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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia
spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL.
Ísis Assis Braga
CUIABÁ-MT
2013
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE AGRONOMIA, MEDICINA VETERINÁRIA E
ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia
spp. EM FELINOS DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL.
Autor (a): Ísis Assis Braga
Orientador: Prof. Dr. Daniel Moura de Aguiar
Co-Orientador: Prof. Dra. Valéria Régia Franco Sousa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Medicina Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
CUIABÁ-MT
2013
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5
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
PRÓ-REITORIA DE ENSINO DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Avenida Fernando Corrêa da Costa, 2367 - Boa Esperança - Cep: 78060900 -CUIABÁ/MT
Tel : +55 65 3615-8627 - Email : [email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
TÍTULO : "Detecção molecular e sorológica de Ehrlichia spp. em felinos domésticos da região metropolitana de Cuiabá, Brasil"
AUTOR : Mestranda Ísis Assis Braga
Dissertação defendida e aprovada em 28/02/2013.
Composição da Banca Examinadora: _________________________________________________________________________________________
Doutor(a)
Presidente Banca / Orientador
Daniel Moura de Aguiar
Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso
Doutor(a)
Examinador Interno
Richard de Campos Pacheco
Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso
Doutor(a)
Examinador Externo
Vamilton Alvares Santarém
Instituição : Universidade do Oeste Paulista
Doutor(a)
Examinador Suplente
Luciano Nakazato
Instituição : Universidade Federal de Mato Grosso
CUIABÁ, 28/02/2013.
6
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, João Geraldo e Eliete
pelos ensinamentos, apoio e amor incondicional.
Ao meu irmão, Igor pelo exemplo de vida e dedicação.
7
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por mais esta conquista, pela força concedida nos momentos de
aflição, e por ter colocado “anjos” em minha vida durante essa etapa.
Aos meus pais, João Geraldo e Eliete, quaisquer que sejam as palavras descritas
neste, serão incapazes de descrever meu sentimento por vocês. Ao Igor, meu irmão,
que é meu orgulho e exemplo. AMO VOCÊS!
Ao amigo e agregado da família, Lázaro (Broto), que apesar da distância sempre
acompanhou e torceu pelos meus objetivos.
Ao meu orientador, Daniel. Muito obrigada pela confiança, paciência, ensinamentos
e por me fazer sentir a vontade em trabalhar com você.
As colegas de laboratório Andréia, Thábata, Thaysa e Clara pelo apoio técnico.
Aos anjos Alvair, Cris, Dirceu, Elenice, Luana, Marcus (Poodle) e Samara, obrigada
pela amizade, pela força e pelos risos.
Aos professores Adriane Jorge, Luciano Nakazato, Richard Pacheco (Tiozão),
Valéria Dutra e Valéria Régia pelo auxílio e disponibilidade de materiais necessários
para a realização deste trabalho.
8
RESUMO
DETECÇÃO MOLECULAR E SOROLÓGICA DE Ehrlichia spp. EM FELINOS
DOMÉSTICOS DA REGIÃO METROPOLITANA DE CUIABÁ, BRASIL
A erliquiose é uma doença de distribuição mundial, causada pelas Rickettsias
Ehrlichia spp.. É considerada endêmica em cães de várias regiões do Brasil, porém
em felinos essa informação é desconhecida e poucos estudos foram realizados até o
momento no país. Com o intuito de detectar a presença de infecção por Ehrlichia
spp. em gatos da região metropolitana de Cuiabá, Mato Grosso, foram coletadas
amostras de sangue de uma população de 212 indivíduos da região e submetidos a
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Ehrlichia spp. e a Reação em
Cadeia pela Polimerase (PCR) visando a amplificação de um fragmento de 409 pb
do gene dsb de Ehrlichia. Dos animais avaliados 88 (41,5%) foram soropositivos
pela RIFI e 20 (9,4%) foram positivos pela PCR. Sequências parciais de DNA
obtidas a partir dos produtos da PCR foram idênticas às sequências de E. canis
depositadas no GenBank. Doze gatos foram positivos em ambos testes molecular e
sorológico. Testes de associação baseados nas alterações clínicas e laboratoriais de
uma parcela da população estudada demonstraram que gatos soropositivos
apresentaram palidez de mucosas e baixas contagens de eritrócitos como variáveis
associadas (p ≤ 0,05). No momento da coleta de sangue não foi visualizado
infestação por carrapatos nos animais. O presente estudo complementa a demanda
de trabalhos nesta espécie, relatando pela primeira vez a detecção molecular e
sorológica de E. canis em gatos da região metropolitana de Cuiabá, região Centro-
Oeste do Brasil.
Palavras-chave: Carrapatos, erliquiose, felinos, PCR, RIFI
9
ABSTRACT
MOLECULAR AND SEROLOGICAL DETECTION OF Ehrlichia spp. IN
DOMESTIC CATS IN THE METROPOLITAN REGION OF CUIABÁ, BRAZIL
Ehrlichiosis is a disease of worldwide distribution, caused by the rickettsial agent
Ehrlichia spp.. The occurrence in dogs is considered endemic in several regions of
Brazil. However, this information in cats is unknown and few studies have been
performed to date in Brazil. In order to detect the presence of Ehrlichia spp. in cats
from the metropolitan area of Cuiabá, Mato Grosso state, blood and serum samples
were collected from a regional population of 212 individuals and tested by
Immunofluorescence Assay (IFA) and the Polymerase Chain Reaction (PCR)
designed to amplify a 409 bp fragment of the dsb gene. Eighty-eight (41.5%) animals
were seropositive by IFAT and 20 (9.4%) were PCR positive. Partial sequences of
DNA obtained from PCR products were identical to the GenBank E. canis
sequences. Twelve cats were positive in both molecular and serological tests.
Association tests, based on clinical and laboratory findings of a partial evaluated
population, showed that seropositive cats presenting pale mucous membranes and
lower counts of erythrocytes as associated variables (p ≤ 0.05). Tick infestation was
not observed at blood collection. This study complements the demand for more
information on this species, reporting the presence and the first molecular and
serological detection of E. canis infection in cats from the metropolitan area of
Cuiabá, Midwest region in Brazil.
Keywords: Ticks, ehrlichiosis, cats, PCR, IFA
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Freqüência de títulos observados em gatos positivos para Ehrlichia
spp. através de Reação de Imunofluorescência Indireta. Cuiabá,
MT. 2013.............................................................................................29
Tabela 2: Associação entre os locais de origem dos felinos e os resultados da
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia
pela Polimerase (PCR). Cuiabá, MT. 2013.....................................31
Tabela 3: Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) dos animais
atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato
Grosso. Cuiabá, MT. 2013..............................................................32
Tabela 4: Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da
Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) dos animais atendidos
no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso.
Cuiabá, MT. 2013............................................................................33
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Localização dos municípios de Cuiabá e Várzea Grande, MT.
