DETEKSI KEBERADAAN PROMOTER 35S CaMV PADA BIJI · PDF fileii deteksi keberadaan promoter 35s camv pada biji jagung (zea mays l.) yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan

ii

DETEKSI KEBERADAAN PROMOTER 35S CaMV

PADA BIJI JAGUNG (Zea mays Linn) YANG DIGUNAKAN

SEBAGAI BAHAN BAKU PANGAN ATAU PAKAN DAN BENIH

DI KOTA MATARAM –NTB , DENGAN METODA POLYMERASE

CHAINS REACTION

TESIS

Baiq Suriati

NIM. 081141012

Program Studi Magister (S2) Biologi

Departemen Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Airlangga

Surabaya

Januari 2013

petugas_labkomp

Textbox

ii

DETEKSI KEBERADAAN PROMOTER 35S CaMV PADA BIJI

JAGUNG (Zea mays L.) YANG DIGUNAKAN SEBAGAI BAHAN

BAKU PANGAN ATAU PAKAN DAN BENIH DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION DI KOTA MATARAM – NTB

TESIS

Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan

Mencapai Derajat Magister Biologi (M.Si)

Oleh:

BAIQ SURIATI

NIM. 081141012

PROGAM STUDI MAGISTER BIOLOGI (S2)

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

FEBRUARI 2013

petugas_labkomp

Textbox

ii

TESIS

DETEKSI KEBERADAAN PROMOTER 35S CaMV

PADA BIJI JAGUNG (Zea mays L) YANG DIGUNAKAN SEBAGAI BAHAN

BAKU PANGAN ATAU PAKAN DAN BENIH DENGAN METODA

POLYMERASE CHAINS REACTION

DI KOTA MATARAM –NTB ,

yang dipersiapkan dan disusun oleh

Baiq Suriati,S.Si

telah dipertahankan di depan Dewan Penguji

pada tanggal 13 Februari 2013

Susunan Dewan Penguji:

Pembimbing Utama

Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si

NIP. 19640303 198810 2 001

Penguji I

Dr. Bambang Irawan, M.Si

NIP. 19550405 198203 1 004

Pembimbing Pendamping

Dr. Sri Puji Astuti W, M. Si

NIP.1966022 19920302 001

Penguji II

Sugiharto, S.Si. M.Si

NIP. 19700301199412 1 001

Penguji III

Dr. Dwi Winarni, Dra. M.Si.

NIP. 19651107198903 2 001

Tesis ini telah diterima sebagai salah satu persyaratan

untuk memperoleh gelar Magister Sains

Tanggal 13 Februari 2013

Ketua Departemen Biologi Ketua Program Studi Magister Biologi

Fakultas Sains & Teknologi Fakultas Sains & Teknologi

Universitas Airlangga Universitas Airlangga

Dr. Alfiah Hayati Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si.

NIP. 19640418 198810 2 001 NIP. 19640303 198810 2 001

iii

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam Tesis ini tidak terdapat karya yang

pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi, dan

sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis

atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan

disebutkan dalam daftar pustaka.

Surabaya, Februari 2013

Yang Menyatakan,

Baiq Suriati, S.Si.

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis yang merupakan

salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains (M.Si) pada Fakultas Sains

dan Teknologi, Universitas Airlangga dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan

sejak bulan September 2012 sampai dengan Desember 2012, dengan judul “Deteksi

Keberadaan Promoter 35S CaMV pada Biji Jagung (Zea mays L.) yang

Digunakan Sebagai Bahan Baku Pangan atau Pakan dan Benih dengan Metoda

Polymerase Chain Reaction Di Kota Mataram-Nusa Tenggara Barat”.

Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan

yang sebesar-besarnya kepada :

Ibu Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si. selaku Dosen, pembimbing utama dan

penguji I sekaligus selaku Ketua Program Studi Magister Biologi yang telah

meluangkan waktu untuk memberikan bimbingan, arahan, saran dan masukan.

Ibu Dr. Sri Puji Astuti W, M.Si. selaku pembimbing pendamping dan penguji

II sekaligus dosen wali yang telah meluangkan waktu untuk memberikan

bimbingan, arahan, saran dan masukan.

Bapak Dr. Bambang Irawan, M.Sc. selaku penguji III yang telah memberikan

petunjuk dan arahan yang membangun.

Bapak Sugiharto, S.Si., M.Si. selaku penguji IV yang telah memberikan


Ibu Dr. Dwi Winarni, Dra., M.Si. selaku penguji V yang telah memberikan


Seluruh Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Magister Biologi yang telah

banyak memberikan bimbingan penulis selama menjalani pendidikan.

Kepada Ayahanda, Ibunda (alm), suami tercinta dan anak-anakku tersayang

(Rifqi dan Naura), dan Ibu mertua serta seluruh keluarga terima kasih atas

dorongan, doa,kasih sayang, semangat, serta kesabaran dan pengertiannya

selama penulis menjalani masa studi sampai dapat menyelesaikan studi.

Tidak lupa penulis juga berterima kasih yang sedalam-dalamnya semua yang

tidak bisa penulis sebut satu persatu yang selalu memberikan dorongan

semangat dan bantuan sehingga dapat menyelesaikan pendidikan dan

penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa di dalam penyusunan tulisan ini masih banyak

kekurangan dan kelemahan. Untuk itu, penulis sangat mengharapkan kritikan dan

saran dari pembaca demi sempurnanya tulisan ini. Semoga tulisan karya ilmiah ini

dapat memberikan manfaat bagi semua pihak. Amin.

Surabaya, Februari 2013

PENULIS

v

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN PENGESAHAN

HALAMAN PERNYATAAN

KATA PENGANTAR

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR LAMPIRAN

ABSTRAK

ABSTRACT

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan Penelitian

1.4 Manfaat Penelitian

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jagung (Zea mays L.)

2.2 Kondisi Pangan di Indonesia

2.3 Sejarah Tanaman Transgenik

2.4 Promoter 35S Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)

2.5 Perkembangan Perakitan Tanaman Jagung Transgenik

2.6 Peranan Badan POM dalam Pengawasan Produk Rekayasa Genetik

2.7 Pemeriksaan Tanaman Transgenik

2.8 Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.8.1 Prinsip dasar polymerase chain reaction (PCR)

2.8.2 Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR

2.9 Elektroforesis Gel Agarosa

2.10 Kerangka Konsep Penelitian

2.11 Hipotesis

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.2 Bahan-bahan Penelitian

3.3 Alat-alat Penelitian

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Isolasi DNA

3.4.2 Determinasi konsentrasi dan kemurnian DNA

3.4.2.1 Konsentrasi DNA

3.4.2.2 Kemurnian DNA

3.4.3 Evaluasi kualitas DNA dengan elektroforesis

3.4.4 Deteksi promoter 35S CaMV pada biji jagung transgenik

dengan metoda PCR

3.4.4.1 Preparasi mastermix

ii

iii

iv

v

vii

viii

ix

xi

xii

1

4

5

6

7

8

9

11

11

14

15

16

17

19

23

24

25

26

26

27

28

28

29

30

30

31

32

32

vi

3.4.4.2 Preparasi PCR untuk promoter 35S CaMV

3.4.5 Elektroforesis produk PCR

3.5 Variabel Penelitian

3.6 Analisis Data

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Persiapan dan homogenisasi sampel

4.2 Isolasi DNA sampel dan sampel positif GMO

4.2.1 Determinasi konsentrasi dan kemurnian DNA

4.2.2 Kualitas DNA total dengan gel agarosa

4.3 Amplifikasi PCR

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

RINGKASAN

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

33

34

35

36

37

39

42

44

48

54

55

56

68

73

vii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

Tabel 2.1

Tabel 2.2

Tabel 2.3

Tabel 2.4

Tabel 2.5

Tabel 3.1

Tabel 3.2

Tabel 3.3

Tabel 4.1

Tabel 4.2

Tabel 4.3

Komposisi gizi jagung berdasarkan bobot kering 9

Beberapa contoh tanaman rekayasa genetik

Luas areal pertanaman jagung Bt (Bt dan Bt/TH) secara

global dari tahun 1996-2006

Penelitian terhadap jagung Bt di Indonesia

Gel agarose untuk pemeriksaan yang efisien

Komponen campuran komponen mastermix 1x reaksi

Komponen campuran mastermix untuk 14 sampel

Program PCR

Nama, nomor dan asal sampel biji jagung, benih jagung dan

kontrol positif GMO yang digunakan dalam penelitian

Konsentrasi dan kemurnian DNA benih jagung, biji jagung

dan positif GMO

Hasil amplifikasi PCR pada biji jagung dan benih jagung

dan kontrol positif GMO setelah diamplifikasi dengan

promoter 35S CaMV.

9

13

13

14

23

32

33

33

39

43

53

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar

Halaman

Gambar 2.1

Gambar 4.1

Gambar 4.2

Gambar 4.3

Gambar 4.4

Gambar 4.5

Gambar 4.6

Gambar 4.7

Penambahan jumlah rantai DNA secara eksponensial dalam 35

siklus

Sampel benih jagung dan biji jagung

Sampel benih jagung dan biji jagung setelah diblander

Hasil elektroforesis DNA total pada sampel biji jagung

Hasil elektroforesis DNA total pada benih jagung dan kontrol

positif transgenik.

Proses amplifikasi dengan menggunakan thermocycler aplied

biosystems viriti 96 well

Hasil amplifikasi biji jagung dengan menggunakan promoter 35S

CaMV

Hasil amplifikasi benih jagung dengan menggunakan promoter 35S

CaMV

18

37

40

45

45

50

50

51

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1

Lampiran 2

Lampiran 3

Lampiran 4

Lampiran 5

Lampiran 6

Cara pembuatan reagen atau pereaksi:

a). Pembuatan larutan CTAB

b). Pembuatan larutan TAE 1X

c). Pembutan larutan agarose 0,7 %

d). Pembuatan larutan agarosa 2%

e). Pembuatan larutan primer reverse 20 µM

f). Pembuatan larutan primer forward 20µM

Teknik transformasi gen dengan perantara Agrobacterium sp

Pembuatan konsentrasi DNA 50 ng dalam 50 µL

Cara Pemakaian Alat

a) Pemakaian pH meter ESCO

b) Pemakaian laminar air flow (BSC) ESCO class II Type A2

c) Pemakaian timbangan Chyo JK-180

d) Cara pemakaian autoclave

e) Cara pemakaian sentrifus

f) Cara pemakaian oven

g) Cara pemakaian spindown

h) Cara pemakaian waterbath shaker labtech LSB 0305

i) Pemakaian thermocycler

j) Cara pemakaian gel dokumen

Foto benih jagung sebagai bahan penelitian

Foto sampel benih jagung dalam kemasan, biji jagung dan

kontrol positif GMO

71

71

71

72

72

72

73

74

75

75

76

77

77

78

78

79

79

80

81

82

83

x

Lampiran 7

Lampiran 8

Lampiran 9

Lampiran 10

Lampiran 11

Foto reagen dan alat untuk isolasi DNA

Peta kota Mataram

Surat keterangan penelitian

Analisis sekuen promoter 35S CaMV Agrobacterium

tumefaciens dengan menggunakan sofeware ClustalW2

yang disesuaikan dengan sekuen gen yang diperoleh dari

GenBank dengan primer 35S-1 dan primer 35S-2

Dokumen hasil resapan spektrofotometer

84

88

89

90

92

xi

Baiq Suriati, 2013. Deteksi Keberadaan Promoter 35S CaMV pada Biji Jagung

(Zea mays L.) yang Digunakan Sebagai Bahan Baku Pangan atau Pakan dan Benih

Dengan Metode Polymerase Chain Reaction di Kota Mataram –NTB. Tesis ini di

bawah bimbingan Dr. Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si. dan Dr. Sri Puji Astuti

Wahyuningsih, Dra.,M.Si. Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi,

Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah biji jagung yang digunakan

sebagai bahan baku pangan atau pakan dan benih di Kota Mataram, positif transgenik

melalui deteksi keberadaan promoter CaMV dengan menggunakan PCR. Ini adalah

deteksi keberadaan produk rekayasa genetik atau produk transgenik yang pertama di

kota Mataram. Telah dilakukan isolasi DNA sebanyak sepuluh sampel biji jagung yang

digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan. Isolasi DNA dilakukan dengan

memodifikasi dua metode yaitu metode CTAB dan Kit Qiagen. Konsentrasi atau

kemurnian DNA dideterminasi dengan spektrofotometer dan kualitas DNA dengan

elektroforesis gel agarose 0,7% dengan konstanta voltase 90 V selama 40 menit.

Konsentrasi DNA hasil isolasi yang diperoleh adalah 1590 ng – 2315 ng/uL dengan

kemurnian antara 1,1-1,8. Amplifikasi PCR menggunakan konsentrasi DNA hasil

isolasi 50 ng/µL. Komponen PCR menggunakan Mastermix dari Roche, konsentrasi

primer 0,4 mM , DNA tamplete 5 µL dengan volume total 50 µL. Proses amplifikasi

dilakukan 40 siklus dengan menggunakan Applied Biosystems viriti thermocycler.

Produk PCR dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 2% selama 90 menit pada

100 volt.

Hasil yang diperoleh biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan

dan benih tidak ada yang teramplifikasi dengan primer 35S CaMV karena hasil

amplifikasi tidak ada yang menunjukkan pita DNA pada 195 bp dibandingkan dengan

sampel positif yang memberikan pita DNA pada 195 bp. Penelitian ini menunjukkan

bahwa biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan dan benih di

kota Mataram, tidak ada yang transgenik setelah diuji dengan PCR.

Kata kunci : jagung, polymerase chain reaction ,transgenik .

xii

Baiq Suriati, 2013. Detection Promoter 35S CaMV whith Polymerace Chain

Reaction Methode in corn grains (Zea mays, L) use in base material food or feed

and seed in Mataram city – Nusa Tenggara Barat. This study was guidance by Dr.

Y. Sri Wulan Manuhara, M.Si., and Sri Puji Astuti, M. Si., Department of

Biology, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

This research aims to know whether the corn grains (Zea mays, L) use as base

material food or feed and seed in Mataram city is transgenic positif through detection of

promoter CaMV by PCR. This is the first detection for the presence of Genetically

modified organism (GMO) in Mataram city. DNA was extracted fom ten sample was

corn grains use in basic food or feed and seed. The isolation of DNA was modified of

CTAB methods and Kit Qiagen.The concentration or purity of extract of DNA by two

methods for determined on spectrofotometer and quality of DNA by elactroforesis

0,7 % agarose gel at constant voltage 90 V for 40 min. Concentrations extract of DNA

ranged from 1590 ng to 2315 ng/ µL and purity ranged 1,1 to 1,8. PCR amplification

reaction containing about 50 ng/ µL of the isolated DNA. The mastermixs component is

Roche, primer concentration 0,4 mM, DNA tamplate 5 µL whith total volume 50 µL.

Amplification is performed during 40 cycles in used Applied Biosystems viriti

thermocycler. PCR product was electroforesis by agarose gel at constant voltage 100 V

for 90 min. The result is from ten sample of corn grains (Zea mays, L) used as base

material food or feed and seed non was amplificated with promoter 35S CaMV in

Mataram city, because no amplification showing DNA bands at 195 bp compared with

positif sample which is showing DNA bands at 195 bp. This research showed that none

of corn grains (Zea mays, L) used as base material food or feed and seed in Mataram

city is transgenic after tested by PCR.

Keywords : Maize, PCR, Transgenik

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Perkembangan bioteknologi saat ini memungkinkan perbaikan sifat tanaman

melalui rekayasa genetika. Dengan teknologi ini, gen dari berbagai sumber dapat

dipindahkan ke dalam tanaman yang akan diperbaiki sifatnya. Teknologi ini disebut

teknologi transgenik (geneticallly modified organism/GMO). Berbagai produk teknologi

transgenik telah dikembangkan sampai saat ini, seperti kedelai, jagung, kapas, padi dan

tomat. Sejalan dengan dimulainya era pasar global menyebabkan peningkatan

perdagangan produk hasil rekayasa genetik sehingga memungkinkan untuk beredarnya

produk rekayasa genetik di Indonesia (Amirhusin, 2004; Faisal, 2005).

Dampak negatif penggunaan produk transgenik berupa alergi dan resistensi

terhadap antibiotik yang tidak dapat diobati dengan antibiotik karena gen yang

disisipkan kedalam tanaman tersebut adalah gen resisten terhadap antibiotik maka

ditetapkan peraturan pemerintah nomor 69 tahun 1999 tentang label dan iklan pangan.

Pada pasal 35 ayat 1 menyatakan bahwa pangan produk rekayasa genetika, wajib

dicantumkan tulisan Pangan Rekayasa Genetik. Ayat 2 menyatakan bahwa pangan hasil

rekayasa genetik sebagaimana dimaksud pada ayat 1 merupakan bahan yang digunakan

dalam suatu produk pangan, pada label cukup dicantumkan keterangan tentang Pangan

Rekayasa Genetik. Ayat 3 menyatakan bahwa selain pencantuman tulisan sebagaimana

dimaksud ayat 1, pada label dapat dicantumkan logo khusus Pangan Hasil Rekayasa

Genetik. Dengan adanya label ini maka konsumen dapat memilih untuk menggunakan

produk transgenik tersebut atau tidak. Tetapi dalam penerapan penggunaan label

transgenik belum sepenuhnya dilakukan.

petugas_labkomp

Textbox

2

Untuk menunjang terlaksananya pengawasan makanan tersebut, diperlukan

pengembangan metoda untuk identifikasi gen yang disisipkan pada produk pangan

hasil rekayasa genetik, baik yang berasal dari tanaman maupun berasal dari hewan

(Ahmad , 2002; Oraby et al., 2005).

Saat ini polymerase chain reaction (PCR) adalah metoda yang sensitif,

spesifik, cepat dan dapat diandalkan untuk uji identifikasi produk hasil rekayasa

genetik baik dalam bentuk bahan baku maupun pada produk olahan pangan dengan

menginformasikan ada atau tidaknya sekuen transgenik sesuai dengan primer yang

dipakai. Penelitian tentang deteksi jagung dengan menggunakan PCR sudah dilakukan

oleh Alejendro et al., (2000); Gurakan et al., (2011); Serge et al., 2006. Metoda PCR

juga digunakan dalam analisis genetically modified organism (GMO) yang dilakukan

oleh kolaborasi 13 negara dengan 29 laboratorium yang melakukan optimasi proses

PCR dengan melakukan deteksi GMO dengan menggunakan promoter 35S CaMV

(Lipp et al., 1999).

Tujuan akhir dari transgenik adalah meregenerasi tanaman baru yang identik

dengan induknya, kecuali dalam hal sifat baru dari gen yang disisipinya. Untuk ekspresi

di dalam sel tanaman, gen-gen asing memerlukan promoter yang sesuai dengan sekuen

awal 5’ dan terminator 3’ untuk menjamin transkripsi yang efisien, stabil dan translasi

mRNA. Promoter 35S CaMV adalah virus mosaik kembang kol atau Cauliflower

Mosaic Virus (CaMV) umumnya digunakan pada tanaman transgenik yang

mempunyai kemampuan untuk mengaktifkan gen asing yang telah disisipkan ke dalam

tanaman inang dan 80% produk transgenik meggunakan promoter 35S CaMV sebagai

komponen penyusunnya (Alejendro et al., 2000).

Jagung merupakan salah satu komoditas utama tanaman pangan sebagai

sumber karbohidrat kedua setelah beras yang sangat berperan dalam menunjang

3

ketahanan pangan. Fungsi demikian menempatkan posisi jagung dalam diversifikasi

konsumsi dan mengurangi ketergantungan terhadap beras. Selain sebagai bahan

konsumsi, jagung sangat berperan dalam industri pangan dan juga industri pakan.

Dengan jumlah penduduk yang terus meningkat, permintaan jagung untuk pemenuhan

kebutuhan pangan dan pakan dari tahun ke tahun akan semakin meningkat sementara

produksi jagung nasional belum mampu untuk memenuhi kebutuhan tersebut.

