) é muitas vezes utilizado
em determinações de CQO. Nas determinações de CQO tanto os componentes orgânicos
como os inorgânicos da amostra são sujeitos a oxidação, no entanto, na maioria dos casos,
a componente orgânica predomina sobre a componente inorgânica. A quantidade de CQO
presente numa amostra é usada como indicativo de poluição em águas residuais e águas
naturais.
Outro indicador muito utilizado como indicativo de poluição é a carência bioquímica de
oxigénio após 5 dias (CBO5) ou do inglês ―5-days Biochemical Oxygen Demand‖
(BOD5).A carência bioquímica de oxigénio após 5 dias define-se como a quantidade de
oxigénio dissolvido que é consumido durante oxidação biologia aeróbia da matéria
orgânica e/ou inorgânica contida na amostra após incubação a temperatura fixa e em
ambiente escuro durante 5 dias.
Desta forma a quantidade de CBO5 que uma determinada amostra contem tem
necessariamente de ser inferior à CQO.
11.1.1. Determinação de CQO por espectrofotometria de absorção
molecular.
Grande parte dos componentes orgânicos é oxidada por uma solução fervente de
dicromato e ácido sulfúrico. Desta forma, a amostra é colocada a digerir com uma solução
fortemente acidificada com ácido sulfúrico e com excesso de dicromato de potássio
(K2Cr2O7). Quando a amostra é digerida, o ião dicromato (Cr2O7 2-
) oxida a matéria
orgânica contida na amostra, resultando na variação do crómio do estado hexavalente
(VI) para o estado trivalente (III).
Ambas as espécies de crómio possuem cor e absorvem radiação eletromagnética na região
visível do espectro. O ião dicromato tem maior poder de absorção na região dos 400nm
onde a absorção do ião crómio (Cr3+
) é muito mais pequena. A absorção máxima do ião
crómio situa-se na região dos 600nm onde a absorção do dicromato se encontra perto de
zero (APHA, 2005b).
Assim sendo, a determinação da CQO inicia-se com a digestão da amostra com ácido
sulfúrico, sulfato de prata, dicromato e sulfato de mercúrio. Após digestão a determinação
Métodos de análise realizados no estágio CAPÍTULO 11
Alain Costa 97
da CQO é realizada através de espectrofotometria de absorção molecular e determinada a
um comprimento de onde de 600nm. A concentração CQO presente na amostra é depois
calculada por curva de calibração realizada previamente.
A CQO é um teste definido, sendo a oxidação da amostra afetada pelo tempo de digestão,
capacidade de oxidação dos reagentes e CQO presente na amostra (APHA, 2005b).
As análises de CQO são realizadas normalmente em amostras de águas residuais e
lixados, sendo normalmente analisadas no CESAB cerca de 100 amostras semanais.
11.1.1.1. Interferências / limitações.
A interferência mais comum é a do ião cloreto. O cloreto tem a capacidade de reagir com
ião prata e precipitar sob a forma de cloreto de prata inibindo desta forma a atividade
catalítica do sulfato de prata. Compostos como o brometo, o iodeto e todos os outros que
possuem a capacidade de inativar o ião prata interferem de forma semelhante na
determinação de CQO. Trata-se de interferências negativas uma vez que reduzem a ação
de oxidação do ião dicromato. As interferências causadas pelo cloreto podem ser
reduzidas, ou mesmo ultrapassadas, complexando o cloreto com o sulfato de mercúrio
(HgSO4).
Tratando-se de um método que utiliza a espectrometria de absorção molecular na zona do
UV-VIS fica sujeito a qualquer composto que tenha a capacidade de precipitar e obstruir
a passagem do feixe de luz, absorvendo a sua energia e interferindo de forma positiva no
resultado final de CQO (APHA , 2005b).
11.1.2. Determinação de CBO5 pelo método manométrico.
A carência bioquímica de oxigénio a 5 dias define-se como a quantidade de oxigénio
dissolvido (OD) que é consumido durante a oxidação biológica aeróbia da matéria
orgânica e/ou inorgânica contida na amostra sob agitação, a temperatura controlada
(20ºC) e em local escuro. A determinação de CBO5 pelo método manométrico tem
fundamento na variação de pressão que o recipiente que contem a amostra sofre (o
recipiente tem de estar devidamente fechado). Durante a determinação de CBO5, os
microrganismos presentes nas águas residuais consomem o oxigénio dissolvido na
amostra, sendo este substituído pelo oxigénio do ar e causando desta forma uma variação
na pressão dentro do recipiente selado. O CO2 formado é eliminado por uma porção de
NaOH que é colocado fora do contacto com a amostra.