Cuiabá, 2013...................................................................................24
12
SUMÁRIO
Página RESUMO ABSTRACT LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS
1 INTRODUÇÃO ............................................................................... 13 2 REVISÃO DE LITERATURA ......................................................... 15
2.1 Erliquiose Felina ......................................................................... 15 2.1.1 Histórico ........................................................................................ 15 2.1.2 Agentes Etiológicos ..................................................................... 16 2.1.3 Patogenia ...................................................................................... 18 2.1.4 Sinais Clínico-laboratoriais ......................................................... 19 2.1.5 Transmissão e Ciclo Biológico ................................................... 19 2.1.6 Diagnóstico ................................................................................... 21
2.2 Erliquiose Humana ....................................................................... 22 3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................. 24
3.1 Local de estudo ............................................................................ 24 3.2 Amostragem .................................................................................. 25 3.3 Reação de Imunofluorescência Indireta ..................................... 25 3.4 Extração de DNA .......................................................................... 26 3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase ........................................... 26 3.6 Purificação e Sequenciamento ................................................... 27 3.7 Análise Estatística ....................................................................... 28
4 RESULTADOS .............................................................................. 28 4.1 Gatos ............................................................................................. 28 4.2 Reação de Imunofluorescência Indireta ..................................... 29 4.3 Reação em Cadeia pela Polimerase ........................................... 30
4.4 Seqüenciamento Genético .......................................................... 30 4.5 Achados Clínico-laboratoriais .................................................... 30 4.6 Análises Estatísticas ................................................................... 31
5 DISCUSSÃO .................................................................................. 33 6 CONCLUSÃO ................................................................................ 38 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................. 39
13
1 INTRODUÇÃO
Dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos, a erliquiose
destaca-se como importante doença de distribuição cosmopolita, sendo
causada por microorganismos do gênero Ehrlichia, acometendo principalmente
cães e humanos (GROVES et al., 1975; RIKIHISA et al.,1991; COUTO, 1998).
Todavia, devido a expansão dos limites zoogeográficos observados em
meio aos artrópodes e as infecções transmitidas pelos mesmos, em
decorrência de mudanças climáticas e maiores acessibilidades a certos nichos
ambientais (SHAW et al., 2001), pesquisas vêm demonstrando também que os
felinos domésticos (Felis catus domesticus) são infectados por espécies do
gênero Ehrlichia. Entretanto, a possibilidade desses animais se comportarem
como reservatórios do agente (STUBBS et al., 2000), bem como fonte de
infecção para outros animais, inclusive humanos, ainda vem sendo explorado
(COUTO, 1998; PADDOCK e CHILDS, 2003).
Ehrlichia spp. pertence à Ordem Rickettsiales e Família
Anaplasmataceae (DUMLER et al., 2001). São parasitos intracelulares
obrigatórios gram-negativos, que se situam em vacúolos citoplasmáticos de
células hematopoiéticas maduras ou imaturas e células endoteliais nos
hospedeiros vertebrados ou no intestino e glândula salivar dos hospedeiros
artrópodes (GROVES et al., 1975; UNVER et al., 2001). Estes organismos se
mantêm na natureza através de interações complexas entre vetores
invertebrados e hospedeiros vertebrados (DUMLER et al., 2001; PADDOCK e
CHILDS, 2003).
Diversas espécies são apontadas como causadoras de erliquiose, como
a Ehrlichia canis, responsável pela Erliquiose Monocítica Canina (EMC); E.
chaffeensis, agente etiológico da Erliquiose Monocítica Humana (EMH); E.
ewingii, agente da Erliquiose Granulocítica Canina (EGC) e Humana (EGH)
(LITTLE, 2010) e E. ruminantium, agente de uma erliquiose de ruminantes
africanos e caribenhos conhecida por Hidropericardite bovina (PETER et al.,
2002), compreendendo espécies filogeneticamente relacionadas, porém
genética e antigenicamente diferentes (YU et al., 2007).
14
A E. canis é a principal espécie circulante no Brasil, tendo o carrapato
Rhipicephalus sanguineus envolvido na transmissão do agente em cães
(LABRUNA e PEREIRA, 2001). Os ciclos naturais e o potencial desses
artrópodes na transmissão de doenças em gatos domésticos não estão
totalmente elucidados (AMYX e HUXSOLL, 1997). Não obstante, sabe-se que
o carrapato R. sanguineus têm hábitos nidícolas (do latim nidi= ninho; cola=
que permanece) e demonstra ampla distribuição geográfica urbana no Brasil,
onde encontra condições favoráveis para o parasitismo e reprodução
(LABRUNA e PEREIRA, 2001).
Vista como agente causal de disfunções hematológicas em cães, a
patogenia gerada pela infecção por E. canis em felinos domésticos não foi
totalmente esclarecida e são escassos os relatos que discorrem no que se
refere as alterações clínicas e laboratoriais manifestadas na erliquiose felina.
Contudo, estudos sugerem que a erliquiose seja incluída no diagnóstico
diferencial de gatos com presença de leucopenia, anemia e trombocitopenia
associado à apatia e febre (BUORO et al., 1989; BOULOY et al., 1994;
BEAUFILS et al., 1995; ALMOSNY e MASSARD, 1999).
No tocante aos aspectos de saúde pública referente à infecção por
bactérias do gênero Ehrlichia, no Brasil pouco se conhece sobre erliquiose
humana. Porém, destaca-se a possibilidade de acometimento humano dessa
enfermidade, já que por muitas vezes espécies de Ehrlichia foram relatadas
circulando entre cães, gatos e seus ectoparasitos (DAGNONE et al., 2003;
AGUIAR et al., 2007 a,b; OLIVEIRA et al., 2009).
Ressaltando os casos frequentes de hemoparasitoses no cotidiano
médico-veterinário, faz-se necessário não somente a caracterização do
microrganismo, como também definir a patogenia ocasionada na espécie felina.
Contudo, o presente estudo objetiva investigar a detecção de infecção causada
por Ehlichia spp. em felinos domésticos da região metropolitana de Cuiabá,
Mato Grosso. Diante disto, associar a infecção por Ehrlichia spp. com possíveis
alterações clinico-laboratoriais.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Erliquiose Felina
2.1.1 Histórico
A erliquiose felina foi inicialmente identificada na França por Charpentier
e Groulade (1986), através de detecção de mórulas em células mononucleares
do sangue, desde então, são crescentes os relatos de casos de infecção por
Ehrlichia spp. em felinos domésticos.
Sucessivos relatos foram descritos, por meio de inquéritos sorológicos,
demonstrando diferentes soroprevalencias: 43% no sudeste da África
(MATTHERWMAN et al., 1996); 8,3% na França (BONI et al., 1997); 10,6% na
região central (AGUIRRE et al., 2004) e 17,9% na região nordeste (ORTUNÕ et
al., 2005) da Espanha.