Untuk memenuhi kebutuhan tersebut, Indonesia melakukan impor jagung dari

Amerika yang merupakan eksportir jagung terbesar. Dalam perdagangan internasional,

Indonesia merupakan importir jagung dalam jumlah besar termasuk impor dari Amerika

Serikat, Argentina, dan Cina yang merupakan negara penghasil utama jagung dunia

(Deswina, 2009; Saragih et al., 2009). Amerika Serikat dan Argentina, mempunyai

kemampuan produktivitas jagung tinggi karena menggunakan benih hibrida transgenik

tahan hama dan tahan herbisida sejak tahun 1997. Menurut Fernandez, Cornejo dan MC

bride (2002) dalam Mendoza et al.(2006), ada 18 tipe jagung rekayasa genetik yang

sudah disetujui oleh pemerintah Amerika Serikat. Badan dunia dalam bidang pertanian

dan pangan (FAO) menyarankan kesemua negara untuk memanfaatkan penggunaan

bioteknologi khususnya transgenik, dan FAO banyak mengulas keuntungan bagi yang

menerapkan tanaman transgenik (Faisal, 2005). Sementara menurut Deswina (2009),

Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan sejak 8 Juli 2008 telah menandatangani

peraturan teknis tentang evaluasi keamanan pangan, sehingga pengkajian dan

persetujuan keamanan pangan menjadi prioritas pertama bagi produk transgenik impor.

Pemerintah Provinsi Nusa Tenggara Barat menetapkan pengembangan tiga

komoditas unggulan yaitu sapi, jagung dan rumput laut. Tahun 2010 produksi jagung di

Nusa Tenggara Barat mencapai 371,8 ribu ton, jauh dari target yang dipatok pada awal

tahun yaitu 209,4 ribu ton (Munir, 2010). Dengan peningkatan jumlah produksi jagung,

4

menggerakkan sektor industri rumah tangga untuk memproduksi produk olahan pangan

dari berbahan dasar jagung. Disamping sebagai bahan baku pangan, jagung juga dapat

digunakan sebagai pakan.

Berdasarkan data dari Dinas Pertanian Tanaman Pangan dan Hortikultura

provinsi Nusa Tenggara Barat, peningkatan produksi jagung di provinsi Nusa Tenggara

Barat karena petani menggunakan benih jagung varietas hibrida maupun super hibrida

yang diberikan oleh Dinas Pertanian maupun dibeli dari toko benih yang ada di toko

benih di wilayah kota Mataram. Indonesia merupakan importir jagung terutama dari

Amerika Serikat yang telah menggunakan benih jagung hibrida transgenik tahan hama

dan tahan herbisida sejak tahun 1997, sehingga besar kemungkinan jagung atau benih

jagung yang beredar di Indonesia, khususnya di kota Mataram – Nusa Tenggara Barat

adalah jagung transgenik. Sementara penelitian tentang jagung yang beredar di

Indonesia khususnya di kota Mataram belum pernah dilakukan.

Berdasarkan uraian latar belakang diatas, untuk mengetahui apakah jagung

maupun benih jagung varietas hibrida maupun super hibrida yang beredar di Indonesia

khususnya di Mataram merupakan produk transgenik atau tidak dan untuk mengetahui

apakah peraturan tentang label pangan transgenik sudah diterapkan, maka dilakukan

penelitian deteksi keberadaan promoter 35S CaMV dengan menggunakan metoda PCR

terhadap biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan dan benih

yang beredar di kota Mataram – Nusa Tenggara Barat.

1.2. Rumusan Masalah

Dari uraian latar belakang permasalahan tersebut, maka rumusan masalah

yang dikemukakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut :

5

1. Apakah biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku produk pangan atau pakan

di kota Mataram positif transgenik berdasarkan deteksi keberadaan promoter 35S

CaMV dengan menggunakan metoda PCR?

2. Apakah benih jagung varietas hibrida maupun super hibrida yang digunakan oleh

petani sebagai benih jagung menunjukkan hasil positif sebagai jagung transgenik

berdasarkan deteksi keberadaan promoter 35S CaMV dengan menggunakan metoda

PCR ?

1.3. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui dan mendapatkan :

1. Biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan di kota

Mataram menunjukkan hasil positif transgenik melalui deteksi keberadaan

promoter 35S CaMV

2. Benih jagung varietas hibrida maupun super hibrida yang digunakan oleh petani

menunjukkan hasil positif sebagai jagung transgenik berdasarkan deteksi

keberadaan promoter 35S CaMV dengan menggunakan metoda PCR.

1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1. Manfaat teoritis :

1. Melengkapi pengetahuan tentang proporsi biji jagung yang digunakan sebagai

bahan baku pembuatan produk olahan pangan atau pakan dan benih jagung yang

positif transgenik khususnya di kota Mataram NTB.

2. Memberikan sumbangan tambahan pengetahuan mengenai pemeriksaan biji jagung

yang digunakan sebagai bahan baku pembuatan produk olahan pangan atau pakan

6

dan benih jagung transgenik secara biologi molekuler menggunakan metoda PCR

melalui deteksi keberadaan promoter 35S CaMV.

1.4.2. Manfaat Praktis :

Memberikan gambaran yang tepat mengenai proporsi biji jagung yang digunakan

sebagai bahan baku pembuatan produk olahan pangan atau pakan serta benih

jagung yang transgenik di kota Mataram, sehingga dapat digunakan sebagai upaya

unruk mencegah beredarnya biji jagung transgenik yang belum mendapatkan ijin

edar dari Badan POM.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Jagung

Menurut Agbios GM data base 2007 yang dikutip Sustiprijatno (2002) diakses

5 Mei 2012. Jagung dibudidayakan secara komersial di lebih dari 100 negara dengan

produksi sekitar 705 juta ton. Pada tahun 2004 produsen jagung terbesar di dunia

berturut-turut adalah Amerika Serikat, Cina, Brasil, Meksiko, Perancis, dan India.

Di Indonesia, jagung merupakan salah satu komuditas pangan strategis setelah

padi. Namun dengan luas areal sekitar 3,5 juta hektar dan produksi nasional sekitar 13

juta ton pada tahun 2007 belum cukup untuk memenuhi kebutuhan jagung di dalam

negeri (Saragih et al., 2009). Berbagai upaya dilakukan untuk peningkatan produksi

pangan salah satunya yaitu melalui perbaikan genetik tanaman. Perbaikan genetik

tanaman pangan dapat dilakukan secara konvensional maupun melalui rekayasa genetik

(genetic engenering). Dengan berkembangnya bioteknologi, perbaikan genetik pada

tanaman penghasil kebutuhan pokok melalui rekayasa genetik akan menjadi andalan

dalam pemecahan masalah pangan di masa mendatang (Herman, 2007).

Menurut FAO yang merupakan badan dunia dalam bidang pertanian dan

makanan, tanaman rekayasa genetik merupakan kebutuhan, dan semua negara di dunia

disarankan untuk menerapkan bioteknologi. Pengujian keamanan produk transgenik

yang dipasarkan, sudah menggunakan metoda yang disetujui oleh badan-badan

pengawas kesehatan dan pangan dunia seperti WHO dan FAO (Faisal, 2005).

Dalam rekayasa genetik tanaman pokok pangan, sifat unggul tidak hanya

didapat dari tanaman itu sendiri, tetapi juga dari spesies lain sehingga dapat dihasilkan

petugas_labkomp

Textbox

8

tanaman transgenik. Tanaman transgenik Bt merupakan tanaman transgenik yang

mempunyai ketahanan terhadap hama, dimana sifat ketahanan tersebut diperoleh dari

bakteri Bacillus thuringiensis (Amirhusin, 2004).

Perakitan tanaman transgenik berkembang pesat setelah adanya laporan

pertama kali tentang perakitan tanaman transgenik pada tahun 1984 (Horsch et al.,

1984 dalam Amirhusin, 2004). Tanaman transgenik adalah tanaman yang telah disisipi

atau memiliki gen asing dari spesies tanaman yang berbeda atau mahkluk hidup lainnya

(Herman, 2007; Yuwono, 2006).

2.2. Kondisi Pangan di Indonesia dan Nilai Gizi Jagung

Menurut Undang-Undang Nomor 7 tahun 1996, ketahanan pangan adalah

kondisi terpenuhinya pangan bagi setiap rumah tangga, yang tercermin dari tersedianya

pangan yang cukup, baik jumlah maupun mutunya, aman, merata dan terjangkau

(Bahagiawati dan Herman, 2008).

Dalam laporan Badan Pusat Statistik (BPS) terjadinya penurunan produksi

beberapa jenis pangan seperti padi, jagung, kentang, ubi dan tebu diperkirakan karena

terjadi penurunan luas panen seluas 29,07 ribu ha (0,22%) dari 13,253 juta ha menjadi

13,224 juta ha. Selain luas panen, produktivitas tanaman juga turun dari 50,15

kuintal/ha menjadi 49,44 kuintal/ha atau 1,42%. Hal ini mengakibatkan terjadinya kasus

gizi buruk di beberapa negara dapat menjadi pertanda krisis pangan. Menurut data

UNICEF, di Indonesia ada sekitar 1,3 juta balita yang masuk dalam katagori rawan gizi

serta terdapat sekitar 19 juta jiwa penduduk miskin yang sulit untuk mendapatkan

pangan yang bergizi dan seimbang (Faisal, 2005).

9

Jagung selain sebagai sumber karbohidrat, juga merupakan sumber protein

yang penting dalam menu masyarakat Indonesia. Menurut Ingglett (1997) dalam Suarni

(2009) Kandungan gizi utama jagung adalah sebagai berikut.

Tabel 2.1. Komposisi gizi jagung berdasarkan bobot kering (Ingglett (1997)

Komponen Biji Jagung Utuh Kadar (%)

Protein 3,7

Lemak 1,0

Serat Kasar 86,7

Abu 0,8

Pati 71,3

Gula 0,34

Untuk perbaikan dan peningkatan kualitas produksi pertanian (intensifikasi)

beberapa tahun yang lalu masih signifikan, karena ketersediaan sumber daya alam dan

tehnologi pertanian yang cukup memadai dan berimbang dengan ketersediaan lahan dan

peningkatan jumlah penduduk. Keadaan ini sulit dipertahankan kecuali ada pendekatan

baru yang menawarkan ide dan teknik untuk meningkatkan produktifitas pertanian.

Penggunaan rekayasa genetik memiliki potensi untuk menjadi problem solving dari

ancaman krisis pangan tersebut. Salah satu produk dari rekayasa genetik adalah tanaman

transgenik (Saragih et al., 2009).

2.3. Sejarah Tanaman Transgenik atau Genetically Modified Organism (GMO)

Tanaman transgenik pertama kali dikomersialkan pada tahun 1995 dan sejak

itu luas pertanaman ini meningkat (James, 2003). Tujuan tanaman trasgenik adalah

untuk mendapatkan tanaman dengan sifat-sifat yang diinginkan antara lain untuk

ketahanan terhadap hama dan penyakit, ketahanan terhadap herbisida, perubahan

kandungan nutrisi, dan peningkatan daya simpan (Manuhara, 2006). Disamping itu

10

untuk memenuhi kebutuhan pangan penduduk dunia yang semakin meningkat dan juga

permasalahan kekurangan gizi manusia (Yuwono, 2006).

Perakitan tanaman transgenik tahan hama merupakan salah satu bidang yang

mendapat perhatian besar dalam perbaikan tanaman. Perakitan tanaman transgenik

tahan hama umumnya menggunakan gen dari Bacillus thuringiensis (Bt). Pada tahun

1995, tanaman transgenik pertama mulai tersedia bagi petani di Amerika Serikat, yakni

jagung hibrida yang mengandung gen cry IA(b), maximize, yang dibuat oleh Novartis,

tanaman kapas yang mengandung gen cry IA(c), Bollgard, sawi (Barfield dan Pua,

1991) dan kentang yang mengandung gen cry 3A, Newleaf, yang dibuat oleh Monsanto.

Sampai tahun 1998, lebih dari 10 jenis tanaman telah berhasil ditransformasi untuk

mendapatkan tanaman transgenik tahan hama (Schuler et al., 1998 dalam Manuhara,

2006 ).

Dalam rekayasa genetik jagung, sifat unggul tidak hanya didapat dari tanaman

jagung itu sendiri, tetapi juga dari spesies lain sehingga dapat dihasilkan tanaman

transgenik. Jagung Bt merupakan tanaman trasgenik yang mempunyai ketahanan

terhadap hama, di mana sifat ketahanan tersebut diperoleh dari bakteri Bacillus

thuringiensis ( Herman, 2007).

Tersedianya bioaktif dari kristal protein yang dikode oleh gen Bt,

memungkinkan modifikasi genetik tanaman jagung transgenik Bt (Bt corn). Protein Bt

yang dihasilkan oleh gen Bt dapat meracuni hama yang menyerang tanaman jagung.

Kristal protein ini bersifat insektisidal dan sering disebut δ-endotoksin yang akan

berubah menjadi pro-toksin. Setelah dimakan oleh serangga, protein Bt ini dipecah oleh

suatu enzim pemecah didalam pencernaan larva serangga yang bersifat alkalin sehingga

menghasilkan protein pendek yang bersifat toksin. Akibatnya akan terbentuk pori-pori

di sel membran saluran pencernaan larva yang mengganggu keseimbangan osmotik dari

11

sel tersebut yang menyebabkan matinya serangga (Hofte dan Whiteley, 1989 dalam

Bahagiawati, 2002).

2.4. Promoter 35S Mosaic Virus Kembang Kol atau Cauli Flower Mosaic

Virus ( CaMV)

Cauliflower mosaic virus (CaMV) adalah tipe dari Caulimovirus, satu dari

enam genera dari family Caulimoviridae, genus Caulimovirus, spesies Cauliflower

mosaic virus (CaMV).

Promoter 35S CaMV adalah promoter yang cukup sensitif untuk metode

skrining produk rekayasa genetik pada jagung maupun produk olahan jagung seperti

tepung jagung, chips jagung, dan minyak jagung (Abdel et al., 2010 ; Ahmad, 2002;

Mendoza et al., 2006). Dalam pengujian PCR dengan menggunakan promoter 35S

CaMV mempunyai kemampuan untuk mendeteksi kandungan transgenik makanan atau

bahan pangan setidaknya 0,5% dan lebih dari 80 % tanaman transgenik menggunakan

promoter 35S CaMV sebagai komponen penyususnnya (Alejendro et al. 2000).

2.5. Perkembangan Perakitan Tanaman Jagung Transgenik

Perakitan tanaman trangenik berkembang pesat setelah ada laporan pertama

kali pada tahun 1984 (Horsch et al.,1984). Pada tahun 1995, tanaman transgenik

pertama mulai tersedia bagi petani di Amerika Serikat, yaitu jagung hibrida yang

mengandung gen cry IA(b) , maximizer, yang dibuat oleh Novartis, tanaman kapas yang

mengandung gen cry IA(c), bollgard, sawi ( Barfield dan Pua, 1991) dan kentang yang

mengandung gen cry 3A, newleaf, yang dibuat oleh Monsanto. Sampai tahun 1998,

lebih dari 10 jenis tanaman telah berhasil ditransformasi untuk mendapatkan tanaman

transgenik tahan hama. Tanaman tersebut meliputi tembakau, tomat, kentang, kapas,

12

padi, jagung, whitespruce, kacang hijau, strowberi dan kanola (Shhuler et al., 1998

dalam Manuhara, 2006).

Penggunaan tanaman transgenik menjadi perdebatan karena penggunaan

antibiotik sebagai gen penyeleksi telah menimbulkan pengaruh terhadap kesehatan

manusia seperti alergi dan kekebalan terhadap antibiotik yang sulit diobati (Rahmawati,

2003). Disamping itu, kekhawatiran akan terjadinya kerusakan lingkungan akibat

tanaman transgenik seperti kasus serbuk sari tanaman transgenik yang dinyatakan

membunuh larva kupu-kupu Monarch. Serbuk sari tanaman transgenik yang tersebar

oleh angin lebih dari 60 meter mencemari tanaman konvensional yang dimakan oleh

organisme non-target termasuk kupu-kupu raja. Kupu-kupu ini memiliki pertumbuhan

yang lebih lambat dan tingkat kematian tinggi (Losey et al., 1999).

Di sisi lain tanaman transgenik memberikan keuntungan bagi petani dan

konsumen. Petani memperoleh hasil yang lebih tinggi dan peningkatan keleluasaan

dalam pengelolaan tanaman, sedangkan konsumen memperoleh hasil yang lebih

menyehatkan karena tanaman ditanan dengan menggunakan pestisida dalam jumlah

sedikit dan atau sifat nutrisi yang lebih menyehatkan. Tanaman transgenik yang telah

disetujui untuk pangan merupakan tanaman yang direkayasa untuk memiliki sifat

seperti tahan terhadap hama dan penyakit, ketahanan terhadap herbisida, perubahan

kandungan nutrisi dan peningkatan daya simpan. Beberapa contoh tanaman rekayasa

genetik dapat dilihat pada tabel 2.2.

13

Tabel 2.2. Beberapa contoh tanaman rekayasa genetik (Manuhara, 2006)

Tanaman Sifat

Kanola Toleran herbisida, kandungan laurat tinggi dan kandungan

asam oleat tinggi

Jagung Toleran herbisida dan tahan hama

Kapas Tahan hama

Pepaya Tahan virus

Kentang Tahan hama dan tahan virus

Kedelai Tahan herbisida dan kandungan asam oleat tinggi

Jeruk Tahan virus

Tomat Penundaan pemasakan dan toleran herbisida

Meskipun ada pro dan kontra terhadap tanaman transgenik, area tanaman

transgenik di dunia meningkat dari tahun ke tahun, data tersaji pada Tabel 2.3. Pada

tahun 2000, area tanaman transgenik mencapai 8,30 juta hektar (James 1998 - 2000).

Di Indonesia, pada tahun 2000 telah dicoba menanam kapas transgenik bollgard di

Sulawesi Selatan seluas 5.000 ha. Menurut Makkarasang (2001), keuntungan yang

diperoleh petani kapas di Sulawesi Selatan mencapai Rp 3 – 4 juta/ha/musim tanam

(Manuhara, 2006).

Menurut James, data dari tahun 2003 sampai 2007 menunjukkan luas area

pertanaman jagung Bt tahan herbisida secara global dari tahun 1996 sampai dengan

2006 terjadi kenaikan seperti dirangkum dalam tabel 2.3.

Tabel 2.3. Luas area pertanaman jagung Bt tahan herbisida secara global dari tahun

1996 -2006 (Herman, 2007).

Sifat Luas (juta ha)

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Bt 0,3 3,0 6,7 7,5 6,8 5,9 7,7 9,1 11,2 11,3 11,1

Bt/TH 0 0 0 0 1,4 1,8 2,2 3,2 3,8 6,8 9,0

Total 0,3 3,0 6,7 7,5 8,2 7,7 9,9 12,3 15,0 15,0 20,1 Ketrangan : Bt = Bacillus turingiensis; TH = toleran herbisida

Meskipun belum banyak yang melaporkan perkembangan penelitian tentang

jagung transgenik di Indonesia tetapi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB Biogen) telah melakukan

14

penelitian terhadap jagung Bt yang tahan terhadap hama seperti terangkum dalam Tabel

2.4 (Herman, 2002).

Tabel 2.4. Penelitian terhadap jagung Bt di Indonesia (Herman, 2002)

Jenis kegiatan Sifat Gen interes Status

Transformasi melalui

penembakan partikel

Tahan terhadap

penggerek batang

Protein inhibitor

II (PinII)

-

Fasilitas uji terbatas

Lapangan uji terbatas Uji

multilokasi

Tahan asian corn

borer

Bt Aman hayati

2.6. Peranan Badan POM dalam Pengawasan Produk Rekayasa Genetik

Dalam rangka mengantisipasi kekhawatiran tentang adanya kemungkinan

dampak negatif penggunaan produk transgenik, maka ditetapkan keputusan menteri

Pertanian No. 856/Kpts/HK.330/9/1997 tentang Ketentuan Keamanan Hayati Produk

Bioteknologi Pertanian Hasil Rekayasa Genetik (PBPHRG). Karena di dalam

Keputusan Menteri Pertanian tersebut belum mencakup aspek keamanan pangan maka

ditetapkan Keputusan Bersama Menteri Pertanian, Menteri Kehutanan dan Perkebunan,

Menteri Kesehatan (Badan POM), dan Menteri Negara Pangan dan Hortikultura No.

998.I/Kpts/OT.210/9/99; 790.a/Kpts-IX/1999; 1145A/MENKES/SKB/IX/1999;

015A/Nmeneg PHOR/09/1999 tentang Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan

Produk Pertanian Hasil Rekayasa Genetik (PPHRG). Sebagai implementasi pelaksanaan

Keputusan bersama empat Menteri telah dibentuk Komisi Keamanan Hayati dan

Keamanan Pangan (Novianti, 2003).