O recipiente encontra-se selado com um detetor (conhecido vulgarmente como
―cabeças‖) que regista a variação da pressão ao longo dos 5 dias. No final deste período,
Métodos de análise realizados no estágio
98
essa alteração da pressão é medida pelo sensor de pressão sendo depois convertida em
CBO5 (expresso em mgO2/L) através de um fator de conversão que depende do volume
de amostra utilizado e da marca dos sensores (APHA, 2005c).
Assim como a análise da CQO, a CBO5 também é realizada normalmente em amostras de
águas residuais e lixiviados, sendo normalmente analisadas cerca de 100 amostras
semanais.
11.1.2.1. Interferências. / Limitações
A determinação de CBO5 está dependente de microrganismos, como tal, todos os
compostos que de alguma forma inibam o seu crescimento ou mesmo os destruam vão
interferir nos resultados. Substâncias tóxicas como bactericidas, metais pesados ou cloro
livre podem inibir a oxidação bioquímica e servir como interferente negativo na
determinação da CBO5.
As algas e/ou microrganismos nitrificantes podem conduzir a resultados elevados e
interferir de forma positiva nos resultados.
Em efluentes que contenham amónio é necessário o uso de um reagente que impeça a
nitrificação uma vez que a transformação do amónio em nitrito consume o oxigénio
presente no recipiente fazendo variar a pressão interior do recipiente (APHA, 2005c).
Uma inadequada agitação da amostra ou uma flutuação na temperatura podem constituir
fontes de erros na determinação de CBO5.
11.2. Determinação de Azoto Amoniacal por Espectrofotometria de
absorção molecular.
Na presença de um catalisador, os iões de amónia reagem com substâncias que contêm
fenol por intermédio de um agente oxidante, formando um composto fenólico de cor azul
que é medido através de espectrometria de absorção molecular a 690nm. O sal de sódio
do ácido dicloroisocianúrico atua como agente oxidante e o salicilato de sódio como
composto fenólico. A reação é catalisada pelo nitroprussiato de sódio (APHA, 2005d).
No CESAB a determinação de azoto amoniacal é realizada normalmente em águas de
consumo humano com a frequência de aproximadamente 80 amostras semanais.
Métodos de análise realizados no estágio CAPÍTULO 11
Alain Costa 99
11.2.1. Interferências / Limitações
Os iões de cálcio e magnésio podem provocar interferências no método pelo que deverão
ser complexados com citrato a pH elevado. Não existem interferências de outras formas
trivalentes de azoto.
O sulfato de hidrogénio quando presente pode ser removido acidificando as amostra a
pH=3 com ácido clorídrico diluído seguido de arejamento vigoroso das amostras até se
deixar de detetar odor a sulfato.
11.3. Cromatografia Gasosa
A cromatografia gasosa (GC) é uma técnica de separação e análise de misturas de
compostos voláteis. A amostra é vaporizada e é transportada por um fluxo de gás
adequado denominado de fase móvel ou gás de arraste. Este gás, que contém a amostra
vaporizada, passa pela coluna capilar onde se encontra a fase estacionária chamada de
coluna cromatográfica. A fase estacionária presente no interior da coluna cromatográfica
possui diferentes afinidades para os diferentes compostos (existem muitos tipos de
colunas cromatográficas específicas para os compostos que se pretende analisar). Essa
diferença de afinidades específica de cada composto vai resultar no seu atraso ou
adiantamento relativo aos outros compostos realizando-se assim a separação da mistura.
Desta forma a mistura é separada tendo em conta o tempo de retenção dos compostos na
coluna cromatográfica, sendo os tempos de retenção característicos para cada composto e
para cada tipo de enchimento da coluna cromatográfica.
Normalmente o GC possui acoplado um instrumento com a capacidade de quantificar os
compostos que foram previamente separados.
11.3.1. Determinação de compostos orgânicos voláteis por Cromatografia
Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (GC-MS).
O GC-MS (cromatografia gasosa acoplada a espectrómetro de massa) é um processo
analítico muito poderoso sendo amplamente utilizado em áreas como a toxicologia,
alimentar, forense e ambiental. Este instrumento híbrido não só separa os componentes
voláteis de uma mistura complexa (GC), como também recolhe o espectro de massa de
cada componente (MS), conseguindo desta forma expressar dois tipos de informações de
dimensões separáveis sobre os componentes da amostra, tempo de retenção obtido por
Métodos de análise realizados no estágio
100
GC e espectro de massa por ionização de eletrões (EI). O tempo de retenção obtido
através do GC está relacionado com propriedades químicas específicas das moléculas
presentes na amostra (volatilidade, polaridade, presença de grupos funcionais específicos)
enquanto o peso molecular é indicador da composição atómica.