No continente americano, o primeiro caso foi relatado no Colorado,
Estados Unidos da América (BOULOY et al., 1994). Os animais apresentaram
títulos de anticorpos para E. canis e Neorickettsia (Ehrlichia) risticii. Os autores
acreditavam na ocasião, que a E. canis fosse patogênica para gatos e
consideraram também a possibilidade de transmissão através da ingestão de
roedores ou dos parasitos destes, uma vez que os felinos não apresentavam
sinais clínicos nem mórulas circulantes (BOULOY et al., 1994). Também nos
EUA, Stubbs et al. (2000) relataram a soroprevalência de 13,2% para E. canis,
e em seguida, organismos extremamente similares a E. canis foram detectados
através de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) em três gatos que
apresentaram manifestações clinicas tais como, poliartrite, além de disfunções
hematológicas (BREITSCHWERDT et al., 2002).
A primeira descrição na América Latina ocorreu no Brasil, na cidade do
Rio de Janeiro, por meio de observação de mórulas em células mono e
polimorfonucleares em esfregaço sanguíneo de gatos que apresentaram febre
e sintomas inespecíficos (ALMOSNY et al., 1998). Em Viçosa, Oliveira et al.
16
(2009) relataram a primeira detecção molecular de E. canis em gatos da
América do Sul. Posteriormente, Braga et al. (2011) detectaram 1% e 5,5% de
positividade nos testes de PCR (baseado no gene 16S rRNA) e Reação de
Imunofluorescência Indireta (RIFI) respectivamente em gatos peridomiciliados
da cidade de São Luís do Maranhão.
2.1.2 Agentes Etiológicos
Ehrlichias são bactérias Gram-negativas, intracelulares obrigatórias,
imóveis, de forma ovóide a elipsoidal, que residem em fagossomos de células
hematopoiéticas, tais como monócitos, macrófagos, neutrófilos e células
endoteliais (DUMLER et al., 2001) localizadas também em células do aparelho
digestório, glândula salivar e hemolinfa de carrapatos (GROVES et al., 1975).
Pertencem à ordem Rickettsiales, que está dividida em duas grandes famílias:
Rickettsiaceae e Anaplasmataceae.
Dumler et al. (2001) propuseram a nova classificação taxonômica desta
ordem, ao utilizarem descobertas no campo de biologia molecular sobre os
genes 16S rRNA e groESL, bem como as características biológicas e
antigênicas existentes nestes agentes. Sendo assim, a família Rickettsiaceae é
composta pelos gêneros Rickettsia e Orientia, enquanto que a família
Anaplasmataceae é composta pelos gêneros Ehrlichia, Anaplasma, Wolbachia
e Neorickettsia. As mudanças também envolveram os gêneros Anaplasma,
Ehrlichia e Neorickettsia. O gênero Anaplasma atualmente composto pelas
espécies A. phagocytophilum (originada da reclassificação da E. equi, E.
phagocytophila e do agente da erliquiose granulocitica humana), A. platys
(outrora E. platys), A. bovis (antes E. bovis), A. marginale, A. centrale e A ovis.
O gênero Neorickettsia, agora contempla as espécies Neorickettsia risticii e N.
sennetsu, anteriormente denominadas por E. risticii e E. sennetsu,
respectivamente. Além disso, a espécie denominada por Cowdria ruminantium
foi transferida ao gênero Ehrlichia e passou a ser designada por E.
ruminantium.
17
Atualmente, o gênero Ehrlichia é composto por seis espécies: E. canis,
E. chaffeensis, E. ewingii, E. muris, E. ruminantium (DUMLER et al., 2001) e
Ehrlichia IOE (Ixodes ovatus Ehrlichia) (SHIBATA et al., 2000).
As espécies de Ehrlichia que naturalmente infectam felinos não foram
totalmente caracterizadas, porém inclusões foram detectadas em monócitos,
linfócitos e granulócitos de gatos com doença febril e trombocitopenia (SHAW
et al., 2001). Por tempos, as doenças causadas por esses patógenos eram
tradicionalmente categorizadas pelos tipos celulares aos quais parasitam. No
entanto, algumas espécies de Ehrlichia e Anaplasma já foram encontradas em
outras células, que não a de tropismo. Além disso, mais de um gênero ou
espécie pode ser responsável pela erliquiose monocítica e granulocítica.
Assim, o sistema de classificação tradicional baseado nas células invadidas,
não pode ser considerado como um caráter descritivo definitivo dessas
doenças.
E. canis é o agente primário da erliquiose monocítica canina (EMC),
sendo importante patógeno, responsável por provocar doença grave em cães.
Sua prevalência está largamente associada à distribuição do vetor, R.
sanguineus, encontrado principalmente em regiões tropicais e subtropicais
(RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005). De acordo com a revisão bibliográfica
realizada por Vieira et al. (2011), E. canis é considerada endêmica em cães de
diversas regiões do Brasil. Apesar de alguns autores terem demonstrado a
capacidade de transmissão desse agente a felinos domésticos (ALMOSNY e
MASSARD, 1999; BREITSCHWERDT et al., 2002; OLIVEIRA et al. 2009;
BRAGA et al., 2011) e selvagens (FILONI et al., 2006), esta infecção necessita
ser melhor avaliada, principalmente devido a escassez de relatos científicos.
Infecção por E. chaffeensis foi relatado em um felino doméstico do
município de São Luís do Maranhão por Braga et al. (2011) através de PCR.
Este agente é responsável pela erliquiose monocítica humana (HME), tendo
como principal hospedeiro vertebrado e vetor, o cervídeo da cauda branca
(Odocoileus virginianus) e Ammblyomma americanum respectivamente
(WALKER et al., 1987), ambos de ocorrência norte-americana.
No Pantanal Mato-grossense, uma nova espécie do gênero Ehrlichia foi
relatada em onças (Phantera onca), apresentando 98% de similaridade à E.
ruminantium (WIDMER et al., 2011), o que reforça a necessidade de mais
18
estudos na região para esclarecer a possibilidade desta nova espécie estar
circulando entre outros animais da região como bovinos, cães e gatos
domésticos.
2.1.3 Patogenia
A patogenia da erliquiose felina permanece desconhecida. Baseado em
achados clínicos, laboratoriais e radiográficos, acredita-se que a patogenia da
doença se comporte como em cães (BREITSCHWERDT, 2004). A EMC
envolve um período de incubação de 8 - 20 dias, seguida pela fase aguda,
subclínica (assintomática) e às vezes, crônica (HARRUS et al., 1997).
A fase aguda da E. canis dura de 2 a 4 semanas, quando o parasita é
inoculado pelo vetor na corrente sanguínea e linfática e penetra em macrófagos
do sistema fagocítico monocitário presentes em gânglios do fígado, baço e
linfonodos, onde se replica por fissão binária. (HARRUS et al., 1997). Nas
células infectadas, erliquia inibe a união do lisossomo com o vacúolo nos
macrófagos impedindo a ativação dos mesmos, não induzindo a liberação de
mediadores químicos, como a interleucina 1 e o fator de necrose tumoral. No
entanto, os macrófagos podem ser ativados por estímulo exógenos, como
aumento intracelular de íons cálcio e interferon gama (RIKIHISA, 1991).
As células mononucleares infectadas disseminam a infecção para outros
sistemas orgânicos, onde aparentemente interagem com as células endoteliais
dos vasos de menor calibre, induzindo vasculite, ou resposta celular
inflamatória perivascular, após a migração para o tecido subendotelial
(HARRUS et al., 1997).