Untuk melaksanakan ketentuan pasal 29 ayat (1) Peraturan Pemerintah Nomor

21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik, ditetapkan

Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 39 tahun 2010 tentang Komisi

Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (KKH PRG) dan untuk mendukung fungsi

15

KKH PRG dalam penyelenggaraan layanan dan pengelolaan informasi dibentuk Balai

Kliring Keamanan Hayati (BKKH) ( Yulinar, 2010).

Untuk keputusan tentang keamanan pangan dan atau keamanan pakan produk

bioteknologi melibatkan Badan POM dan kementerian terkait, yaitu Kementerian

Pertania,Kementerian Kehutanan, dan Kementerian Kelautan dan Perikanan. Sedangkan

untuk uji keamanan pangan sesuai dengan pedoman pengkajian keamanan pangan

produk rekayasa genetik telah disahkan sejak tahun 2008 oleh Badan POM (Deswina,

2009), sehingga pengkajian dan persetujuan keamanan pangan menjadi prioritas

pertama bagi produk transgenik impor.

2.7. Pemeriksaan Tanaman Transgenik

Saat ini metoda ekstraksi DNA yang tersedia dan yang paling banyak

digunakan adalah ekstraksi menggunakan cetyltrimethylammonium bromida (CTAB)

Keuntungan penggunaan CTAB adalah : biaya murah, menghasilkan isolat DNA yang

memuaskan tanpa ada degradasi DNA karena faktor-faktor pemanasan berlebihan,

aktivitas nuklease dan pH rendah, umumnya terjadi pada proses pengolahan pangan

yang berkontribusi terhadap degradasi DNA (Ahmad., 2002). Ekstraksi DNA

menggunakan CTAB adalah metoda resmi untuk ekstraksi di Jerman yang diakui

komite standarisasi Eropa yang digunakan untuk mendeteksi makanan atau pakan hasil

rekayasa genetik (Nguyen et al., 2008).

Konfirmasi keberadaan dan integrasi transgenik dapat dilakukan dengan

polymerase chain reaction (PCR). Polymerase chain reaction dapat mengimformasikan

ada atau tidaknya sekuen transgenik sesuai dengan primer yang dipakai (Duijn et al.,

2002). Polymerase chain reaction merupakan cara yang populer digunakan karena

dapat menganalisis secara cepat dengan ketelitian yang tinggi. Polymerase chain

16

reaction mampu mendeteksi transgenik pada berbagai variasi makanan seperti yang

dilaporkan oleh Mendoza et al. (2006) diantaranya, deteksi transgenik pada tepung

jagung, tomat, kedelai oleh Ming (2002); deteksi transgenik pada jagung (Lih et al.,

2002); deteksi transgenik pada daging (Chreiber, 1999). Sedangkan promoter CaMV

35S mempunyai kemampuan universal untuk membedakan jagung transgenik atau

jagung konvensional (Lee et al., 2004).

2.8. Polymerase Chain Reation (PCR)

Polymerase chain reaction adalah suatu suatu teknik yang dipakai untuk

melipat gandakan asam nuklet (DNA/RNA) in vitro secara enzimatik menggunakan

polymerase termostabil didalam suatu mesin pengubah suhu (thermocycler).

Polymerase chain reaction merupakan teknik yang handal dalam mempersingkat

jalannya pengerjaan kloning DNA dan pemetaannya yang kemudian berkembang

menjadi teknik utama dalam laboratorium biologi molekuler yang digunakan antara lain

untuk transkripsi in vitro dari PCR template. Metoda ini pertama kali dikembangkan

pada tahun 1985 oleh Kary B. Mulliset (Yuwono, 2006).

Metode PCR digunakan sebagai metode dasar untuk mendeteksi urutan gen

pengapit baru yang disisipkan yaitu promoter 35S dari CaMV dan terminator NOS

melalui plasmid T yang ada dalam Agrobacterium tumefaciens (Querci, 2004) dalam

Adugna dan Mesfin, (2008) dan penanda gen resisten kanamisin (nptII) menurut ILSI

(1999) dalam Adugna dan Mesfin, (2008)

Polymerase chain reaction dapat digunakan untuk menggandakan fragmen

DNA secara eksponensial dalam waktu singkat. Teknik ini, selain cepat juga memiliki

sensitivitas, spesialisitas dan nilai prediksi secara akurasi yang tinggi. Konsep asli

teknologi PCR mensyaratkan bahwa posisi DNA yang akan dilipat gandakan harus

17

diketahui terlebih dahulu sebelum proses tersebut dilakukan. Pengetahuan tentang posisi

DNA tersebut penting untuk merancang primer yang sesuai. Primer adalah suatu sekuen

oligonukleotida pendek yang berfungsi untuk mengawali sintesis rantai DNA dalam

PCR (Yuwono, 2006).

2.8.1. Prinsip dasar polymerase chain reaction (PCR)

Prinsip dari teknik polymerase chain reaction adalah

pelipatgandaan segmen DNA target dalam tabung reaksi dengan bantuan enzim DNA

polimerase. Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan yaitu

fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) primer, yaitu suatu sekuen

oligonukleotida pendek (15 - 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali

sintesis rantai DNA, (3) deoksiribonucleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP,

dCTP ,dGTP, dan dTTP, serta (4) DNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan

katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Komponen penting lainnya adalah bufer PCR

(Yuwono, 2006).

Proses pelipatgandaan DNA ini terjadi melalui 3 tahap, yaitu denaturasi

(denaturation), pelekatan (annealing), dan pemanjangan (extension). Tahap denaturasi

terjadi pada suhu tinggi ( 90 – 95 0C ) di mana untai ganda DNA terpisah menjadi untai

tunggal. Proses ini berlangsung selama 1 – 2 menit. Kemudian, pada tahap pelekatan,

suhu diturunkan menjadi 55oC. Pada tahap ini primer akan menempel pada cetakan

yang telah terpisah menjadi untai tunggal melalui ikatan hidrogen pada sekuen yang

komplementer. Suhu pelekatan primer yang lebih tepat dapat dihitung dari jumlah dan

jenis nukleotida penyusun primer (Yuwono, 2006). Sebenarnya pelekatan dapat

berlangsung lebih efisien jika dilakukan pada suhu 370C tetapi suhu yang lebih rendah

ini dapat menyebabkan mispriming (penempelan primer pada tempat yang salah).

18

Ada dua jenis primer yang digunakan dalam PCR, masing-masing memiliki

sekuen oligonukleotida yang identik dengan sekuen rantai DNA cetakan yang

komplementer yaitu primer sense dan primer anti sense. Proses pelekatan biasanya

dilakukan selama 1 – 2 menit. Setelah tahap pelekatan, suhu dinaikkan menjadi 720C

selama 1 – 2 menit. Pada saat ini DNA polimerase melakukan proses pemanjangan

(extension) kedua primer dengan arah dari 5` ke 3`, sehingga terbentuklah dua untaian

DNA ganda baru. Ketiga tahap reaksi tersebut diulang sampai 25 – 30 siklus sehingga

pada akhir proses di peroleh molekul-molekul DNA rantai ganda baru dalam jumlah

yang jauh lebih banyak, karena jumlahnya meningkat secara eksponensial (Yuwono,

2006). Contoh penggandaan DNA cara eksponensial dalam 35 siklus disajikan pada

Gambar 2.1.

Gambar 2.1.Penambahan jumlah rantai DNA secara eksponensial dalam 35 siklus

(Laimore,1990)

Hasil pelipatgandaan DNA ini dapat divisualisasikan dengan berbagai cara,

misalnya dengan elektroforesis pada gel agarose (DNA diwarnai dengan pewarnaan

ethidium bromide sehingga tampak berpendar di bawah sinar ultra violet). Menurut Lipp

et al., (1999), produk PCR dapat divisualisasi dengan gel agarose 2%. DNA sasaran

yang telah dilipatgandakan ini dapat digunakan lebih lanjut untuk berbagai keperluan,

19

misalnya di karakterisasi sifat – sifatnya, dicari urutan nukleotidanya (sequencing)

ataupun dipotong dengan enzim tertentu (Yuwono, 2006).

2.8.2. Faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR

Keberhasilan PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, misalnya:

a. Deoksiribonukleotide triphosphat (dNTP)

Deoksiribonukleotide triphosphat terdiri atas deoksi-adenosin trifosfat (dATP),

deoksi-guanosin trifosfat (dTTP), deoksi-cytosin trifosfat (dCTP) dan deoksi-timidin

trifosfat (dTTP). Kadar masing-masing dNTP yang diperlukan dalam PCR adalah 200

µM dan keempatnya sebaiknya berkadar yang sama untuk memperkecil kemungkinan

kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi (Gefland dan White,

1990 dalam Yuwono, 2006).

b. Primer oligonukleotida

Kadar akhir primer yang optimal berkisar antara 0,1-1 µM/50 µL. Kadar primer

diatas 1,0 µM dapat menyebabkan terkumpulnya hasil polimerisasi yang non spesifik

(Yuwono, 2006). Harus dihindari kemungkinan terbentuknya hibrid antara primer yang

satu dengan yang lainnya. Jumlah G dan C pada primer berkisar antara 50 – 60 % dari

jumlah keseluruhan nukleotida yang ada. Perlu dihindari pula rancangan primer dengan

tiga atau lebih nukleotida C atau G yang terletak berurutan pada ujung 3`, karena dapat

menyebabkan mispriming, terutama pada daerah-daerah yang kaya akan sekuen G dan

C (Gelfand dan White, 1990 dalam Yuwono, 2006).

Primer sense dan primer antisense yang digunakan sebaiknya mempunyai nilai

Tm (melting temperature) yang berdekatan. Tm adalah suhu saat setengah dari molekul

20

DNA mengalami denaturasi. Nilai Tm oligonukleotida dapat dihitung dengan rumus:

Tm = 2oC x (A+T) +4

oCx(G+C) (Yuwono, 2006).

c. DNA template atau DNA cetakan.

Kadar DNA template yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105

– 106

molekul/ µL (Yuwono, 2006). Deoxyribonucleic acid target yang lebih panjang dapat

pula diamplifikasi walau kurang efisien, karena produknya yang panjang lebih rentan

terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja enzim polimerase. Selain itu, waktu untuk

amplifikasi jadi lebih panjang. Fragmen DNA yang terlalu panjang dapat dipotong dulu

dengan enzim restriksi (Sambrook et al., 1989 dalam Yuwono, 2006).

DNA dalam bentuk murni paling baik digunakan sebagai template oleh karena itu DNA

template (cetakan) harus dimurnikan dari komponen penyertanya. Ketidakmurnian

DNA dapat mengganggu reaksi, dan menghambat kerja polimerase. Dalam memilih

target yang akan diamplifikasi, yang paling penting diperhatikan adalah stabilitas

genetik target. Perubahan atau hilangnya sekuen target akan berakibat hilangnya

reaktifitas. Efisiensi amplifikasi biasanya lebih tinggi jika menggunakan DNA yang

sudah linier. DNA template (cetakan) perlu didenaturasi dulu pada suhu 95oC selama 5

menit, dengan tujuan menghindari pembentukan produk nonspesifik dan membuat DNA

template terpisah sempurna (Sambrook et al., 1989 dalam Yuwono, 2006).

d. Komposisi larutan buffer.

Buffer yang dianjurkan untuk PCR adalah buffer Tris-HCl pH 8,3 - 8,8 dengan

kadar 10 - 50 mM, (pada suhu20oC). Untuk membantu proses penempelan primer

(primer annealing), ditambahkan KCl sampai kadar 50 mM. Diatas kadar ini, KCl

justru akan menghambat aktifitas Taq DNA polymerase. Komponen lain yang perlu

21

ditambahkan adalah gelatin bovine serum albumin atau BSA sebanyak 0,1 % b/v dan

detergen non-ionik seperti Tween 20 sebanyak 0,05 – 0,1 % untuk menstabilkan enzim

Taq DNA polymerase (Yuwono, 2006).

e. Jumlah siklus reaksi

Banyaknya siklus dalam PCR yang diperlukan bergantung terutama pada kadar

awal molekul DNA target yang akan dilipatgandakan. Siklus yang terlalu banyak dapat

menyebabkan meningkatnya kadar produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang

terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan. Sebagai patokan,

3,0 x 105 molekul target molekul memerlukan 25 – 30 siklus, 1,5 x 10

4 molekul target

memerlukan 35 – 40 siklus (Yuwono, 2006).

f. Enzim yang digunakan.

Enzim yang digunakan adalah taq polymerase dengan kadar 1,25 – 2,5 unit/

reaksi atau 1,25 – 2,5 unit/50 µL dan sebaiknya tidak melebihi 2,5 U/50 µL karena

kadar enzim yang terlalu tinggi akan menurunkan spesifisitas PCR ( Yuwono, 2006).

g. Faktor teknis dan non-teknis lainnya.

Teknik PCR rawan kontaminasi yang dapat terjadi pada bahan, reagen dan

peralatan yang digunakan. Oleh karena itu semua pekerjaan harus dilakukan secara hati-

hati. Semua bahan, reagen dan peralatan yang digunakan harus dijaga sterilitasnya dan

hanya digunakan untuk satu kali pemakaian (Yuwono, 2006)

h. Keunggulan polymerase chain reaktion (PCR)

Keunggulan dan keuntungan PCR menurut Adugna dan Mesfin (2008), antara

lain :

22

1. Sensitif untuk analisa transgenik walaupun dalam kandungan DNA yang

sangat rendah.

2. Memungkinkan amplifikasi segmen DNA tertentu secara selektif walaupun

dalam bentuk campuran.

3. Membutuhkan reagen dan waktu yang lebih sedikit dibanding dengan uji

imunologi.

4. Molekul DNA relatif stabil selama proses pengujian (Vanden et al., 2005).

i. Keterbatasan dan kelemahan metode PCR

Keterbatasan PCR antara lain :

1. Sangat sensitif sehingga dengan kontaminasi yang sangat rendah

memungkinkan terjadinya hasil positif palsu (Greiner et al., 2005).

2. Positif palsu juga dapat terjadi karena promoter CaMV, NOS dan nptII

terdapat di alam secara alami dalam makanan ( ILST, 1999 dalam Adugna

dan Mesfin, 2008).

3. Kemungkinan terjadinya hasil negatif palsu yang disebabkan oleh urutan

nukleotida primer yang tidak adekuat (Adugna dan Mesfin, 2008).

Untuk keterbatasan dan kelemahan metode PCR tersebut, maka penggunaaan

kontrol positif (+) dan kontrol negatif (-) sangatlah penting. Dengan menggunakan

kontrol positif untuk mengetahui pasangan basa (bp) dari gen yang di deteksi ,dan

kontrol negatif dengan mengunakan reagen yang di tambahkan aquadest steril atau

dengan internal kontrol (Adugna dan Mesfin, 2008).

23

2.9. Elektroforesis gel agarose

Elektroforesis adalah suatu tehnik pemisahan yang banyak digunakan untuk

memisahkan makro molekul (seperti protein dan asam nukelat). Prinsip kerjanya

berdasar pada perbedaaan kecepatan gerak partikel-partikel bermuatan dalam medan

listrik. Molekul DNA bermuatan negatif, akibatnya pada medan listerik molekul DNA

akan bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul antara lain

bergantung pada bentuk molekul DNA dan muatan listriknya. Meskipun demikian

ukuran molekul DNA juga ikut menentukan kecepatan migrasi jika elektroforesis

dilakukan dalam media gel (Brown, 1991).

Gel dapat terbuat dari agarose, poliakrilamid, atau campuran keduanya, yang

membentuk struktur kerangka dengan lubang-lubang kompleks, tempat lewatnya

molekul DNA. Makin kecil molekul DNA makin cepat juga perpindahannya melewati

gel. Karena itu elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA sesuai dengan

ukurannya. Pada akhir reaksi gel elektroforesis masing-masing molekul DNA akan

terpisah dan dari jarak tempuhnya dapat di ketahui ukurannya. Kadar gel yang sering di

gunakan adalah 0,7% - 2% (Brown, 1991). Kadar gel agarose untuk pemeriksaaan yang

efisien di lihat pada tabel 2.5.

Table 2.5. Gel agarose untuk pemeriksaan yang efisien (Supardi, 1991)

Agarose (% b/v) Ukuran molekul DNA (kbp)

0,3 5-50

0,6 1-2

0,8 0,5-10

1,0 0,4-8

1,2 0,4-6

1,5 0,2-4

1,8 0,3-3

Keterangan: b/v: berat/ volume; kbp: kilo base pair

24

Untuk mendetekasi pita DNA pada gel dapat di gunakan ethidium bromide.

Bahan pewarna ini berkaitan dengan molekul basa DNA dan menyebabkan DNA

berpendar bila di sinari cahaya ultraviolet (Brown, 1991).

2.10. Kerangka konsep penelitian

Biji jagung dan benih jagung

Transgenik Non transgenik

DNA

Amplifikasi dengan PCR

DNA dengan promoter 35S CaMV

Biji jagung atau benih

jagung non transgenik

Biji jagung atau benih

jagung transgenik

Transgenik

Elektroforesis produk PCR

Terdapat Pita DNA promoter

35S CaMV (195 bp)

Tidak ada pita DNA promoter

35S CaMV (195 bp)

Amplifikasi dengan PCR

Sekuen primer : 35S 1: 5’-GCT CCT ACA AAT GCC ATCA-3’ 35S 2: 5’-GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’

Elektroforesis produk PCR

25

2.11. Hipotesis

1. Benih jagung yang digunakan sebagai benih oleh petani, positif sebagai

transgenik setelah diuji melalui deteksi keberadaan promoter 35S CaMV

dengan menggunakan metoda PCR.

2. Biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan positif

sebagai transgenik setelah diuji melalui deteksi keberadaan promoter 35S

CaMV dengan menggunakan metoda PCR

26

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Departemen Biologi

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga Surabaya dan Balai Besar

Pemeriksaan Obat dan Makanan Mataram bulan September sampai dengan Desember

2012. Pengambilan sampel dilakukan kota Mataram yaitu di pasar tradisional, toko

benih dan bantuan benih dari Dinas Pertanian dan Hortikultura Provinsi NTB.

3.2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yang adalah :

Biji dan benih jagung diperoleh dari wilayah kota Mataram dengan rincian sebagai

berikut: sampel berupa biji jagung diperoleh dari pasar tradisional yaitu pasar Cemare,

pasar Karang Sukun, pasar Karang Jasi, pasar Sindu, pasar Kebon Roek dan pasar

Mandalika. Sampel benih diperoleh dari Dinas Pertanian Tanaman Pangan dan

Hortikultura provinsi Nusa Tenggara Barat dan toko benih di Sweta.

Kontrol positif berupa sampel kedelai positif GMO yang diperoleh dari Pusat

Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN) Badan Pemeriksaan Obat dan

Makanan Republik Indonesia di Jakarta. Sampel kedelai positif ini digunakan sebagai

baku kerja Genetically Modified Organism (GMO) bubuk kedelai Roundup Ready yang

sudah diverifikasi terhadap Certified Reference Material (Soya Bean Powder Set

Certified Reference Material IRMMN.4105.

petugas_labkomp

Textbox

27

sodium chlorida (NaCl) Amresco, sodium hydroxide solution (Merck), sodium

chloride (Amresco),Tris (Hidroxymethyl)-aminomethane hydrochloride (Amresco),

hexadecyltrimethyl-ammonium bromide (CTAB) (Amresco), EDTA (Amresco)

kloroform ( Merck), ethanol absolut (Merck) buffer PB (DNA binding buffer) Qiagen,

buffer PE (wash buffer) Qiagen, buffer AE ( elution buffer) Qiagen, DNA AWAYTM

(removes DNA and DNAse contamination) Molecular Bio-Products Inc., San Diego,

α- amilase heat stable ( Sigma), larutan 0,5 M EDTA pH 6,0, Ultra pure TM

agarose

(Invitrogen), SYBR Safe DNA Gel Stain (Promega), DNA moleculer weight marker

100 bp (Amresco), suchrosa loading dye (Amresco), TAE buffer 40x, bovine serum

albumin (BSA), deoxynucleotida triphosphat (dNTP mix) yaitu satu set campuran dari

dATP, dCTP, dGTP,dan dTTP masing-masing 10 µM, go taq hot start polymerase,

primer dengan urutan basa nukleotida : 35S-1 : 5’-GCT CCT ACA AAT GCC ATC A-

3’; 35S-2 : 5’- GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’ (Alejandro et al., 2000;

Gurakan et al., 2011; Lee et al., 2004; Lipp, 1999; Zaulet et al., 2009; Nikolic et al,

2008; Oraby et al., 2005).