O GC-MS possui uma fonte de ionização (que no equipamento utilizado pelo laboratório
é produzido por um filamento) no final da coluna cromatográfica e que resulta na
fragmentação dos compostos. Após terem sido ionizados, os compostos são introduzidos
no ―ion trap‖ onde são enviados seletivamente (tendo em consideração a massa atómica
do ião) para o ―eléctron multiplier‖. A primeira vez que o ião embate no ―eléctron
multiplier‖ são produzidos eletrões, que vão ser ejetados e embater na outra face do
―eléctron multiplier‖ produzindo-se sucessivamente de forma exponencial. Desta forma o
sistema consegue transformar o sinal fraco emitido por um ião num sinal muito forte que
pode ser processado pelo software do equipamento. O software possui uma livraria que
identifica os iões e os associa aos compostos. Os compostos são identificados e
quantificados por dois iões específicos denominados de ―iões de quantificação‖.
(Hubschmann, 2009).
Assim sendo, o GC-MS consegue fornecer duas informações valiosas, o tempo de
retenção e o espectro de massa dos iões. Os iões de quantificação são comparados com a
livraria do software e é realizada a quantificação do composto tendo em consideração a
área do pico cromatográfico (APHA, 2005d; APHA, 2005e).
Esta metodologia é usada no CESAB para determinar compostos orgânicos voláteis
(VOC do inglês ―volatic organic compound‖). A designação de VOC está associada a
compostos orgânicos que possuam baixo ponto de ebulição.
Através desta metodologia no CESAB são analisados os seguintes VOC:
Clorofórmio
Bromodiclorometano
Dibromoclorometano
Bromofórmio
Cloreto de Vinilo
Tetracloreto de Carbono
Benzeno
1,2-dicloroetano
Tricloroetileno
Tetracloroetileno
A análise de VOC inicia-se num auto-sampler designado de purge-and-trap. Neste
método de preparação de amostra, os compostos orgânicos voláteis são arrastados das
Métodos de análise realizados no estágio CAPÍTULO 11
Alain Costa 101
amostras através de uma purga de hélio sendo depois aprisionados numa armadilha
(―trap‖) contendo um adsorvente orgânico a baixa temperatura. A desadsorção dos
compostos retidos é depois feita por aquecimento da armadilha, sendo os VOC arrastados
e enviados para o GC para análise. Após passar pela coluna cromatográfica, os VOC
devidamente separados chegam ao MS onde são quantificados através dos seus iões de
quantificação.
A
Tabela 11-1 apresenta os VOC analisados no decorrer do estágio assim com o seu tempo
de retenção e os seus respetivos iões de quantificação.
Tabela 11-1- Descrição dos VOC analisados seu tempos de retenção e os iões de quantificação
Composto Tempos de Retenção Iões de quantificação
Cloreto de Vinilo 2.080 62.0+64.0
Clorofórmio 8.853 83.0+85.0
Tetracloreto de Carbono 9.556 117.0+119.0
Benzeno 10.081 77.0+78.0
1,2-Dicloroetano 10.252 62.0+64.0
Tricloroeteno 11,695 95.0+130.0
Bromodiclorometano 12.915 83.0+85.0
Tetracloroeteno 15.937 129.0+166.0
Dibromoclorometano 16.570 127.0+129.0
Bromofórmio 18.794 173.0+175.0
(Nota: O tempo de retenção dos compostos pode sofrer alteração)
A concentração presente na amostra é calculada por interpolação da curva de calibração
para os seguintes compostos:
Clorofórmio
Bromodiclorometano
Dibromoclorometano
Bromofórmio
Tetracloroetileno
O clorofórmio, Bromodiclorometano, Dibromoclorometano e bromofórmio são
compostos orgânicos voláteis que também são conhecidos por trihalometanos. Os
trihalometanos são compostos derivados do metano em que três átomos de hidrogénio são
substituídos por três átomos de halogénios.
Métodos de análise realizados no estágio
102
A concentração presente na amostra é determinada por fator de resposta para os
compostos:
Cloreto de Vinilo
Tetracloreto de Carbono
Benzeno
1,2-dicloroetano
Tricloroeteno
A determinação por fator de resposta é realizada segundo a equação:
[ ]
(11-1)
Em que:
FR- fator de resposta,
[Pcal] - concentração do padrão de calibração (conhecida),
Áreap - Intensidade da área obtida com o padrão de calibração,
A concentração presente na amostra pode então ser determinada segundo a equação:
[ ] (11-2)
Em que
[VOC] - concentração do VOC presente na amostra
ÁreaA - intensidade da área obtida na amostra.
FR - fator de resposta.