A gravidade dos sinais clínicos variam na fase aguda, mas tendem a
desaparecer espontaneamente, embora alguns cães possam permanecer com
infecção subclínica, sendo o agente albergado no baço (HARRUS et al.,1997).
A fase subclínica da erliquiose é associada com a persistência do organismo e
aumento do título de anticorpos séricos, que começam a aparecer após 7 a 21
dias a infecção inicial, refletindo a ineficácia do sistema na eliminação do
organismo intracelular (HOSKINS, 1991). Os achados hematológicos são
19
similares aos da fase aguda, associados à ausência de sinais clínicos (TROY &
FORRESTER, 1999).
Alguns cães imunocompetentes são capazes de eliminar a bactéria
durante esta fase. Outros persistem com infecção crônica e podem desenvolver
a forma mais grave da doença (HARRUS et al.,1997). De acordo com Codner e
Farris-Smith (1986) a persistência da E. canis no interior da célula hospedeira
conduz a uma reação de hipersensibilidade e resposta imunomediada,
podendo acarretar em pancitopenia. A estimulação antigênica crônica
produzida contra a infecção persistente pode também direcionar para doença
glomerular imunomediada.
2.1.4 Sinais clinico-laboratoriais
Alguns traços característicos da EMC, como febre, apatia,
emagrecimento, anorexia, dores articulares e disfunções hematológicas
(anemia normocítica e normocrômica, leucopenia, trombocitopenia) têm sido
observados em casos de erliquiose felina (BUORO et al.,1989; ALMOSNY,
1999; BOULOY et al., 1994; BEAUFILS et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2009).
Entretanto, ainda não se sabe se a infecção por E. canis em gatos se comporta
idêntica a EMC. Não há conhecimento de que gatos tornaram-se
persistentemente infectados ou se desenvolveram implicações
imunopatológicas como resultados de infecção crônica (SHAW et al., 2001).
2.1.5 Transmissão e Ciclo Biológico
Acredita-se que a maioria das espécies de Ehrlichia sp. sejam
transmitidas por vetores artrópodes, porém em gatos, a rota de transmissão
não foi estabelecida. Sabe-se que alguns agentes pertencentes à família
Rickettsiaceae e Coxiella burnettii têm transmissão oral em gatos. Contudo,
Peavy et al. (1997), discutiu a hipótese de que rotas orais de transmissão e
20
vetores artrópodes deveriam ser considerados na infecção por Ehrlichia sp. em
felinos.
Infestações por R. sanguineus em felinos domésticos já foram descritas
no Brasil, nos municípios de Mossoró-RN (FERREIRA et al., 2009) e João
Pessoa-PB (FERREIRA et al., 2010). Porém, a ausência de estudos que
elucidam a transmissão de Ehrlichia spp. em felinos, nos limita a inferirr o
carrapato R. sanguineus como vetor do agente em gatos.
Os cães são considerados reservatórios para E. canis bem como para a
manutenção do carrapato vetor primário, R. sanguineus. Grandes populações
de R. sanguineus podem se estabelecer e sobreviver dentro das casas e canis,
fornecendo uma fonte quase constante de infecção para os cães em ambientes
com grande infestação (DANTAS-TORRES, 2008).
Estágios imaturos dos carrapatos são infectados quando se alimentam
em cães em fase bacteriêmica, as bactérias ingeridas são capazes de se
multiplicar nos hemócitos e nas células das glândulas salivares e do intestino
(SMITH et al., 1976). As erliquias são transmitidas transestadialmente, não
havendo transmissão transovariana, consequentemente, larvas não podem
transmitir a infecção (GROVES et al.,1975). A transmissão a partir do carrapato
para cães susceptíveis pode ser realizada pelo menos por 155 dias após a
infecção do carrapato. Outra importante forma de transmissão é a transfusão
sanguínea (LEWIS et al., 1977).
O ciclo de desenvolvimento da Ehrlichia sp. na célula hospedeira inicia-
se com a adesão de pequenas células densamente coradas, as quais
penetram na célula. Dentro do vacúolo da célula hospedeira, as células densas
se transformam rapidamente em células reticuladas. Estas se multiplicam por
divisão binária, aproximadamente em 48 horas e, após 72 horas de infecção,
maturam e transformam-se em células densas novamente. Em seguida, são
liberadas da célula hospedeira e recomeçam um novo ciclo de infecção
(ZHANG et al. 2006).
21
2.1.6 Diagnóstico
Bonnard & Dralez (1990) afirmaram que os sintomas clínicos indicam a
suspeita de Erliquiose, no entanto, o diagnóstico da infecção se torna
impraticável sem o auxílio laboratorial, já que os sintomas são similares a
diversas outras doenças infecciosas (OLIVEIRA et al., 2009).
Segundo Swango et al. (1989), o diagnóstico é baseado na combinação
do histórico, anamnese, achados clínicos, análises laboratoriais e exames post
mortem. Contudo, diversas técnicas de diagnóstico estão disponíveis, tais
como detecção direta (microscopia) do agente nas células hematopoiéticas
infectadas ou em tecidos, isolamento em cultura celular, técnicas sorológicas
como Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Western immunoblot e
Ensaio de Imunoabsorção por Ligação Enzimática (ELISA). A técnica molecular
de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) demonstra elevada eficácia,
sensibilidade e especificidade para diagnóstico da erliquiose (IQBAL et al.,
1994; HARRUS e WANER, 2011).
A citologia de esfregaço de sangue periférico baseia-se na identificação
das mórulas nas células mononucleares infectadas, embora esta técnica
ofereça o método mais rápido de diagnóstico, ela é considerada pouco sensível
e raramente confirmatória na clínica prática (PADDOCK & CHILDS, 2003). A E.
canis pode ser cultivada in vitro em células DH82 (dog histiocytosis),
provenientes de monócitos caninos a partir de um caso de histiocitoma
(WELLMAN et al., 1988). Entretanto, embora o isolamento do agente em
cultura celular seja sensível e específico, este método é demorado e requer um
nível de experiência técnica, dificultando o seu uso como diagnóstico de rotina.
Quanto ao uso do ELISA e do western immunoblot, ambos apresentam
elevada sensibilidade, sendo que este último tem sido utilizado para
caracterizar e distinguir os diferentes agentes no caso de reação cruzada entre
os patógenos da família Anaplasmataceae (HARRUS e WANER, 2011). A RIFI
é considerada o teste padrão ouro para identificação e quantificação de
anticorpos da classe IgG anti-E.canis, na qual títulos ≥ 40 indicam
soropositividade (AGUIAR et al. 2007b; HARRUS e WANER, 2011). A RIFI é
indicada para a detecção de casos mais crônicos, uma vez que a formação de
22
anticorpos inicia somente entre 1 a 3 semanas após a infecção (MCBRIDE et
al., 1996).