3.3. Alat

Tabung falcon 5 ml steril, tabung microsentrifuse 2,0 ml, 1,5 ml dan 0,5 ml

steril. Mikropipet Gilsen Model P2 ( 0,2-2 µL), P10 (1-10 µL), P100 ( 10 µL- 200 µL) ,

P200 (20 µL- 200 µL) dan P1000 (100 µL- 1000 µL), qiamp mini colum (kit Qiagen ),

Elektroforesis Thermo Scientific owl Easycast TM

BIA, thermomixer, Applied Biosystems

viriti 96 well thermocycler , waterbath shaker Labtech LSB 0305/B 100628020, vortex,

spektrofotometer UV- 1800/ A 1145461508CD Shimadzu, UV-transilluminator OB

201313 gel dokumentasi, pH meter, BSC (laminar air flow) ESCO class II Type A2,

28

Analitic Balance Chyo JK-180, refrigerator, sentrifuge Thermo Sorvall Legend Mach

1,6, spin down centrifuge Biorad Mini Centrifuge 56007489, oven, autoclave, blander

3.4. Prosedur Kerja

3.4.1. Isolasi DNA

Setiap sampel diambil 50 – 80 biji, kemudian diblender dengan hati-hati

sampai halus. Setelah selesai menghaluskan satu sampel dilanjutkan dengan sampel

yang lain. Setiap selesai menghaluskan sampel dengan blender, blender dibersihkan

dengan kuas sampai partikel tepung tidak ada yang tertinggal sebelum digunakan lagi

(Alejendro et al., 2000; Zaulet et al, 2009).

Sampel yang telah halus, ditimbang sebanyak 100 mg kemudian dimasukkan

ke dalam tabung Eppendorf 2-ml ditambah 1,5 ml CTAB, kemudian diinkubasi pada

suhu 65oC sekurang kurangnya 30 menit, setelah itu disentrifugasi pada 15 000 g

selama 10 menit. Dipipet 700 µL supernatan ke dalam tabung 2 ml, diekstraksi dengan

700 µL kloroform dicampur homogen, kemudian disentrifugasi pada 15000 g selama

10 menit. Diambil 400 µL fase air ke dalam tabung steril 5 ml ditambah 2 ml buffer PB

( Qiagen), dicampur dan dituang ke dalam QIAamp maxi kolom sampai cairan habis.

Kolom dicuci sebanyak dua kali dengan menggunakan 750 µL buffer PE,

kemudian kolom dikeringkan dengan cara disentrifugasi pada 12000 g selama 5 menit.

Kolom diletakkan pada tabung steril 2-ml, ditambahkan 50 µL buffer elusi tepat

ditengah kolom untuk mengelusi DNA didiamkan selama 5 menit, kemudian

disentrifugasi lagi pada 12 000 g selama 5 menit. Larutan DNA disimpan pada suhu

-20oC, bila akan segera digunakan dapat disimpan pada suhu 4

oC. Pengujian kontrol

positif dilakukan dengan metoda isolasi yang sama seperti pengujian sampel. Kontrol

negatif ekstraksi disertakan pada setiap pengujian dengan menggunakan buffer CTAB

29

tanpa menggunakan sampel dan harus dianalisis bersama-sama pada waktu pengujian

sampel (Bjarte et al., 2008; Oraby et al., 2005; QIAamp® DNA Mini and Blood Mini

Handbook ed Qiagen, 2007).

Untuk menghidari kontaminasi silang antar sampel maka pada masing masing

tahapan penelitian dilakukan dengan peralatan dan ruangan yang terpisah atau

tersendiri, sedangkan untuk memastikan keakuratan hasil uji, setiap melakukan isolasi

DNA disertakan dengan kontrol negatif (kontrol pereaksi) dan kontrol positif.(Adugna

dan Mesfin, 2008). DNA hasil isolasi dilakukan determinasi konsentrasi dan

kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan diuji kualitasnya dengan

elektroforesis gel agarosa.

3.4.2. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA

Untuk mengetahui konsentrasi maupun rasio kemurnian DNA secara tepat dapat

diukur dengan menggunakan spektrofotometri absorben ultraviolet (ultraviolet

absorbance spectrophotometry) dengan seperangkat komputer.

Cara kerja pengujian rasio kemurnian dan konsentrasi DNA dengan spektrofotometer

adalah : Spektrofotometer dihidupkan, kemudian dipilih menu Bio – Methode kemudian

dipilih menu DNA Quantitation dan dilakukan uji blangko dengan menggunakan

aquadest. Setelah itu isolat DNA dimasukkan ke dalam kuvet spektrofotometer.

Data hasil resapan yang dihasilkan berupa rasio absorbansi (kemurnian DNA)

dan konsentrasi DNA yang diprint sebagai dokumen hasil pengukuran. Kuvet

dikeluarkan dan diganti dengan cairan DNA lain yang akan diukur dan diperlakukan

sama seperti pengukuran sebelumnya. Interpretasi hasil pengukuran dengan

spektrofotometer.

30

a. Konsentrasi DNA

Konsentrasi DNA dapat dihitung berdasarkan resapan absorbansi pada λ 260

nm dikalikan dengan faktor pengenceran dimana 1 OD260 = 50 µg ml-1

DNA

(Brown, 1991; Nur, 2012; Oraby et al.,2005; Yuwono, 2005). Untuk menghitung

konsentrasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

Konsentrasi DNA yang digunakan sebagai tamplate dalam proses amplifikasi

sesuai dengan yang telah dilakukan oleh Ahmed (2010) yaitu 50 ng/µL. Perhitungan

pembuatan konsentrasi 50 µg dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Rumus pembuatan pengenceran konsentrasi DNA

V1 x N1 = V2 x N2

Keterangan : V1 : Volume DNA awal; N1 : Konsentarsi DNA awal ;

V2 : Volume DNA yang akan dibuat; N2 : Konsentrasi DNA yang

akan dibuat

Hasil perhitungan pengenceran ditampilkan pada lampiran 3.

b. Kemurnian DNA

Kemurnian DNA pada suatu sampel dapat diketahui dengan menghitung rasio

absorban pada λ 260 nm dan λ 280 nm (A 260/ A280). Nilai kemurnian DNA yang

baik berkisar antara 1.8 – 2,0 (Abdel et al., 2010; ; Brown, 1991 ; Clark, 1996; Nur,

2012).

Konsentrasi DNA = Absorbansi λ 260 nm x Konstanta DNA doble helix (50)

x Faktorpengenceran

31

3.4.3. Evaluasi kualitas DNA

Evaluasi kualitas DNA hasil isolasi dapat diketahui dengan melakukan

elektroforesis pada gel agarosa 0,7% dengan voltase 90 volt selama 40 menit (Gurakan

et al., 2011) dengan langkah sebagai berikut :

Ditimbang 700 mg agarosa dan dilarutkan dengan 100 ml larutan TAE 1X.

Larutan dipanaskan hingga mendidih dan gel agarose didiamkan pada suhu kamar

hingga suhu gel agarosa ± 500C. Ditambahkan 8 uL SYBR safe DNA gel stain, diaduk

sampai homogen kemudian gel dituang ke dalam baki ( tray) cetakan gel, dengan hati-

hati sisir gel diletakkan digel agarose. Setelah gel agarose memadat, sisir yang diatas gel

agarose ditarik kemudian gel agarose diletakkan pada alat elektroforesis. Gel agarose

digenangi dengan larutan buffer TAE 1X sampai gel terendam didalam baki

elekktroforesis.

Dipipet 10 µL DNA hasil isolasi baik dari sampel, kontrol negatif dan kontrol

positif dan masing-masing dicampur dengan 2 µL pemberat DNA ( suchrosa loading

buffer) yang telah diletakkan di atas kertas parafilm. Dipipet keseluruhan volume (12

µL) dicampur dan dimasukkan perlahan- lahan ke dalam sumur di gel agarose. Pada

sumur pertama dimasukkan 10 µL yang merupakan campuran 5 µL marker DNA

dengan berat molekul 100 bp dengan 5 µL suchrosa loading buffer yang sudah

tercampur homogen.

Elektroforesis dijalankan pada tegangan 90 volt selama 40 menit, DNA akan

bermigrasi ke arah anoda ( kutub positif, merah). Pewarna dalam buffer terlihat telah

bermigrasi sesuai dengan jarak yang diperlukan untuk pemisahan fragmen DNA, power

supply dimatikan. Dengan adanya SYBR safe DNA gel stain yang telah dimasukkan ke

dalam agarose, DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar ultraviolet (gel dokumentasi)

dan dokumentasi. Keberadaan DNA hasil isolasi dapat dibuktikan dengan adanya pita

32

DNA yang berpendar di bawah pemaparan sinar UV dari gel dokumentasi (UV-

transilluminator OB 201313.

3.4.4. Deteksi benih jagung dan biji jagung transgenik (GMO) dengan PCR

melalui identifikasi promoter CaMV 35S

3.4.4.1.Preparasi mastermix

Disiapkan mastermix dalam tabung Eppendorf 1,5 atau 2,0 ml yang akan

digunakan untuk serangkaian reaksi, yaitu seluruh sampel termasuk kontrol negatif dan

kontrol positif. Mastermix disimpan pada 4oC maksimum selama 30 menit sebelum

digunakan. Satu sampel menggunakan satu reaksi mastermix dengan volume akhir

50 µL per reaksi. Adapun campuran mastermix yang digunakan dalam PCR deteksi

jagung transgenik adalah mastermix FastStart PCR Master (Roche), yang sudah

mengandung semua campuran reaksi yang diperlukan dalam master mix untuk proses

PCR seperti Taq DNA Polymerase, magnesium chlorida, dNTP mix (dATP, dCTP,

dGTP, dTTP masing-masing 0,4 nM.

Primer yang digunakan adalah primer 35S-1 dan 35S-2 yang komplementer

dengan sekuen promoter 35S CaMV dari Agrobacterium tumefaciens yang diperoleh

dari GenBank menggunakan software ClustalW2 (data tersaji pada lampiran 10), dipipet

secara berturut-turut seperti terlihat pada tabel 3.1.

Tabel 3.1. Komponen campuran mastermix untuk 1 x reaksi

Reagen Volume Konsentrasi Akhir

ddH2O 18 µL

Master Mix 25 µL 1 x

20 µM Primer 35S-1 1 µL 0,4 µM

20 µM primer 35S-2 1 µL 0,4 µM

Total volume : 45 µL

33

Pembuatan pereaksi PCR atau mastermix untuk sepuluh sampel (biji jagung

nomor 1 sampai 6 dan benih jagung nomor 7 sampai 10), kontrol negatif, jagung GMO,

kontrol mastermix dilebihkan satu reaksi komponen mastermix untuk mengatasi

kemungkinan kelebihan saat proses pemipetan. Jadi total komponen campuran

mastermix yang dibuat untuk 14 reaksi adalah sebagai berikut:

Tabel 3.2. Komponen campuran mastermix untuk 14 sampel

Reagen Volume Konsentrasi akhir

ddH2O 252 µL

Master Mix 350 µL 1 x

20 µM Primer 35S-1 14 µL 0,4 µM

20 µM primer 35S-2 14 µL 0,4 µM

Total volume : 45 µL

Ke dalam tabung Eppendorp 2 ml, dipipet 252 µL ddH2O, 350 µL Mastermix,

20 µL dan primer 35S-1 dan 20 µL primer 35S-2. Komponen master mix dicampur

hati-hati dengan menggunakan pipet yang dinaik turunkan sampai campuran homogen.

3.4.4.2.Preparasi PCR untuk promoter CaMV 35S

Dipipet 45 µL mastermix ke dalam tabung PCR 0,5 ml, ditambahkan 5 µL

template atau cetakan DNA dengan konsentrasi 50 ng/µL ( tabel pengeneceran cetakan

DNA menjadi 50 ng/ 50µL tersaji pada lampiran 3). Untuk kontrol negatif digunakan 5

µL hasil isolasi, sedangkan untuk kontrol mastermix digunakan 5 µL ddH2O sehingga

total volume setiap reaksi adalah 50 µL kemudian disentrifugasi beberapa detik.

Tabung PCR tersebut ditempatkan pada alat PCR ( thermocycler) dan diprogram

seperti dibawah ini :

34

Tabel 3.3. Tabel program PCR

Tahapan Siklus Temperatur Waktu

Denaturasi awal 1 980C 2 menit

Denaturasi 40 950C 30 detik

Annealing 40 550C 40 detik

Ekstension 40 720C 40 detik

Ekstemsion akhir 1 720C 3 menit

Suhu akhir + 4oC, laju pemanasan 1,5

oC/ detik, laju pendinginan 1,0

oC/detik.

Proses amplifikasi disertakan kontrol negatif dan kontrol mastermix untuk

mengontrol kemungkinan adanya kontaminasi saat pengujian (Gurakan et al., 2011,

Oraby et al., 2005). Hasil amplifikasi selanjutnya divisualisasi dengan menggunakan

elektroforesis gel agarosa.

3.4.5 Elektroforesis produk PCR

Menurut Lipp et al. (1999), produk PCR dapat divisualisasi dengan gel agarose

2%. Untuk visualisasi hasil PCR dilakukan dengan agarose 2% SYBR safe DNA gel

stain dalam TAE 1X dan DNA molekuler marker 100 bp. Dengan adanya SYBR Safe

DNA Gel stain yang telah dimasukkan kedalam agarose, DNA dapat divisualisasikan di

bawah sinar ultraviolet dan difoto untuk didokumentasi dengan menggunakan UV-

transilluminator.

Cara membuat gel agarose (Alejandro et al., 2000; Gurakan et al., 2011)

adalah sebagai berikut: Ditimbang 2 g agarosa dan dilarutkan dengan 100 ml larutan

TAE 1X. Larutan dipanaskan hingga mendidih dan gel agarose didiamkan pada suhu

kamar hingga suhu gel agarosa ± 500C. Ditambahkan 8 uL SYBR safe DNA gel stain,

diaduk sampai homogen kemudian gel dituang ke dalam baki ( tray) cetakan gel,

dengan hati-hati sisir gel diletakkan digel agarose. Setelah gel agarose memadat, sisir

yang diatas gel agarose ditarik kemudian gel agarose diletakkan pada alat elektroforesis.

35

Gel agarose digenangi dengan larutan buffer TAE 1X sampai gel terendam didalam baki

elekktroforesis.

Dipipet 15 µL hasil penggandaan (produk PCR) baik dari kontrol negatif,

kontrol positif dan sampel. Masing-masing dicampur dengan 3 µL pemberat DNA

(suchrosa loading buffer) yang telah diletakkan di atas kertas parafilm. Dipipet

keseluruhan volume (18µL) dan dimasukkan perlahan-lahan ke dalam sumur di gel

agarose. Pada sumur pertama dimasukkan 10 µL campuran 5 µL marker DNA dengan

berat molekul 100 bp dengan 5 µL suchrosa loading buffer yang sudah tercampur

homogen.

Elektroforesis dijalankan pada tegangan 100 volt selama 90 menit sehingga

DNA akan bermigrasi ke arah anoda ( kutub positif, merah ). Setelah pewarna dalam

buffer terlihat telah bermigrasi sesuai jarak yang yang diperlukan untuk pemisahan

fragmen DNA, power supply dimatikan. Dengan adanya SYBR safe DNA gel stain yang

telah dimasukkan ke dalam agarose, DNA dapat divisualisasi di bawah sinar ultraviolet

dengan menggunakan gel doc (UV-transilluminator OB 201313) dan didokumentasi.

Interpretasi elektroforesis hasil PCR yaitu dengan membandingkan pita DNA

antara nilai bp sampel dengan nilai bp kontrol positif yang memberikan bp yang sama

yaitu pada 195 bp (Dimitrios,.et al, 2008; Adugna dan Mesfin, 2008)

3.5. Variabel Penelitian

Variabel pada penelitian ini adalah : Variabel bebas (independen) terdiri dari :

biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku produk olahan pangan atau pakan dan

benih jagung hibrida maupun super hibrida yang beredar di kota Mataram. Sedangkan

variabel terikat (dependen) terdiri dari: pita DNA hasil amplifikasi promoter 35S

36

CaMV dengan ukuran 195 bp. Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah kit isolasi

DNA, reagen untuk PCR dan kondisi reaksi pada thermocycler

3.6. Analisis Data

Analisis data pada penelitian ini menggunakan analisis deskriptif untuk

identifikasi jagung transgenik (GMO) pada sampel biji jagung yang merupakan bahan

dasar pembuatan produk olahan pangan dan pakan serta benih jagung melalui deteksi

keberadaan promoter 35S CaMV.

37

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Persiapan dan Homogenisasi Sampel

Prosedur sampling maupun jumlah sampel merupakan hal yang penting dalam

pengujian produk tanaman transgenik yang berasal dari bahan baku ataupun bahan

makanan karena menyangkut masalah homogenitasnya. Meskipun tidak ada protokol

pengambilan sampel secara khusus yang telah dikembangkan untuk identifikasi produk

tanaman tansgenik yang berasal dari biji-bijian, strategi penanganan sampling yang

optimal adalah keseimbangan antara sensitivitas dan biaya, jumlah sampel harus cukup

representatif untuk pengujian tanaman transgenik ( Ahmad, 2002). Teknik sampling

yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik area probability sampling yang

merupakan bagian dari teknik sampling non random, dimana tidak semua lokasi

mempunyai kesempatan dipilih menjadi lokasi sampling. Cara pengambilan sampel,

yaitu dengan membagi lokasi sampling menjadi area yang lebih kecil dalam hal ini kota

Mataram dibagi menjadi kecamatan. Kota Mataram terdiri dari 6 kecamatan dan

masing-masing kecamatan diwakili satu sampel. Biji jagung, benih jagung dan sampel

positif yang digunakan untuk penelitian dapat dilihat pada gambar 4.1.

Gambar 4.1. Sampel biji jagung, benih jagung dan sampel GMO.1- 6 : sampel biji jagung; 7-

10 : sampel benih jagung dan 11: kontrol positif kedelai GMO.

1

1

2 1

2 3

4 5

6

7

9

8

10

11 2

4 5

petugas_labkomp

Textbox

38

Jumlah sampel yang dipakai dalam penelitian ini sebanyak sepuluh sampel

berupa enam macam sampel biji jagung dan empat macam sampel benih jagung.

Sampel biji jagung diperoleh dari 6 pasar dari 19 keseluruhan pasar yang ada di kota

Mataram, sedangkan sampel benih jagung diperoleh dari Dinas Pertanian Tanaman

Pangan dan Hortikultura provinsi NTB dan dari toko benih yang berlokasi di Suweta.

Dalam penelitian ini Benih jagung disampling berdasarkan data dari Dinas Pertanian

yaitu benih yang paling banyak diminati oleh petani jagung seperti varietas hibrida

maupun super hibrida.

Untuk menentukan jumlah lokasi sampling menurut Darmawan (2009), sampel

yang kurang dari 1000 dapat diambil 20 sampai 50 persen walaupun ini bukan standar

baku, melainkan hanya perkiraan berdasarkan pertimbangan praktis yang disesuaikan

dengan topik penelitian. Dalam hal ini, jumlah pasar yang ada di kota Mataram

berjumlah 19, dengan 6 sampel sama dengan 32 persen dari jumlah lokasi. Jadi dengan

pengambilan sampel seperti ini, diharapkan akan dapat mewakili data jagung maupun

benih jagung yang ada di kota Mataram.

Untuk kontrol positif berupa sampel kedelai positif GMO yang diperoleh dari

Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN) Badan Pemeriksaan Obat dan

Makanan Republik Indonesia di Jakarta. Sampel kedelai positif ini digunakan sebagai

baku kerja Genetically Modified Organism (GMO) bubuk kedelai Roundup Ready yang

sudah diverifikasi terhadap Certified Reference Material (Soya Bean Powder Set

Certified Reference Material IRMMN.4105. Jadi sampel positif ini dapat digunakan

sebagai kontrol positif untuk deteksi keberadaan promoter 35S CaMV pada biji jagung

maupun benih jagung. Nama sampel dan lokasi pengambilan sampel tersaji pada tabel

4.1.

