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Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic
du Lupus Erythémateux Systémique
Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.
15/06/2001
Historique et épidémiologie de la maladie lupique
Lupus signifie « loup » en latin formes cutanées
Prévalence de 15 à 200 pour 100 000 habitants ;
Fréquence plus élevée chez les sujets non caucasiens ;
Prédominance féminine :
8 à 9 femmes pour un homme ; Pic de fréquence entre 20 et 30
ans ; Étiologies : facteurs génétiques,
endocriniens, immunitaires environnementaux…
Éruption en ailes de papillon
(Hebra 1845)
Mais présence aussi de complications viscérales…
15/06/2001
Diagnostic clinique de la maladie lupique
Définition de Dubois : « Syndrome clinique
- de cause inconnue, - avec atteinte systémique- touchant un ou plusieurs
appareils
Critères de gravité de la maladie : atteinte rénale, cardiaque, neurologique, hématologique (AHAI, purpura thrombopénique);
- évoluant par poussées, - entrecoupé de rémissions
multiples ».
15/06/2001
Diagnostic biologique de la maladie lupique
Anomalies biologiques diverses:
1) Signes hématologiques :
anémie, leucopénie, thrombopénie
2) Signes inflammatoires :
- Hyperglobulinémie polyclonale
- Dissociation VS, CRP ;
3) Cryoglobulinémie (III) ;
4) Activation du complément :
CH50, C3, C4 (C1q).
Grande diversité d’auto-Ac:
- Ac antinucléaires les plus spécifiques :
- anti-ADNnatif (40 à 90%)
- anti-Sm (5 à 30%)
- anti-PCNA (3 à 5%),
- Ac anti-phospholipides (20 à 40% des lupus),
- Ac anti-cellules sanguines
- Facteur rhumatoïde (30%)
15/06/2001
Critères de classification de l’ACR
1 Éruption malaire en ailes de papillon
2 Lupus discoïde
3 Photosensibilité
4 Ulcérations buccales et nasopharyngées
5 Polyarthrite non érosive
6 Pleurésie ou péricardite
7 Atteinte rénale : protéinurie 0.5 g/24 h, cylindres urinaires
8 Atteinte neurologique : convulsions, psychose (sans médicaments inducteurs)9 Atteinte hématologique : Anémie hémolytique avec hyper-réticulocytose
ou leucopénie 4 000/mm3 constatée au moins à 2 reprises
ou lymphopénie 1 500/mm3 constatée au moins à 2 reprises
ou thrombopénie 100 000/mm3 en l'absence de cause médicamenteuse
10 Désordre immunologique : anticorps anti-ADN natif, anticorps anti-Sm, anticorps anti-phospholipides (soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou sérologie syphilitique dissociée)
11 Présence d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.
15/06/2001
Rôle dans la pathogénie :
IgG et de haute avidité Atteintes rénales
IgM et de faible avidité Faible activité de la maladie
Intérêt dans le diagnostic :
- Taux élevés = Forte valeur prédictive (94%) mais attention!!
- Diagnostic différentiel de lupus induit (Ac anti-ADNn <5%)
Intérêt dans le suivi :
- Évolutivité : Taux élevés = Indice pronostic péjoratif
8 à 35% de lupus quiescents avec Ac anti-ADNn à taux élevés;
- Prise en charge thérapeutique.
Les Anticorps anti-ADN natif
Ac anti-ADN natif = Anticorps anti-nucléaires dirigés contre l’ADN du nucléosome. Il existe 3 types d’Ac anti-ADN :
- Ac anti-ADN natif dirigés contre l’ADNdb seul ou l’ADNdb et l’ADNsb ; - Ac anti-ADN dénaturé dirigés uniquement contre l’ADNsb.
Discordances :
Pas de règle
100% établie!!
Seuls les Ac anti-ADN natif sont spécifiques du LES :
15/06/2001
Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif
Recherche des anticorps anti-nucléaires par : Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2.
