Detección y caracterización de fagos deStreptococcus thermophilus en Uruguay:

base para el desarrollo de cepas resistentesbase para el desarrollo de cepas resistentes

María Julia PianzzolaProf. Microbiología

Departamento de BiocienciasFacultad de Química. Universidad de la República

mpianzzo@fq.edu.uy

Contenidos

Introducción

ObjetivosObjetivos

Resultados

Streptococcus thermophilus

• G+ cocos en pares o cadenas

• Termófila, Tóptima 42°C

• Aanaerobia aerotolerante• Aanaerobia aerotolerante

• Genoma 1,8 Mb

• Separada hace 7000 años de patógenas

• Única especie Strepctococcus usado en la industriaalimentaria

• Única especie GRAS ( Generally Recongnized As Safe) por la FDA (American Food and Drug Administration)

Usos en la industria

• La segunda especie BAL más importante después de Lactococcus lactis

• Uso en yogur y variedades de quesos

• Rápida acidificación• Rápida acidificación

• Producción de productos de fermentación comoformiato, acetaldehído contribuyen aroma y textura

• En yogur: proto-colaboración: St-Lb bulgaricus

• Promisorio candidato a probiótico (no todas lascepas y en asociación con otras cepas)

Bacteriófagos de S. thermophilus

• ADN doble cadena

• 3 grupos de fagos: cos, pac y “nuevo” (Mills et al 2011)

• Organización genómica modular:• Organización genómica modular:

Achigar et al., 2017

Infección por bacteriófagos

Prescott, 7th edición

Interacción S.thermophilus- fagos

• Ciclos de producción largos aumentan la incidencia de:

materia prima contaminada

superficies contaminadas

subproductos recicladossubproductos reciclados

Fagos en aire-ambiente

• Uso intensivo y repetido de cepas o mezclas estárteres

Consecuencia:

fallas en el proceso de fermentación

La problemática de los fagos a nivel industrial

5,5

6

6,5

7

pH Normal

4

4,5

5

0 1 2 3 4

Tiempo (horas)

Lenta

Fallida

• Caída de productividad• Baja calidad de producto• Pérdida de materia prima

Estrategias de control

• Esterilización de la leche

• Rotación de cultivos estárteres

• Maximizar prácticas de higiene

• Mejorar diseños de las plantas

PERO

el problema no puede erradicarse,

POR TANTO:

Monitoreo de fagos:

-Alerta para incremento en el número

-Estudio de poblaciones y su adaptabilidad a las medidas que se tomen

¿ Por qué el problema persiste?

• Bacterias: resistencia a fagos, mecanismos

• Fagos: co-evolución para ser resistentes

ENTONCES:

Desarrollo de cepas mejoradas para resistencia a fagos

Mecanismos de resistencia a fagos de las bacterias

• Inhibición de la unión al receptor

• Destrucción del genoma del fago que ingresa a la bacteria (R-M) bacteria (R-M)

• Suicidio de células para abortar la infección (Abi)

• Sistema de defensa CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) o Resistencia adquirida

Sistema CRISPR-Cas

Barrangau et al., 2014

• Construcción de banco de fagos autóctonos

Optimizar técnicas de detecciónAislar fagos de muestras industrialesCaracterizar los fagos

Objetivos:

• Selección de cepas resistentes con potencial para ser utilizadas como iniciadores industriales

Evaluar las cepas de la colección respecto a fagos (desafíos sensibilidad/ resistencia)Seleccionar cepas resistentes por método clásicoEvaluar las características tecnológicas de las cepas

• Evaluar Nuevas estrategias para diseño de cepas resistentes

• Optimización de Técnicas de detección basadas enPCR y Real-Time PCR (qPCR)

Diagnóstico rápido

Detección y aislamiento de fagosDetección y aislamiento de fagos

Diagnóstico rápido

Discriminar entre diferentes fagos

Cuantificación

• Aislamiento de los fagos por técnica de la doble capade agar

Muestreo, detección y aislamiento

Aislamiento de fagos en doble capa de agar

432 muestras analizadas

Del Río et al., 2008

146 aislamientos realizados15 fagos diferentes

432 muestras analizadas

Detección por PCR de fagoscos y pac

Real Time PCR (QPCR)

1203 ensayos de sensibilidad resistencia

Ensayos de sensibilidad/resistenciaEnsayos de sensibilidad/resistencia

Caracterización de los fagos

15 perfiles de restricción diferentes

Análisis de genomas de fagos

Obtención de resistentes

R

103 ensayos de generación, 26 nuevas cepas posiblemente resistentes

Selección de resistentesSelección de resistentes

• Cada clon obtenido debe superar el ensayo de sensibilidad/resistencia para cada fago

Evaluación de resistentesEvaluación de resistentes

• Debe mantener las propiedades tecnológicas de la cepa madre

Selección de resistentesSelección de resistentes

4

4,5

5

5,5

6

6,5

0,00 1,00 2,00 3,00 4,00

pH

Tiempo (horas)

Curvas de fermentación de SBQ28T1, SBQ28T2 y SBQ28T3 comparadas con el rango aceptable de fermentación

Límite superior

Límite inferior

SBQ28T1

SBQ28T2

SBQ28T3

Evaluación de la resistencia adquirida(Sistema CRISPR/Cas)

Amplificación de regionesCRISPR

Secuenciado y análisis de regiones CRISPR

Achigar, 2014Tesis de Maestría

Estudio multigeneracional de laevolución de un locus CRISPR1 en cepas

resistentes

Proteínas hipotéticas Proteínas estructurales Enzimas

Conclusiones

• Colección de fagos de Streptococcus thermophilus

• Método optimizado de QPCR: detección, cuantificación, prevención

• Cepas de S. thermophilus resistentes • Cepas de S. thermophilus resistentes

• 15 fagos identificados, genomas secuenciados

• Cepas caracterizadas de acuerdo al sistema CRISPR/Cas

• Recursos humanos formados en el área

Perspectivas

• Establecer las bases para el diseño de cepas de S. thermophilus resistentes y estables: Tesis Doctorado en Biotecnología Rodrigo Achigar

• Búsqueda de nuevas cepas de BAL en muestras tradicionales y no tradicionales con propiedades tradicionales y no tradicionales con propiedades tecnológicas de interés: colaboración AUTEL y UTEC

• Continuar la colaboración con S. Moineau de la Université Laval, Canadá

Agradecimientos

Gracias!

MSc. Rodrigo AchigarLic. Maria Eugenia Taibo

Dr. Sylvain Moineau