39

Tabel 4.1. Nama, nomor dan asal sampel biji jagung, benih jagung dan kontrol positif

GMO yang digunakan dalam penelitian No Sampel Nomor sampel Asal sampel

1 Biji Jagung 1 Pasar Cemare

2 Biji jagung 2 Pasar Karang Sukun

3 Biji Jagung 3 Pasar Pagesangan

4 Biji jagung 4 Pasar Sindu

5 Biji jagung 5 Pasar Kebon Roek

6 Biji jagung 6 Pasar Mandalika

7 Benih jagung Bisi 816 super hibrida 7 Dinas Pertanian

8 Benih jagung Bisi 2 hibrida 8 Dinas Pertanian

9 Benih jagung Pioner hibrida P 21 9 Toko Benih Sweta

10 Benih jagung Bisi 22 super hibrida 10 Toko Benih Sweta

11 Sampel kedelai GMO 11 PPOMN Jakarta

Benih jagung yang disampling sesuai dengan yang digunakan sebagai benih

oleh petani yaitu benih varietas hibrida dan superhibrida dari Bisi dan Pioner, sehingga

sampel yang digunakan sudah dapat mewakili penggunaan benih oleh petani jagung di

kota Mataram.

4.2. Isolasi Sampel dan Kontrol Positif.

Tahapan yang penting dalam analisis DNA adalah isolasi DNA. Tahap pertama

yang dilakukan dalam mengisolasi DNA pada penelitian ini adalah proses

homogenisasi atau penghalusan sampel. Menurut Doyle dan Doyle (1990) dalam Utami

et al., 2012, metoda untuk menghaluskan sampel dari tumbuh-tumbuhan yaitu dengan

menambahkan nitrogen cair, tetapi dalam penelitian yang dilakukan oleh Utami et al.,

2012, penggunaan nitrogen cair pada tahap ekstraksi dengan CTAB tidak memberikan

hasil yang lebih baik karena tidak memberikan pita DNA yang tebal seperti yang telah

dilakukan oleh Doyle dan Doyle (1990). Dalam penelitian ini penggunaan nitrogen cair

tidak dilakukan disamping tidak memberikan hasil pita DNA sesuai dengan yang

diharapkan, nitrogen cair sifatnya mudah menguap serta harganya mahal.

Dalam penelitian ini tahap isolasi memerlukan perlakuan fisik dan kimia.

Perlakuan fisik yaitu sampel yang berupa biji diblender supaya menjadi partikel yang

40

lebih halus untuk mempermudah pelisisan sel sehingga DNA dapat diisolasi atau

dipisahkan dari komponen lain. Setiap selesai melakukan penghalusan pada setiap

sampel, blender dicuci menggunakan sabun, dikeringkan, dibersihkan menggunakan

DNA AWAYTM

kemudian dibersihkan lagi dengan menggunakan alkohol 70%.

Dengan perlakuan ini diharapkan tidak akan terjadi kontaminasi saat proses

homogenisasi sampel yang kemungkinan terjadi saat penghalusan dengan blender.

Proses penghalusan sampel yang berupa benih jagung memerlukan waktu yang

lebih lama dibandingkan dengan penghalusan pada biji jagung. Penghalusan biji jagung

memerlukan waktu sepuluh menit setiap sampel sedangkan untuk benih jagung

memerlukan waktu 15 menit untuk setiap sampel karena tekstur benih lebih keras dan

lebih kering dibandingkan dengan biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku

pangan atau pakan. Mengacu SNI 01-6944-2003 yaitu standar mengenai persyaratan

benih jagung salah satunya adalah kadar air. Syarat kadar air untuk benih jagung tidak

boleh lebih dari 12% sedangkan SNI: 01-3920-1995 tentang biji jagung yang digunakan

sebagai bahan pangan dan pakan, kadar airnya maksimal 14 %. Jadi, semakin kecil

kadar air jagung maka tekstur jagung akan semakin keras sehingga memerlukan waktu

lebih lama saat penghalusan menggunakan blender. Biji jagung dan benih jagung

setelah diblender dapat dilihat pada gambar 4.2.

Gambar 4.2 : Sampel benih dan biji jagung setelah diblender. 1- 6 : sampel biji jagung; 7 -

10 : benih jagung

41

Dalam penelitian ini metoda isolasi yang digunakan adalah metoda kit Qiagen

yang dimodifikasi dengan dapar CTAB. Setelah pelisisan sel dengan cara diblender,

tahap pelisisan sel selanjutnya yaitu secara kimia dengan pemberian dapar CTAB yang

dimodifikasi dengan protokol dari Kit Qiagen. Modifikasi ini digunakan karena menurut

Yuwono (2006), dapar CTAB sangat efektif untuk memecah sel tanaman dan biasanya

digunakan untuk isolasi DNA dari jaringan tanaman. Dengan penghalusan dan

pemberian dapar CTAB ini, akan mempermudah pelisisan sel yang tidak mengandung

DNA supaya sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari

komponen-komponen sel lainnya. Sebelum digunakan, CTAB terlebih dahulu

dipanaskan sampai mencapai suhu 650C, karena fungsi CTAB untuk pelisisan sel secara

kimia dan proses pelisis sel akan semakin kuat dengan diberi perlakuan secara fisik

melalui pemanasan.

Protokol isolasi DNA dengan menggunakan metoda CTAB sudah divalidasi

dan sesuai digunakan untuk isolasi genom tanaman walaupun dalam berbagai matrik

yang berbeda dan metoda CTAB juga sudah digunakan Gurakan et al., (2010); Oraby

et al., (2005) untuk mengisolasi DNA tanaman, sedangkan kit Qiagen, protokolnya

juga sesuai digunakan untuk isolasi genom tanaman (Abdel et al., 2010). Di Jerman

metoda isolasi dengan menggunakan CTAB sudah menjadi metoda resmi untuk

mendeteksi pangan atau pakan rekayasa genetik (Nguyen at al., 2008).

Untuk memastikan keakuratan hasil uji, setiap melakukan isolasi DNA

disertakan dengan kontrol negatif (kontrol pereaksi) dan kontrol positif.(Adugna dan

Mesfin, 2008). DNA hasil isolasi kemudian dilakukan pengukuran konsentrasi dan

kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer dan diuji kualitasnya dengan

elektroforesis gel agarosa (Abdel et al., 2010; Zaulet et al., 2009).

42

4.2.1. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA

Pengukuran dilakukan dengan menggunakan dua panjang gelombang yaitu

pada λ 260 nm dan λ 280 nm, karena DNA yang mengandung unsur purin dan pirimidin

akan menyerap cahaya UV. Pada λ 260 nm yang terukur adalah pita ganda DNA,

sedangkan λ 280 nm yang terukur adalah kontaminan berupa protein atau phenol.

Dalam penelitian ini, dilakukan pengenceran DNA hasil isolasi sampai

mendapatkan resapan yang berkisar antara 0,2 – 0,8. Pengenceran yang dilakukan

adalah dari setiap isolat, dipipet 5µL dan diencerkan dengan 45 µL ddH2O (faktor

pengenceran = 50), kemudian dilakukan pengukuran kemurnian dan konsentrasi DNA

dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 260 nm dan λ 280 nm. Tujuan dari

pengenceran ini adalah untuk mendapatkan absorbansi yang berkisar antara 0,2-0,8

supaya sesuai dengan hukum Lambert-beer. Dengan perlakuan ini, hasil yang diperoleh

akan lebih akurat. Rekaman hasil absorbansi spektrofotometer tersaji pada lampiran 9.

Konsentrasi hasil isolasi DNA biji jagung dan benih jagung yang diperoleh

sekitar 1590 ng – 2315 ng/ µL, konsentrasi isolat DNA hasil isolasi ini sudah cukup

untuk melakukan amplifikasi. Konsentrasi DNA yang digunakan sebagai tamplate

dalam proses amplifikasi adalah sekitar 50 ng sesuai dengan yang sudah dilakukan oleh

Abdel, (2010). Tujuan membuat konsentrasi yang sama dari setiap sampel adalah

supaya kualitas produk amplifikasi yang diperoleh hasilnya sama atau homogen. Data

pengenceran tersaji pada lampiran 3. Hasil spektrofotometri pada λ 260 dan λ 280,

rasio absorbansi dan hasil perhitungan konsentrasi hasil isolasi biji jagung, benih

jagung dan jagung GMO dapat dilihat pada tabel 4.2.

43

Tabel 4.2. Konsentrasi dan kemurnian DNA benih jagung, biji jagung dan positif

GMO

Nomor

sampel

Sampel Absorbansi Kemurnian

λ 260/ λ 280

Konsentrasi

DNA (ng/ µL) λ 260 nm λ 280 nm

1. Isolat biji jagung 0,849 0,754 1,1 2122






7. Isolat benih jagung 0,708 0,625 1,1 1770




11. Sampel pisitif GMO 0,774 0,700 1,1 1935

12. Kontrol negatif 0,000 0,000 0,0 0,000

Rasio kemurnian DNA yang diperoleh setelah dihitung dengan perbandingan

resapan 260 nm / 280 nm, diperoleh nilai yang berkisar antara 1,1 sampai 1,8. Nilai

kemurnian DNA yang diperoleh ini masih ada yang kurang baik karena menurut Nur

(2012), nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8 sampai 2,0. Bila kurang dari 1,8

maka ddH2O yang diambil terlalu banyak sedangkan DNA yang diambil terlalu sedikit,

namun bila lebih dari 2,0 maka larutan isolat masih mengandung kontaminan protein

atau senyawa lain sehingga DNA yang diperoleh belum murni. Menurut Adugna dan

Mesfin (2008); Bambang (2008); Radji (2011), pengujian PCR sangat efisien dalam

menggandakan molekul DNA, sehingga molekul yang digandakan tidak perlu murni

karena hanya yang sesuai dengan primer yang disiapkan yang akan tergandakan. Jadi

dalam hal ini kemurnian yang diperoleh tidak mempengaruhi proses amplifikasi DNA.

Isolasi dengan metoda yang sama yaitu menggunakan kit Qiagen untuk

mengisolasi DNA pada tanaman rekayasa genetik seperti jagung, kedelai, kentang dan

44

tomat juga telah dilakukan oleh Oraby et al. (2005) dan mendapatkan konsentrasi

DNA antara 300 sampai 3100 ng/ µL dengan kemurnian sekitar 1,4. Sedangkan dalam

penelitian ini, konsentrasi hasil isolasi yang diperoleh lebih banyak yaitu sebanyak

1590 sampai 2315 ng/ µL dengan kemurnian antara 1,1 sampai 1,8. Jadi isolasi yang

dilakukan pada penelitian ini rata-rata lebih besar konsentrasi dan kemurniannya

dibandingkan dengan yang telah dilakukan oleh Oraby et al., (2005) karena dilakukan

modifikasi antara dapar CTAB dengan kit Qiagen. Pada penelitian yang sama Oraby et

al., (2005) telah melakukan perbandingan antara menggunakan metoda CTAB dengan

metoda kit Qiagen. Hasil yang diperoleh yaitu DNA hasil isolasi dengan menggunakan

metoda CTAB yaitu sebanyak 80 sampai 1650 ng/ µL dengan kemurnian sekitar 1,2

dibandingkan dengan menggunakan metoda kit Qiagen yaitu sebanyak 300 – 3100 ng/

µL dengan kemurnian sekitar 1,5.

Jadi dengan modifikasi antara CTAB dan kit Qiagen, diperoleh hasil isolasi

DNA dengan kemurnian dan konsentrasi yang lebih baik dibandingkan dengan

menggunakan metoda CTAB atau kit Qiagen tanpa modifikasi.

Kontrol negatif atau blangko, tidak memberikan absorban pada λ 260 nm

maupun λ 280nm, jadi reagen isolasi yang digunakan tidak mengandung DNA atau

protein atau tidak terjadi kontaminasi dari sampel atau kontrol positif saat isolasi. Data

hasil perhitungan ratio kemurnian DNA disajikan di Tabel 4.2.

4.2.2. Kualitas DNA dengan gel agarosa

Disamping menggunakan spektrofotometer (secara kuantitatif), cara lain untuk

melihat kualitas dari DNA hasil isolasi adalah dengan elektroforesis gel agarosa (secara

kualitatif). DNA hasil isolasi dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 0,7% pada

90 volt selama 40 menit (Gurakan et al., 2011; Nikolic et al., 2008). Menurut Yuwono

45

(2005), semakin kompak suatu DNA akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan

bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibanding dengan DNA

linier atau sirkuler. Sementara menurut Mendoza et al. (2006) elektroforesis gel dapat

memberikan informasi secara kualitatif tingkat degradasi DNA yang disebabkan oleh

proses pengolahan yang tidak bisa terdeteksi bila menggunakan spektrofotometer.

Hasil elektroforesis DNA total disajikan pada gambar 4.3 dan 4.4.

Gambar 4.3. Hasil elektroforesis DNA total pada sampel biji jagung. 1: Marker DNA

leader 100 bp; 2: kontrol negatif; 3sampai 8: biji jagung

Gambar 4.4. Hasil elektroforesis DNA total pada benih jagung dan kontrol positif

GMO. 1 : kontrol negatif; 2 sampai 5: benih jagung; 6: kontrol positif

Hasil elektroforesis DNA total pada gambar 4 dan gambar 5 terlihat DNA

sampel yang berupa biji jagung dan benih jagung masih tidak murni karena masih ada

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6

100 bp

500 bp

1000 bp

DNA

RNA

RNA

DNA

1 2 3 4 5 6 7 8

46

protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar. Pita DNA yang bersih

diindikasikan dengan pita DNA yang tanpa ada latar belakangnya smear di sepanjang

jalur pergerakan pita genom DNA karena tingkat kemurnian DNA hasil isolasi yang

baik yaitu DNA yang tidak terkontaminasi dan tidak terdegradasi yang dapat terlihat

dengan munculnya latar belakang tersebut. Kontaminasi yang dilihat pada hasil

elektroforesis gel agarosa diperkuat dengan hasil yang ditunjukkan oleh absorbansi

spektrofotometer dimanan DNA masih terkontaminasi protein atau RNA (data

disajikan pada tabel 10). Menurut Brown (1991) untuk mengatasi masalah ini adalah

dengan menambahkan Proteinase K yang akan memecah polipeptida menjadi unit yang

lebih kecil sehingga lebih mudah dihilangkan dengan fenol. Sedangkan untuk

menghilangkan RNA yaitu dengan pemberian fenol, tetapi kebanyakan molekul ini akan

tetap bersama DNA dalam lapisan akuasa.

Dalam penelitian ini sudah dilakukan penambahan Proteinase K dan fenol,

tetapi tidak memberikan hasil yang signifikan karena masih terlihat adanya kontaminasi

protein dan RNA. Sama seperti yang sudah dilakukan oleh Utami et al., 2012,

penggunaan proteinase K tidak efisien karena walaupun sudah diberi perlakuan

penambahan proteinase tetapi pita DNA yang dihasilkan tipis dan masih mengahasilkan

protein dengan intensitas yang tinggi. Satu-satunya cara yang paling tepat untuk

menghilangkan RNA adalah dengan enzim ribonuklease (RNAse) yang akan memecah

molekul ini dengan cepat menjadi subunit ribonukloetida. Menurut Adugna dan Mesfin

(2008); Bambang (2008); Radji (2011) pengujian PCR sangat efisien dalam

menggandakan molekul DNA sehingga molekul yang digandakan tidak perlu murni

karena hanya yang sesuai dengan primer yang disiapkan yang akan tergandakan. Jadi

dalam hal ini kemurnian yang diperoleh tidak akan mempengaruhi proses amplifikasi

DNA sehingga pemberian enzim ribonuklease (RNAse) tidak dilakukan.

47

Isolat yang dihasilkan pada kontrol positif terlihat DNA terdegradasi sehingga

tidak bisa bermigrasi sebagai satu pita pada gel agarosa yang disebabkan oleh proses

pengolahan (Mendoza et al. (2006), tetapi hasil absorbans dari spektrofotometer

menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang diperoleh yaitu sebesar 1935 ng/µL. Jadi

hasil spektrofotometri tidak dapat menunjukkan kualitas DNA hasil isolasi terdegradasi

atau tidak. Untuk kontrol negatif atau reagen tanpa sampel tidak ada pita DNA yang

menandakan tidak terjadi kontaminasi saat isolasi DNA. Untuk meghindari terjadinya

kontaminasi saat melakukan penelitian di laboratorium harus menerapkan prinsip good

laboratory practice seperti penggunaan jas lab, sarung tangan, masker dan yang tidak

kalah penting dalam pengujian bioteknologi yang berbasis DNA adalah pemisahan

ruangan dan pemakaian alat yang digunakan untuk melakukan PCR dengan untuk

melakukan isolasi atau elektroforesis. Yang tidak kalah penting adalah penggunaan

pipet dan tip merupakan tempat yang sangat rawan terjadinya kontaminasi saat memipet

regensia sehingga sangat disarankan untuk menggunakan positive displacement pipets

yaitu pipet yang menggunakan tip khusus yang mempunyai plunger yang fungsinya

menekan cairan yang akan dimasukkan ke dalam tabung dan akan memisahkan cairan

reagensia yang akan dimasukkan dengan ujung mikro pipet tersebut.

Hasil isolasi yang diperoleh menunjukkan bahwa metoda isolasi DNA dengan

menggunakan CTAB yang dikombinasi dengan Kit Qiagen cukup sensitif digunakan

untuk isolasi DNA pada biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau

pakan dan benih jagung tetapi akan lebih baik untuk penelitian berikutnya ditambahkan

RNAse sehingga RNA yang ada dalam isolat DNA dapat dihilangkan.

48

4.3. Amplifikasi PCR dan deteksi hasil PCR pada benih jagung dan biji

jagung transgenik (GMO) dengan PCR melalui identifikasi promoter

CaMV 35S

Pembuatan campuran perekasi PCR (mastermix) dilakukan dengan hati-hati

dan di ruang tersendiri dengan masing-masing alat untuk mencegah terjadinya

kontaminasi. Rancangan primer 35S CaMV yang digunakan berdasarkan sekuen DNA

genom Promoter 35S CaMV yang digunakan oleh Gurakan et al., 2011; Lipp et al.,

1999 dan Tozzini et al., 2000, dengan urutan sebagai berikut : 35S-1(R) : 5’-GCT CCT

ACA AAT GCC ATC A-3’; 35S-2(F): 5’- GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’

yang menghasilkan pita DNA pada 195 bp. Rancangan primer ini sudah disesuaikan

dengan promoter 35S CaMV dari genBank yang berasal dari Agrobacterium

tumefaciens dengan hasil bahwa promoter 35S CaMV komplementer dengan sekuen

primer 35S CaMV. Campuran mastermix dalam penelitian ini menggunakan konsentrasi

akhir primer sebanyak 0,4 µM sesuai dengan pendapat Gelfand dan White (1989) dalam

Yuwono (2006) yang menyatakan bahwa konsentrasi optimum primer adalah antara 0,1

sampai 0, 5 µM karena dengan konsentrasi ini akan menghasilkan produk PCR yang

sangat spesifik. Menurut Yuwono (2006), konsentrasi 1,0 µM masih dapat

menghasilkan produk yang spesifik tetapi bila konsentrasi melebihi dari 1,0 µM akan

mengakibatkan terakumulasinya hasil polimerisasi yang tidak spesifik.

Laporan Lipp et al., (1999) yang merupakan hasil penelitian kolaborasi 29

laboratorium dari 13 negara untuk menentukan metoda deteksi produk GMO dalam

kedelai dan jagung dengan menggunakan promoter yang sama yaitu promoter 35S

CaMV, menggunakan konsentrasi primer 0,7 µM. Sementara Alejendro (2000) juga

dengan primer yang sama untuk mendeteksi biji jagung untuk industri pangan dan

pakan menggunakan konsentrasi akhir primer 0,25 µM. Penelitian lain yang

menggunakan primer yang sama yaitu primer 35S CaMV untuk deteksi GMO dalam

49

jagung yaitu Oraby et al. (2005) dan Gurakan et al. (2011) menggunakan konsentrasi

akhir primer 0,5 µM. Dalam penelitian ini konsentrasi akhir primer 0,4 µM adalah

masih dalam batasan yang dianjurkan oleh Gelfand dan White (1989) dalam Yuwono

(2006) yaitu 01 sampai 1 µM sehingga hasil amplifikasi yang dihasilkan akan sesuai

dengan yang diharapkan.