Aspect nucléaire homogène sur cellules HEp-2
Confirmation de la spécificité « anti-ADNn » et dosage par
3 méthodes distinctes : Test de Farr Immunofluorescence sur
Crithidia luciliaeTechnique ELISA
15/06/2001
Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif
Test de Farr (RIA) IFCL ELISA
Sensibilité +++ ++ ++++++++
Spécificité ++++++ ++ +/-
Avantages -Technique quantitative-Méthode en phase liquide
- Test de référenceTest de référence
-Spécifique de l'ADN natif,
-Simple à mettre Simple à mettre en oeuvreen oeuvre
-Technique -Technique quantitative,quantitative,-Facilité d'emploi,-Facilité d'emploi,-Faible coût-Faible coût
Inconvénients -Présence possible d'ADN dénaturé en solution
-Utilisation de Utilisation de radioisotopesradioisotopes
-Technique semi-quantitative,
-Lecture subjectiveLecture subjective-Phénomène de zone
Présence possible Présence possible d'ADN dénaturé d'ADN dénaturé contaminantcontaminant
Interférences Héparines,Dextrans, Polyanions
Ac anti-histonesViroses, Syndrome des anti-phospholipides
15/06/2001
Objectifs de ce travail
Enquête rétrospective :
Évaluation des performances de 7 coffrets de dosage immuno-enzymatique des Ac anti-ADN natif par rapport au test de Farr utilisé en routine dans le laboratoire d’Immunologie du CHRU de Lille.
15/06/2001
Sérums et patients
Critères biologiques de sélection des 80 sérums :
76 sérums avec un titre en anticorps
anti-nucléaires 1/320e en IFI :
43 sérums Farr +33 sérums Farr –
4 sérums avec taux d’alpha foeto-protéine (AFP) 4000g/L (seuil à 10g/L)
Répartition clinique :
70 pathologies auto-immunes : • 53 lupiques :53 lupiques :
• 17 non lupiques17 non lupiques = autres maladies auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie)
10 autres pathologies (Raynaud, pneumopathie, hépatopathie)
N=44 Sex ratio(F/H)=93%Age=15-78 ans (moyenne 42ans)Sévérité : Forme bénigne 18% (8/44)
Forme modérée 48% (21/44)Forme grave 34% (15/44)
Traitement : 43/44 (97%)Association à d’autres MAI : 45.5% (20/44)
15/06/2001
Matériel et méthodes
Les 7 coffrets ELISA : - Test 1 : société Bio AdvanceBio Advance,- Test 2 : société Sanofi Pasteur Sanofi Pasteur
DiagnosticsDiagnostics (Biorad),- Test 3 et 4 : société BMDBMD, - Test 5 : société The binding The binding
sitesite, - Test 6 : société Menarini Menarini
DiagnosticsDiagnostics,- Test 7 : société Pharmacia & Pharmacia &
UpjohnUpjohn. Test de Farr : Société
Ortho Clinical Diagnostic
Méthodologie identique : 1) Incubation des sérums dans les puits coatés
d’ADNbicaténaire,
2) Lavage,
3) Incubation en présence du conjugué,
4) Lavage,
5) Incubation en présence du substrat,
6) Révélation (lecture de DO).
Mais différences entre les trousses :
- Nature de l’antigène, de l’anticorps ;
- Autres : temps d’incubation, dilution
des sérums, nombre de calibrants,
DO de référence et la valeur seuil…
Calcul d’un seuil arbitraire
15/06/2001
Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les
patients lupiques
UI/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
220
Seuil arbitraire
Farr
BioAdvance
Sanofi
BMD a
BMD b
The B
inding site
Men
arini
Pharmacia
15/06/2001
Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les
patients non-lupiques
UI/mL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
220
Seuil arbitraire
Farr
BioAdvance
Sanofi
BMD a
BMD b
The B
inding site
Men
arini
Pharmacia
15/06/2001
0
20
40
60
80
100
Farr
Indices informationnels
Sensibilité (%)Spécificité (%)
Performances du test de Farr : Sensibilité=71%Sensibilité=71% Spécificité=78%Spécificité=78%
Ac de haute affinité =Maladie lupique évolutive89% des lupus avec Farr positif = formes modérées ou graves
Corrélation Titres/ Clinique : seulement entre formes bénignes et graves
Discordances clinico-biologiques :
- 28% lupus avec Farr négatif : -supérieur à la littérature (8 à 22%)-rarement formes bénignes -découverte récente -souvent atteinte articulaire-lupus traité
- 18% non-lupiques avec Farr positif :-SAPL le plus souvent
Contre performance?Contre performance?