A PCR e o sequenciamento têm sido também utilizados para a detecção
do agente, haja visto que torna possível a identificação de DNA de bactérias
mesmo em amostras de culturas cito-negativas, e mesmo antes da formação
de mórulas e da soroconversão (MCBRIDE et al., 1996). Harrus e Waner
(2011) apontam várias vantagens na utilização dos métodos moleculares tanto
pela PCR convencional quanto em tempo real, entre elas a detecção anterior à
soroconversão, a maior sensibilidade do teste e a detecção do material
genético do agente ao invés dos anticorpos, o que é fundamental para
estabelecer a diferenciação entre infecção ativa e exposição.
2.2 Erliquiose Humana
A Erliquiose Monocítica Humana (HME) e Erliquiose Granulocítica
Humana (EGH) têm sido amplamente relatadas (OLANO e WALKER, 2002).
Casos de HME causadas por E. chaffeensis foram descritas na América
do Norte, Ásia, Europa e em alguns países da América Latina, incluindo
Argentina (RIPOLL et al., 1999), Chile (LÓPEZ et al., 2003) e Peru (MORO et
al., 2009). No Brasil evidências sorológicas têm sido relatadas no estado de
Minas Gerais (CALIC et al, 2004).
A ocorrência de infecção por E. chaffeensis foi descrita pela primeira vez
em humanos por Anderson et al. (1991), a partir do isolamento e PCR de
amostras de sangue de pacientes com histórico clínico compatível com
erliquiose. HME geralmente manifesta como doença moderada a severa e
aproximadamente 60 a 70% dos pacientes com casos sérios têm sido
hospitalizados. Em alguns pacientes, a doença não tratada pode progredir
rapidamente até a morte (PADDOCK & CHILDS, 2003).
A. phagocytophilum, antes classificado como E. phagocytophila, é o
agente causador da HGE. E. ewingii foi reconhecida como agente de infecção
humana em 1999 em várias regiões dos Estados Unidos. Esta bactéria é
similar sorologicamente a E. chaffeensis, mas semelhante a A.
23
phagocytophilum, propagando-se dentro de neutrófilos (BULLER et al., 1999).
Pessoas imunodeprimidas possuem maior risco de desenvolver EGH, cujo
curso é semelhante ao causado pelas demais espécies do gênero e
caracterizada por febre, dor de cabeça, trombocitopenia, com ou sem
leucopenia (PADDOCK et al., 2001).
Além das espécies supracitadas, Perez et al. (1996) isolaram uma
erliquia de um paciente humano aparentemente saudável na Venezuela
denominado o isolado de VHE (Venezuela Human Ehrlichia). O isolado
apresentou morfologia ultraestrutural compatível com E. canis, E. chaffeensis e
E. muris. Entretanto, a sequência do gene 16S rRNA deste isolado foi similar
(99,9%) às sequências de E. canis Florida e E. canis Oklahoma . Contudo, os
pesquisadores sugeriram que VHE é uma nova cepa ou subespécie de E. canis
que causava uma infecção subclínica crônica em humanos.
Em 2001, estudos realizados na mesma região geográfica compararam
as estruturas moleculares e antigênicas do isolado VHE com isolados de E.
canis de cães e carrapatos. Baseados na análise da sequência do gene 16S
rRNA e na análise de Western immunoblot, a E. canis isolada de cães e
carrapatos foram idênticas ao isolado VHE, sugerindo que a mesma cepa de E.
canis é responsável por ambas EMC e HME na Venezuela (UNVER et al.,
2001). Posteriormente, mais seis casos de pacientes humanos infectados com
E. canis na Venezuela foram relatados. Nesses casos, os pacientes
apresentavam sintomas compatíveis com a HME (PEREZ et al., 2006).
Diniz et al. (2007) desenvolveram a primeira investigação epidemiológica
em cães como sentinelas para múltiplos organismos vetores, a fim de avaliar a
potencial de infecção humana por estes agentes na região sudeste do Brasil, e
os resultados apontaram um risco potencial para a exposição humana, nos
locais onde há cães infectados.
24
3 MATERIAL E MÉTODOS
3. 1 Local de estudo
O estudo foi realizado nos municípios de Cuiabá e Várzea Grande,
localizados no centro-sul do Estado de Mato Grosso, nas coordenadas
geográficas: 15º35'56'' de latitude sul e 56º06'01'' de longitude oeste e
15°38’48’’ de latitude sul e 56°07’57’’ de longitude oeste, respectivamente
(Figura 1), e altitude média de 165m. Ambos fazem parte da região
metropolitana de Cuiabá, MT. A região apresenta clima tropical quente e sub-
úmido, com precipitação média anual de 1750 mm. A temperatura máxima, nos
meses mais quentes, é de aproximadamente 43°C e a mínima varia entre 12 e
14ºC. Os municípios possuem, juntos, uma população estimada de 803.694
habitantes (IBGE, 2010).
BRAZIL
Figura 1: Localização dos municípios de Cuiabá e Várzea Grande, MT. Cuiabá, 2013.
25
3.2 Amostragem
Durante os meses de maio a dezembro de 2011, amostras de sangue de
felinos domésticos foram coletadas de um Abrigo de Animais (n=31) e dos
Centros de Controle de Zoonoses (CCZ) de Cuiabá (n=23) e Várzea Grande
(n=65). Amostras de sangue recebidas para avaliação hematológica no
Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da Universidade
Federal de Mato Grosso (HOVET-UFMT) (n=93) também foram analisadas,
totalizando em 212 gatos amostrados. A colheita de sangue foi realizada por
meio de venopunção da jugular externa com agulha 0,25 mm x 0,8 mm, sendo
em seguida acondicionadas em tubos sem e com EDTA (Ethylenediamine
Tetraacetic Acid). Os tubos foram devidamente identificados, acondicionados
em caixas de térmicas sob refrigeração e transportados ao Laboratório de
Virologia e Rickettsioses do HOVET-UFMT. Para a obtenção de soro, as
amostras foram centrifugadas a 1000g por 5 minutos. O soro e o sangue total
foram armazenados em microtubos, identificados, separados em alíquotas e
refrigerados a -20°C até a realização dos testes.
Os animais foram classificados quanto ao sexo e a faixa etária.
Baseados na arcada dentária, animais com massa corpórea inferior a 1,5 kg
foram considerados jovens e superiores ou iguais a 1,5 kg foram considerados
adultos (SHARIF et al., 2007). Dados como anamnese, e resultados de exames
clínicos e laboratoriais foram recolhidos dos prontuários dos animais avaliados
do HOVET-UFMT.
3.3 Reação de Imunofluorescência Indireta
A Reação de Imunofluorescência Indireta foi realizada a partir de células
DH82 infectadas com a cepa São Paulo de E. canis oriundas do Laboratório de
Virologia e Rickettsioses da HOVET-UFMT.