Dalam laporan yang sama, Lipp at al. (1999) melakukan kolaborasi yang

beranggotakan 13 negara dengan 29 laboratorium, untuk menentukan atau

mengoptimasi suhu dan waktu denaturasi awal, denaturasi, annealing, ekstension dan

siklus reaksi (program PCR) yang optimal dalam pengujian GMO pada jagung dan

kedelai menggunakan promoter 35S CaMV dengan alat PCR yang berbeda merek.

Program PCR yang diperoleh dalam kolaborasi ini berbeda-beda pada masing-masing

merek alat. Jadi dengan alat yang berbeda, diperlukan optimasi program PCR maupun

konsentrasi DNA template untuk mendapatkan hasil amplifikasi yang maksimal. Dalam

hal ini peneliti juga melakukan optimasi sehingga mendapatkan program PCR yang

optimal yang diperoleh adalah sebagai berikut denaturasi awal pada 980C selama 2

menit (satu siklus); Denaturasi 950C selama 30 detik, Annealing 55

0C selama 40 detik,

ekstension 720C selama 40 detik 40 siklus dan ekstension akhir 72

0C selama tiga menit.

Jadi suhu annealing yang paling tepat yaitu pada 550C. Proses amplifikasi dengan PCR

berlangsung sekitar 1 jam 45 menit.

Setiap melakukan proses amplifikasi PCR disertakan kontrol negatif dan

kontrol mastermix untuk mengontrol kemungkinan adanya kontaminasi yang akan

terjadi saat melakukan isolasi ataupun saat pembuatan pereaksi PCR. Perlakuan yang

sama dilakukan juga oleh Gurakan et al. (2011) dan Oraby et al. (2005).

50

Gambar 4.5. Proses amplifikasi dengan menggunakan thermocycler applied biosystem

Setelah diamplifikasi dengan menggunakan primer 35S-1 dan 35S-2 pada

sampel biji jagung, benih jagung, kontrol negatif dan jagung GMO, produk PCR

tersebut dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 2% dan divisualisasi

menggunakan UV- transilumionator dan mendapatkan hasil seperti disajikan pada

gambar 4.6 dan 4.7.

Gambar 4.6. Hasil amplifikasi biji jagung dengan menggunakan primer 35S-1 dan primer

35S-2. 1: DNA marker 100 bp; 2: kontrol mastermix; 3 : kontrol negatif; 4:

kontrol positif GMO; 5-10: biji jagung nomor 1- 6

100 bp

200 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

300 bp

1000 bp

51

Gambar 4.7. Hasil amplifikasi benih jagung dengan menggunakan primer 35S-1 dan

primer 35S-2.1 : DNA marker 100 bp; 2 : kontrol mastermix; 3 : kontrol

negatif; 4 : kontrol positif GMO; 5-8 : benih jagung.

Pada Gambar 4.6 sampel biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku

pangan seperti jagung marning, keripik jagung, dodol ataupun pakan, tidak ada yang

menunjukkan pita DNA pada 195 bp yang menandakan tidak ada kandungan transgenik

(GMO) pada biji jagung tersebut. Gambar 4.7 adalah hasil amplifikasi PCR pada

sampel benih jagung yang digunakan oleh petani sebagai benih untuk budidaya jagung,

juga tidak ada yang menunjukkan pita DNA pada 195 bp yang menandakan tidak ada

kandungan transgenik (GMO) pada benih jagung tersebut. Kontrol negatif dan kontrol

mastermix (pereaksi PCR), tidak menghasilkan pita DNA, berarti tidak terjadi

kontaminasi saat melakukan isolasi maupun saat pembuatan pereaksi PCR. Sedangkan

untuk kontrol positif, terdapat pita DNA pada 195 bp. Kemungkinan hasil negatif yang

ditunjukkan pada biji dan benih jagung adalah negatif palsu karena isolat DNA yang

diamplifikasi banyak mengandung RNA yamg mungkin menghambat proses

amplifikasi PCR.

Program PCR seperti yang tersaji pada lampiran 8, yaitu menggunakan

denaturasi awal pada 980C selama 2 menit (satu siklus); Denaturasi 95

0C selama 30

100 bp

200 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

300 bp

bp

1000 bp

52

detik, Annealing 550C selama 40 detik, ekstension 72

0C selama 40 detik 40 siklus dan

ekstension akhir 720C selama tiga menit .

Hasil PCR menunjukkan hasil bahwa program ini dapat digunakan untuk

deteksi promoter CaMV pada biji jagung dan benih jagung dengan menggunakan

thermocycler Applied Biosystems viriti 96 well.

Gurakan et al., (2011) juga telah melakukan deteksi jagung transgenik (Bt11)

dalam pangan dan pakan di Turki. Metoda isolasi DNA yang digunakan adalah metoda

CTAB tetapi diamplifikasi PCR dengan menggunakan empat macam pasangan primer

yaitu primer 35S-1 dan 35S-2; primer Nos-01 (R) dan Nos-2 (F); primer zein Ze-03

(R) dan Ze-04 (F); serta primer spesifik Bt yaitu IV S2- / PATB(R) dan IV S2-2/

PATB(F). Sampel yang digunakan yaitu jagung untuk pangan atau pakan yang lebih

bervariasi berupa pakan produk komersil, tepung jagung, corn flakes, jagung karnel,

pop corn, dan jagung konvensional. Tempat pengambilan sampel dilakukan di Turki

yang diwakili oleh tujuh provinsi dan masing-masing provinsi diperoleh maksimal

empat sampel. Dari 31 sampel yang diuji, 11 sampel yang positif transgenik dengan

rincian tujuh sampel yang positif dengan primer 35S CaMV dan nos sedangkan sisanya

adalah positif pada primer Bt. Jadi penelitian yang dilakukan oleh Gurakan et al., (2011)

dilakukan dengan menggunakan variasi sampel yang lebih banyak dan diamplifikasi

dengan menggunakan empat macam primer sehingga dengan adanya variasi sampel

dan penggunaan empat macam primer kemungkinan akan memberikan hasil positif

lebih banyak dibandingkan dengan penelitian ini yaitu menggunakan sampel berupa biji

jagung dan benih jagung yang bervariasi pada varietasnya dan dengan menggunakan

satu macam primer yaitu primer 35S CaMV. Tetapi pada penelitian ini, samplingnya

lebih refresentatif karena dalam satu provinsi jumlah sampelnya berjumlah sepuluh

sampel dengan varietas yang bervariasi sedangkan Gurakan et al., (2011), sampel

53

dilakukan maksimal empat sampel pada satu provinsi. Kendala yang dihadapi peneliti

bila menggunakan sampel yang lebih bervariasi seperti yang dilakukan oleh Gurakan et

al., (2011) adalah terbatasnya jenis produk olahan jagung yang diproduksi di kota

Mataram sehingga peneliti mengalami kesulitan dalam sampling.

Jadi bila menggunakan sampel yang lebih banyak dan lebih bervariasi serta

menggunakan bermacam-macam primer akan memberikan kemungkinan lebih banyak

menunjukkan hasil yang positif sebagai transgenik dibandingkan dengan sampel yang

varietasnya bervariasi.

Hasil amplifikasi DNA biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan

atau pakan dan benih jagung di kota Mataram disajikan dalam Tabel 4.3

Tabel 4.3. Hasil amplifikasi PCR pada biji jagung, benih jagung dan kontrol

positifGMO setelah diamplifikasi dengan promoter 35S CaMV.

Nomor

Sampel

Isolat Hasil Amplifikasi

1 Biji Jagung Negatif

2 Biji jagung Negatif

3 Biji Jagung Negatif




7 Benih jagung Bisi Negatif


9 Benih jagung Pioner Negatif


11 Sampel GMO Positif

54

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan

Kesimpulan dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

1. Biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku produk olahan pangan atau

pakan dan benih yang ada di kota Mataram setelah dianalisis melalui deteksi

keberadaan promoter 35S CaMV dengan menggunakan PCR menunjukkan hasil

negatif sebagai transgenik (GMO) atau tidak ada yang teramplifikasi.

Kemungkinan hasil negatif yang ditunjukkan adalah negatif palsu karena isolat

DNA yang diamplifikasi banyak mengandung RNA yamg mungkin

menghambat proses amplifikasi PCR walaupun dalam kontrol positif juga

terdapat RNA tetapi masih dapat teramplifikasi.

2. Benih jagung varietas hibrida maupun super hibrida yang digunakan sebagai

benih oleh petani yang ada di kota Mataram setelah dianalisis melalui deteksi

keberadaan promoter 35S CaMV dengan menggunakan PCR menunjukkan hasil

negatif sebagai transgenik (GMO) atau tidak ada yang teramplifikasi.

Kemungkinan hal yang sama juga seperti pada biji jagung.

petugas_labkomp

Textbox

55

5.2. Saran

1. Sebaiknya penelitian selanjutnya dilakukan bukan hanya di satu provinsi tetapi

dilakukan di Indonesia atau banyak provinsi, untuk mengatasi keterbatasan

variasi sampel. Dengan menggunakan sampel yang lebih bervariasi dan dengan

menggunakan primer yang lebih banyak seperti yang sudah dilakukan oleh

Gurakan et al., (2011) yang menggunakan empat macam primer yaitu primer

35S-1 dan 35S-2; primer Nos-01 (R) dan Nos-2 (F); primer zein Ze-03 (R) dan

Ze-04 (F); serta primer spesifik Bt yaitu IV S2- / PATB(R) dan IV S2-2/

PATB(F), akan memberikan kemungkinan lebih banyak menunjukkan hasil

positif sebagai transgenik dibandingkan dengan sampel yang varietasnya saja

yang bervariasi.

2. Sebaiknya untuk penelitian selanjutnya, isolat DNA dimurnikan dulu dari

kontaminan RNA untuk menghindari hasil negatif palsu yang kemungkinan

disebabkan oleh keberadaan RNA tersebut.

Baiq Suriati, 2013. Deteksi Keberadaan Promoter 35S CaMV pada Biji Jagung

(Zea mays L.) yang Digunakan Sebagai Bahan Baku Pangan atau Pakan dan Benih

dengan Metoda Polymerase Chain Reaction di Kota Mataram Nusa Tenggara

Barat. Tesis ini di bawah bimbingan Dr. Y. Sri Wulan Manuhara., M.Si dan

Dr. Sri Puji Astuti.,M.Si., Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi,

Universitas Airlangga, Surabaya.

RINGKASAN

Perkembangan kemajuan bioteknologi saat ini memungkinkan perbaikan sifat

tanaman melalui rekayasa genetik. Dengan teknologi ini, gen dari berbagai sumber

dapat dipindahkan ke dalam tanaman yang akan diperbaiki sifatnya. Teknologi ini

disebut teknologi transgenik atau genetically modified organism. Berbagai produk

teknologi transgenik yang telah dikembangkan sampai saat ini seperti kedelai, jagung,

kapas, padi, tomat. Dengan adanya rekayasa genetik tanaman, maka upaya untuk

pemenuhan kebutuhan pokok dimasa yang akan datang dapat terpecahkan.

Jagung merupakan salah satu komoditas utama tanaman pangan sebagai sumber

karbohidrat kedua setelah beras yang sangat berperan dalam menunjang ketahanan

pangan. Fungsi demikian menempatkan posisi jagung dalam diversifikasi konsumsi dan

mengurangi ketergantungan terhadap beras. Jagung selain sebagai sumber karbohidrat,

juga merupakan sumber protein yang penting dalam menu masyarakat Indonesia.Selain

sebagai bahan konsumsi, jagung sangat berperan dalam industri pangan dan juga

industri pakan. Dengan jumlah penduduk yang terus meningkat, permintaan jagung

untuk pemenuhan kebutuhan pangan dan pakan dari tahun ke tahun akan semakin

meningkat sementara produksi jagung nasional belum mampu untuk memenuhi

kebutuhan tersebut.Untuk memenuhi kebutuhan tersebut, Indonesia melakukan impor

jagung dari Amerika yang merupakan eksportir jagung terbesar. Dalam perdagangan

57

internasional, Indonesia merupakan importir jagung dalam jumlah besar termasuk impor

dari Amerika Serikat, Argentina, dan Cina yang merupakan negara penghasil utama

jagung dunia (Deswina, 2009; Edwin, 2009). Menurut laporan kementrian pertanian

Amerika Serikat (2006), nilai impor produk transgenik dari Amerika Serikat saja

mencapai US$ 600 juta pada tahun 2005 (Saragih et al., 2009). AS dan Argentina,

mempunyai kemampuan produktifitas jagung tinggi karena menggunakan benih

transgenik tahan haman dan tahan herbisida sejak tahun 1997. Kepala Badan

Pengawas Obat dan Makanan sejak 8 Juli 2008 telah menandatangani peraturan teknis

tentang evaluasi keamanan pangan, sehingga pengkajian dan persetujuan keamanan

pangan menjadi prioritas pertama bagi produk transgenik impor (Deswina, 2009).

Provinsi Nusa Tenggara Barat jumlah produksi jagung tahun 2010 sebesar 371,8

ribu ton , melampaui dari yang ditargetkan pada awal tahun yaitu 209,4 ribu ton.

Berdasarkan data yang diperoleh dari Dinas Pertanian Tanaman Pangan dan

Hortikultura provinsi Nusa Tenggara Barat, Peningkatan ini disebabkan petani

menggunakan benih jagung varietas hibrida dan super hibrida. Karena Indonesia

merupakan importir jagung terutama dari Amerika Serikat yang telah menggunakan

benih jagung transgenik tahan hama dan tahan herbisida sejak tahun 1997, sehingga

besar kemungkinan jagung yang beredar di Indonesia, khususnya di kota Mataram –

Nusa Tenggara Barat adalah jagung transgenik sehingga dilakukan penelitian deteksi

keberadaan promoter 35S CaMV pada biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku

pangan atau pakan dan benih.

Kehawatiran akan dampak negatif dari penggunaan produk rekayasa genetik

berupa alergi dan resisten terhadap antibiotik yang tidak dapat diobati dengan antibiotik

karena gen yang disisipi ke dalam tanaman adalah gen yang resisten terhadap antibiotik

58

(Ferber, 1999). Untuk mengantisipasi kekhawatiran tentang adanya dampak negatif

penggunaan produk transgenik, maka ditetapkan keputusan Menteri Pertania No.

856/Kpts/HK.330/9/1997 tentang Ketentuan Keamanan Hayati Produk Bioteknologi

Pertanian Hasil Rekayasa Genetik (PBPHRG). Namun keputusan ini belum mencakup

aspek keamanan pangan, maka ditetapkan Keputusan Bersama Menteri Pertanian,

Menteri Kehutanan dan Perkebunan, Menteri Kesehatan (Badan POM), dan Menteri

Negara Pangan dan Hortikultura No. 998.1/Kpts/OT.210/9/99; 790.a/Kpts-IX/1999;

1145A/MENKES/SKB/IX/1999; 015A/Nmeneg PHOR/09/1999 tentang keamanan

Hayati dan Keamanan Pangan Produk Pertanian Hasil Rekayasa Genetik (PPHRG) dan

sebagai implementasi pelaksanaan keputusan bersama empat Menteri telah dibentuk

Komosi Keamanan Hayati dan Keamanan Pangan (Novianti, 2003). Ditetapkan

Peraturan Presiden Republik Indonesia Nomor 39 tahun 2010 tentang Komisi

Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (KKH PRG) dan untuk memberikan

pelayanan dan informasi kepada masyarakat dibentuk Balai Kliring Keamanan Hayati

(BKKH) (Yulinar,2010). Guna menunjang terlaksananya pengawasan makanan

tersebut, diperlukan pengembangan metoda untuk identifikasi gen yang disisipkan

pada produk pangan hasil rekayasa genetik, baik yang berasal dari tanaman maupun

berasal dari hewan yang sifatnya cepat dan murah (Ahmed , 2002; Cankaret et al.,2005

dalam Ahmed et al., 2010; Oraby et al., 2005.

Saat ini polymerase chain reaction (PCR) adalah metoda yang sensitif, spesifik,

cepat dan dapat diandalkan untuk uji identifikasi produk hasil rekayasa genetik baik

dalam bentuk bahan baku maupun pada produk olahan pangan dengan

menginformasikan ada atau tidaknya sekuen transgenik sesuai dengan primer yang

dipakai. Penelitian tentang deteksi jagung dengan menggunakan PCR sudah dilakukan

oleh : Alejendro et al., 2000; Gurakan et al., 2010; Lih et al., 2002; Serge et al., 2006.

59

Promoter 35S mosaik virus kembang kol atau Cauliflower Mosaic Virus

(CaMV) umumnya digunakan pada tanaman transgenik yang mempunyai kemampuan

untuk mengaktifkan gen asing yang telah disisipkan ke dalam tanaman inang

(Alejandro et al., 2000 ; Bellarmino et al., 2000; Bhattacharya et al., 2002; Radke et

al.,198). Promoter 35S CaMV adalah virus mosaik kembang kol atau Cauliflower

Mosaic Virus (CaMV) umumnya digunakan pada tanaman transgenik yang mempunyai

kemampuan untuk mengaktifkan gen asing yang telah disisipkan ke dalam tanaman

inang dan lebih dari 80% produk transgenik meggunakan promoter 35S CaMV sebagai

komponen penyusunnya (Alejendro et al., 2000).

Prinsip dari teknik polymerase chain reaction adalah

pelipatgandaan segmen DNA target dalam tabung reaksi dengan bantuan enzim DNA

polimerase. Empat komponen utama pada proses PCR adalah (1) DNA cetakan,

(2) primer, (3) deoksiribonuleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP

,dGTP, dan dTTP, serta (4) DNA polimerase. Komponen penting lainnya adalah bufer

PCR (Yuwono, 2006). Proses pelipat gandaan DNA ini terjadi melalui 3 tahap, yaitu

denaturasi (denaturation), pelekatan (annealing), dan pemanjangan (extension).

(Yuwono, 2006).

Teknik sampling yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik area

probability sampling yang merupakan bagian dari teknik sampling non random, dimana

tidak semua lokasi mempunyai kesempatan dipilih menjadi lokasi sampling. Cara

pengambilan sampel, yaitu dengan membagi lokasi sampling menjadi area yang lebih

kecil dalam hal ini kota Mataram dibagi menjadi kecamatan. Kota Mataram terdiri dari

6 kecamatan dan masing-masing kecamatan diwakili satu sampel. Jumlah sampel yang

dipakai dalam penelitian ini sebanyak sepuluh sampel berupa enam sampel biji jagung

dan empat sampel benih jagung. Benih jagung diperoleh dari Dinas Pertanian Tanaman

60

Pangan dan Hortikultura Provinsi Nusa Tenggara Barat dan toko benih yang ada di kota

Mataram, sedangkan sampel biji jagung yang merupakan bahan dasar pembuatan

produk olahan jagung dan pakan diperoleh dari 6 pasar dari 19 keseluruhan pasar yang

ada di kota Mataram. Kontrol positif berupa sampel kedelai positif GMO yang

diperoleh dari Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN) Badan

Pemeriksaan Obat dan Makanan Republik Indonesia di Jakarta. Sampel kedelai positif

ini digunakan sebagai baku kerja Genetically Modified Organism (GMO) bubuk kedelai

Roundup Ready yang sudah diverifikasi terhadap Certified Reference Material (Soya

Bean Powder Set Certified Reference Material IRMMN.4105. Jadi sampel positif ini

dapat digunakan sebagai kontrol positif untuk deteksi keberadaan promoter 35S CaMV

pada biji jagung maupun benih jagung.

Metoda isolasi yang digunakan adalah dengan menggunakan protokol dari Kit

Qiagen yang dimodifikasi dengan dapar CTAB. Modifikasi ini digunakan karena

menurut Yuwono (2006), CTAB sangat efektif untuk memecah sel tanaman dan

biasanya digunakan untuk isolasi DNA dari jaringan tanaman. Protokol isolasi DNA

dengan metoda CTAB sudah divalidasi dan sesuai digunakan untuk isolasi genom

tanaman walaupun dalam berbagai matrik yang berbeda (Querci, 2004 dalam Asfaw,

2008). DNA hasil isolasi dilakukan determinasi konsentrasi dan kemurniannya dengan

menggunakan spektrofotometer dan diuji kualitasnya dengan elektroforesis gel agarosa

(Abdel et al., 2010; Zaulet et al.,2009). Hasil spektrofotometri pada λ 260 dan λ 280,

rasio absorbansi dan hasil perhitungan konsentrasi hasil isolasi biji jagung, benih

jagung dan jagung GMO dapat dilihat pada tabel 2.