A determinação de VOC é realizada normalmente em amostras de água de consumo
humano, sendo analisadas aproximadamente 50 análises por semana.
Métodos de análise realizados no estágio CAPÍTULO 11
Alain Costa 103
11.3.1.1. Interferências / Limitações
As interferências na determinação de VOC por GC-MS podem ser causadas por
contaminações de solventes, reagentes, material de vidro e por dispositivos de tratamento
de amostra, que podem desta forma conduzir ao aumento da intensidade ou de um
aumento da linha do cromatograma. Assim sendo, todos os materiais que entram em
contacto com as amostras devem estar isentos de interferentes.
11.3.2. Determinação de Pesticidas Organoclorados por Cromatografia
Gasosa acoplada ao Detetor de Captura de Eletrões (GC-ECD).
O GC-ECD (cromatografia gasosa acoplada a detetor de captura de eletrões) é um
processo analítico seletivo para compostos eletronegativos especialmente para compostos
clorados, bromados e fluorados. Esta característica é determinante na capacidade do GC-
ECD para determinação de pesticidas organoclorados2. No interior do ECD encontra-se
selado níquel radioativo 63 que emite eletrões (partículas β) que colidem com as
moléculas e ionizam o gás azoto. Esta reação forma uma nuvem de eletrões estáveis e
livres na célula detetora do ECD. O sistema eletrónico do ECD trabalha no sentido de
manter a corrente na nuvem de eletrões constante através de pulsos periódicos.
Após terem sido separados na coluna cromatográfica do GC, os compostos
organoclorados entram no ECD que os mede quantitativamente através da queda de
corrente que se verifica na nuvem eletrónica. (SRI Instruments, 2012).
Esta metodologia é utilizada na determinação dos seguintes pesticidas organoclorados:
Clortalonil
Heptacloro
Heptacloro exo-epóxido
Dieldrina.
Os pesticidas organoclorados ocorrem na água devido à aplicação destes compostos na
agricultura, no controlo de pragas. Devido à sua toxicidade e ao facto de serem
persistentes na natureza, torna-se necessário a monitorização destes compostos, quer na
água de consumo humano, quer em águas de abastecimento, quer ainda em águas
superficiais e subterrâneas, de acordo com a legislação em vigor e/ou com os requisitos
específicos do cliente.
2 Organoclorados – são compostos orgânicos que possuem pelo menos um átomo de cloro ligado
covalentemente.
Métodos de análise realizados no estágio
104
A determinação dos pesticidas organoclorados é efetuada de forma quantitativa, usando
como preparação da amostra a microextração em fase sólida (SPME ―solid phase micro
extration‖) e a análise cromatográfica por GC-ECD. Os pesticidas organoclorados são
extraídos da água por SPME através de uma fibra que possui grande afinidade com os
pesticidas organoclorados. Desta forma, é possível aumentar a sensibilidade do método,
uma vez que os analítos presentes na amostra vão ser previamente concentrados na fibra
durante o tempo em que esta está imersa sob agitação, sendo simultaneamente separados
de possíveis interferências. Após a adsorção dos pesticidas na fibra é realizada a
desadsorção térmica destes compostos no injetor do cromatógrafo gasoso, sendo de
seguida levados pelo gás de arraste (hélio) para a coluna capilar.
No GC, os compostos separam-se em função das afinidades com a fase estacionária e
atingem a célula de detetor de captura de eletrões onde são identificados com base nos
diferentes tempos de retenção e quantificados de acordo com a perturbação que efetuam
na nuvem eletrónica do ECD.
Tabela 11-1 Tabela 11-2 apresenta os pesticidas organoclorados analisados assim com
respetivo tempo de retenção.
Tabela 11-2- Pesticidas organoclorados e respetivos tempos de retenção.
Pesticida Organoclorados Tempo de retenção
Clortalonil 19.58
Heptacloro 24.79
Heptacloro exo-epóxido 26.44
Dieldrina 29.77
(Nota: O tempo de retenção dos compostos pode sofrer alteração)
A concentração de pesticidas organoclorados presentes na amostra é determinada por
fator de resposta, segunda a equação:
[ ]
(11-3)
Em que:
FR – Fator de resposta
[Pcal] – Concentração do padrão de calibração
Apcal – Altura do pico cromatográfico obtido com o padrão de calibração.
Métodos de análise realizados no estágio CAPÍTULO 11
Alain Costa 105
A concentração na amostra é então calculada segundo a equação:
[ ] (11-4)
Em que:
[Pesticida] – concentração do pesticida
AA – altura do pico cromatográfico da amostra
FR – Fator de Resposta.
A determinação de pesticidas organoclorados é realizada normalmente em amostras de
águas subterrâneas e águas superficiais, sendo analisadas cerca de 10 amostras mensais.