26
Os soros foram diluídos inicialmente a 1:40 (AGUIRRE et al., 2004) em
PBS (pH 7,2) com 1% de soroalbumina bovina, e aplicadas em lâminas
contendo antígeno previamente fixado. Em cada lâmina foram incluídos soros
controles não reativo (controle negativo) e soro reativo (controle positivo). Após
aplicação das amostras, as lâminas foram incubadas por 30 minutos a 37ºC em
câmara úmida, seguida por lavagem em solução salina tamponada - PBS (pH
7,2). Depois da secagem em temperatura ambiente, foi adicionado conjugado
de cabra anti-IgG de felino (Sigma® Diagnostics, St. Louis, EUA) na diluição de
1:1000. As lâminas foram novamente incubadas a 37ºC por 30 minutos em
câmara úmida, lavadas em PBS (pH 7,2) por 10 minutos e submetidas a
secagem. Posteriormente, adicionou-se glicerina nas lâminas (pH 8,5) que
foram examinadas em microscópio (objetiva de 40x) de epifluorescência. As
amostras consideradas positivas passaram por sucessivas diluições na razão
dois com objetivo de obter o título final.
3.4 Extração de DNA
A extração de DNA do sangue total foi realizada através do kit comercial
Axyprep Blood Genomic DNA Miniprep (Axygen Biosciences, Hangzhou,
China) conforme as instruções do fabricante. O DNA extraído foi então
identificado e armazenado a -20ºC até a realização da PCR.
3.5 Reação em Cadeia pela Polimerase
A técnica de Reação em Cadeia pela Polimerase visou à amplificação de
um fragmento de 409-pb do gene dsb de Ehrlichia, utilizando-se uma PCR
contendo: 100-400 ng de DNA; 0,2 mM de cada nucleotídeo dATP, dTTP,
dCTP e dGTP (Promega®); 0,4 µM de cada iniciador (primer) dsb: dsb-330 (5’-
GAT GAT GTC TGA AGA TAT GAA ACA AAT-3’) e dsb-728 (5’-
CTGCTCGTCTATTTTACTTCTTAAAGT-3’); 1,25 U de Taq Polimerase
27
(Platinum® Taq DNA polymerase – Invitrogem); solução tampão (pH 8,4)
contendo 50 mM de KCl; 20 mM Tris-HCl e 3 mM de MgCl2 (DOYLE et al.,
2005). O volume foi completado com água MilliQ autoclavada para completar
50 µl e a amplificação foi efetuada em termociclador automático (MULTIGENE
MINI24 - Labnet International Inc.). Em cada reação foi utilizado controle
positivo (DNA extraído a partir de cultivo celulare da cepa E. canis São Paulo) e
controle negativo (água MilliQ) a fim de avaliar possíveis contaminações.
Inicialmente, as amostras foram desnaturadas a 95ºC por dois minutos,
seguida de uma sequência de 50 ciclos repetidos de 15 segundos a 95ºC, 30
segundos a 58ºC e 30 segundos a 72ºC, seguidos de cinco minutos de
extensão final a 72ºC. A amplificação resultante das reações foi visualizada em
Gel de Agarose a 1,5% com tampão de corrida TBE 1X pH 8,0 (44,58 MTris-
base; 0,44 M ácido bórico; 12,49 mM EDTA) à 120v/60mA. Após a corrida, o
gel foi corado com brometo de etídio (0,5µl/ml – Invitrogen®) e visualizado sob
luz ultravioleta (UV) em câmara escura.
3.6 Purificação e Sequenciamento
Os produtos amplificados foram purificados com o kit Illustra GFX PCR
DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Bio-Sciences) segundo
instruções do fabricante, em seguida, submetidos ao sequenciamento genético
utilizando Big Dye (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do
fabricante, em sequenciador automático de DNA modelo ABI PRISM-310
Genetic Analyzer (Applied Biosystens/Perkin Elmer). As sequências obtidas
foram editadas no software BioEdit (Ibis Biosciences, Carlsband, CA) e
posteriormente analisada através do programa Basic Local Alignment Search
Tool (BLAST) a fim de verificar a identidade com demais seqüências
correspondentes disponíveis no GenBank.
28
3.7 Análise Estatística
Dos 212 felinos avaliados, foram realizados estudos de associações
entre faixa etária, sexo e origem do animal com a positividade para Ehrlichia
spp. constatada pela PCR e RIFI.
Dos felinos atendidos no HOVET-UFMT (n=93), além das variáveis
obtidas durante anamnese, exames clínicos e laboratoriais também foram
submetidas ao estudo de associação Para melhor avaliação dos resultados
obtidos no teste sorológico, as mesmas variáveis foram analisadas segundo os
títulos de anticorpos apresentados na RIFI: baixos títulos (40 a 640) e altos
títulos (1.280 a 40.960).
Todas as análises foram realizadas pelo teste do Qui-Quadrado (χ2) ou
pelo teste exato de Fischer quando necessário com uso do software estatístico
EPIINFO 3.5.3.
4 RESULTADOS
4.1 Gatos
Um total de 212 felinos foram avaliados neste estudo, os quais 102
(48,1%) se tratavam de fêmeas e 110 de (51,9%) machos. Quanto à faixa
etária, 59 (28,6%) eram jovens e 147 (71,4%) eram adultos. Não foi obtida
informações a respeito da faixa etária de seis gatos. Durante a coleta de
material biológico dos animais, não foram visualizados infestações por
carrapatos.
29
4.2 Reação de Imunofluorescência Indireta
No teste sorológico, 88 (41,5%) gatos foram soro-reagentes para E.
canis, dos quais 42 de 93 eram procedentes do HOVET-UFMT, 3 de 23 do
CCZ de Cuiabá, 27 de 65 do CCZ de Várzea Grande e 16 de 31 do abrigo de
animais. Vinte e seis (30,6%) gatos positivos foram considerados jovens e 59
(69,4%) adultos, 45 (51,1%) eram fêmeas e 43 (48,9%) eram machos. Os
títulos de anticorpos reagentes contra E. canis variaram de 40 à 40960 (Tabela
1).
Tabela 1- Frequência de títulos observados em gatos positivos para Ehrlichia spp. através de Reação de Imunofluorescência Indireta. Cuiabá, MT. 2013
Títulos Número de gatos %
40 2 2,2%
80 14 16,0%
160 31 35,2%
320 15 17,0%
Baixos
640 14 16,0%
1280 10 11,3%
2560 0 0%
5120 0 0%
10240 1 1,1%
20480 0 0%
Altos
40960 1 1,1%
30
4.3 Reação em Cadeia pela Polimerase
Vinte (9,4%) gatos foram positivos para Ehrlichia spp. através da PCR.
De acordo com a origem dos animais, 8 de 93 eram provenientes do HOVET-
UFMT, 1 de 23 do CCZ de Cuiabá e 11 de 65 do CCZ de Várzea Grande. Não
foi observada positividade em felinos do abrigo. Relativo à faixa etária dos
gatos positivos, 8 (40%) eram jovens e 12 (60%) adultos, quanto ao gênero,
ambos foram positivos na mesma proporção (50%). Doze dos vinte gatos
positivos pela PCR também foram positivos pela RIFI.
4.4 Sequenciamento Genético
Sequências parciais de 300 nucleotídeos de cada uma das 20 amostras
geradas neste estudo foram idênticas entre si e entre as sequências de E.
canis Uberlândia (GU586135) e E. canis str. Jake (CP000107), depositadas no
Genbank.