61

Tabel 2. Konsentrasi DNA benih jagung, biji jagung dan jagung GMO.

Sampel

Panjang gelombang Kemurnian

λ 260/ λ 280

Konsentrasi DNA

(ng/ µL) 260 nm 280 nm

Isolat biji jagung 0,849 0,754 1,1 2122






Isolat benih jagung 0,708 0,625 1,1 1770




Sampel GMO 0,774 0,700 1,1 1935

Kontrol negatif 0,000 0,000 0,0 0,000

Konsentrasi DNA yang diperoleh sekitar 1590 ng – 2315 ng/ µL, konsentrasi

isolat DNA hasil isolasi ini sudah cukup untuk melakukan amplifikasi. Konsentrasi

DNA yang digunakan sebagai tamplate dalam proses amplifikasi adalah sekitar 50 ng

sesuai dengan yang sudah dilakukan oleh Abdel, (2010) supaya kualitas produk

amplifikasi yang diperoleh hasilnya sama atau homogen. Rasio kemurnian DNA yang

diperoleh 1,1 – 1,8. Nilai kemurnian DNA yang diperoleh ini masih ada yang kurang

baik karena menurut Nur (2012), nilai kemurnian DNA berkisar antara 1,8 – 2,0.

Menurut Adugna dan Mesfin (2008); Irawan (2008); Radji (2011), pengujian PCR

sangat efisien dalam menggandakan molekul DNA, sehingga molekul yang digandakan

tidak perlu murni karena hanya yang sesuai dengan primer yang disiapkan yang akan

tergandakan.

Disamping menggunakan spektrofotometer (secara kuantitatif), cara lain untuk

melihat kualitas dari DNA hasil isolasi adalah dengan elektroforesis gel agarosa (secara

kualitatif). DNA hasil isolasi dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 0,7% pada

90 volt selama 40 menit (Gurakan et al., 2011; Nikolic et al., 2008). Menurut Yuwono

(2005), semakin kompak suatu DNA akan bermigrasi lebih jauh dibandingkan dengan

bentuk yang kurang kompak. DNA superheliks lebih kompak dibanding dengan DNA

62

linier atau sirkuler. Sementara menurut Mendoza et al. (2006) elektroforesis gel dapat

memberikan informasi secara kualitatif tingkat degradasi DNA yang disebabkan oleh

proses pengolahan yang tidak bisa terdeteksi bila menggunakan spektrofotometer.

Hasil elektroforesis DNA total disajikan pada gambar 1 dan 2.

Hasil elektroforesis DNA total pada gambar 1 dan gambar 2 terlihat DNA masih

tidak murni karena masih ada protein dan RNA dalam jumlah yang cukup besar. Sama

seperti hasil yang ditunjukkan oleh absorbansi spektrofotometer, DNA masih

terkontaminasi protein atau RNA. Isolat yang dihasilkan pada kontrol positif terlihat

Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA total pada sampel biji jagung. 1: Marker DNA leader

100bp; 2 : kontrol negatif; 3- 8 : sampel biji jagung.

100 bp

500 bp

1000 bp

Gambar 2. Hasil elektroforesis DNA total pada benih jagung dan kontrol positif

transgenik (GMO) 1: kontrol negatif; 2-5 : sampel benih jagung; 6: kontrol positif

GMO.

DNA

RNA

RNA

DNA

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8

10

63

DNA terdegradasi sehingga tidak bisa bermigrasi sebagai satu pita pada gel agarosa

yang disebabkan oleh proses pengolahan (Mendoza et al. (2006), tetapi hasil absorbans

dari spektrofotometer menunjukkan bahwa konsentrasi DNA yang diperoleh yaitu

sebesar 1935 ng/µL.

Rancangan primer 35S CaMV yang digunakan berdasarkan sekuen DNA genom

promoter 35S CaMV yang digunakan oleh Gurakan et al., 2011; Lipp et al., 1999 dan

Tozzini et al., 2000, dengan urutan sebagai berikut : 35S-1(R) : 5’-GCT CCT ACA

AAT GCC ATC A-3’; 35S-2(F): 5’- GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA-3’ yang

menghasilkan pita DNA pada 195 bp. Disamping itu, sekuen promoter 35S CaMV dari

genBank yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens komplementer dengan sekuen

primer 35S CaMV seteah diuji dengan menggunakan sofeware ClustalW2.

Setelah diamplifikasi sampel biji jagung, benih jagung, kontrol negatif dan

jagung GMO, produk PCR tersebut dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 2%

dan divisualisasi menggunakan UV- transilluminator dan mendapatkan hasil sebagai

berikut:

100 bp

200 bp

Gambar 3. Hasil amplifikasi biji jagung dengan menggunakan promoter 35S CaMV. 1: DNA

marker 100 bp; 2 : Kontrol mastermix; 3: kontrol negatif; 4: jagung GMO; 5-10:

biji jagung nomor 1- 6.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

64

Pada gambar 3, sampel biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku pangan

seperti jagung marning, keripik jagung, dodol ataupun pakan, tidak ada yang

menunjukkan pita DNA pada 195 bp yang menandakan tidak ada kandungan transgenik

(GMO) pada biji jagung tersebut. Gambar 4 adalah hasil amplifikasi PCR pada sampel

benih jagung yang digunakan oleh petani sebagai benih untuk budidaya jagung, juga

tidak ada yang menunjukkan pita DNA pada 195 bp yang menandakan tidak ada

kandungan transgenik (GMO) pada benih jagung tersebut. Kontrol negatif dan kontrol

mastermix (pereaksi PCR), tidak menghasilkan pita DNA, berarti tidak terjadi

kontaminasi saat melakukan isolasi maupun saat pembuatan pereaksi PCR. Sedangkan

untuk kontrol positif, terdapat pita DNA pada 195 bp. Kemungkinan hasil negatif yang

ditunjukkan oleh sampel biji maupun benih jagung adalah negatif palsu karena isolat

DNA yang teramplifikasi masih mengandung RNA yang mungkin menghambat proses

amplifikasi PCR walaupun pada kontrol positif tetap dapat menunjukkan positif sebagai

transgenik karena dapat teramplifikasi saat proses PCR. Program PCR dengan

menggunakan denaturasi awal 980C selama 2 menit (satu siklus); Denaturasi 95

0C

selama 30 detik, Annealing 550C selama 40 detik, ekstension 72

0C selama 40 detik 40

siklus dan ekstension akhir 720C selama tiga menit menunjukkan hasil bahwa program

Gambar 4. Hasil amplifikasi benih jagung dengan menggunakan promoter 35S CaMV.

1: DNA marker 100bp ;2 : kontrol master mix; 3: kontrol negatif; 4: kontrol

positif transgenik(GMO); 5-8: benih jagung.

100 bp

200 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

65

ini dapat digunakan untuk deteksi promoter CaMV pada biji jagung dan benih jagung

dengan menggunakan thermocycler applied biosystems viriti 96 well.

Gurakan et al., (2011) juga telah melakukan deteksi jagung transgenik (Bt11)

dalam pangan dan pakan di Turki. Metoda isolasi DNA yang digunakan adalah metoda

CTAB tetapi diamplifikasi PCR dengan menggunakan empat macam pasangan primer

yaitu primer 35S-1 dan 35S-2; primer Nos-01 (R) dan Nos-2 (F); primer zein Ze-03

(R) dan Ze-04 (F); serta primer spesifik Bt yaitu IV S2- / PATB(R) dan IV S2-2/

PATB(F). Sampel yang digunakan yaitu jagung untuk pangan atau pakan yang lebih

bervariasi berupa pakan produk komersil, tepung jagung, corn flakes, jagung karnel,

pop corn, dan jagung konvensional. Tempat pengambilan sampel dilakukan di Turki

yang diwakili oleh tujuh provinsi dan masing-masing provinsi diperoleh maksimal

empat sampel. Dari 31 sampel yang diuji, 11 sampel yang positif transgenik dengan

rincian tujuh sampel yang positif dengan primer 35S CaMV dan nos sedangkan sisanya

adalah positif pada primer Bt. Jadi penelitian yang dilakukan oleh Gurakan et al., (2011)

dilakukan dengan menggunakan variasi sampel yang lebih banyak dan diamplifikasi

dengan menggunakan empat macam primer sehingga dengan adanya variasi sampel

dan penggunaan empat macam primer kemungkinan akan memberikan hasil positif

lebih banyak dibandingkan dengan penelitian ini yaitu menggunakan sampel berupa biji

jagung dan benih jagung yang bervariasi pada varietasnya dan dengan menggunakan

satu macam primer yaitu primer 35S CaMV. Tetapi pada penelitian ini, samplingnya

lebih refresentatif karena dalam satu provinsi jumlah sampelnya berjumlah sepuluh

sampel dengan varietas yang bervariasi sedangkan Gurakan et al., (2011), sampel

dilakukan maksimal empat sampel pada satu provinsi. Kendala yang dihadapi peneliti

bila menggunakan sampel yang lebih bervariasi seperti yang dilakukan oleh Gurakan et

66

al., (2011) adalah terbatasnya jenis produk olahan jagung yang diproduksi di kota

Mataram sehingga peneliti mengalami kesulitan dalam sampling.

Jadi bila menggunakan sampel yang lebih banyak dan lebih bervariasi serta

menggunakan bermacam-macam primer akan memberikan kemungkinan lebih banyak

hasil yang positif sebagai transgenik dibandingkan dengan sampel yang bervariasi pada

varietasnya saja.

Tabel 3. Hasil amplifikasi PCR pada biji jagung dan benih jagung dan jagung

GMO setelah diamplifikasi dengan promoter 35S CaMV.

Sampel/ Isolat Hasil Amplifikasi

Biji Jagung 1 Negatif

Biji jagung 2 Negatif

Biji Jagung 3 Negatif




Benih jagung Bisi Negatif


Benih jagung Pioner Negatif


Jagung GMO Positif

Kesimpulan dan saran dari penelitian ini adalah sebagai berikut:

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Biji jagung yang digunakan sebagai bahan baku produk olahan pangan atau

pakan dan benih jagung yang digunakan sebagai benih oleh petani di kota

Mataram setelah dianalisis melalui deteksi keberadaan promoter 35S CaMV

dengan menggunakan PCR menunjukkan hasil negatif sebagai transgenik

(GMO) atau tidak ada yang teramplifikasi. Ini mengindikasikan bahwa biji

jagung yang digunakan oleh produsen pangan yang ada di kota Mataram

menggunakan biji jagung sebagai bahan baku yang dibeli dipasar yang berasal

dari hasil petani yang ada di kota Mataram atau provinsi NTB. Dengan hasil

67

penelitian ini maka penerapan penggunaan label Produk Rekayasa Genetik pada

biji dan benih tidak perlu diterapkan.

2. Kemungkinan hasil negatif yang ditunjukkan adalah negatif palsu karena isolat

DNA yang diamplifikasi banyak mengandung RNA yang mungkin menghambat

amplifikasi PCR.

Saran :

1. Sebaiknya penelitian selanjutnya dilakukan bukan hanya di satu provinsi tetapi

dilakukan di Indonesia atau banyak provinsi, untuk mengatasi keterbatasan

variasi sampel. Dengan menggunakan sampel yang lebih bervariasi dan dengan

menggunakan primer yang lebih banyak seperti yang sudah dilakukan oleh

Gurakan et al., (2011) yang menggunakan empat macam primer yaitu primer

35S-1 dan 35S-2; primer Nos-01 (R) dan Nos-2 (F); primer zein Ze-03 (R) dan

Ze-04 (F); serta primer spesifik Bt yaitu IV S2- / PATB(R) dan IV S2-2/

PATB(F), akan memberikan kemungkinan lebih banyak menunjukkan hasil

positif sebagai transgenik dibandingkan dengan sampel yang varietasnya saja

yang bervariasi.

2. Isolat DNA yang akan diamplifikasi PCR sebaiknya dimurnikan dulu dari

kontaminasi RNA untuk menghindari kemungkinan negatif palsu yang sebabkan

oleh kontaminasi RNA tersebut.

68

DAFTAR PUSTAKA

Adugna., A dan Masfin,T., 2008. Detection and Quantification of Genetically

Engineered Crops. eJournal. Icrisat.org.vol.6 hal 1-6.

Ahmad, F. E., 2002. Detection of Genetically Modified Organisms in Food. Trends in

Biotechnology Vol.20 No.5.

Abdel, L.A., Mawgood., Mustafa, A. G., Abdullah, A. A., Salem, S.A and Abdullah, A.

Al-D, 2010. Monitoring of genetically Modified Food in Saudi Arabia. African

Journal of Food Science Vol.4(8): 536-540.

Alejandro, C.T., M.C. Martinez., M.F.Lucca., C.V.Rovere., A. J. Distefano., M. del

Vas., H.E.Hopp., 2000. Semi Quantitative Detection of Genetically

Modified,Grains Based on CaMV 35S Promoter amplification. Journal of

Biotechnologi ISSN: 0717-3458.

Amirhusin, B., 2004. Perakitan Tanaman Transgenik Tahan Hama. Jurnal Litbang

Pertanian 23(1).

Anonymous, 2010. Analisis Penawaran dan Permintaan Jagung untuk Pakan di

Indonesia http://pse.litbang.deptan.go.id/ind/pdf files/anjak_2010_01.pdf. Diakses

tanggal 9 November 2012.

Bahagiawati, 2002. Penggunaan Bacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Buletin

AgroBio 5(1): 21-28, 2002

Bahagiawati dan Herman, 2008. Peraturan perundang-undangan tentang keamanan

Produk Bioteknologi dan Status Perakitan Tanaman. Balai Penelitian

Bioteknologi dan sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Diakses 6 Mei 2012

Bambang, I., 2008. Genetika Molekuler. Pusat Penerbitan dan Percetakan UNAIR

Surabaya.

Battacharya, R.C., Viswakarma N., Bhat S.R., Kirti, P.B, and Chopra, V.L. 2002.

Development of Insect-Resistant Transgenic Cabbage Plants Expressing a

Synthetic cry IA(b) Gene from Bacillus thuringiensis. Current Science. Vol. 83.

No. 2.

Bellarmino, M.M., 2000. Agrobakterium-Mediated Genetic Transformation of a

Phalaenopsis Orchid. Springer-Verlag, Plant Cell Reports. 19; 435-442

Bjarte R.H., Signe M. D., Knut R., Even H., Askild L.H, 2008. Determination of eight

genetically modified maize events by quantitative, multiplex PCR and fluorescene

capillary gel elektrophoresis. Springer-Verlag, Eur Food Res Technol. 227;1125 -

1137.

Brown T.A, 1991. Pengantar Kloning Gene,. Yayasan Essentia Medica Yogyakarta.

http://pse.litbang.deptan.go.id/ind/pdf%20files/anjak_2010_01.pdf

69

Clark, 1997. Plant Molecular Biology a Laboratory Manual. Springer. ISBN 3-540-

58405-6.

Darmawan, D, 2009. Metodologi Penelitian dan Teknik Praktis Menulis Karya Ilmiah.

Ilmiah Metromedia Education Surabaya.

Deswina, P., 2009. Pengkajian Pelepasan Tanaman Padi Transgenik di Indonesia

“Assesment on Release of Transgenik Rice Plant in Indonesia”. Journal of

Applied and Industrial Biotechnology in Tropical Region, Vol 2, ISSN:1979-9748

Dimitrios,S., Elenis, Despina., P. Kologianni., Kyriaki G., Penelope C., Ioannon,

Theodore K C., 2008. Advances in molecular techniques for detection and

quantification of genetically modified organisms. Springer-verlag 2008 DOI

10.1007/s00216-008-1868-4

Donna, G. B, and Eng-C. P., 1991. Gene Transfer in Plants of Brassica juncea using

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation. Springer- Verlag, Plant

Cell Reports. 10: 308-314.

Duijn, V.G., Biert V.R., Hendriette, B-M., Ineke, V. B., Abdi J. A., Soeniel, J, and

Martin, H., 2002. Detection of Genetically Medified Organisms in Food by

Protein and DNA Based Techniques: Bridging the Methods. Journal of AOAC

International Vol.85,No.3.

Faisal, 2005. Tanaman Transgenik dan Kebijakan Pengembangannya di Indonesia.

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia. ISSN 1693-1831.

Gurakan, G.C., Gamze, A dan Remziye, Y, 2011. Qualitative Detection of GM Maize

(Bt 11) in Food and Feed Sold Commercially in Turkey by PCR Based Methods.

Indian Journal of Biotechnology. Vol 10, pp 143-146

Herman, M., 2002. Perakitan Tanaman Tahan Serangga Hama melalui Teknik Rekayasa

Genetik. Buletin AgroBio 5(1):1-13.

Herman, M., 2007. Sebelas Tahun Perkembangan Jagung Bt dan Statusnya secara

Global. Jurnal AgroBiogen 3(2):73-79.

Hull R,. S.N. Covey and P. Dale, (2000). Genetically Modified Plants and the Promoter:

Assessing the Risks and Enhancing the Debate. (online): www.biotech-

info.net/enhaching_debate html. Diakses 21 Mei 2012.

IAamp® DNA Mini Kit and Blood Mini Handbook 2007.2nd ed. Qiagen.

James, C., 2003. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2002 Feature:

Bt.Maize. International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications

No.29 – 2003.

http://www.biotech-info.net/enhaching_debate%20html.%20Diakses

http://www.biotech-info.net/enhaching_debate%20html.%20Diakses

70

Juarini, 2006. Kondisi Kebijakan Pangan Indonesia. Artikel, Universitas Pembangunan

Indonesia.

Lee, S-H., Yong-H.P., Jin-K.K., Keun-W.P and Young-M.K., 2004. Qualitative PCR

Method for Detection of Genetically Modified Maize Line NK603 and TC1507.

Agric. Chem. Biotechnol.47(4),185-188.

Lipp, M., Peter, B., Klaus, P., Jean, P., Elke, A., 1999. IUPAC Colaborative Trial Study

of a Method to Detect Genetically Modified Soy Beans and Maize in Dried

Powder. Journal of AOAC International Vol.82,No. 4.

Losey, J.E., Rarnor, L.S. and Carter, M.E., 1999. Transgenik pollen hams Monarch

larvae. Nature.399, 214.

Manuhara,Y.S.W. 2006. Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman untuk

Meningkatan Kesejahteraan Hidup Manusia. Makalah Seminar Nasional

Biodiversitas Biologi-FMIPA,UNAIR Surabaya,22 Juli 2006. ISBN:979-98109-1-

4.

Mendoza, A., Fernadez, S., Cruz, M.A., Rodriguez, P.M.A., Resendez, P.D. 2006.

Detection of Genetically Modified Maize Food Products by the Polymerase

Chains Reaction. CienciaY Tecnologia Alimentaria. ISSN: 1135-8122 p.175-181.

Munir, B. 2011. Evaluasi 2010 dan Program 2011`Komoditas Unggulan Nusa

Tenggara Barat.

Nguyen, T.C.T., Son, R., Raha, A.R., Lai, O.M and Clemente, M.W.V.L. 2008.

Detection of Genetically Modified Organism (GMOs) Using Molekular

Techniques in Food and Feed Samples from Malaysia and Vietnam. International

Food Research Journal 15(2): 155-166.

Nikolic, Z., M.Milosevic., M.Vujakovic., D. Marinkovic., A. Jevtic., S. Balesevic –

Tubic, 2008. Qualitatif Triplex PCR for the Detection of Genetically Modified

Soybean and Maize. Biotechnol, & Biotechnol. EQ.22/2008/3. Diakses tanggal 8

Juli 2012

Novianti, S dan Sutrisno, 2003. Perkembangan Penelitian Bioteknologi Pertanian di

Indonesia. Buletin AgroBio 6(1): 1-7.

Nur Fatimah, 2012. Uji kuantitatif DNA http://ditjenbun.deptan.go.id di akses tanggal

13 Mei 2012.

Oraby, A.S.H., Amal, H.A, and Ahlam, A.A.M, 2005. Screening Food Products for the

Presence of CaMV 35S Promoter and NOS 3 Terminator. Journal of the Science

of Food and Agriculture. 85:1974-1980 (2005) DOI: 10.1002/2201.