11.3.2.1. Interferências / Limitações
As interferências na determinação de pesticidas organoclorados em GC-ECD podem ser
causadas por contaminações de solventes, reagentes, material de vidro e por dispositivos
de tratamento de amostra, que podem desta forma conduzir ao aumento da intensidade ou
de um aumento da linha do cromatograma. Assim sendo, todos os materiais que entram
em contacto com as amostras devem estar isentos de interferentes.
CAPÍTILO 12
Alain Costa 107
12. Conclusões gerais e propostas para trabalhos futuros
De acordo com os objetivos propostos inicialmente para o estágio, pode considerar-se que
o estágio foi realizado com sucesso.
Na primeira fase do estágio pretendia-se a integração do estagiário no CESAB, a sua
familiarização com a documentação utilizada no Laboratório (Manual de Gestão da
Qualidade, legislação e protocolos de métodos analíticos), o desenvolvimento de
competências no uso de equipamentos e materiais/reagentes de laboratório, objetivo que
foi atingido com sucesso.
A validação do método de ―Determinação de Óleos, Gorduras e Hidrocarbonetos Totais
por Espectrofotometria de Infravermelho por Transformada de Fourier, com recurso ao
solvente de extração tetracloroetileno‖ assumiu um papel fundamental no estágio. A
validação iniciou-se com a escolha da marca de solvente que era mais apropriado para
esta determinação, seguindo-se um conjunto de etapas descritas no relatório que
permitiram a validação do método. Após a realização de todos os testes necessários para a
validação do método e da sua acreditação por parte da IPAC, conclui-se que o mesmo se
encontrava em condições de se tornar o método utilizado por rotina na determinação
desse analíto.
No decorrer do estágio surgiu a oportunidade de validar um método de determinação de
CQO através da utilização de kits de determinação rápida. Foram realizados os testes
preliminares no processo de validação, tendo-se chegado à conclusão que não é possível
validar o método para as gamas de trabalho propostas. Realizou-se também uma análise
de custos de reagentes relativos à utilização de cada um dos métodos tendo-se chegado à
conclusão que os kits teriam de possuir um preço de aquisição muito baixo, para se
mostrarem competitivos com o método utilizado atualmente.
O objetivo da familiarização com as práticas do Laboratório, assim como o
acompanhamento dos técnicos na execução das várias metodologias em vigor e a
execução analítica das metodologias em amostras reais com supervisão foi atingido com
sucesso, uma vez que no decorrer do estágio foi possível ao estagiário adquirir
competências em métodos analíticos referentes à análise de vários tipos águas.
Ao nível pessoal, considero que o estágio no CESAB se revelou um teste às capacidades
que fui adquirindo ao longo do meu percurso académico, tendo obtido com este, uma
grande confiança pelo facto dos objetivos que me foram propostos terem sido
sucessivamente atingidos. O estágio num Laboratório com o rigor da CESAB
proporcionou ainda a possibilidade de ter um contacto mais aprofundado com o ―mundo
do trabalho‖, resultando num acumular de diferentes contactos e experiências que
culminou com a evolução das minhas capacidades e da minha experiência.
Capitulo 13
Alain Costa 108
13. Referências bibliográficas
98/83/CE, D. (1998). DIRECTIVA 98/83/CE DO CONSELHO de 3 de
Novembro de 1998 relativa à qualidade da água destinada ao consumo humano.
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APHA (2005b) - Standard Methods for the Examination of Water and
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Water and Wastewater, American Public Health Association, Método 5210B-D.
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APHA (2005f) - Standard Methods, Standard Methods for the Examination of
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Barreto, Luciano Vieira J. S. (2008). A Camada de Ozono e as Substancias que a
Destroem, Enciclopédia Biosfera N.06; 2008, ISSN 1809-058351
Camões, M. F. (2001) - Guia Eurachem/Citac- Quantifiacção da Incerteza. Versão
em Português
Comissão Europeia, C. (2011). Manual de licenciamento de substâncias que
empobrecem a camada de ozono (ODS). Direcção C – Integração da Adaptação e
Tecnologias Hipocarbónicas, Versao 6.1, ODS database versão 2.4
Referencias bibliográficas CAPÍTULO 13
Alain Costa 109
Decreto de Lei nº 277/2009 - Diário da República, I Série, N.º 277, 2 de Outubro
de 2009.
Decreto Lei nº236/98 - Diário da Republica, I Série, Nº 176, 1 de Agosto de
1998.
Decreto Lei nº306/2007 - Diário da República, I Série, N.º 164, 27 de Agosto de
2007.
Decreto-Lei nº 243/2001 - Diário da Republica, I Série, Nº 206, 5 de Setembro de
2001.