Phase pré-sérologique?Phase pré-sérologique?
Lupus éteints ou stabilisé sous Lupus éteints ou stabilisé sous traitement?traitement?
Phase pré-clinique de lupus biologique?Phase pré-clinique de lupus biologique?
15/06/2001
Indices informationnels
0
20
40
60
80
100
Farr
BioAdvance
Sanofi
BMD a
BMD b
The Binding si
te
Men
arini
Pharmacia
Sensibilité (%)Spécificité (%)
15/06/2001
Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr
Concordance des résultats : MODESTE
- Dans la population lupique de 43 à 73%,
- Dans la population non lupique de 34 à 82%,
- Meilleure concordance globale avec les tests 2 (68%) et 7 (67%).
Corrélation des titres d’Ac anti-ADNn dans la population lupique : ACCEPTABLE
- Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67,
- Meilleure avec les tests 2 et 6,
- Meilleure pour les titres élevés en Ac anti-ADN natif.
15/06/2001
Comparaison des méthodes ELISA
Grande hétérogénéité des résultats obtenus :
Variation des sensibilités de 15 à 100%
Variation des spécificités de 15 à 94%
Concordance des résultats : MAUVAISE
- Dans la population lupique seulement pour 6 sérums (11%)
Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles : 82%
- Dans la population non lupique seulement pour 1 sérum (3.7%)!!
Médiocre avec les 5 coffrets les plus spécifiques : 22%
Corrélation des titres avec la clinique : MAUVAISE
Seule UNE trousse (test 2) titres formes graves/ bénignes
15/06/2001
Manque de standardisation global entre les 7 coffrets même si étalonnés par rapport au même standard international : W0 80
Diagnostic biologique incohérent entre la majorité des trousses
Suivi évolutif des patients lupiques non adapté par méthode ELISA
Origines des discordances :
Facteurs extérieurs?
Défaut intrinsèque?- Phase solide=manque de spécificité,
- Imperfections des microplaques,
- Ac anti-plastique.
Différences entre les trousses?- Nombre d’étalons pour la calibration,
- Nature du réactif conjugué (antiglobuline),
- Origine de l’Ag.
Comparaison des méthodes ELISA
15/06/2001
Interférences
Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé :
Résultats faux positifs avec 6 coffrets
(Farr négatif et patients non lupiques). AFP :
Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et 7) Ac anti-phospholipides :
Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5 et 6 )
Phase solide favorise les réactions croisées entre Ac anti-phospholipides et ADN,
Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums : présence probable d’Ac anti-ADNn Phase pré-clinique de lupus?
Facteur rhumatoïde et cryoglobuline:
Non représentatif dans notre enquête.
15/06/2001
Intérêt d’une démarche biologique hiérarchisée
Détection par
IF-CL++ --Méthodes ELISA
Confirmation par test de Farr
Adapter selon dialogue clinico-biologique
Suivi évolutif : Test de Farr détecte une augmentation des Ac anti-ADNn dans 85% des cas de rechutes contre 75% pour ELISA et 63% pour l’IF-CL
Associer d’autres paramètres biologiques : CH50 et fractions…
Recherche d’anticorps anti-nucléaires par IFI : Présents dans 99 à 100% des lupus mais non spécifiques de la maladie (connectivites, affections inflammatoires, sujet
âgé)
Recherche d’Ac anti-ADNn
=Test de 1ère intention
Aspect homogène en IFI avec
titre1/320e
15/06/2001
Conclusion
Aucun coffret commercial ELISA n’atteint les performances du test de Farr car :
- Problèmes techniques
- Encore trop de discordances et d'interférences
- Absence de corrélation entre titre et sévérité clinique
Choisir un coffret fiable
Confirmation par test plus spécifique
Importance du dialogue clinico-biologique…