4.5 Achados Clinico-laboratoriais
Nos exames clínico-laboratoriais dos gatos avaliados no HOVET-UFMT,
foram observados sinais clínicos e alterações laboratoriais palidez das
mucosas, linfadenomegalia, anemia, monocitose, linfopenia e trombocitopenia.
31
4.6 Análises estatísticas
A positividade para Ehrlichia spp. através dos testes de PCR e RIFI
foram avaliadas frente as variáveis: faixa etária, sexo e origem dos gatos
amostrados. Não houve associação significativa quando analisados faixa etária
e sexo (p>0,05). O resultado das análises estatísticas avaliando origem dos
gatos está apresentado na Tabela 2.
Tabela 2- Associação entre os locais de origem dos felinos e os resultados da
Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR). Cuiabá, MT. 2013
* Letras diferentes na mesma coluna indica P<0,05
Os resultados do testes de associação entre a RIFI e as avaliações
clínico–laboratoriais estão descritos na Tabela 3. Somente palidez das
mucosas foi associada à soropositividade (p<0,05). No entanto, quando os
títulos foram classificados em baixos e altos, somente a baixa contagem de
eritrócitos foi associada aos baixos títulos de anticorpos (p<0,05).
PCR RIFI Origem
Nº de gatos
testados Gatos positivos %* Gatos positivos %*
Hovet/ UFMT 93 8 2,6a 42 45,1a
CCZ - Cuiabá
23 1 4,3a 3 13,0b
CCZ - Várzea Grande
65 11 16,9a,b 27 41,5a
Abrigo 31 0 0a,c 16 51,6a
Total 212 20 9,4 88 41,5
32
Tabela 3 - Associação entre os achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT. 2013
RIFI Achados clínicos e
laboratoriais n Positivos % Valor de p
Mucosas Normais Pálidas
73 20
29 13
39.7 65.0
0.02
Linfadenomegalia Ausente Presente
67 26
28 14
41.8 53.8
0.15
* Eritrócitos < 5.5 x106/mm3 5.5 – 10 x106/mm3 > 10 x106/mm3
20 73 0
9 33 0
45.0 45.2
0
0.59
* Leucócitos < 5.5 x103/mm3 5.5 – 19.5 x103/mm3
> 19.5 x103/mm3
25 61 7
7 32 3
28.0 52.5 16.7
0.11
* Monócitos 0-0.8 x 103/mm³ > 0.8 x 10³/mm³
63 30
31 11
49.2 36.7
0.13
* Plaquetas < 300 x103/mm3 300 – 800 x103/mm3
> 800 x103/mm3
53 40 0
21 21 0
39.6 52.5
0
0.11
* Linfócitos < 1.1 x103/mm3 1.1 – 10.7 x103/mm3
> 10.7 x103/mm3
31 62 0
12 30 0
48.4 38.7
0
0.19
* Valores de Referências (Jain, 1993)
A Tabela 4 apresenta os resultados de testes de associação de acordo
com a PCR e as avaliações clínico–laboratoriais. Nenhuma das variáveis foi
associada com a positividade para Ehrlichia spp. através de PCR, no entanto,
houve uma tendência à linfopenia em gatos positivos.
33
Tabela 4 - Associação entre achados clínico-laboratoriais e os resultados da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) dos animais atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso. Cuiabá, MT. 2013
* Valores de Referências (Jain 1993)
5 DISCUSSÃO
O presente estudo relata a primeira detecção molecular e sorológica de
E. canis em felinos domésticos da região Centro-Oeste do Brasil, mais
precisamente na região metropolitana de Cuiabá, Mato Grosso. De maneira
geral, a frequência de anticorpos anti-Ehrlichia canis (41,5%) e de DNA erliquial
(9,4%) encontrada neste trabalho é a maior já detectada no país.
PCR Achados clínicos e laboratoriais n Positivos % Valor de p
Mucosas Normais Pálidas
73 20
8 0
11 0
0.13
Linfadenomegalia Ausente Presente
63 22
4 4
6
15.4
0.14
* Eritrócitos < 5.5 x106/mm3 5.5 – 10 x106/mm3 > 10 x106/mm3
20 73 0
2 6 0
10 8.2 0
0.54
* Leucócitos < 5.5 x103/mm3 5.5 – 19.5 x103/mm3
> 19.5 x103/mm3
7 55 23
0 6 2
0
9.8 8
0.67
* Monócitos 0-0.8 x 103/mm³ > 0.8 x 10³/mm³
63 30
5 3
7.9 10
0.50
* Plaquetas < 300 x103/mm3 300 – 800 x103/mm3
> 800 x103/mm3
53 40 0
6 2 0
11.3
5 0
0.24
* Linfócitos < 1.1 x103/mm3 1.1 – 10.7 x103/mm3
> 10.7 x103/mm3
31 62 0
5 3 0
16.1 4.8 0
0.07
34
A soroprevalência detectada evidencia a exposição da população felina
desta região à Ehrlichia spp., no entanto a ocorrência de reação cruzada com
outros agentes da família Anaplasmataceae não pode ser descartada (WEN et
al., 1997). Mediante ao fato, amostras de DNA amplificado analisadas por
reação de sequenciamento foram idênticas às sequencias de E. canis
depositadas no GenBank, corroborando com os achados de Oliveira et al.
(2009), que também relataram identidade às sequencias de E. canis, inclusive
quando comparadas às sequencias obtidas de um estudo realizado em cães,
na mesma área (OLIVEIRA, 2009), sugerindo a possibilidade de que uma
mesma cepa de E. canis estaria infectando cães e gatos.
Em estudo desenvolvido com DNA de Ehrlichia spp. obtido por nested
PCR, Braga et al. (2011) demonstrou 98% de similaridade com cepas de E.
canis oriundas de cães da Tunísia (EU781695), Taiwan (EU143637) e Itália
(EU439944). Outra sequência obtida foi 97% similar à E. chaffeensis (Arkansas
- AF416764), Ehrlichia sp. de Rhipicephalus (Boophilus) microplus do Tibet
(AF414399) e Ehrlichia sp. de cervídeos do Japão (AB454074). No presente
estudo, apenas E. canis foi detectado nos gatos na região metropolitana de
Cuiabá, MT.
No Brasil, os estudos acerca da erliquiose felina são poucos, apesar das
altas taxas de infecção em cães. Silva et al. (2010) demonstraram que a
soroprevalência de anticorpos anti-E. canis em cães de Cuiabá foi de 42,5%, a
qual se assemelha a do presente estudo. Entretanto, a proporção de gatos
positivos para E. canis pela PCR foi inferior à diagnosticada em cães no
Laboratório de Virologia e Rickettsioses do HOVET-UFMT, ao redor de 33%
(Comunicação pessoal, AGUIAR, 2012).
Não obstante, os resultados destacam a infecção por E. canis na
população de felinos da região metropolitana de Cuiabá, reconhecida como
endêmica para E. canis (SILVA et al., 2010; ALMEIDA et al., 2012; MELO et al.,
2011).