Directiva 1005/2009/CE, de 16 de Setembro de 2009, Conselho do Parlamento
Europeu.
Environmental, T. - TBF Environmental. Obtido em 6 de 10 de 2012
Eurachem. (1998). The Fitness for Purpose of Analytical Methods - A Laboratory
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Correlação de Pearson. Revista Política Hoje, Vol. 18, n. 1
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Sptectrophotometer Works. Journal of Chemical Education, 681-684.
González, Gustavo-, Herrador M. e Asuero, Agustín (2010). Intra-laboratory
assessment of method accuracy (trueness and precision) by using validation
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Guardado, J. C., Sánchez, M. E., & Hernández, G. Á. (2006). Quimica Organica.
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Referências Bibliográficas
110
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Applications‖ WILEY-VCH Second Edition.
IPAC. (2007). OGC007 - Guia para a quantificação de incerteza em ensaio
quimicos. Instituto Português da Acreditação.
ISO (1990). ―ISO 8466 - Water Quality-Calibration and Evalution of Analytical
Methods and Estimation of Performance Characteristics, Part 1: Statistical
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ISO (1994). ―ISO 5725-3 - Accuracy (Trueness and Precison) of measurment
methods and results, Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard
measurmente method"
ISO (1994). ―ISO 5725-6 Accuracy (Trueness and Precison) of measurment
methods and results, Part 6: Use in pratice of accuracy values‖.
ISO (2009). ―ISO/TS 13530- Water quality — Guidance on analytical quality
control for chemical and physicochemical water analysis‖.
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Water. Pergamon, 2707-2722.
McMurry, J. (2012). Organic Chemistry (Brooks/Cole ed.)
Mendes (2004). Qualidade da água para consumo humano.
Nações Unidas (1985)- Convenção de Viena para a protecção da camada de
Ozono-Viena.
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Referencias bibliográficas CAPÍTULO 13
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Pinho Carina, Mansilha Catarina, Gameiro Paula. (2011). Evaluation of the actual
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Priscila Vaz de Arruda, R. d. (2006). Glicerol: um subproduto com grande
capacidade industrial e metabólica. Revista Analytica, 56-62.
RELACRE (1996), Guia Relacre Nº 3: Validação de resultados em laboratórios
químicos. Lisboa.
RELACRE (2000), Guia Relacre Nº13: Validação de métodos internos de ensaio
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SRI - Instruments ―Electron Capture Detector -ECD‖ Disponivel em
http://www.srigc.com/ECDman.pdf [Acedido em Dezembro de 2012]
U. N. (1987). The Montreal Protocol on Substances that Deplete the Ozone Layer.
Voet, D. e Voet, J. G. (2011). Biochemistry. USA. 4rd ed., John Wiley & Sons,
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Wishart, David (2009a). - Pharm570-IR Lecture #7 - Infrared Spectroscopy.
Wishart, David (2009b). - Pharm570-IR Lecture #8 - Predicting IR Absorption
Frequencies.
ANEXOS
Alain Costa 113
ANEXOS
ANEXO-I Ficha de segurança do composto tetracloroetileno
ANEXOS
114
ANEXOS
Alain Costa 115
ANEXOS
116
ANEXOS
Alain Costa 117
ANEXOS
118
ANEXOS
Alain Costa 119
ANEXOS
120
ANEXOS
Alain Costa 121
ANEXOS
122
ANEXOS
Alain Costa 123
ANEXO-II Imagens dos espectros obtidos na análise dos diferentes
fornecedores de tetracloroetileno
Ilustração 1 - Background do tetracloroetileno da marca Merck
Ilustração 2 Espectro do tetracloroetileno da marca Merck
ANEXOS
124
Ilustração 3 – Background do tetracloroetileno da marca Panreac PAI
Ilustração 4 - Espectro do tetracloroetileno da marca Panreac PAI
ANEXOS
Alain Costa 125
Ilustração 5 - Background do tetracloroetileno da marca Panreac PRS
Ilustração 6- Espectro do tetracloroetileno da marca Panreac PRS
ANEXOS
126
Ilustração 7- Background do tetracloroetileno da marca Panreac PS
Ilustração 8- Espectro do tetracloroetileno da marca Panreac PS
ANEXOS
Alain Costa 127
Ilustração 9- Background do tetracloroetileno da marca J. T. Baker
Ilustração 10- Espectro do tetracloroetileno da marca J. T. Baker
ANEXOS
128
ANEXOS III - Retas de calibração obtidas na validação do método
Ilustração 11 - Retas de calibração 1/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,011
1,17 50 0,016
1,57 50 0,021
1,96 50 0,026
3,92 50 0,050
5,87 50 0,073
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,009
11,90 10 0,021
17,85 10 0,031
23,80 10 0,043
29,75 10 0,056
59,50 10 0,116
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa 01/10
10
20
6
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
10
4
6
8
0,01218
0,00184
30
Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,004 Aceitar