Radji, M, 2011. Rekayasa Genetika Pengantar untuk Profesi Kesehatan. Sagung Seto

Jakarta.

http://ditjenbun.deptan.go.id/

71

Radke, S.E., Andrews B.M., Moloney, M.M., Crouch, M.L., Kridl, J.C., and Knauf,

V.C., 1988. Transformasi of Brassica napus L. using Agrobacterium

tumefaciens: Developmentally Regulaated Expression of a Raintroduced Napin

Gene. Theor Appl Genet. 75: 685-694.

Rahmawati, S. 2003. Gen Penyeleksi alternatif untuk Transformasi Tanaman. Buletin

AgroBio 6(1): 26-33.

Saragih, E., Santun, R.P. Sitorus., Harianto dan Sugiono, M, 2009. Analisis

Kelayakan Ekonomi, Keberlanjutan Usaha Tani dan Faktor-Faktor Penentu

Adopsi Benih Jagung Transgenik di Indonesia. Jurnal Agro Ekonomi 27 No.1: 23-

44.

Saragih, E., Santun, R.P. Sitorus., Harianto dan Sugiono, M , 2010. Analisis Regulasi

dan Kebijakan Keamanan Hayati dan Peluang Keberhasilan Adopsi Benih

Transgenik di Indonesia. Jurnal AgroBiogen 6(1);40-48.

Serge, L., Marta, H., Sophie, F., Francine, B., Malcolm, B., Shirin, B., Thomas G., Neil

H., Othmar, K., Patrick, P., Maria, P., Pere, P., Mare, V., Yves, B, dan Jose R.,

2006. A microarray-based Detection System for Genetically Modified (GM) Food

Ingredients. Springer Plant Molecular Biology DOI 10.1007/s 11103-005-6173-4.

Standar Nasional Indonesia No: 01-6994-2004 tentang Benih Jagung. Badan

Standarisasi Nasional.

Standar Nasional Indonesia No: 01-3920-1995 tentang Biji Jagung. Badan Standarisasi

Nasional.

Suarni, 2009. Komposisi Nutrisi Jagung .Menuju Hidup Sehat. Prosiding Seminar

Nasional Serealia. ISBN: 978-979-8940-27-9

Sustiprijatno, 2002. Jagung Transgenik dan Perkembangan Penelitiannya di Indonesia,

Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya

Genetika Pertanian Bogor. Litbang deptan.go.id/bppi/lengkap/bpp10253pdf.

Diakses 5 Mei 2012.

Utami, A., Meryalita, R., Prihati, N.A., Ambarsari, L., Kurniati,A. P., Nurcholis, W.,

2012. Variasi Metoda Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma

xanthorrhiza,Roxb. Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa Surabaya. ISBN:

978-979-028-550-7

Yulinar, 2010. Pangan Produk Rekayasa Genetik dan Pengkajian Keamanannya di

Indonesia. Buletin Info POM. ISSN 1829-9334.

Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andi Offset,

Yogyakarta.

Yuwono, T. 2005. Bioteknologi Pertanian. Gadjah Mada University Press,

Yogyakarta.

72

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler, hal 49 - 74. Erlangga, Jakarta

Zaulet, M., Lavinia, R., Steliana, K., Catalina, L., Sorina, M., Elena, M.B., Marieta, C.,

2009. Detection and Quantification of GMO and Squencing of the DNA amplified

products. Romania Biotechnological Letters Vol.14,No.5,4733-4746.

73

LAMPIRAN

Lampiran 1. Cara pembuatan reagen atau pereaksi.

a) Pembuatan larutan CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromida)

1. Dimbang 10 g CTAB, 41 g NaCl, 7,87 g tris HCl

2. Dilarutkan dalam aquadest 400 ml aquadest

3. Ditambahkan larutan NaOH sampai larutan mencapai pH 8,0

4. Ditambahkan 20 ml larutan EDTA 0,5M pH 8,0

5. Ditambahkan aquadest sampai 500 ml.

b) Pembuatan larutan TAE 1 X dari larutan TAE 40 X

1. Dipipet 10 ml larutan TAE 40X

2. Ditambahkan aquadest sampai 400 ml

3. Simpan di suhu ruang.

c) Pembuatan agarose 0,7%

1. Ditimbang 700 mg agarosa dan dilarutkan dengan 100 ml larutan TAE 1X

2. Larutan dipanaskan hingga mendidih, dan setelah suhu agarosa ± 500C

ditambahkan 8 uL SYBR safe DNA gel Stain, kemudian gel dituang ke dalam

baki ( tray) cetakan gel dan meletakkan sisir gel digel agarose.

3. Setelah gel agarose memadat, sisir ditarik dengan hati-hati dan gel agarose

diletakkan apada alat elektroforesis kemudian digenangi dengan larutan buffer

TAE 1X sampai gel terendam didalam baki elekktroforesis.

74

d) Pembuatan agarose 2%

1. Ditimbang 2 g agarosa dan dilarutkan dengan 100 ml larutan TAE 1X

2. Larutan dipanaskan hingga mendidih, dan setelah suhu agarosa ± 500C

ditambahkan 8 uL SYBR safe DNA gel Stain, kemudian gel dituang ke dalam

baki ( tray) cetakan gel dan meletakkan sisir gel digel agarose.

3. Setelah gel agarose memadat, sisir ditarik dengan hati-hati dan gel agarose

diletakkan apada alat elektroforesis kemudian digenangi dengan larutan buffer

TAE 1X sampai gel terendam didalam baki elekktroforesis.

e) Pembuatan larutan Primer Reverse 20 µM

Primer reverse yang belum diencerkan (serbuk) konsentrasinya adalah 196 µg,

kemudian dibuat stok primer yang setara dengan 100 µM yaitu dengan

menambahkan 196 µL ddH2O. Untuk membuat Primer reverse 20 µM , dipipet 20

µL larutan stok primer 100 µM kemudian ditambahkan ddH20 80 µL.

f) Pembuatan larutan Primer Forward 20µM

Primer forward yang belum diencerkan (serbuk) konsentrasinya 195 µg, kemudian

dibuat stok primer yang setara dengan 100 µM yaitu dengan menambahkan 195 µL

ddH2O. Untuk membuat Primer forward 20 µM , dipipet 20 µL larutan stok primer

100 µM kemudian ditambahkan ddH20 80 µL.

75

Lampiran 2. Teknik transformasi gen dengan perantara Agrobacterium sp.

Sebagian dari DNA plasmid yaitu T-DNA dipindahkan ke dalam sel tanaman yang

terluka dan disisipkan ke dalam genom tanaman. Walaupun gen-gen T-DNA

berasal dari bakteri, tetapi mampu diekspresikan pada sel tanaman. Ekspresi gen-gen

tersebut adalah sintesis fitohormon (auksin dan sitokinin) dan sintesis opin.

Akibatnya jaringan yang terinfeksi akan mengalami proliferase sel yang tidak

terkendali dan menghasilkan jaringan tumor. Pada biakan jaringan, pertumbuhan

tumor ini dapat tumbuh terus walaupun dalam media tidak ditambahkan auksin dan

sitokinin, yang biasanya senyawa ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan

tumbuhan secara in vitro (Day dan Lichtenstein, 1992; White, 1993; Heldt, 1999

dalam Manuhara, 2006).

76

Lampiran 3. Tabel pembuatan konsentrasi DNA 50 ng dalam 50 µL untuk

amplifikasi PCR

Isolat Konsentrasi awal

(ng)

Jumlah DNA

(µL)

Jumlah ddH2O

(µL)

Biji jagung 01 2122 1,2 48,8

Biji jagung 02 2125 1,2 48,8

Biji jagung 03 1892 1,3 48,7

Biji jagung 04 1762 1,4 48,6

Biji jagung 05 1890 1,3 48,7

Biji jagung 06 1947 1,3 48,7

Benih jagung 07 1770 1,4 48,6

Benih jagung 08 2212 1,1 48,9

Benih jagung 09 1590 1,6 48,4

Benih jagung 10 2315 1,1 48,9

Kontrol positif GMO 1935 1,3 48,7

77

Lampiran 4. Cara pemakain alat

a) Cara Pemakaian pH meter Esco

1. Elektrode dibilas dengan air destilasi kemudian dikeringkan dengan tissue halus.

2. pH meter dihidupkan dengan menekan tombol on / off

3. Ditekan tombol MODE untuk memilih pengukuran yang dikehendaki.

4. Elektrode dicelupkan ke dalam dapar pH 4 dan ditunggu beberapa saat sampai

menunjukkan angka 4.

5. Elektrode dicelupkan ke dalam dapar pH 7 dan ditunggu beberapa saat sampai

menunjukkan angka 7.

6. Elektrode diangkat dan dibilas dengan tisu

7. Elektrode dicelupkan ke dalam sampel/ contoh yang akan diukur dan ditunggu

beberapa saat sampai penunjukan stabil.

8. Eletrode diangkat dan bilas dengan air destilasi sampai bersih lalu dikeringkan

dengan tissue halus.

9. Elektrode disimpan dalam larutan KCl jenuh.

10. pH meter dimatikan dengan menekan tombol on/off.

78

b) Cara pemakaian laminar air flow (BSC) ESCO class II type A2

1. Menyambungkan alat Biosafety Cabinet dengan sumber arus listrik

2. Menaikkan Sash dengan menekan tombol hingga setinggi tanda Sash Haight

3. Blower dinyalakan dengan menekan tanda

4. Password diisi dengan menekan tombol ”SET” sebanyak 4 kali kemudian

menekan tombol satu kali hingga muncul password 0001 pada layar

5. Tombol SET , ditekan , blower akan menyala dan menunggu hingga proses

warming up selesai dan biosafety cabinet siap digunakan

6. Setelah selesai menggunakan, blower dimatikan dengan menekan tanda

selanjutnya menekan tombol SET sebanyak 4 kali kemudian menekan tombol

satu kali sehingga muncul 0001 pada layar kemudian menekan kembali SET,

selanjutnya menunggu hingga proses purging selesai

7. Laminar dibersihkan dengar DNA away dan alkohol 70%

8. Sash diturunkan dengan menekan tombol

9. Lampu UV dinyalakan selama 1 jam dengan menekan tombol UV

79

c) Cara pemakaian timbangan Chyo JK-180

1. Meletakkkan contoh uji, reagen yang akan ditimbang didekat timbangan

2. Menyambungkan timbangan dengan sumber listrik

3. Memeriksa kedudukan water pas pada timbangan

4. Menghidupkan timbangan dengan menekan tombol ON

5. Setelah terlihat angka nol dilayar, contoh uji, media, pereaksi yang akan

ditimbang diletakkan diatas piring timbangan

6. Timbangan dikembalikan ke posisi nol, mematikan dengan menekan tombol off

d) Cara pemakaian autoclave

1. Tombol ON ditekan untuk menyalakan Autoclave

2. Autoclave dibuka dengan menggeser lid Autoclave kearah Unlock

3. Autoclave diisi dengan Aquadest sebanyak 2 liter

4. Bahan yang akan disteril dimasukkan kedalam Autoclave

5. Autoclave ditutup dengan menggeser lid kearah Lock

6. Menekan tombol Start untuk memulai sterilisasi

7. Sterilisasi sudah selesai bila lampu indikasi menuju ke lampu Complete

8. Autoclave dibukan dengan menggeser lid Autoclave kearah Unlock

9. Semua media yang sudah disterilkan dikeluarkan

10. Sisa aquadest dikeluarkan melalui lubang pembuangan yang ada di bawah

water level tank.

11. Mematikan Autoclave dengan menekan tombol OFF

80

e) Cara pemakaian sentrifuge

1. Menekan tombol “ON” untuk menyalakan sentrifuge

2. Tutup sentrifuge dibuka dengan menekan tombol

3. Rotor digunakan sesuai dengan besar kecilnya wadah yang akan disentripuge

4. Bahan yang akan dicentrifuge dimasukkan

5. Tutup alat sentripuge ditutup

6. Satuan kecepatan sentripuge diatur dengan menekan tombol ” ” dan ”

7. Lama sentrifuge diatur dengan menekan tombol ” ” dan ” ” dibagian

bawah display waktu

8. Tutup centrifuge dibuka dengan menekan tombol ” ”

9. Bagian yang telah selesai dicentrifuge dikeluarkan

10. Centrifuge ditutup kembali

11. Alat centrifuge dimatikan dengan menekan tombol ”OFF”

f) Cara pemakaian oven

1. Menghubungkan alat oven dengan sumber arus listrik

2. Memutar tombol ON untuk menyalakan autoclave

3. Memutar tombol pengatur suhu pada suhu 180oC

4. Memutar tombol pengatur waktu ke angka 2 jam

5. Membuka tutup oven dan memasukkan alat yang akan disteril

6. Jika telah selesai waktu sterilisasi mematikan oven dengan memutar tombol OFF

7. Jika oven sudah tidak panas, mengeluarkan alat yang disteril

81

g) Cara pemakaian spindown

1. Membuka tutup centrifuge dengan menekan tombol pada bagian depan

2. Memasukkan bahan yang akan dispindownkan

3. Menekan Tombol ON untuk mengihupkan spindown

4. Setelah selesai mematikan alat dengan menekan tombol OFF

5. Membuka tutup centrifuge setelah rotor berhenti berputar

6. Mengeluarkan bahan yang telah dispindownkan

7. Membersihkan bagian dalam tutup centrifuge dengan alkohol 70% dan DNA

away kemudian menutup kembali centrifuge

h) Cara pemakaian waterbath Shaker labtech LSB 0305

1. Menekan tombol untuk menaikkan angka, sedangkan untuk menurunkan

angka menekan terus tombol tersebut

2. Menekan tombol Geser atau untuk memindahkan ke kiri

atau kanan untuk merubah angka digit

3. Menekan tombol ”SET” sebanyak 2 kali untuk mengakhiri pengaturan RPM/G

4. Untuk mengatur waktu, menekan tombol ”SET” sebanyak 3 kali, pada Dislay

akan tampak rinE

5. Menekan tombol untuk menaikkan angka dan menekan terus untuk

menurunkannya

6. Menekan tombol Geser atau untuk bergerak ke kiri atau

kanan untuk merubah angka digit

7. Menekan tombol ”SET” untuk mengakhiri pengaturan waktu

82

i) Cara pemakaian polymerase chean reaction

1. Menghubungkan alat PCR dengan sumber arus listrik

2. Menghidupkan PCR dengan menekan tombol ON

3. Akan muncul tampilan menu, pilih Browse/ New Methods

4. Memilih metode yang akan digunakan

5. Mengecek suhu dan siklus PCR yang akan digunakan dengan menekan tombol

view/edit

6. Bila metode telah sesuai menekan RUN

7. Memasukkan contoh yang telah dicampur dengan master mix

8. Selanjutnya menekan start Run Now

9. Bila proses telah selesai ditekan tombol Stop

10. Selanjutnya ditekan tombol Exit

11. Matikan Mesin PCR dengan menekan tombol “OFF”

12. Mengeluarkan contoh yang telah selesai diamplifikasi

13. Melepaskan alat PCR dari sumber arus listrik

14. Mengisi buku pemakaian alat

83

j) Cara pemakaian gel dokumen

1. Menhgubungkan alat Gel-Dok dengan sumber arus listrik

2. Menghidupkan Gel-Dok dengan menekan tombol ”White Light ”

3. Meletakkan gel hasil elektroforesis di tempat gel

4. Menekan tombol ”ON” Camera

5. Mengaktifkan komputer dengan memilih program ”Infinity”

6. Menekan ” Star Preview”

7. Memastikan posisi gel dapat terlihat di monitor

8. Menekan tombol “OFF” pada White Light

9. Menekan tombol “ON“ di Lampu UV dan Security

10. Menekan ”Outo expose”

11. Maka akan muncul gambar bench pada layar

12. Menekan tombol “OFF“ di Lampu UV dan Security

13. Menekan tombol ”Save” pada program komputer

14. Mengeprint hasil elektroforesis dengan menekan tombol ”Print”

15. Bila sudah selesai, mematikan komputer

16. Melepaskan alat dari sumber arus listrik

17. Membersihkan tray / tempat gel dengan menggunakan tissue tak berserat

84

Lampiran 5. Foto sampel benih jagung

Keterangan Gambar:

Sampel benih jagung tanpa kemasan.

1. Benih jagung Bisi 2 hibrida

2. Benih jagung Bisi 22 super hibrida

3. Benih jagung Pioner hibrida P 21

4. Benih jagung Bisi 816 super hibrida

1 2

3 4

85

Lampiran 6. Foto sampel benih, biji jagung dan kontrol positif

Keterangan Gambar:

1. Benih jagung dalam kemasan

2. Biji jagung untuk pangan dan pakan

3. Kontrol positif GMO kedelai dari Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional

(PPOMN) RI.

1 1 2

3

86

Lampiran 7. Foto reagen dan alat untuk isolasi DNA

Keterangan :

1. Ragen isolasi DNA

2. Reagen dan alat iaolasi

3. pH meter

4. Timbangan analitik

1

2

4 3

1 2

87

Keterangan :

5. Vortex

6. Spindown

7. Water bath

8. Centrifuge

9. Alat elektroforesis

10. Alat elektroforesis

5 6

7 8

9 10

88

Keterangan :

11 . Spektrofotometer

12 . PCR (Thermocycler)

13. Gel dokumen

14. Autuclave

11 12

13 14

89

Keterangan :

15. Pembuatan mastermix

16. Laminar air flow dan refrigerator

17. Hot plate

18. Mikro pipet

15 16

17 18

90

Lampiran 8. Peta kota Mataram

91

Lampiran 9. Surat keterangan telah melakukan penelitian

92

Lampiran 10. Analisis sekuen Promoter 35S CaMV dari Agrobacterium

tumefaciens yang diperolah dari GenBank dengan menggunakan

sofeware ClustalW2 dengan sekuen gen primer 35S-1 dan primer

35S-2

CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment

promoterCaMV

TTGGTCGTTCCGGTACCGTGAACGTCGGCTCGATTGTACCTGCGTTCAAATACTTTGCGA 60

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

TCGTGTTGCGCGCCTGCCCGGTGCGTCGGCTGATCTCACGGATCGACTGCTTCTCTCGCA 120

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

ACGCCATCCGACGGATGATGTTTAAAAGTCCCATGTGGATCACTCCGTTGCCCCGTCGCT 180

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

CACCGTGTTGGGGGGAAGGTGCACATGGCTCAGTTCTCAATGGAAATTATCTGCCTAACC 240

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GGCTCAGTTCTGCGTAGAAACCAACATGCAAGCTCCACCGGGTGCAAAGCGGCAGCGGCG 300

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GCAGGATATATTCAATTGTAAATGGCTTCATGTCCGGGAAATCTACATGGATCAGCAATG 360

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

AGTATGATGGTCAATATGGAGAAAAAGAAAGAGTAATTACCAATTTTTTTTCAATTCAAA 420

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

ATACAGAGTCTTTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC 14100

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GACACTCTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATT 14160

93

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTTGGATTCCATTGCCCAGCTATC 14220

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

TGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGC 14280

primer -------------------------------------

GCTCCTACAAATGCCATCA---- 19

*******************

promoterCaMV

GATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC 14340

primer ------------------------------------GATAGTGG--------

-------- 27

** *****

promoterCaMV

CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTG 14400

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAA 14460

primer GATTG-TGCGTCA---------------------------------------

-------- 39

***** ** * **

promoterCaMV

GACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGTATAAGA 14520

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

GCTCATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACATTT 14580

primer ----------------------------------------------------

--------

promoterCaMV

CCGGTGAGTAATATTGTACGGCTAAGAGCGAATTTGGCCTGTAGACCTCAATTGCGAGCT 22500

primer ----------------------------------------------------

--------

Keterangan : Diedit dari aplikasi ClustalW2 sekuen untuk promoter 35S

CaMV dari Agrobacterium tumefaciens setelah disesuaikan dengan sekuen

primer 35S CaMV.

94

Lampiran 11. Resapan spektrofotometer biji jagung , benih jagung dan sampel

GMO

Kontrol negatif

95

96

97

98

99

100

101

102

Documents

DETEKSI KEBERADAAN PROMOTER 35S CaMV PADA BIJI · PDF fileii deteksi keberadaan promoter 35s camv pada biji jagung (zea mays l.) yang digunakan sebagai bahan baku pangan atau pakan