Segundo Trapp et al. (2002) o parasitismo por R. sanguineus é
considerado um fator de risco para a erliquiose canina. Em casos de erliquiose
felina desconhece-se essa informação, porém sabe-se que a exposição a
carrapatos tem sido reportada em cerca de 30% dos casos da doença
(LAPPIN, 2001). Ainda assim, o tempo de exposição a esses vetores é menor
35
quando comparado aos cães (BREITSCHWERDT et al., 2002), fato frequente,
devido ao hábito felino de se lamber, removendo os carrapatos. Esta
característica higiênico-profilática felina pode justificar a ausência de
parasitismo por R. sanguineus no presente estudo.
Devido à ausência de carrapatos e a alta freqüência de gatos positivos
para Ehrlichia spp. pela PCR e RIFI, sugere-se a possibilidade de que outros
vetores, como pulgas, atue na transmissão do agente em felinos. Contudo,
como a prevalência da infecção por E. canis está intimamente associada à
distribuição do vetor R. sanguineus (RODRIGUEZ-VIVAS et al., 2005), e tendo
sido constatado DNA de E. canis nesta espécie de carrapato na região do
presente estudo (ALMEIDA et al., 2012), a transmissão por essa espécie de
ixodídeo não pode ser descartada.
A avaliação conduzida nos felinos oriundos do HOVET-UFMT positivos
para E. canis pela PCR demonstrou que grande parte da população estudada
apresentava trombocitopenia, corroborando o achado de Oliveira et al. (2009).
Entretanto, este resultado não foi confirmado estatisticamente. Na EMC, a
trombocitopenia é resultado de hipoplasia megacariocítica e de redução do
tempo de vida das plaquetas, em consequência de alterações inflamatórias
imuno-mediadas e/ou por disfunção dos mecanismos de coagulação (TROY e
FORRESTER, 1999). Outros fatores, no entanto, podem ser responsáveis por
causar trombocitopenia em felinos como doenças auto-imunes, neoplasias
metastáticas ou hematológicas, doenças infecciosas (FeLV e FIV) e infecções
por protozoários (Leishmaniose e Babesiose) (FERREIRA NETO et al., 1981).
Adicionalmente, observou-se tendência à linfopenia em gatos positivos
pela PCR (p = 0,07) e este achado é comumente relatado nos cães durante a
fase aguda da infecção (HARRUS et al., 1997). Nesta fase, alteração como
linfadenomegalia também é observado frequentemente devido à reativa
hiperplasia linfóide induzida pela doença (TROY e FORRESTER, 1999) o que
sustenta nosso achado em gatos positivos pela PCR.
Uma maior proporção de animais soropositivos apresentou resultados
negativos pela PCR, demonstrando ausência de E. canis no sangue periférico
naquele momento. Em cães, sabe-se que durante as fases subclínica e crônica
da doença, a bactéria pode não ser encontrada no sangue periférico, pelo
provável sequestro realizado pelo baço e tecidos linfóides ou mesmo devido
36
aos baixos números de cópias de DNA da bactéria circulante (HARRUS et al.,
1998; EBERHARDT et al., 2006). Por outro lado, pouco se conhece sobre a
dinâmica da infecção por E. canis em gatos, portanto qualquer suposição a
cerca de rickettsemia em gatos seria algo meramente especulativo.
Com base na anamnese dos felinos proveniente do HOVET-UFMT,
observou-se uma maior proporção de gatos sororeativos para E. canis,
associados a palidez das mucosas (p = 0,02). Animais soropositivos que
apresentaram baixos títulos de anticorpos (40 a 640) foram associados a
baixas contagens de eritrócitos, o que justifica a palidez das mucosas. A
atuação do sistema fagocítico monocitário, a lise das células pela ação do
sistema complemento e a supressão da eritropoiese na medula óssea são
identificados como mecanismos responsáveis pela anemia na infecção crônica
por E. canis em cães (HARRUS et al., 1999). Ao contrário da EMC, pouco se
conhece a cerca da patogênese ou das implicações imunopatológicas
resultante de infecção crônica em gatos (SHAW et al., 2001), de modo que não
é apropriado inferir que tais animais estavam cursando a fase crônica da
infecção.
Doze dos vinte gatos positivos pela PCR também se apresentaram
sororeativos pela RIFI, apresentando baixos títulos com exceção de um felino,
presumindo que esses animais possivelmente estavam cursando a fase aguda
ou assintomática paralelamente com o período de soroconversão. Outra
possível hipótese seria que esses animais estariam cursando um período de
recrudescência, em conseqüência da imunossupressão. Wen et al. (1997)
afirma que a combinação dos testes de RIFI e PCR podem ser usados como
instrumento diagnóstico da erliquiose, uma vez que fornece um melhor
compreensão das fases de infecção.
Do total de animais avaliados, nenhuma associação foi estabelecida
entre a positividade de ambos os testes e as variáveis referentes à faixa etária
e sexo. Resultados similares quanto a faixa etária foram relatados por Stubbs
et al. (2000), por outro lado, houve discordância no que se refere a gênero, pois
maiores taxas de infecção foram descritas predominantemente em fêmeas. De
acordo com os resultados do presente estudo, a infecção por E. canis ocorre
na mesma proporção em relação a idade e sexo, minimizando o efeito do
comportamento social na epidemiologia da infecção na região estudada.
37
Quando analisado a origem dos gatos em relação à infecção, animais
oriundos do CCZ de Várzea Grande apresentaram maior frequência de gatos
positivos pela PCR e a segunda maior frequência de anticorpos anti-E.canis,
revelando possivelmente características peculiares à área, qual expõe esses
animais à infecção. Gatos do abrigo apresentaram maior frequência de
anticorpos anti-E. canis, supondo que estes animais foram mais expostos ao
agente. Ressalta-se que no abrigo, muitas vezes os felinos permaneciam em
contato com cães. Em contrapartida, gatos do CCZ de Cuiabá apresentaram
frequência de anticorpos anti-E. canis menores que os demais locais avaliados.
Este trabalho destaca a presença de E. canis circulando na população
de gatos da região metropolitana de Cuiabá, contribuindo com os demais
estudos que sugerem a participação do felino doméstico como reservatório da
E. canis. Adicionalmente, o presente estudo fornece subsídios clínico médico
veterinário, ressaltando a inclusão da erliquiose felina como diagnóstico
diferencial em gatos anêmicos, linfopênicos e trombocitopênicos,
principalmente em áreas endêmicas para E. canis. Ao mesmo tempo, nossos
resultados reforçam a necessidade de novas pesquisas a respeito da
epidemiologia e da dinâmica da infecção em felinos domésticos.
38
6 Conclusão
A partir dos resultados do presente estudo concluímos que:
• A E. canis é uma espécie circulante na população de felinos
domésticos da região metropolitana de Cuiabá.
• A exposição de felinos domésticos à Ehrlichia spp. é próxima ao
que ocorre em cães nesta mesma área.
• A ausência de carrapatos R. sanguineus nos gatos estudados
sugere a participação de outros vetores atuando na transmissão.
• Alterações clínico-laboratoriais como palidez das mucosas e
anemia foram associados à infecção.
39
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