0,33
------------------------
Aceitar
0,9998
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
Padrão de Controlo
0,9995 Aceitar Padrão de Controlo
4,79 Aceitar
0,24
0,00200
-0,00367
y = 0,0122x + 0,0018R² = 0,9998
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,002x - 0,0037R² = 0,9995
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
Alain Costa 129
Ilustração 12- Retas de calibração 2/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,010
1,17 50 0,016
1,57 50 0,021
1,96 50 0,027
3,92 50 0,052
5,87 50 0,078
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,009
11,90 10 0,021
17,85 10 0,032
23,80 10 0,043
29,75 10 0,056
59,50 10 0,116
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa
0,19
Padrão de Controlo
0,9997 Aceitar Padrão de Controlo
3,80 Aceitar
02/10
30
0,9997 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,005 Aceitar
0,40
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
8
0,01325
0,00028
0,00200
-0,00341
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0132x + 0,0003R² = 0,9997
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,002x - 0,0034R² = 0,9997
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
130
Ilustração 13- Retas de calibração 3/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,012
1,17 50 0,016
1,57 50 0,022
1,96 50 0,027
3,92 50 0,052
5,87 50 0,077
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,009
11,90 10 0,020
17,85 10 0,031
23,80 10 0,043
29,75 10 0,055
59,50 10 0,115
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa
0,01284
0,00165
0,00199
-0,00380
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
03/10
30
0,9998 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,004 Aceitar
0,33
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
Padrão de Controlo
0,9997 Aceitar Padrão de Controlo
3,62 Aceitar
0,18
y = 0,0128x + 0,0017R² = 0,9998
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,002x - 0,0038R² = 0,9997
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
Alain Costa 131
Ilustração 14- Retas de calibração 4/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,011
1,17 50 0,016
1,57 50 0,022
1,96 50 0,028
3,92 50 0,053
5,87 50 0,079
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,010
11,90 10 0,022
17,85 10 0,034
23,80 10 0,047
29,75 10 0,058
59,50 10 0,115
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa
8
0,01332
0,00093
0,00196
-0,00089
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
04/10
30
0,9996 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,006 Aceitar
0,46
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
0,23
Padrão de Controlo
0,9995 Aceitar Padrão de Controlo
4,56 Aceitar
y = 0,0133x + 0,0009R² = 0,9996
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,002x - 0,0009R² = 0,9995
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
132
Ilustração 15- Retas de calibração 5/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,010
1,17 50 0,015
1,57 50 0,020
1,96 50 0,025
3,92 50 0,049
5,87 50 0,075
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,010
11,90 10 0,022
17,85 10 0,032
23,80 10 0,045
29,75 10 0,056
59,50 10 0,112
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa
0,18
Padrão de Controlo
0,9997 Aceitar Padrão de Controlo
3,59 Aceitar
05/10
30
0,9998 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,004 Aceitar
0,34
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
8
0,01270
0,00001
0,00190
-0,00103
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0127x + 1E-05R² = 0,9998
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,0019x - 0,001R² = 0,9997
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
Alain Costa 133
Ilustração 16- Retas de calibração 6/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,011
1,17 50 0,016
1,57 50 0,022
1,96 50 0,027
3,92 50 0,054
5,87 50 0,079
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,010
11,90 10 0,020
17,85 10 0,031
23,80 10 0,044
29,75 10 0,056
59,50 10 0,115
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Elaborado:
Padrão de Controlo
0,9995 Aceitar Padrão de Controlo
4,80 Aceitar
0,24
06/10
30
0,9997 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,005 Aceitar
0,40
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
0,01342
0,00068
0,00198
-0,00310
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0134x + 0,0007R² = 0,9997
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,002x - 0,0031R² = 0,9995
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
134
Ilustração 17- Retas de calibração 7/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,012
1,17 50 0,018
1,57 50 0,024
1,96 50 0,028
3,92 50 0,054
5,87 50 0,079
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,011
11,90 10 0,021
17,85 10 0,032
23,80 10 0,043
29,75 10 0,055
59,50 10 0,113
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain CostaElaborado:
Padrão de Controlo
0,9995 Aceitar Padrão de Controlo
4,75 Aceitar
0,24
07/10
30
0,9995 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,006 Aceitar
0,51
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
0,01305
0,00261
0,00192
-0,00172
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0131x + 0,0026R² = 0,9995
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,0019x - 0,0017R² = 0,9995
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
Alain Costa 135
Ilustração 18- Retas de calibração 8/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,009
1,17 50 0,014
1,57 50 0,019
1,96 50 0,024
3,92 50 0,050
5,87 50 0,074
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,011
11,90 10 0,021
17,85 10 0,032
23,80 10 0,043
29,75 10 0,055
59,50 10 0,111
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain Costa
0,01284
-0,00101
0,00188
-0,00110
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
08/10
30
0,9998 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,004 Aceitar
0,33
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
Elaborado:
Padrão de Controlo
0,9997 Aceitar Padrão de Controlo
3,39 Aceitar
0,17
y = 0,0128x - 0,001R² = 0,9998
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,0019x - 0,0011R² = 0,9997
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
136
Ilustração 19- Retas de calibração 9/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,010
1,17 50 0,016
1,57 50 0,021
1,96 50 0,026
3,92 50 0,052
5,87 50 0,076
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 1 mg/L
Sol. De Controlo 1 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,011
11,90 10 0,023
17,85 10 0,035
23,80 10 0,044
29,75 10 0,056
59,50 10 0,112
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain CostaElaborado:
Padrão de Controlo
0,9996 Aceitar Padrão de Controlo
4,41 Aceitar
0,22
09/10
30
0,9995 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,006 Aceitar
0,47
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
0,01293
0,00059
0,00188
0,00034
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0129x + 0,0006R² = 0,9995
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,0019x + 0,0003R² = 0,9996
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
ANEXOS
Alain Costa 137
Ilustração 20- Retas de calibração 10/10
P REGISTO das Pesagens efectuadas na preparação dos óleos de referência e de controlo e das soluções intermédias de trabalho e de controlo
Analista Data 16-Dez-2011
Balão Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Média
mL (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g) (g)
1 Óleo de Calibração 50 39,242 39,2421 39,2421 39,2421 69,7412 69,7411 69,7412 69,7412 30,4991 0,762 g/mL
2 Óleo de Controlo 50 39,8922 39,8922 39,8922 39,8922 70,3820 70,3820 70,3820 70,3820 30,4898 0,762 g/mL
3 Sol. De Trabalho 1 10 14,858 14,8581 14,8582 14,8581 15,1556 15,1556 15,1556 15,1556 0,2975 29750 mg/L
4 Sol. De Trabalho 2 10 14,7976 14,7977 14,7976 14,7976 14,8956 14,8955 14,8955 14,8955 0,0979 9790 mg/L
5 Sol. De Controlo 1 10 15,2534 15,2534 15,2535 15,2534 15,5493 15,5494 15,5494 15,5494 0,2959 29593 mg/L
6 Sol. De Controlo 2 10 14,6023 14,6024 14,6025 14,6024 14,7003 14,7003 14,7001 14,7002 0,0978 9783 mg/L
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 0,8 a 6 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
0,78 50 0,011
1,17 50 0,016
1,57 50 0,021
1,96 50 0,026
3,92 50 0,052
5,87 50 0,076
Declive
Ordenada na Origem 1,96 mg/L
R2
LQ
LQ (extracção)
P REGISTO das Gamas de Trabalho
Gama de Concentrações de 6 a 30 mg/L
Sol. De Trabalho 2 mg/L
Sol. De Controlo 2 mg/L
Conc. dos Padrões Volume Total Absorvância
mg/L mL
5,95 10 0,011
11,90 10 0,023
17,85 10 0,034
23,80 10 0,046
29,75 10 0,058
59,50 10 0,114
Declive
Ordenada na Origem 14,80 mg/L
R2
44,39 mg/L
LQ
LQ (extracção)
Observações
Alain CostaElaborado:
Padrão de Controlo
0,9998 Aceitar Padrão de Controlo
2,81 Aceitar
0,14
10/10
30
0,9998 Aceitar
Critério de Aceitação
Padrão de Controlo
0,004 Aceitar
0,33
10
20
6
Aceitar
------------------------
Critério de Aceitação
------------------------
4
Nº Mistura ou Solução
9783
20
9790
vol.da sol. 1
µL
29750
Aceitar
10
4
6
8
Registo da Preparação das Soluções de Óleos e Gorduras
Alain Costa
Balão Vazio Balão com Mistura Peso da
Mistura
Densidade do
Óleo/cons Mistura
0,01284
0,00099
0,00192
0,00002
8
2
29593
vol.da sol. 1
µL
y = 0,0128x + 0,001R² = 0,9998
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
0,090
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L
y = 0,0019x + 2E-05R² = 0,9998
0,000
0,020
0,040
0,060
0,080
0,100
0,120
0,140
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00
Abs
orvâ
ncia
mg/L